CN114431222A - 一种用于人神经干细胞的细胞冻存液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于人神经干细胞的细胞冻存液，由冻存液A和冻存液B组成，其中，冻存液A是由以下组分组成的：10％～30％白蛋白，4.0～8.0g/L葡萄糖，0.4～0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0～9.0g/L氯化钠等；冻存液B是由以下组分组成的：10％～20％二甲基亚砜，4.0～8.0g/L葡萄糖，0.4～0.8mg/L维生素B12等。本发明还提供了利用该冻存液冻存人神经干细胞的方法。本发明的细胞冻存液及冻存方法，不含血清，无动物源病原微生物污染风险，冻存效果优，复苏后细胞活率高，对细胞增殖及细胞功能特性无影响。本发明对人神经干细胞的冻存及研究具有重要意义。

Description

一种用于人神经干细胞的细胞冻存液
技术领域
本发明涉及一种用于人神经干细胞的细胞冻存液，属于细胞冻存技术领域。
背景技术
细胞冻存是细胞培养技术中的重要环节，在构建细胞库时，是必不可少的环节。细胞冻存液是细胞冻存时必须使用的一种保护液，其目的是将需要冻存的细胞与保护液充分混匀成细胞悬液，在细胞快速降温冻存过程中防止或减少冷冻过程中产生的冰晶对细胞的损伤。同时在细胞长期深低温储存过程中，可供给细胞生命代谢所需的营养物质。
目前常用的冻存液一般为培养基、血清及二甲基亚砜(DMSO)按照一定比例的混合，其缺点是：含有血清，会增加动物病原体污染的可能性。另外有研究表明，长期与血清接触的细胞会对血清有内吞，内吞后可能会引起细胞的某些蛋白表达发生变化。另外，常规的冻存液中DMSO的比例一般为10％，较高的DMSO浓度对细胞损伤较大。
神经干细胞(neural stem cell，NSC)是一类具有多方向分化潜能的干细胞，能够长期自我更新，且在一定条件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。对人神经干细胞冻存时，对细胞保护液要求较高，传统冻存液无法保证人神经干细胞长期储存后的细胞活性。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种用于人神经干细胞的不含血清的细胞冻存液，本发明还提供了其制备方法及应用。本发明还提供了一种人神经干细胞的冻存方法、复苏方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于人神经干细胞的细胞冻存液，由冻存液A和冻存液B组成，其中，冻存液A是由以下组分组成的：10％～30％白蛋白(重量体积比，单位g/ml)，4.0～8.0g/L葡萄糖，0.4～0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0～9.0g/L氯化钠，0.015～0.030g/L氯化镁，0.2～0.4g/L氯化钾，余量为水；冻存液B是由以下组分组成的：10％～20％二甲基亚砜(重量体积比，单位g/ml)，4.0～8.0g/L葡萄糖，0.4～0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0～9.0g/L氯化钠，0.015～0.030g/L氯化镁，0.2～0.4g/L氯化钾，余量为水。
优选的，所述冻存液A是由以下组分组成的：20％白蛋白，6.0g/L葡萄糖，0.6mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，7.5g/L氯化钠，0.025g/L氯化镁，0.3g/L氯化钾，余量为水。
优选的，所述冻存液B是由以下组分组成的：15％二甲基亚砜，6.0g/L葡萄糖，0.6mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，7.5g/L氯化钠，0.025g/L氯化镁，0.3g/L氯化钾，余量为水。
所述用于人神经干细胞的细胞冻存液的制备方法为：分别配制冻存液A和冻存液B；将各组分加入水(优选超纯水)中，混匀溶解，溶解过程中可用振荡器进行2～3min的震荡混匀，混匀后在超净工作台中采用0.22μm过滤器进行过滤，过滤完成后密封，置于4℃冰箱中保存，备用。
所述细胞冻存液在人神经干细胞的冻存中的应用。
一种人神经干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)制备人神经干细胞单细胞悬液：将在37℃、5％CO2环境中培养的悬浮神经干细胞球收集后，离心，弃去上清液，加入消化酶，37℃孵育15min；取出，轻吹至单细胞悬液后，用DMEM/F12稀释终止，终止后进行台盼蓝细胞计数及活率计算，离心，弃去上清液，得人神经干细胞单细胞悬液；
(2)冻存人神经干细胞细胞：将人神经干细胞单细胞悬液加入4℃预冷的冻存液A中，混匀，然后加入4℃预冷的冻存液B，混匀，冻存液A与冻存液B的体积比为1:0.8～1.2；混匀后，分装至冻存管，-80℃下冻存8～14h，然后转入液氮罐中长期储存。
进一步地，所述离心的条件为：400G，5min。
进一步地，所述冻存液中人神经干细胞的浓度为0.2×107～1.0×107个/ml。
进一步地，所述冻存液的pH值为7.0～8.0。
进一步地，对冻存液进行检测后再冻存，检测标准为：无细菌、真菌、无支原体，内毒素≤0.5IU/ml。
一种人神经干细胞的复苏方法，包括以下步骤：将利用上述方法冻存的人神经干细胞取出，10秒内放置入37～42℃水浴锅中，轻晃冻存管使冻存管内细胞受热均匀，待冻存管内细胞融化至米粒大小时取出(约1～2min)，放入超净工作台中，将冻存管内融化的细胞悬液用移液器轻轻转移至37℃的20ml DMEM/F12中，轻轻混匀，取10μl细胞悬液进行计数并计算其细胞活率，复苏后细胞活率大于80％，经过7～14天培养后可细胞功能性检测及微生物检测。
进一步地，保持冻存管管口处于水浴液面以上，防止水浴锅中液体经管口进入到冻存管内，造成细胞污染。
进一步地，将细胞加入DMEM/F12稀释液时，使用1ml移液器轻柔地将融化的细胞悬液逐滴加入至稀释液中，间或摇动稀释液使人神经干细胞均匀分布在稀释液中。
进一步地，细胞计数采用台盼蓝染色方法，使用倒置生物显微镜镜下记录细胞计数板四个象限内总细胞(T)及死细胞(D)数量，根据活细胞及死细胞数量，进行细胞活率计算及细胞量计算。计算公式如下：
活细胞率(％)＝[(T-D)/T]×100；
细胞总数＝T×104×V。
进一步地，细胞功能性检测包括流式细胞鉴定神经干细胞表面标记物Nestin、Musashi，荧光免疫的方法鉴定神经干细胞的分化特性，即神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞分化结果，异源物质主要是微生物的检测，包括无菌检测，支原体检测和内毒素检测，其结果阴性为合格。
本发明的细胞冻存液及冻存方法，不含血清，无动物源病原微生物污染风险，冻存效果优，复苏后细胞活率高，对细胞增殖及细胞功能特性无影响。本发明对人神经干细胞的冻存及研究具有重要意义。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1制备用于人神经干细胞的细胞冻存液
由冻存液A和冻存液B组成，其中，1L的冻存液A是由以下组分组成的：20％白蛋白，6.0g/L葡萄糖，0.6mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，7.5g/L氯化钠，0.025g/L氯化镁，0.3g/L氯化钾，余量为水。
1L的冻存液B是由以下组分组成的：15％二甲基亚砜，6.0g/L葡萄糖，0.6mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，7.5g/L氯化钠，0.025g/L氯化镁，0.3g/L氯化钾，余量为水。
细胞冻存液的制备方法为：分别配制冻存液A和冻存液B；将各组分加入超纯水中，混匀溶解，溶解过程中用振荡器进行2～3min的震荡混匀，混匀后在超净工作台中采用0.22μm过滤器进行过滤，过滤完成后密封，置于4℃冰箱中保存，备用。
实施例2制备用于人神经干细胞的细胞冻存液
由冻存液A和冻存液B组成，其中，冻存液A是由以下组分组成的：10％白蛋白，8.0g/L葡萄糖，0.4mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，9.0g/L氯化钠，0.015g/L氯化镁，0.4g/L氯化钾，余量为水。
冻存液B是由以下组分组成的：10％二甲基亚砜，8.0g/L葡萄糖，0.4mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，9.0g/L氯化钠，0.015g/L氯化镁，0.4g/L氯化钾，余量为水。
细胞冻存液的制备方法为：分别配制冻存液A和冻存液B；将各组分加入超纯水中，混匀溶解，溶解过程中用振荡器进行2～3min的震荡混匀，混匀后在超净工作台中采用0.22μm过滤器进行过滤，过滤完成后密封，置于4℃冰箱中保存，备用。
实施例3制备用于人神经干细胞的细胞冻存液
由冻存液A和冻存液B组成，其中，冻存液A是由以下组分组成的：30％白蛋白，4.0g/L葡萄糖，0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0g/L氯化钠，0.030g/L氯化镁，0.2g/L氯化钾，余量为水。
冻存液B是由以下组分组成的：20％二甲基亚砜，4.0g/L葡萄糖，0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0g/L氯化钠，0.030g/L氯化镁，0.2g/L氯化钾，余量为水。
细胞冻存液的制备方法为：分别配制冻存液A和冻存液B；将各组分加入超纯水中，混匀溶解，溶解过程中用振荡器进行2～3min的震荡混匀，混匀后在超净工作台中采用0.22μm过滤器进行过滤，过滤完成后密封，置于4℃冰箱中保存，备用。
实施例4人神经干细胞的冻存
步骤如下：
(1)制备人神经干细胞单细胞悬液：将在37℃、5％CO2环境中培养的悬浮神经干细胞球收集后，离心(400G，5min)，弃去上清液，加入消化酶，37℃孵育15min；取出，轻吹至单细胞悬液后，用DMEM/F12稀释终止，终止后进行台盼蓝细胞计数及活率计算，离心(400G，5min)，弃去上清液，得人神经干细胞单细胞悬液；
(2)冻存人神经干细胞细胞：将人神经干细胞单细胞悬液加入4℃预冷的冻存液A(实施例1制备)中，混匀，然后加入4℃预冷的冻存液B(实施例1制备)，混匀，冻存液A与冻存液B的体积比为1:1，人神经干细胞的浓度为0.5×107个/ml；混匀后，检测，检测标准为：无细菌、真菌、无支原体，内毒素≤0.5IU/ml；满足检测标准后，将冻存液分装至冻存管，-80℃下冻存12h，然后转入液氮罐中长期储存。
实施例5人神经干细胞的复苏
步骤如下：将实施例4冻存的人神经干细胞取出，10秒内放置入40℃水浴锅中，轻晃冻存管使冻存管内细胞受热均匀，待冻存管内细胞融化至米粒大小时取出(约2min)(保持冻存管管口处于水浴液面以上，防止水浴锅中液体经管口进入到冻存管内，造成细胞污染)，放入超净工作台中，将冻存管内融化的细胞悬液用移液器轻轻转移至37℃的20mlDMEM/F12中(使用1ml移液器轻柔地将融化的细胞悬液逐滴加入至稀释液中，间或摇动稀释液使人神经干细胞均匀分布在稀释液中)，轻轻混匀，取10μl细胞悬液进行计数并计算其细胞活率，复苏后细胞活率大于80％，经过7～14天培养后可细胞功能性检测及微生物检测。
细胞计数采用台盼蓝染色方法，使用倒置生物显微镜镜下记录细胞计数板四个象限内总细胞(T)及死细胞(D)数量，根据活细胞及死细胞数量，进行细胞活率计算及细胞量计算。
计算公式如下：
活细胞率(％)＝[(T-D)/T]×100；
细胞总数＝T×104×V。
细胞功能性检测包括流式细胞鉴定神经干细胞表面标记物Nestin、Musashi，荧光免疫的方法鉴定神经干细胞的分化特性，即神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞分化结果，异源物质主要是微生物的检测，包括无菌检测，支原体检测和内毒素检测，其结果阴性为合格。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种用于人神经干细胞的细胞冻存液，其特征在于：由冻存液A和冻存液B组成，其中，冻存液A是由以下组分组成的：10％～30％白蛋白，4.0～8.0g/L葡萄糖，0.4～0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0～9.0g/L氯化钠，0.015～0.030g/L氯化镁，0.2～0.4g/L氯化钾，余量为水；冻存液B是由以下组分组成的：10％～20％二甲基亚砜，4.0～8.0g/L葡萄糖，0.4～0.8mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，6.0～9.0g/L氯化钠，0.015～0.030g/L氯化镁，0.2～0.4g/L氯化钾，余量为水。
2.根据权利要求1所述的用于人神经干细胞的细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液A是由以下组分组成的：20％白蛋白，6.0g/L葡萄糖，0.6mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，7.5g/L氯化钠，0.025g/L氯化镁，0.3g/L氯化钾，余量为水。
3.根据权利要求1所述的用于人神经干细胞的细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液B是由以下组分组成的：15％二甲基亚砜，6.0g/L葡萄糖，0.6mg/L维生素B12，0.365mg/L谷氨酰胺，7.5g/L氯化钠，0.025g/L氯化镁，0.3g/L氯化钾，余量为水。
4.权利要求1～3中任一项所述的用于人神经干细胞的细胞冻存液的制备方法，其特征在于：分别配制冻存液A和冻存液B；将各组分加入水中，混匀溶解，溶解过程中可用振荡器进行2～3min的震荡混匀，混匀后在超净工作台中采用0.22μm过滤器进行过滤，过滤完成后密封，置于4℃冰箱中保存，备用。
5.权利要求1～3中任一项所述的细胞冻存液在人神经干细胞的冻存中的应用。
6.一种人神经干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备人神经干细胞单细胞悬液：将在37℃、5％CO2环境中培养的悬浮神经干细胞球收集后，离心，弃去上清液，加入消化酶，37℃孵育15min；取出，轻吹至单细胞悬液后，用DMEM/F12稀释终止，离心，弃去上清液，得人神经干细胞单细胞悬液；
(2)冻存人神经干细胞细胞：将人神经干细胞单细胞悬液加入4℃预冷的冻存液A中，混匀，然后加入4℃预冷的冻存液B，混匀，冻存液A与冻存液B的体积比为1:0.8～1.2；混匀后，分装至冻存管，-80℃下冻存8～14h，然后转入液氮罐中长期储存；
所述冻存液A、冻存液B如权利要求1～3中任一项所述的细胞冻存液。
7.根据权利要求6所述的人神经干细胞的冻存方法，其特征在于：所述离心的条件为：400G，5min；
和/或：所述冻存液中人神经干细胞的浓度为0.2×107～1.0×107个/ml；
和/或：所述冻存液的pH值为7.0～8.0；
和/或：对冻存液进行检测后再冻存，检测标准为：无细菌、真菌、无支原体，内毒素≤0.5IU/ml。
8.一种人神经干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：将利用权利要求6或7所述的冻存方法冻存的人神经干细胞取出，10秒内放置入37～42℃水浴锅中，轻晃冻存管使冻存管内细胞受热均匀，待冻存管内细胞融化至米粒大小时取出，放入超净工作台中，将冻存管内融化的细胞悬液用移液器轻轻转移至37℃的20ml DMEM/F12中，轻轻混匀。
9.根据权利要求8所述的人神经干细胞的复苏方法，其特征在于：轻轻混匀后，取10μl细胞悬液进行计数并计算其细胞活率，经过7～14天培养后进行细胞功能性检测及微生物检测。
10.根据权利要求8所述的人神经干细胞的复苏方法，其特征在于：将细胞加入DMEM/F12稀释液时，使用1ml移液器轻柔地将融化的细胞悬液逐滴加入至稀释液中，间或摇动稀释液使人神经干细胞均匀分布在稀释液中。
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