CN115644169A - 一种nk细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种NK细胞冻存液及冻存方法，属于生物医学技术领域。本发明的NK细胞冻存液由冻存液A和冻存液B组成；所述冻存液A包括以下组分：人血清白蛋白、右旋糖酐和海藻糖；所述冻存液B包括以下组分：忍冬提取物、551‑H3培养基、培养上清浓缩液、羟乙基淀粉和甘油。本发明通过对NK细胞冻存液中各组分的种类及含量的筛选，使最终制备得到的NK细胞冻存液能够有效的保护细胞免受损伤，并且在冻存和复苏过程中维持细胞的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种NK细胞冻存液及冻存方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
随着再生医学的发展，细胞治疗得到越来越多关注。过继性免疫细胞治疗也相继出现了各种不同类型的细胞，如T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤浸润性T细胞、树突状细胞(DC)-CIK细胞、CAR-T、CAR-NK细胞等。低温冷冻保存是细胞治疗技术中的一项关键技术。免疫细胞在室温下，由于细胞内部代谢产生大量代谢产物导致细胞内环境发生变化，造成细胞死亡。而在生物在低温条件下，生物样本内的酶活性受到抑制，化学反应减慢到近乎停滞，理论上可实现生物样本在低温下的长期保存。但由于冻存方案的不同，低温保存的效果也参差不齐，现阶段生物样本库行业处于快速发展时期，迫切需要成熟的冻存体系方案，以改善细胞冻存质量，为细胞治疗提供保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞冻存液及冻存方法，本发明通过对NK细胞冻存液中各组分的种类及含量的筛选，使最终制备得到的NK细胞冻存液能够有效的保护细胞免受损伤，并且在冻存和复苏过程中维持细胞的活性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种NK细胞冻存液，由冻存液A和冻存液B组成；所述冻存液A包括以下组分：人血清白蛋白、右旋糖酐和海藻糖；所述冻存液B包括以下组分：忍冬提取物、551-H3培养基、培养上清浓缩液、羟乙基淀粉和甘油。目前对于免疫细胞的冻存大多数使用经典冷冻方法，即使用胎牛血清、DMSO等将生物样本进行预处理，并以1℃/min的速度缓慢降温至-80℃，再转移至液氮中长期保存，这种方法对细胞损伤及毒性较大，影响细胞的后续应用。本申请发明人经过大量的实验发现，采用渗透性冷冻保护剂甘油替代二甲基亚砜，甘油无色、无臭、外观呈澄明粘稠液态，对细胞无毒害作用，且在冷冻和脱水过程中甘油溶质通过氢键和离子键对水和细胞产生的亲和力来稳定细胞成分的构型避免水结冰产生冰晶损伤细胞；在冻存液中添加培养上清浓缩液，由于培养上清浓缩液中含有各种细胞因子，能够维持细胞冻存中和复苏后的细胞活性，无添加异源蛋白；在冻存液中添加海藻糖，海藻糖是一种典型应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征，同时，海藻糖还能用于保护生物体内DNA分子防止放射线引起的损伤，海藻糖与膜脂质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替膜结合水的功用，从而防止生物体膜和膜蛋白的变性等，增强了细胞水合作用和氢键形成，抑制冰晶形成，形成一种玻璃基质以减弱代谢活动，抑制冰晶对细胞体的损伤；在冻存液中添加忍冬提取物，忍冬提取物含有绿原酸、木犀草素、忍冬素、忍冬苷，其适应性强，耐旱耐冻，可耐零下30℃低温，低温下生理活动减弱，且具有加强免疫机能作用，能促进免疫细胞的吞噬功能，调节冻存后免疫细胞的杀伤活性，维持细胞复苏后杀伤受体处于高水平状态。
作为本发明所述NK细胞冻存液的优选实施方式，所述冻存液A包括以下体积百分比的组分：人血清白蛋白30～60％、右旋糖酐10～30％和海藻糖25～45％；所述冻存液B包括以下体积百分比的组分：忍冬提取物5～10％、551-H3培养基45～50％、培养上清浓缩液4～6％、羟乙基淀粉18～20％％和甘油21～25％。本申请发明人经过大量的实验发现，当采用上述含量的组分配制NK细胞冻存液时，能保护细胞免受损伤，维持并保证细胞在复苏后的活性。
作为本发明所述NK细胞冻存液的优选实施方式，所述冻存液A和冻存液B的体积比为1：1。
作为本发明所述NK细胞冻存液的优选实施方式，所述培养上清浓缩液的制备方法为：将单个核细胞培养12～14天，离心、过滤、收集上清液，并经过浓缩得所述培养上清浓缩液。
作为本发明所述NK细胞冻存液的优选实施方式，所述浓缩倍数为6～8倍。
本发明还提供一种NK细胞的冻存方法，采用所述NK细胞冻存液对NK细胞进行冻存。
作为本发明所述NK细胞的冻存方法的优选实施方式，所述NK细胞的冻存方法包括以下步骤：
(1)配制冻存液A并置于4℃预冷，配制冻存液B置于-20℃预冷15min；
(2)将冻存液A加入细胞沉淀中，混匀，再滴加冻存液B，混匀得细胞悬液，计算细胞密度；
(3)将细胞悬液分装于冻存管中并进行程序降温。
作为本发明所述NK细胞的冻存方法的优选实施方式，所述步骤(3)中的细胞密度为1*108/ml。
本发明还提供所述NK细胞冻存液在冷冻保存NK细胞中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种NK细胞冻存液及冻存方法。本发明的NK细胞冻存液添加培养上清浓缩液，培养上清浓缩液中含有各种细胞因子，能够维持细胞冻存中和复苏后的细胞活性，无添加异源蛋白，避免外源蛋白给细胞带来的污染，同时将生物废料加以应用，大大节省了冻存成本；本发明的NK细胞冻存液添加海藻糖和忍冬提取物，能够抑制细胞冻存过程中由于温度的传导不均匀导致的冰晶的产生，减少冰晶对细胞的伤害，同时调节冻存后免疫细胞的杀伤活性，维持细胞复苏后杀伤受体处于高水平状态；本发明的NK细胞冻存液添加甘油，在冷冻和脱水过程中甘油溶质通过氢键和离子键对水和细胞产生的亲和力来稳定细胞成分的构型避免水结冰产生冰晶损伤细胞，避免对细胞有毒性的DMSO的添加，同时由于甘油无毒，细胞复苏后可无需洗涤离心即可培养或应用，简化了复苏后操作步骤，减少离心洗涤对细胞的损伤及细胞丢失；本发明的NK细胞冻存方法可满足高密度冻存，降低成本的同时最大程度维持细胞冻存及复苏后的活性。
附图说明
图1为实施例1～3、对比例1～9的细胞复苏后的增值情况图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1～3、对比例1～9
本发明实施例1～3、对比例1～9的NK细胞冻存液中各组分的含量如表1所示。
表1
上述NK细胞冻存液中培养上清浓缩液的制备方法为：
(1)前期培养:将单个核细胞(密度为2×107)采用NK细胞无血清培养液、自体血浆、IL-2和IL-15，在T-75培养瓶中混合，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；第3天离心换液：500g离心5min后将细胞于NK细胞无血清培养液、自体血浆继续培养；第4-6天每天观察细胞：根据细胞悬液颜色或细胞量添加培养液，每次添加体积不宜超过现有体积一倍。加液时按5％的自体血浆加入NK细胞培养液；第7天计数：添加IL-2和IL-15；加液使细胞浓度高于1.0×106Cells/mL；当培养液体积大于300mL则转移至培养袋培养；第8-11天每天观察或计数：根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，通过计数添加培养液(之后按1％添加自体血浆)，使得细胞浓度高于1.0×106Cells/mL；第12-14天每天观察或计数：根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，使得细胞浓度低于2.0×106Cells/mL。当细胞生长至所需数量时即进行收集冻存，离心收集细胞沉淀，上清液放置4℃备用。
(2)培养液浓缩：将上述离心得到的上清液加15ml培养液至3kd/10kd膜切割分子量的超滤离心管中各5管，5000g离心20min，每管收集200ul浓缩液，共2ml浓缩液，存放至4℃冰箱备用。
效果例
1、分别采用实施例1～3、对比例1～9的NK细胞冻存液进行NK细胞冻存，具体包括以下步骤：
(1)将冻存液A置于4℃预冷，将冻存液B置于-20℃预冷15min；
(2)采用上述实施例的前期培养方法制备得到NK细胞沉淀，将冻存液A加入细胞沉淀中，缓慢混匀细胞沉淀，再缓慢滴加冻存液B，边滴加边摇晃，混匀得细胞悬液，调整细胞浓度为1*108/ml；
(3)将细胞悬液分装于冻存管中并放置-80℃超低温冰箱，放置过夜，隔天转移至-196℃液氮罐中。
2、将上述冻存后的细胞进行解冻，包括对细胞进行洗涤和不进行洗涤：
(1)冻存后细胞复苏洗涤：将551-H3培养基放置37℃水浴锅预热，备用；从液氮罐中取出NK细胞，立即放置37℃水浴锅中，快速摇晃使细胞悬液在1min内融化，用75％酒精喷洒擦拭冻存管，传入安全柜内；将预热后的培养基转入离心管中，551-H3培养基：细胞悬液为10:1，吸出细胞悬液缓慢滴加至551-H3培养基中，混匀，1500rpm，5min；废弃上清，加入预热的551-H3培养基重悬细胞，计数及检测细胞活率，调整密度放置37℃CO2培养箱中培养。
(2)冻存后细胞复苏(不洗涤)：将551-H3培养基放置37℃水浴锅预热，备用；准备好生物安全柜；从液氮罐中取出NK细胞，立即放置37℃水浴锅中，快速摇晃使细胞悬液在1min内融化，用75％酒精喷洒擦拭冻存管，传入安全柜内；将复苏的细胞悬液加至已有551-H3的培养基中混匀，取样计数及活率，调整密度，放置37℃，CO2培养箱中培养。
3、分别检测实施例1～3、对比例1～9的细胞复苏后的活率及表型、及复苏后0h/12h/24h/36h/48h/60h/72h增殖情况，结果如表2～表3、图1所示。
细胞活率检测方法：用移液枪吸取20ul染料，置1.5mL EP管中，备用；将待测样品置于旋涡振荡器上，振荡10秒，用移液枪轻轻吹打10次，混合均匀，从中部吸取20μL，置上述备用EP管中；用移液枪轻轻吹打10次，混合均匀，从中部吸取20μL，缓慢加入计数板中，按细胞计数仪操作规程进行检测。
细胞表型检测方法：将三倍体积的生理盐水，室温1500rpm离心5min，弃上清，加入三倍体积生理盐水重悬，室温1500rpm离心5min，生理盐水重悬，调整细胞密度为3*105/mL；设置空白对照组，不加抗体，待测组加入FITC-CD3/APC-CD56、FITC-CD3/APC-CD16各5μL，吹打均匀后，置于室温孵育15min；孵育后每管加入三倍体积的生理盐水，室温1500rpm离心5min；弃上清，用200μL PBS重悬细胞沉淀，均匀吹打；上机检测，用空白组细胞调节电压及设门，之后进行待测管检测。
表2
表3
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种NK细胞冻存液，其特征在于，由冻存液A和冻存液B组成；所述冻存液A包括以下组分：人血清白蛋白、右旋糖酐和海藻糖；所述冻存液B包括以下组分：忍冬提取物、551-H3培养基、培养上清浓缩液、羟乙基淀粉和甘油。
2.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液A包括以下体积百分比的组分：人血清白蛋白30～60％、右旋糖酐10～30％和海藻糖25～45％；所述冻存液B包括以下体积百分比的组分：忍冬提取物5～10％、551-H3培养基45～50％、培养上清浓缩液4～6％、羟乙基淀粉18～20％％和甘油21～25％。
3.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液A和冻存液B的体积比为1：1。
4.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述培养上清浓缩液的制备方法为：将单个核细胞培养12～14天，离心、过滤、收集上清液，并经过浓缩得所述培养上清浓缩液。
5.根据权利要求3所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述浓缩倍数为6～8倍。
6.一种NK细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1～5任一项所述NK细胞冻存液对NK细胞进行冻存。
7.根据权利要求6所述NK细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制冻存液A并置于4℃预冷，配制冻存液B置于-20℃预冷15min；
(2)将冻存液A加入细胞沉淀中，混匀，再滴加冻存液B，混匀得细胞悬液，计算细胞密度；
(3)将细胞悬液分装于冻存管中并进行程序降温。
8.根据权利要求7所述NK细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤(3)中的细胞密度为1*108/ml。
9.权利要求1～5任一项所述NK细胞冻存液在冷冻保存NK细胞中的应用。
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