DE10233676A1

DE10233676A1 - Nucleinsäuresequenz und Protein sowie Polypeptide kodierend für eine Mannit-Dehydrogenase oder deren Teile sowie deren Herstellung und Verwendung in Diagnostik und Therapie

Info

Publication number: DE10233676A1
Application number: DE10233676A
Authority: DE
Inventors: Birgit Dr. Simon-Nobbe; Peter Mag. Schneider; Ursula Mag. Denk; Verena Wally; Klaus Prof. Dr. Richter; Christian Dr. Radauer; Markus Dr. Teige; Christof Prof. Dr. Ebner; Michael Dr. Breitenbach
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2002-07-24
Publication date: 2004-02-12

Abstract

Offenbart werden Polypeptide aus der Mannit-Dehydrogenase von Cladosporium herbarum, hierfür kodierende Nukleinsäuren und deren Verwendung in Diagnostik und Therapie.

Description

Die verschiedensten Stoffe rufen bei bestimmten Personen allergische Reaktionen hervor. Bekannt sind nicht nur Allergien gegen Bestandteile von Tieren, wie beispielsweise Katzenhaare, sondern auch Allergien gegen Pflanzen bzw. Pflanzenteile, wie Blütenpollen. Bekannt sind aber auch Allergien gegen Mikroorganismen, wie beispielsweise Schimmelpilze.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Hauptallergen des Schimmelpilzes Cladosporium herbarum. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß es sich bei diesem Hauptallergen überraschenderweise um eine Mannit-Dehydrogenase handelt.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, das wenigstens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz mit der Sequenz ID Nr. 1 aufweist. Die Aminosäuresequenz ist in 1 dargestellt, ebenso wie die zugehörige DNA-Sequenz. Die Erfindung betrifft auch die Polypeptide mit den Seq.ID Nr. 4, 5 und 6.
Offenbart wird weiterhin die vollständige Sequenz eines Polypeptids kodierend für eine Mannit-Dehydrogenase. Seq.ID Nr. 7 stellt die Nucleinsäuresequenz und Seq.ID Nr. 8 die Aminosäuresequenz hiervon dar. Die Sequenzen sind in 3 dargestellt.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid weist bevorzugt wenigstens ein Epitop auf. Unter einem Epitop versteht man einen Bereich, an den Antikörper binden können. Grundsätzlich gibt es lineare Epitope. In diesem Fall liegen die das Epitop bildenden Aminosäuren nebeneinander. Häufiger sind aber die sogenannten Konformationsepitope. Diese werden durch die Faltung des Polypeptids gebildet. Dabei können Aminosäuren, die in der Sequenz nicht benachbart sind, aufgrund der dreidimensionalen Faltung des Polypeptids in eine räumliche Nähe kommen und diese Oberflächenstruktur wird von einem Antikörper gebunden.
Bevorzugt sind die Epitope spezifisch für einen Schimmelpilz. Grundsätzlich können mit Hilfe geeigneter Techniken, beispielsweise unter Verwendung von Adjuvanzien, Antikörper gegen fast alle Aminosäuresequenzen erzeugt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide spielen aber bei der Diagnostik und Therapie eine wesentliche Rolle. Deshalb weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide bevorzugt spezifische Epitope auf, wobei die Epitope spezifisch für einen Schimmelpilz sind. Häufig weisen Proteine bzw. Polypetide, die aus einem bestimmten Organismus stammen, Ähnlichkeiten auf zu einem entsprechenden Protein bzw. Polypeptid, das von einem verwandten Organismus stammt. Es ist daher möglich, daß Antikörper, die gegen ein Epitop eines bestimmten Schimmelpilzes gerichtet sind, auch mit einem entsprechenden Epitop eines verwandten Schimmelpilzes reagieren.
Je spezifischer ein Epitop ist, desto weniger reagieren hiergegen gerichtete Antikörper mit einem Epitop eines homologen Polypeptids aus einem verwandten Organismus. Die erfindungsgemäßen Polypeptide weisen daher bevorzugt solche Epitope auf, die spezifisch sind für einen Schimmelpilz. Besonders bevorzugt weisen die Polypeptide solche Epitope auf, die spezifisch sind für einen Schimmelpilz aus der Gattung Cladosporium. Ganz besonders bevorzugt weisen die Polypeptide ein Epitop auf, das spezifisch ist für Cladosporium herbarum. Antikörper, die gegen ein derartiges Epitop gerichtet sind, reagieren nicht mit anderen Polypeptiden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, daß das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz ID Nr. 1 für eine Mannit-Dehydrogenase kodiert. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Teile dieser Aminosäuresequenz mit wenigstens 11 Aminosäuren. Die erfindungsgemäßen Polypeptide weisen bevorzugt wenigstens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Sequenz mit der Sequenz ID Nr. 1 auf. Bevorzugter sind solche Polypeptide, die wenigstens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweisen, und ganz besonders bevorzugt sind solche Polypeptide, die wenigstens 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz mit der Sequenz ID Nr. 1 aufweisen. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid vom N-Terminus mit der Sequenz PGQQATKHESLLDQLS (Seq.ID Nr. 4) sowie zwei Polypeptide vom C-terminalen Ende mit der Sequenz LDTGLSDFVVK (Seq.ID Nr. 5) und MGRDGLAKEL (Seq.ID Nr. 6).
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Polypeptid mit der Sequenz ID Nr. 8 sowie Teile dieses Polypeptids, die ein Epitop enthalten. Die erfindungsgemäßen Teile der Sequenz ID Nr. 8 weisen wenigstens 11, bevorzugt wenigstens 20, noch bevorzugter wenigstens 50 und ganz besonders bevorzugt wenigstens 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz mit der Sequenz ID Nr. 8 auf.
Bevorzugt weisen diese Polypeptide wenigstens ein Epitop auf. Es ist beispielsweise möglich mit Hilfe von Hydrophilie/Hydrophobie Bestimmungen nachzuweisen, welche Teile des Polypeptids besonders geeignet sind für immunologische Reaktionen. Dies kann beispielsweise mit Hilfe geeigneter Computerprogramme erfolgen.
Alternativ hierzu ist es auch möglich, mit Hilfe der sogenannten Pepscan-Methode Fragmente der Sequenz herzustellen und durch Reaktion mit Seren von allergischen Patienten zu testen, ob die kurzen Fragmente relevante Epitope enthalten. Weiterhin muss geklärt werden, ob es sich hierbei um Epitope handelt, die spezifisch sind für einen Schimmelpilz, insbesondere für einen Schimmelpilz aus der Gattung Cladosporium und insbesondere für Cladosporium herbarum. Zu der Bestimmung bedient man sich der Hilfe geeigneter Serum Panels.
Es ist auch möglich, mit Hilfe rekombinanter Techniken kürzere Fragmente der vollständigen Sequenz rekombinant in Bakterien, beispielsweise in E. coli oder in höheren Organismen, beispielsweise Insektenzellen, Hefen oder eukoriontischen Zellen herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, der zur Desensibilisierung von Patienten gegen eine Schimmelpilzallergie eingesetzt werden kann. Bei der Desensibilisierung werden Patienten, die an einer Allergie leiden, mit einer geringen Menge eines Antigens in Kontakt gebracht, wodurch neutralisierende IgE-Antikörper gebildet werden sollen. Durch diese neutralisierenden Antikörper werden die Antigene, wenn der Patient mit den Antigenen in Kontakt gekommen ist, gebunden. Dadurch wird die Bindung von allergische Reaktionen auslösenden Antikörpern von IgE-Typ vermieden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können daher zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden. Hierzu können die rekombinant oder auch chemisch hergestellten Polypeptide in eine geeignete Impfstofformulierung eingearbeitet werden. Die Impfstofformulierung kann neben den Polypeptiden auch übliche Zusatzstoffe und Formulierungshilfen, wie auch Adjuvanzien enthalten.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu einem diagnostischen Nachweis einer Erkrankung. Bei einer derartigen Erkrankung handelt es sich üblicherweise um eine Allergie. Die Polypeptide werden in einem geeigneten diagnostischen Nachweissystem eingesetzt. Hierbei kann es sich um einen Radioimmunassay (RIA) handeln, oder bevorzugt auch um einen ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Die übliche Konfiguration eines derartigen diagnostischen Tests ist bekannt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleotide aus der Nikleotidsequenz mit der Sequenz ID Nr. 2. Die Nukleotidsequenz mit der Sequenz ID Nr. 2 ist ebenfalls in 1 dargestellt. Es handelt sich hierbei um einen Teil des Gens für die erfindungsgemäße Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium herbarum.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Polynukleotide mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID Nr. 7. Teile dieser Nukleotidsequenz sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Mit Hilfe dieser Nucleotidsequenz oder Teilen davon kann ein gewünschtes Polypeptid rekombinant in geeigneten Wirtszellen hergestellt werden.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid weist wenigstens acht aufeinanderfolgende Nukleotide, bevorzugt wenigstens 12, noch bevorzugter wenigstens 20 und am bevorzugtesten wenigstens 50 aufeinanderfolgende Nukleotide auf. Für manche Einsatzgebiete müssen die Nukleotide länger sein, in diesem Fall weisen die Polynukleotide wenigstens 100 aufeinandertolgende Nukleotide ausgewählt aus der Sequenz ID Nr. 2 oder Sequenz ID Nr. 7 auf.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können zum Nachweis einer Mannit-Dehydrogenase dienen. Bevorzugt wird dabei das Vorhandensein eines Gens kodierend für diese Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium herbarum nachgewiesen. Bei diesen Verfahren handelt es sich um an sich bekannte Nukleinsäureamplifikationsmethoden. Hierfür kommt beispielsweise das NABSA in Frage oder bevorzugt die Polymerase Kettenreaktion (PCR).
Mit Hilfe eines derartigen Verfahrens kann das Vorhandensein des Schimmelpilzes Cladosporium herbarum nachgewiesen werden. Derartige Anwendungen sind nicht nur in der medizinischen Diagnostik von Interesse, sondern auch in anderen Bereichen, beispielsweise der Hygiene und der Untersuchung von Lebensmitteln. Berücksichtigt werden muß hier, daß Cladosporium herbarum auch bei verhältnismäßig niederen Temperaturen bis zu etwa +6C° wachsen kann und daher in Bereichen der Lebensmitteltechnologie eine unerwünschte Kontamination darstellen kann. Für die Überwachung von Lebensmitteln kann der Nachweis auch von geringen Mengen von Cladosporium herbarum eine wesentliche Rolle spielen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids offenbart. Zunächst kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Polynukleotide und mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion ein Gen aus einem Schimmelpilz, bevorzugt aus Cladosporium herbarum, amplifiziert werden. Dieses Polynukleotid kann dann in einen geeigneten Vektor eingebaut werden, mit dem eine Wirtszelle transformiert wird. Geeignete Vektoren vermehren sich in der Wirtszelle und dabei werden die Polypeptide exprimiert. Bei den Wirtszellen kann es sich um übliche Wirtszellen handeln. In Frage kommen hierbei bakterielle Wirtszellen wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis oder Hefen wie beispielsweise Sacharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden IgE Immunblots von Rohextrakt aus Cladosporium herbarum mit 62 Patientenseren getestet. Hierbei zeigte sich ein immunreaktives Protein vom Molekulargewicht 29 kD, das von 61 % der Patientenseren erkannt wurde. Die Patienten waren im Hauttest bzw. Bluttest (RAST) vorselektioniert und reagierten positiv auf Cladosporium herbarum Extrakt. Kein anderes Allergen im Extrakt aus Cladosporium herbarum reagiert mit einer so großen Prozentzahl an Patientenseren. Es wird daher davon ausgegangen, daß dieses Protein das Hauptallergen von Cladosporium herbarum ist.
In der zweidimensionalen Auftrennung durch isoelektrische Fokussierung und SDS-PAGE wurde dieses Protein als ein Spot von 29 kD und dem isoelektrischen Punkt bei pH = 5.8 dargestellt.
Das Protein wurde in einem konventionellen Verfahren (Beispiel 1) zur Homogenität gereinigt. Die Ausbeute war 1 mg. Das homogen gereinigte Protein wurde nun im IgE-Immunblot mit einem Pool von sechs Patienten getestet und war stark positiv (Beispiel 2).
Das zur Homogenität gereinigte Protein wurde durch automatisierten Edman-Abbau N-terminal ansequenziert und interne Peptidsequenzen wurden nach CNBr Abbau ermittelt.
N-terminale und interne Peptidsequenzen nach Trypsinverdau wurden durch Edman-Abbau von etwa 50 μg Protein ermittelt, die durch Ausschneiden eines Spots aus der zweidimensionalen Elektrophorese gewonnen wurden.
Tabelle 1 zeigt eine Liste aller ermittelten Peptidsequenzen. Es wurde der "single letter code" verwendet. Die in Tabelle 1 schwarz unterlegten Aminosäuren konnten in der Sequenz der Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium fulvum aufgefunden werden.
Peptidseguenzen der NADP-abhängigen Mannit-Dehydrogenase von C. herbarum N-terminale Sequenz
Die Peptidsequenzen wurden durch computergestützte Homologiesuche mit allen in den Datenbanken (Swissprot, Genbank u.a.) aufgelisteten Proteinsequenzen verglichen. Alle Peptide zeigten Homologie zur Familie der Mannit-Dehydrogenasen. Die Mannit-Dehydrogenase, zu der die Peptide die höchste Sequenzähnlichkeit aufweisen, ist die Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium fulvum. Die Position dieser Peptide in der Sequenz sind in dem "alignment" (Tabelle 2) sichtbar.
Protein-Alignment der NADP-MtDH von C. fulvum mit Peptidsequenzen von C. herbarum
Tabelle 2
In Tabelle 2 ist die Anordnung der Polypeptide mit den Seq.ID Nr. 4, 5, und 6 anhand der Homologie mit C.fulvum gezeigt.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Enzymaktivität des zur Homogenität gereinigten Proteins geprüft. Die Experimente ergeben, dass das hochgereinigte Hauptallergen von Cladosporium herbarum tatsächlich eine Mannit-Dehydrogenase ist, die die folgende Stoffwechselreaktion katalysiert: Fructose + NADPH + H⁺ ⇔ Mannit + NADP⁺. Ferner wurde gefunden, dass NADH als Co-substrat nicht aktiv ist und dass auch Fructose-6-Phosphat als Substrat nicht aktiv ist. Fructose-6-Phosphat wirkt auf die Reaktion als Inhibitor. Die Methode der Aktivitätsbestimmung ist in Beispiel 3 beschrieben.
Es wurden nunmehr die N-terminale und eine interne Peptidsequenz der Mannit-Dehydrogenase von Cladosporium herbarum benützt, um durch Rückübersetzung PCR-primer zu entwerfen. Die Auswahl der Primer ist in Tabelle 3 zusammengefaßt.
DNA-Sequenz der von den Peptiden abgeleiteten Oligos
Oligo 1:

– abgeleitet von der N-terminalen Sequenz der Mannit-Dehydrogenase (MtDH) von C. herbarum (siehe Seq.ID Nr. 2)
– Oligosequenz: 5'CA(A/G) CA(A/G) GC(I/C) AC(I/C) AA(A/G) CA(C/T) GA 3'

Oligo 2:

– abgeleitet von Peptid 4 der MtDH von C. herbarum
– Oligosequenz: 5' AC(A/G) AA(A/G) TC(A/G) CT(I/C) AG(I/C) CC(A/G) GT(A/G) TC 3'

Die Primer sind Gemische von synthetischen Oligonukleotiden.
(A/G)... bedeutet, daß an dieser Stelle sowohl Adenin als auch Guanin in den Oligonukleotiden vorkommen. Ebenso bei (C/T) und (I/C), wobei I für die Base Inosin steht.
Tabelle 3
Mit diesen in Tabelle 3 gezeigten Primern wurde eine PCR-Reaktion mit DNA einer von den Erfindern konstruierten cDNA-Bank aus Cladosporium herbarum (Achatz G et al., 1995, Mol. Immunol., 32; 213-27) durchgeführt. Das Ergebnis war eine Bande von 636 bp. Diese wurde durch automatisierte DNA-Sequenzierung nach Sanger (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-7) unter Verwendung der PCR-Primer als Sequenzierungsprimer sequenziert. Dabei wurde Seq.ID Nr. 2 ermittelt. Die von dieser DNA-Sequenz abgeleitete Proteinsequenz (Seq.ID Nr. 1) ist zu 87 identisch mit der Proteinsequenz der Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium fulvum. Zieht man auch die Substitution durch chemisch verwandte Aminosäuren (zB. I–V, Isoleucin – Valin etc.) in Betracht, so erhöht sich dieser Wert auf 92 %. Unter der plausiblen Annahme, dass die Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium herbarum ebenso wie die Mannit-Dehydrogenase aus Cladosporium fulvum eine Gesamtlänge von 267 Aminosäuren aufweist, wurde durch Peptidsequenzierung einerseits und durch DNA-Sequenzierung andererseits bereits 65 % der Aminosäuresequenz des Hauptallergens (Mannit-Dehydrogenase) aus Cladosporium herbarum bestimmt. Die gesamte bisher bekannte Sequenz dieses Proteins und ihr Alignment mit der homologen Sequenz aus Cladosporium fulvum ist in 2 dargestellt.
Beispiel 1
Proteinreinigung
1. Ammoniumsulfatfällung:
Durch eine Ammoniumsulfatkonzentration von 50 % kann eine Vorfraktionierung erreicht werden, wobei Mannit-Dehydrogenase (MtDH) im Überstand verbleibt.
Dem Extrakt wurden 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 zugesetzt. Proteasen wurden mit 1 Tablette Roche Complete je 100 ml Extrakt und 2 m M EDTA inhibiert.
Die Fällung erfolgte durch Zugabe vor festem, gemahlenem Ammoniumsulfat und wurde in zwei Schritten durchgeführt, zuerst 0-30 %, anschließend 30-50 %. Die Fällung wurde für mind. 45 min., äquilibriert, bevor der Extrakt be 12 000g zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde filtriert und über die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) weitergereinigt.
2. HIC (Phenylsepharose):
Der Überstand von der Ammoniumsulfatfällung wurde mit 3 M Natriumacetat auf pH 6.5 eingestellt. Die Säule (8 ml Source 15 PHE, PHARMACIA) wurde mit 1,2 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA äquilibriert und bei einer Durchflußrate von 1 ml/min mit der Probe beladen. Nach Waschen der Säule mit 20 ml Puffer wurde mit einem Gradienten über 40 ml von 1,2 M Ammoniumsulfat bis 0,6 1 A Ammoniumsufat eluiert.
Die Mannit-Dehydrogenase (MtDH)-Fraktionen wurden gepoolt und für den Anionentauscher vorbereitet. Das Volumen wird über Centricon-Zentrifugenröhrchen (Millipore) eingeengt; Pufferaustausch gegen 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 mit Hilfe von PD-10 Desalting Columns (AMERSHAM-PHARMACIA).
3. Anionentauscher (Q-Sepharose):
Die Säule (8 ml Source 15 Q, PHARMACIA) wurde mit 15 mM Tris-HCl, pH 7.5 äquilibriert. Eluiert wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0-300 mM über 100 ml.
Beispiel 2
Immunblot der nativ gereinigten MtDH nach Auftrennung im SDS-Gel
Nativ gereinigte MtDH wurde in einem reduzierenden SDS-Gel (Laemmli UK, Nature, 1970; 27:680-5) nach dem Molekulargewicht aufgetrennt. Das Protein wurde anschließend in einem Western Blot (Towbin H et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1979; 76: 4350-4) auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach der Absättigung freier Bindungsstellen (30 min in Blockingpuffer: 50 mM Na-phosphat pH 7.5, 0,5 % Tween20, 0.5 % BSA, 0.05 % NaN₃), erfolgte die Inkubation der Membran mit Patientenserum (1:10 verdünnt in Blockingpuffer). Dann wurde die Membran (3×10 min mit Blockingpuffer) zur Entfernung unspezifisch gebundener Antikörper gewaschen. Der Nachweis spezifisch gebundener IgE-Ak erfolgte mit Hilfe eines ¹²⁵J-markierten rabbit-anti-human IgE Antikörpers. Nach Exponierung der Membran auf einem Röntgenfilm konnte das Ergebnis abgelesen werden.
Ergebnisse:

1) Die nativ gereinigte MtDH reagiert spezifisch mit den IgE-Antikörpern von C. herbarum Allergikern. Es zeigt sich eine prominente IgE-reaktive Bande bei 29kD.
2) Dasselbe Resultat, nämlich eine prominente IgE-reaktive Bande bei 29kD, erhält man, wenn ein C. herbarum Gesamtextrakt im SDS-Gel aufgetrennt und anschließend im Immunblot mit Patientenserum inkubiert wird.

Beispiel 3
Immunblot der nativ gereinigten MtDH nach 2 dimensionaler Auftrennung
Nativ gereinigte MtDH wurde unter denaturierenden Bedingungen in einer Isoelektrischen Fokusierung (O'Farrel PH, J. Biol. Chem., 1975; 250: 4007-21) entsprechend der Nettoladung (isoelektrischer Punkt) des Proteins aufgetrennt. Im Anschluß daran wurde das so aufgetrennte Protein einer SDS-Gelelektrophorese (Laemmli UK, Nature, 1970; 27:680-5) unterzogen, wodurch zusätzlich eine Auftrennung nach dem Molekulargewicht erfolgte. Das Protein wurde in einem Western Blot (Towbin H et aI., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1979; 76: 4350-4) auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach der Absättigung freier Bindungsstellen (30min in Blockingpuffer: 50mM Na-phosphat pH 7.5, 0,5 % Tween 20, 0.5 % BSA, 0.05 % NaN₃), erfolgte die Inkubation der Membran mit Patientenserum (1:10 verdünnt in Blockingpuffer). Anschließend wurde die Membran (3×10 min mit Blockingpuffer) zur Entfernung unspezifisch gebundener Antikörper gewaschen. Der Nachweis spezifisch gebundener IgE-Ak erfolgte mit Hilfe eines ¹ ²⁵J-markierten rabbit-anti-human IgE Antikörpers. Nach Exponierung der Membran auf einem Röntgenfilm konnten folgende Ergebnisse erkannt werden:
Ergebnisse:

1) Die nativ gereinigte MtDH reagiert spezifisch mit den IgE-Antikörpern von C. herbarum Allergikern. Beobachtet wurde ein prominenter IgE-reaktiver Spot bei einem Molekulargewicht von 29 kD und einem isoelektrischen Punkt von 5,8.
2) Dasselbe Resultat, nämlich einen prominenten IgE-reaktiven Spot bei einem Molekulargewicht von 29 kD und einem isoelektrischen Punkt von 5.8, erhält man, wenn ein C. herbarum Gesamtextrakt im zweidimensionalen Gel aufgetrennt und anschließend im Immunblot mit Patientenserum inkubiert wird. Zusätzlich findet man im Gesamtextrakt ein IgE-reaktives Protein mit einem Molekulargewicht von 29 kD und einem isoelektrischen Punkt von 5.6. Dieses Protein könnte eine Isoform der MtDH darstellen.

Beispiel 4
Zum Beleg der erfindungsgemäßen Ergebnisse wurde eine Bestimmung der Enzymaktivität mit dem herkömmlich gereinigten Protein durchgeführt. Die Messung der Absorption von NADPH erfolgte bei 340 nm im Photometer.
Reaktionsansatz (1 ml):
50 mM Tris-HCl, pH 7.5
0,25 mM NADPH bzw. NADH
D-Fructose bzw. Fructose-6-phosphat (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 M)
ad 1 ml H₂O
Start der Reaktion mit 0,5 ul Cla h1
Ergebnisse:

Reaktion mit Fructose und NADPH.
Keine Reaktion mit Fructose-6-Phosphat und NADH

Beispiel 5
Sequenz der Mannitdehydrogenase (MtDH)
Die vollständige Sequenz der Mannitdehydrogenase aus Cladosporium herbarum wurde ermittelt wie im folgenden beschrieben.
Die durch Edman Abbau der zur Homogenität gereinigten Mannitdehydrogenase aus Cladosporium erhaltenen Peptidsequenzen wurden benützt, um Primer-Gemische für die PCR zu synthetisieren. PCR ergab eine Bande von 636 nt, die einerseits sequenziert und andererseits als Hybridisierungsprobe zum Screenen unserer cDNA Bank benützt wurde. Es wurde ein vollständiger Klon von Cladosporium herbarum Mannitdehydrogenase (MtDH) isoliert und sequenziert. Die vollständige Sequenz ist in 3 gezeigt und ist zu 84% identisch mit der publizierten Sequenz der MtDH von C. fulvum.
Tabelle 4 zeigt das Sequenzalignment der beiden Mannitdehydrogenasen von Cladosporium herbarum und Cladosporium fulvum, wobei nur die unterschiedlichen Aminosäuren dargestellt sind.
Tab. 4: Vergleich der Aminosäuresequenzen der MtDHs von C. herbarum und C. fulvum:
Schwarz unterlegt bedeutet identische Aminosäuresequenz, grau unterlegt sind chemische ähnliche Aminosäuren und unterschiedliche Aminosäuren sind ohne Hinterlegung dargestellt.
Die Sequenz von C. fulvum ist als Seq ID NO:9 und die Aminosäuresequenz von C. herbarum ist als SEQ ID NO: 10 wiedergegeben.
Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, welche Bereiche des Polypeptids sich eventuell für den Nachweis oder einen Impfstoff für Cladosporium eignen. Hierbei handelt es sich um die Bereiche, die keine Unterschiede aufweisen.
Bei den Bereichen, die starke Unterschiede aufweisen, ist davon auszugehen, dass die immunologischen Reaktionen unterschiedlich ausfallen, daher können solche Bereiche hochspezifische Epitope beinhalten.
Bei der Ermittlung der in 3 wiedergegebenen Sequenz wurde festgestellt, dass geringfügige Unterschiede in der Nukleotidsequenz, verglichen mit den anfangs isolierten Teilsequenzen auftraten. Dies kann auf unterschiedliche Sequenzen zurückzuführen sein, die sich in der Genbank befanden. Diese Unterschiede ändern aber nichts an der vorliegenden Erfindung. Gegenstand der Erfindung sind die offenbarten unterschiedlichen Sequenzen, da davon ausgegangen wird, dass es sich hierbei um Varianten des Gens handelt.
Beispiel 6
Expression in E. coli und Reaktivität mit Patientenserum.
Der offene Leserahmen der MtDH wurde in folgende Expressionsvektoren hineinkloniert:

a) pHis-Parallel 2 Vektor (XhoI/BamHI) (Ref.: P. Sheffield, S. Garrard, and Z. Derewenda (1999). Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expr Purif 15, 34.)
b) pMW172 Vektor (NdeI/EcoRI) (Ref.: M. Susani, P. Jertschin, C. Dolecek. W. R. Sperr, P. Valent, C. Ebner, D. Kraft, R. Valenta, and O. Scheinet (1995). High level expression of birch pollen profilin (Bet v 2) in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant allergen. Biochem Biophys Res Commun 215, 250.)

Die Plasmide wurden anschließend in den Escherichia coli Stamm BL21 (D3) transformiert. Für die darauffolgende Induktion wurden je 5ml LBamp mit 5Oμl einer stationären Übernachtkultur der zwei Klone angeimpft und bei 37°C solange geschüttelt, bis ein OD₆₀₀ von 0,8 erreicht war (ca. 4h). Die Induktion der Proteinexpression erfolgte mit 0,8 mM IPTG. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37°C im Schüttelinkubator wurden die E. coli-Suspensionen 15 min. bei 4000 rpm abzentrifugiert. Die Bakterienpellets wurden anschließend in 1ml 1×PBS resuspendiert und je 6μl der gelösten Bakterienpellets mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit Coomassie BBR250 gefärbt. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten: Die mit den Expressionsplasmiden transformierten und mit IPTG induzierten E, coli Zellen, nicht aber die E. coli Zellen ohne Plasmid zeigen eine starke Proteinbande beim jeweils erwarteten Molekulargewicht, nämlich 30 kD, bzw. etwa 33 kD (apparent molecular weight).
Mit den mit Hilfe eines Gels aufgetrennten Polypeptiden wurde ein IgE-Immunblot durchgeführt. Verwendet wurde Serum eines Cladosporium-positiven Allergikers. Der Nachweis der gebundenen IgE-Antikörper erfolgte mit dem ¹ ²⁵Jod markierten rabbit-anti-human-IgE-Antikörper (RAST). Die beiden in E. coli überexprimierten Fremdproteine reagieren stark mit dem IgE des Patienten, nicht aber die Proteine von E. coli selbst.
Beispiel 7
Ermittlung der Häufigkeit der Reaktion gegen rekombinante MtDH mit Hilfe von 30 Seren von Cladosporium-positiven Allergikern.
Der in Beispiel 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei aber 30 verschiedene Cladosporium-positive nicht vorselektierte Allergikerseren verwendet wurden. Die Kontrolle zeigte eine sehr schwache Immunreaktivität des E. coli Extraktes mit dem zweiten Antikörper (RAST). Dies ist vermutlich auf ein Artefakt zurückzuführen. Andere Kontrollen waren wie erwartet negativ.
Von 30 Patienten zeigten 20 eine IgE-positive Bande bei 30 kD die stärker war als die schwache Bande im Kontrollversuch. Somit wird MtDH von etwa zwei Drittel der Cladosporium-positiven Allergiker erkannt. Dieser Befund ist wichtig, weil durch diesen Versuch gezeigt wird, dass rekombinante Cladosporium herbarum MtDH als Diagnostikum und Therapeutikum für einen Großteil der Patienten einsetzbar ist. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 11 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz mit der Sequenz ID Nr. 1 oder der Sequenz ID Nr. 8 oder eine Sequenz ausgewählt aus Seq.ID Nr. 4, 5 und 6 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Epitop aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop spezifisch ist für einen Schimmelpilz.
Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Schimmelpilz zu der Gattung Cladosporium gehört.
Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Schimmelpilz um Cladosporium herbarum handelt.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz mit der Sequenz ID Nr. 1 oder der Sequenz ID Nr. 8 für eine Mannit-Dehydrogenase kodiert.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Sequenz ID Nr. 1 oder der Sequenz ID Nr. 8 aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Sequenz ID Nr. 1 oder der Sequenz Nr. 8 aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Sequenz ID Nr. 1 oder der Sequenz Nr. 8 aufweist.
Impfstoff zur Desensibilisierung von Patienten gegen eine Schimmelpilzallergie, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Impfstoffes.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum diagnostischen Nachweis einer Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Erkrankung um eine Allergie handelt.
Polynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens acht aufeinanderfolgende Nukleotide aus der Nukleotidsequenz mit der Sequenz ID Nr. 2 oder der Sequenz ID Nr. 7 aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 12 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 20 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 50 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 100 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist.
Verwendung eines Nukleotids nach einem der Ansprüche 14 bis 18 zum Nachweis einer Mannit-Dehydrogenase.
Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Mannit-Dehydrogenase aus einem Schimmelpilz handelt.
Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Schimmelpilz um Cladosporium herbarum handelt.
Verwendung eines Nukleotids nach einem der Ansprüche 14 bis 18 zur Herstellung einer Nukleinsäuresequenz kodierend für wenigstens einen Teil einer Mannit-Dehydrogenase.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 14 bis 18 in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) eingesetzt wird.
Vektor zur Transformation einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 14 bis 18 beinhaltet.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor gemäß Anspruch 24 transformiert wurde.
Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Escherichia coli handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Pichia pastoris handelt.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 25 bis 27 angezogen wird, wobei das Polypeptid exprimiert und gereinigt wird.