CN115974081A - 一种nk细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种nk细胞冻存液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115974081A CN115974081A CN202310061239.9A CN202310061239A CN115974081A CN 115974081 A CN115974081 A CN 115974081A CN 202310061239 A CN202310061239 A CN 202310061239A CN 115974081 A CN115974081 A CN 115974081A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- dextran
- solution
- cryopreservation solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 106
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims description 45
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 claims abstract description 19
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 claims abstract description 19
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 claims abstract description 19
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 52
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 22
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 20
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 20
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 63
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 9
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 9
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 9
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108091008043 NK cell inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术
NK细胞是以CD3-CD56+为标志的大颗粒淋巴细胞。作为免疫系统的重要组成部分，NK细胞在对抗病原体感染和肿瘤免疫监视中担任着哨兵和前线防御者的角色。与T、B细胞不同，NK细胞不表达基因重排的抗原特异性受体，而是依赖一系列种系基因编码的受体。正常组织细胞由于高表达MHCⅠ类分子,可与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族抑制性受体结合，传递抑制信号，从而免受NK细胞攻击；而感染或转化的细胞通常下调表达MHCⅠ类分子，尽管可以因此逃避MHCⅠ限制性T细胞的识别，但可减弱MHCⅠ类分子和NK细胞抑制性受体结合传递的抑制信号，使NK细胞激活并杀伤感染或转化的细胞。由于利用NK细胞在对肿瘤的生物治疗中显示了巨大的应用潜力，人们一直在寻找最优的扩增活化NK细胞的方法。
NK细胞的冷冻保存也是制约NK细胞应用的重要步骤。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，且缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。在不加保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，对细胞造成不可逆的永久损伤，甚至引起细胞死亡。
按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃～-80℃，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成，是目前细胞冻存最常用的一种方法。
现有的NK细胞冻存方法，复苏后存在细胞存活率降低、细胞活性低下等问题，NK细胞的临床应用需要能更好维持NK细胞活性的冻存方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种NK细胞冻存液，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。
本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。
优选地，所述人血白蛋白在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6-2％；例如0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述二甲基亚砜在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为5-10％；例如5％、6％、7％、8％、9％、10％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
冻存液中二甲基亚砜含量较低，更适合于NK细胞冻存的临床应用。
优选地，所述右旋糖酐在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6-1.5％；例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述聚乙二醇在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5-6.0mg/mL；例如0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、5.5mg/mL、6mg/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述维生素B12在所述NK细胞冻存液中的浓度为5-50ng/mL；例如5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在细胞冻存液中加入维生素B12，有助于提高细胞复苏后的存活率和杀伤靶细胞的能力。
当人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠以上述特定的浓度存在于冻存液中并进行配合时，具有更优的提高NK细胞复苏后的增殖和杀伤能力。
优选地，所述的NK细胞冻存液还包括木糖。
木糖的加入能够进一步提高细胞复苏后的增殖和杀伤能力，且木糖和维生素B12在上述效果上具有一定的协同作用。
优选的，所述木糖在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5-3mg/mL。
优选地，所述右旋糖酐选自右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的NK细胞冻存液的制备方法，所述制备方法为：将各制备原料进行物理混合，即得。
第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的NK细胞冻存液在NK细胞冻存中的应用。
优选地，所述应用的具体步骤包括：将NK细胞与第一方面所述的NK细胞冻存液混合后，降温，冻存。
优选地，所述冻存液中NK细胞的密度为(1×106)-(4×107)个/mL，例如1×106个/mL、2×106个/mL、3×106个/mL、4×106个/mL、5×106个/mL、6×106个/mL、7×106个/mL、8×106个/mL、9×106个/mL、1×107个/mL、2×107个/mL、3×107个/mL、4×107个/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述实施例、对比例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：
人血白蛋白来源于购自Instituto.Grifols公司的商品名为人血清白蛋白的产品；
聚乙二醇来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为聚乙二醇10000的产品；
右旋糖酐20来源于购自甘肃成纪生物药业有限公司的商品名为右旋糖酐20的产品；
右旋糖酐40来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为右旋糖酐40的产品；
右旋糖酐70来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为右旋糖酐70的产品；
维生素B12来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为维生素B12的产品；
DMEM基础培养基来源于购自Sigma Aldrich公司的商品名为DMEM培养基的产品；
胎牛血清来源于购自Gibco公司的商品名为胎牛血清的产品；
NK细胞培养基为购自康宁公司的商品名为KBM581培养基的产品；
Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒为购自APExBIO公司的商品名为CellCounting Kit-8(CCK-8)的产品。
实施例1
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 10ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法：将人血白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐40、聚乙二醇、维生素B12和0.9％氯化钠溶液进行物理混合。
实施例2
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白2％、二甲基亚砜6.5％、右旋糖酐40 1.5％、聚乙二醇5mg/mL、维生素B12 50ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例3
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白0.6％、二甲基亚砜8.8％、右旋糖酐70 0.6％、聚乙二醇1mg/mL、维生素B12 30ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例4
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1.5％、二甲基亚砜7％、右旋糖酐20 1.5％、聚乙二醇3mg/mL、维生素B12 40ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1.5％、二甲基亚砜7.5％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇4mg/mL、维生素B12 20ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 10ng/mL、木糖2mg/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 2ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1.3％、二甲基亚砜8.5％、右旋糖酐40 0.2％、聚乙二醇2mg/mL、维生素B12 10ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种NK细胞冻存液，包括以下成分：人血白蛋白1％、二甲基亚砜8％、右旋糖酐40 1％、聚乙二醇0.1mg/mL、维生素B12 10ng/mL、溶解介质为0.9％氯化钠溶液。
制备方法参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种NK细胞冻存液，其与实施例6的区别仅在于，将10ng/mL维生素B12替换为10ng/mL木糖，其他成分和含量保持不变。
制备方法参照实施例1。
对比例2
本对比例提供一种NK细胞冻存液，其与实施例1的区别仅在于，不含维生素B12，其他成分和含量保持不变。
制备方法参照实施例1。
对比例3
本对比例提供一种NK细胞冻存液，其以体积分数计包括以下成分：DMEM基础培养基70％、胎牛血清20％、二甲基亚砜10％。
其制备方法为：将二甲基亚砜、胎牛血清和DMEM基础培养基进行物理混合。
测试例1
检验不同细胞冻存液对NK细胞存活率的影响
NK细胞的扩增：采取志愿者的外周血，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，将5×106个外周血单个核细胞与5×106个IL-21滋养细胞共同培养，添加7.5mL NK细胞培养基，培养温度为37℃，在第7天向NK细胞培养基中添加1×107个IL-21滋养细胞，培养温度为37℃，添加7.5mL NK细胞培养基，在第10天收获细胞，其中98％为CD3-CD56+NK细胞。
NK细胞的冻存：使用NK细胞冻存液重悬NK细胞，使NK细胞的密度为2×107个/mL，1mL/支分装至细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于含有异丙醇的冻存盒，-80℃冻存18h后，将细胞冻存管转到液氮罐。
NK细胞的复苏：从液氮中取出细胞冻存管，37℃水浴中1min后，将NK细胞取出，按1:10的体积比加入0.9％氯化钠注射液，轻轻混合，在1000rpm条件下离心5min，除去上清。用1mL NK细胞培养基重悬NK细胞后，将NK细胞加入预热至37℃的20mL NK细胞培养基中，置于37℃、5％CO2的培养箱培养。
使用实施例1-9、对比例1-3所述的冻存液将NK细胞分别冻存1个月、6个月后，将冻存后的细胞复苏，复苏后的细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中20h后，使用台盼蓝染色方法检测细胞存活率，细胞存活率如表1所示。
表1
| 冻存前 | 冻存1个月 | 冻存6个月 | |
| 实施例1 | 97.1 | 91.0 | 85.5 |
| 实施例2 | 97.1 | 89.4 | 80.9 |
| 实施例3 | 97.1 | 90.3 | 81.3 |
| 实施例4 | 97.1 | 92.0 | 78.0 |
| 实施例5 | 97.1 | 90.7 | 82.6 |
| 实施例6 | 97.1 | 91.2 | 88.7 |
| 实施例7 | 97.1 | 90.3 | 76.8 |
| 实施例8 | 97.1 | 88.8 | 75.0 |
| 实施例9 | 97.1 | 87.6 | 73.7 |
| 对比例1 | 97.1 | 86.2 | 73.0 |
| 对比例2 | 97.1 | 84.5 | 70.9 |
| 对比例3 | 97.1 | 76.6 | 67.1 |
由表1数据可知，使用本发明涉及的NK细胞冻存液冻存细胞，提高了细胞的存活率，减少了NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，维生素B12和木糖在提高细胞的存活率上具有协同作用。
测试例2
检验不同细胞冻存液对NK细胞扩增活性的影响
使用实施例1-9，对比例1-3所述的细胞冻存液冻存NK细胞1个月后，进行细胞复苏，冻存和复苏的方式如测试例1所述。复苏后的细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养20h后，向培养液中添加5×106个IL-21滋养细胞和7.5mL培养液，8天后使用台盼蓝染色方法检测细胞数量和NK细胞纯度，结果见表2。
表2
由表2数据可知，使用本发明涉及的NK细胞冻存液冻存细胞，提高了细胞扩增倍数和NK细胞纯度，减少了NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，维生素B12和木糖在上述效果上具有协同作用。
测试例3
检验不同细胞冻存液对NK细胞杀伤活性的影响
使用实施例1-9和对比例1-3所述的细胞冻存液分别冻存NK细胞1个月，然后进行细胞复苏，复苏后的细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养20h后，将效靶比为10:1的NK细胞(效)和K562细胞(靶)加入96孔圆底板，50μL/孔。同时设靶细胞孔(仅有K562细胞)、效应细胞孔(仅有NK细胞)和空白(仅有NK细胞培养基)为对照，每种实验条件设3个复孔。将细胞混匀，置于37℃、5％ CO2的培养箱中分别培养4h、6h、12h后，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒进行检测，用酶标仪检测OD450 nm波长OD值。NK细胞杀伤率(％)＝[1-(效靶细胞孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞OD值]×100％，结果表3。
表3
由表3数据可知，使用本发明涉及的NK细胞冻存液冻存细胞，细胞复苏后具有良好的杀伤能力，维生素B12和木糖在提高细胞杀伤能力上具有协同作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明NK细胞冻存液及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种NK细胞冻存液，其特征在于，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。
2.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6-2％；
优选地，所述二甲基亚砜在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为5-10％；
优选地，所述右旋糖酐在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6-1.5％。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述聚乙二醇在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5-6.0mg/mL；
优选地，所述维生素B12在所述NK细胞冻存液中的浓度为5-50ng/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述NK细胞冻存液还包括木糖。
5.根据权利要求4所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述木糖在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5-3mg/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述右旋糖酐选自右旋糖酐20、右旋糖酐40或右旋糖酐70中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的NK细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将各制备原料进行物理混合，即得。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的NK细胞冻存液在NK细胞冻存中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤包括：将NK细胞和权利要求1-6中任一项所述的NK细胞冻存液混合后，降温，冻存。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述冻存液中NK细胞的密度为(1×106)-(4×107)个/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310061239.9A CN115974081A (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种nk细胞冻存液及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310061239.9A CN115974081A (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种nk细胞冻存液及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115974081A true CN115974081A (zh) | 2023-04-18 |
Family
ID=85966651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310061239.9A Pending CN115974081A (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种nk细胞冻存液及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115974081A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116458494A (zh) * | 2023-04-21 | 2023-07-21 | 北京景达生物科技有限公司 | 一种高纯度nk细胞库构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021000027A (ja) * | 2019-06-21 | 2021-01-07 | 帝人株式会社 | 医療用細胞凍結保存液 |
| CN114431222A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-05-06 | 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 | 一种用于人神经干细胞的细胞冻存液 |
-
2023
- 2023-01-16 CN CN202310061239.9A patent/CN115974081A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021000027A (ja) * | 2019-06-21 | 2021-01-07 | 帝人株式会社 | 医療用細胞凍結保存液 |
| CN114431222A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-05-06 | 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 | 一种用于人神经干细胞的细胞冻存液 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116458494A (zh) * | 2023-04-21 | 2023-07-21 | 北京景达生物科技有限公司 | 一种高纯度nk细胞库构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Izadyar et al. | Development of a cryopreservation protocol for type A spermatogonia | |
| CN110074096B (zh) | 一种无血清细胞冻存液及其制备方法和应用 | |
| RU2396748C2 (ru) | Среда для хранения клеток | |
| Seo et al. | Cryopreservation of amniotic fluid-derived stem cells using natural cryoprotectants and low concentrations of dimethylsulfoxide | |
| Franks | Biological freezing and cryofixation | |
| CN108040460A (zh) | 冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的方法 | |
| KR20120078094A (ko) | 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결배지 조성물 및 양수 줄기세포의 저온보존 방법 | |
| CN112772637A (zh) | 一种无dmso人脐带间充质干细胞注射液冻存液 | |
| CN115974081A (zh) | 一种nk细胞冻存液及其制备方法和应用 | |
| CN115777693B (zh) | 一种细胞冻存液、制备方法、应用方法及用途 | |
| CN111602648A (zh) | 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
| CN114667999A (zh) | 一种免疫细胞冻存稳定剂、冻存液及冻存方法 | |
| CN107711823B (zh) | 一种常温保存的细胞冻存液及其应用 | |
| KR101954120B1 (ko) | 동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 방법 | |
| CN116636525A (zh) | 用于干细胞及其制品长期保存的冻存液及冻存方法 | |
| CN106190979A (zh) | 体外培养造血干/前驱细胞的方法及其组成物 | |
| Gook et al. | Ovarian tissue cryopreservation | |
| CA2683858A1 (en) | Ergothioneine and/or its derivatives as a cell preservative | |
| Xiao et al. | Effects of fulvic acids on goat sperm | |
| Zalomova et al. | Fetal Serum in Combination with 5% Dimethyl Sulfoxide Efficiently Protects the Human Gut Microbiota during Cryopreservation in Liquid Nitrogen | |
| Fitzgerald et al. | Effect of storage temperature, equilibration time, and buffers on survival of Tritrichomonas foetus in the presence of glycerol at freezing temperatures | |
| CN117981747B (zh) | 一种细胞冻存液及其在细胞制剂中应用 | |
| CN115104601B (zh) | 一种组织保存液及其制备方法 | |
| CN116138246A (zh) | 一种nkt细胞冻存液及nkt细胞的保存方法 | |
| Zhu et al. | Effect of human oviductal epithelial cell cultural medium on cryopreserved human sperm survival |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |