KR20120078094A

KR20120078094A - 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결배지 조성물 및 양수 줄기세포의 저온보존 방법

Info

Publication number: KR20120078094A
Application number: KR1020100140278A
Authority: KR
Inventors: 손윤희; 유지; 서장수
Original assignee: 경북대학교병원
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2012-07-10
Also published as: WO2012091206A1; US20130267008A1

Abstract

본 발명은 Me₂SO 농도를 대폭 감소시키고 동물혈청(fetal bovine serum)을 제거하는 한편, 트레할로오즈, 수크로오즈 및 카탈라아제를 사용하여서 양수 줄기세포를 냉동 손상시키지 않으면서도 장기간 저온보존할 수 있는 방법에 관한 것으로, 이당류, 산화방지제 및 카스파아제 억제제를 첨가함으로써 표준 Me₂SO 농도의 1/4을 사용하여 양수 유래의 줄기세포를 저온보존할 수 있다. 그 결과, 세포 동결 용액 중 저 농도 Me₂SO의 사용은 AFSC의 임상 실험 발전을 뒷받침하는 산업적 효과를 갖는다.

Description

양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결배지 조성물 및 양수 줄기세포의 저온보존 방법 {A freezing medium composition for cryopreserving amniotic fluid-derived stem cells and a method for cryopreserving the same}

본 발명은 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결배지 조성물 및 양수 줄기세포의 저온보존 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 Me₂SO 농도를 대폭 감소시키고 동물혈청(fetal bovine serum)을 제거하는 한편, 트레할로오즈, 수크로오즈 및 카탈라아제를 사용하여서 양수 줄기세포를 냉동 손상시키지 않으면서도 장기간 저온보존하도록 하는 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결배지 조성물 및 양수 줄기세포의 저온보존 방법에 관한 것이다.

최근, 양수(Amniotic fluid: AF)는 인간 배아 줄기세포 연구와 관련된 윤리적 문제점을 야기시키지 않으면서 얻을 수 있는, 특징 분석이 잘 된 중간엽(mesenchymal) 줄기세포의 공급원으로 부상하였다. 양수 줄기세포(AFSC)는 지방, 뼈, 근육 및 신경 세포를 비롯한 다수의 세포 계보로 분화되는 것으로 나타났다.

출생 후에 일반적으로 폐기되는 양수는 인체의 다른 부분보다 더 풍부한 줄기세포 공급원을 제공할 수 있다. AFSC는 성인 골수 유래의 줄기세포에 비해 더 우수한 증식속도 및 증가된 분화성을 나타낸다. 또한, AFSC는 면역조절 특성을 나타내고, 따라서 이식편대숙주질환 치료에서 뿐만 아니라 면역 매개 질환에서 이용될 수도 있다. 따라서, AF로부터 줄기 세포를 공급하는 것이 비교적 쉽고, AFSC의 장기 저축(banking)은 향후 재생의학 기술에 상당한 영향을 줄 것이다. 그러나, 임상용 줄기세포를 제조하는데 있어서 주된 걸림돌의 한가지는 세포가공, 저온보존(cryopreservation), 보관 및 유통에 있어서 현재 우수한 제조 방법이 없다는 것이다.

AFSC의 저온보존을 위한 효과적인 기술을 개발하는 것이 줄기세포 저축에서 중요하다. 동결 속도는 저온보존 및 보관 이후의 세포 생존도를 측정하는데 있어서 중요한 인자이다. 제어되는 완만한 속도로 세포를 냉각시키면, 세포막 파열을 일으킬 수 있는 세포내 얼음 축적을 방지한다. 그러나, 완만 동결에서도 세포외 얼음 형성에 의해 세포를 탈수시킬 수 있고, 이를 방지하기 위한 저온보존제가 일반적으로 동결 배지에 첨가된다.

가장 널리 사용되는 저온보존제(CPA)는 다이메틸설폭사이드(Me₂SO)인데, 이는 흡습성을 갖는 극성 화합물로서 세포에 유독할 수 있다. 예컨대, 가장 통상적으로 사용되는 AFSC 저온보존 배지 방법은 동물 또는 인간 혈청의 존재하에 CPA로서 10% Me₂SO로 이루어진 동결 배지를 포함한다. 그러나, Me₂SO-저온보존된 조혈 줄기세포 산물의 이식은 심각한 부작용, 예컨대 구토, 저혈압, 급성 복통, 호흡곤란, 심장 부정맥 및 혈색소뇨와 종종 인과관계를 가짐에도 불구하고, AFSC에 사용된 저온보존 배지 중 Me₂SO 존재의 임상적 효과를 연구한 논문은 없었다.

CPA의 첨가 및 제외는 상기 세포에 유해한 삼투압 충격과 관련된 복잡한 과정이다. 따라서, 줄기세포의 저온보존 및 보관을 위한 CPA-무함유 배지 또는 비-독성 CPA를 개발하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 Me₂SO 농도 감소가 동종간/자가 혈청 또는 혈청을 함유하지 않은 조건에서 냉동된 AFSC의 생존도 및 성능에 어떻게 영향을 주는지를 알아야 한다.

수크로오즈 및 트레할로오즈와 같은 이당류는 동결 건조를 위한 부형제 및 탈수 공정중의 안정화제로서 뿐만 아니라 천연 저온보존제로서 널리 사용되어 왔다. 사실상, 많은 유기체는 거의 완전한 탈수 상태에서도 생존할 수 있다. 이는 탈수가사로 알려진 현상으로, 저온보존 동안에 발생하는 탈수와 유사하다. 탈수가사는 몇몇 경우에 트레할로오즈와 같은 다량의 이당류 축적과 관련되고, 이는 비독성 CPA로서 트레할로오즈를 사용하는 것에 대해 커다란 관심을 불러 일으켰다. 예컨대, 문헌[L.S.Limaye, V.P.Kale, Cryopreservation of human hematopoietic cells with membrane stabilizers and bioantioxidants as additives in the conventional freezing medium, J. Hematother, Stem Cell Res. 10 (2001) 709-718]에는 트레할로오즈가 조혈 전구세포(hematopoietic progenitor cell)를 보존하는데 효과적임을 기재하고 있고, 문헌[C. Scheinkonig, S. Kappicht, H.J.Kolb, M. Schleuning, Adoption of long-term cultures to evaluate the cryoprotective potential of trehalose for freezing hematopoietic stem cells, Bone Marrow Transplant. 34 (2004) 531-536]에는 골수 및 말초혈액 줄기세포의 콜로니 형성능 보존에 있어서 인슐린 및 트레할로오즈를 평가하였다.

탈수 이외에, 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 형성은 냉동 동안 또는 그 직후에 세포 생존도를 감소시키는 또 다른 원인이다. Limaye 등의 문헌에는 바이오산화방지제를 저온보존 용액에 첨가하면 세포의 해동후 회복을 증가시킨다고 기재하고 있다. 막 안정화제 및 바이오산화방지제의 사용은 인간 조혈세포의 저온보존을 향상시키는 것으로 나타났다.

또 다른 선행기술에는 저온보존 배지에 사용된 혈청 단백질이 세척 동안에 제거하기가 어렵고 세포 용액에 남은 잔류물이 세포 주입 또는 이식을 받은 환자 내에서 부작용을 일으킬 수 있다. 그러므로, 임상 용도 목적의 줄기세포 보관을 위한 혈청-무함유 배지를 개발하는 것이 중요하다.

또한, 선행 특허문헌 중 대한민국 특허출원 10-2006-7004375 호 ‘생분해성 폴리머-리간드 접합체 및 세포 아집단의 분리,세포의 냉동보존, 배양 및 이식에서의 그의 용도 ’에는 (a) 적어도 하나의 생분해성 입자를 포함하는 조성물에 세포를 고정시켜 혼합물을 형성하고, (b) 혼합물을 냉동하며, (c) 세포-폴리머 입자 접합물로부터 세포를 해동 및 회수하는 것을 포함하는 고정-의존성(ankorage-dependent) 세포의 냉동보존 방법이 기재되어 있고,

대한민국 특허출원 10-2009-7007620 호 ‘조직-유래 세포의 냉동 보존 방법 ’에는 ‘목적하는 세포를 포함하는 조직을 단편화하고, 단편화된 조직편을 소정의 배지 중에 배양시키고, 배양된 조직편을 회수시켜 동결보호용액 중에 현탁시켜, 해당 조직편 현탁물을 -70℃ 이하의 온도로 동결시킴을 특징으로 하는 조직 유래 세포의 동결보존 방법’이 기재되어 있으며,

대한민국 등록번호 1005342150000호 ‘냉동 보관된 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법’에는 ‘냉동 보관된 제대혈을 해동하여 aMEM(alpha-minimum essential medium) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 얻어진 단핵구로부터 CD133 양성 세포를 분리하고; 그리고, 분리된 세포를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 aMEM 배지에 부유 배양하는 단계를 포함하는, 냉동 보관된 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법‘이 기재되어 있으나,

특허문헌 중 어디에도 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 조성물 및 그 저온보존 방법에 대하여는 기재하고 있지 않다.

종래에, 임상용 줄기세포를 제조하는데 있어서 가장 큰 걸림돌은 이들 세포의 저온보존, 보관 및 유통을 위한 적절한 조성물 및 제조 방법이 없다는 것이다. 줄기세포에 사용되는 가장 최근의 저온보존 조성물 및 방법은 인간 치료 용도에서 유독성 저온보호제(CPA) 다이메틸설폭사이드(Me₂SO)를 동물 혈청 단백질의 존재하에 포함한다. 저온보호제와 관련된 합병증을 방지하기 위하여는 사용되는 동결 배지 중의 비독성 CPA를 개발시키거나 CPA 농도를 감소시켜야 한다.

본 발명자들은 완만 동결 이후에 인간 배아 줄기세포의 생존도를 감소시키는 주요한 원인이 냉동 손상(cryoinjury)에 의해 유도된 세포자멸사(apoptosis)임을 증명하였다. 또한, 임상전 데이터에 따르면, 냉동 및 해동 공정중의 카스파아제 활성화가 세포자멸사를 유도할 수 있고, 따라서 이식을 위한 이식편의 냉동 손상에 일조할 수 있다. 그러므로, 다른 세포보호제와 함께 카스파아제 억제제를 사용하면 생존 세포의 장기 보관 동안에 보호를 제공할 수 있는데, 이는 조직공학의 성공을 위해 중요하다.

본 발명에서는 이당류, 바이오산화방지제 및 카스파아제 억제제를 함유하는 동결 배지가 AFSC 보존에 유용할 수 있음을 밝혀내고, 이를 증명하기 위하여 이들 구성성분을 함유하는 다양한 동결 배지를 제조하였고, 동결 프로토콜에서 이들을 시험함으로써 AFSC 보호도가 증가하는지를 확인함으로써 최종 AFSC-함유 주입 산물에 존재하는 Me₂SO의 최종 농도를 감소시킨다.

따라서, 본 발명에서는 저 농도의 Me₂SO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk를 함유하는 것을 특징으로 하는 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결건조 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기에서 Me₂SO 농도가 2.5 내지 5 % (v/v)이고, 트레할로오스 농도가 60 mmol/L 이며, 카탈라아제 농도가 100 mg/mL 이고, zVAD-fmk 농도가 30 μM 인 것을 특징으로 하는 동결건조 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 동결건조 배지 조성물을 이용한 양수 줄기세포의 저온보존 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 5% Me₂SO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk를 함유하는 용액중에서 저온보존된 해동후 세포 생존도가 통계적으로 유의하게(p<0.05) 증가되었다. 5% 또는 2.5% (v/v) Me₂SO와 함께 트레할로오즈 및 카탈라아제를 함유한 용액은 최소 3주동안 저온보존된 AFSC 중 배양 증식, 세포표면항원 발현 및 줄기세포마커의 mRNA 발현의 측면에서 대조군(10% (v/v) Me₂SO 및 30% FBS)에서와 유사한 결과를 나타냈다. 따라서, AFSC는 이당류, 산화방지제 및 카스파아제 억제제를 첨가함으로써 표준 Me₂SO 농도의 1/4을 사용하여 저온보존될 수 있다. 세포 동결 용액 중 저 농도 Me₂SO의 사용은 AFSC의 임상 실험 발전을 뒷받침하는 산업적 효과가 있다.

도 1은 Me₂SO, FBS, 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk (카보벤족시-v-알릴-알라닐-아스파르틸-(O-메틸)-플루오로메틸 케톤)의 상이한 조성으로 저온보존된 해동후 AFSC의 MTT 어세이를 나타낸 도면이다.
도 2는 Me₂SO, FBS, 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk의 상이한 조성으로 저온보존된 해동후 AFSC의 배양 증식 곡선을 나타낸 도면이다.
도 3은 Me₂SO, FBS, 트레할로오즈 및 카탈라아제의 상이한 조성을 함유하는 용액에 저온보존된 해동후 AFSC의 흐름세포측정 분석(flow cytometric analysis)을 나타낸 것이다.
도 4는 Me₂SO, FBS, 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk의 상이한 조성으로 저온보존된 해동후 AFSC의 RT-PCR 분석을 나타낸 도면이다. 여기서, Non-cryo는 저온보존되지 않은 AFSC를 나타낸다.
도 5a는 Matrigel로 예비코팅된 플라스틱 플레이트 상에 5% (v/v) Me₂SO (용액 3) 및 2.5% (v/v) Me₂SO (용액 6)과 함께 트레할로오즈 및 카탈라아제를 함유하는 용액에 저온보존된 해동후 AFSC의 5-azaC로 근원성 경로 유도한 후에 근원성 분화를 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타낸 도면이고, 도 5b는 상기를 면역형광 착색에 의해 나타낸 도면이다.

AFSC는 대표적인 3개 주요 배아 생식세포 층(외배엽, 내배엽 및 중배엽)을 포함한 다수의 계보(lineage)로 분화다능성 줄기세포이다. 이들 세포는 쉽게 대량 생산될 수 있고, 저온보존될 수 있으며, 치료적 용도를 위한 세포 공급원으로서 즉각 사용되도록 병원으로 운반될 수 있다. 그러나, 임상 용도에서는 다량의 동결보관된 세포가 필요할 수 있고, 따라서 줄기세포 저축의 개발이 필요하다. 이러한 저축에서는 특히 보관된 세포가 세포 요법 및 재생 의학에서 임상 용도로 사용되고자 할 때 이들 세포 생성물의 품질 및 안전이 확보되어야 한다.

저온보존 동안에, 세포막은 현재의 냉동 프로토콜 중에 발생하는 세포내 얼음 형성으로 인해 크게 손상된다. 그러므로, 줄기세포 저온보존을 위한 보다 효과적인 기술의 개발이 세포 저축의 현실화를 위해 고려되어야 할 중요한 측면이다.

CPA의 첨가는 냉동으로 인한 세포 손상을 감소시키거나 없애기 위한 저온보존 중의 통상적인 조치이다. 현재, 대부분의 줄기세포 저온보존 프로토콜은 CPA로서 혈장막-투과 분자 Me₂SO를 사용한다. 그러나, Me₂SO로 처리된 냉동-해동된 줄기세포를 임상적으로 이용하면 신부전, 심장 부정맥 및 기타 합병증이 야기될 수 있다. 그러므로, 저 농도의 Me₂SO 또는 비독성 CPA를 수반하는 저온보존 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다.

본 발명에서는 이당류, 산화방지제 및 카스파아제 활성억제제가 사용된다. 주입 생성물 중 Me₂SO 양을 감소시키고 FBS를 제거하기 위하여 AFSC의 저온보존에서 저 농도의 Me₂SO에 대한 동결 효과를 분석하였다.

많은 식물 및 동물은 다량의 이당류, 특히 수크로오즈 및 트레할로오즈의 축적에 의해 거의 완전한 탈수 상태에서도 생존할 수 있다. 이당류는 매우 고 점성이고 저 이동성인 유리를 형성할 수 있어서, 보존된 물질의 안정성을 증가시킨다. 이는 막, 리포좀 및 단백질의 구조 및 기능 보존을 위해 필요한 것이 첨가제 (당 또는 다당류)의 유리 형성능 뿐임을 시사한다. 유리 형성 이외에, 단백질 및 인지질 중의 극성 기와 당 사이의 직접적인 상호작용이 공기 건조 또는 동결 건조 동안에 다양한 조성의 바이오물질을 안정화하는데 필수적인 것으로 보인다.

글루코오즈의 비독성 이당류인 트레할로오즈는 동결 건조를 위한 부형제 및 탈수 동안의 안정화제로서 저온보존제로 널리 사용되어 왔다. 그의 저온보존능은 각종 조직 및 세포에서 평가되었다. 트레할로오즈를 Ms₂SO-계 저온보존배지(cryomedia)에 첨가하여서 저온보존한 췌장 조직의 경우, 생존률이 높아진다. 이는 또한 제대혈 및 태아간으로부터의 저온보존된 인간 조혈 줄기세포의 콜로니 형성 증가에 의해 증명되는 바와 같이, 10% Me₂SO 단독으로 사용되는 것에 비해 트레할로오즈가 10% Me₂SO와 함께 사용될 때에 보다 우수한 저온보존성을 제공한다.

냉동으로 인한 또 다른 손상 이유는 세포 생존도 감소의 원인으로 지적되어 온 유리 라디칼의 형성이다. 유리 라디칼은 낮은 습도 하에서 증가하고, 빙점하 조건에서는 지질 과산화, 단백질 산화 및 DNA 손상과 같은 산화적 손상을 발생시킨다. 유리 라디칼-매개된 손상에 대한 세포의 주요 방어 메카니즘에는 아스코르브산, α토코페릴 아세테이트, 환원된 글루타티온, 수퍼옥사이드 디스무타아제, 카탈라아제 및 퍼옥사이드와 같은 산화방지제를 포함한다.

세포자멸사는 세포 저온손상에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 세포자멸사는 저온보존 동안에 카스파아제-8 및 카스파아제-9 둘다의 활성화에 의해 유도된다. 본 발명에서는 합성 광범위-스펙트럼(broad-spectrum) 비가역성 카스파아제 억제제인 zVAD-fmk가 다른 저온보존제와 함께 AFSC의 해동후 생존률을 증가시키기 위해 사용된다.

트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk의 저온보존 작용 모드가 전체적으로 상이하기 때문에, 본 발명에서는 통상적인 냉동 배지 중의 Me₂SO 양을 감소시키거나 FBS를 제외시킬 목적으로 5% 또는 2.5% Me₂SO와 함께 상기 3가지 화합물을 조합 사용한다.

바람직하게, 본 발명에서는 상기 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk가 저온보존 용액 중에 각각 60 mmol/L, 100 mg/mL 과 30 μM 범위로 함유된다.

본 발명에서는 대사 활성 세포에 의해 보라색 포르마잔 결정을 형성하는 황색 테트라소듐 염 MTT를 절단함으로써, 저 농도 Me₂SO의 혈청-무함유 용액 중 이당류(트레할로오즈), 산화방지제(카탈라아제) 및 카스파아제 억제제(zVAD-fmk) 존재하의 냉동 세포가 대조군 용액에 비해 해동 후에 더욱 생존가능함을 밝혀내었다.

문헌[J.P.Rodrigues, F.H. Paraguassu-Braga, L. Carvalho, E.Abdelhay, L.F.Bouzas, L.C.Porto, Evaluation of trehalose and sucrose as cryoprotectants for hematopoietic stem cells of umbilical cord blood, Cryobiology 56 (2008) 144-151]에는 이당류가 제대혈의 조혈 줄기세포의 저온보존 용액에 사용되어서 Me₂SO 농도를 감소시킬 수 있음을 보여주었다.

또한, 문헌[L.S.Limaye 등, 상기 참조]은 통상적인 냉동 배지에 첨가되는 산화방지제가 쥐 골수세포 및 인간 성인 골수의 보호를 개선시킴을 증명하였다.

또한, 문헌[X. Xu, S. Cowley, C.J.Flaim, W. James, L. Seymour, Z. Cui, The roles of apoptotic pathways in the low recovery rate after cryopreservation of dissociated human embryonic stem cells, Biotechnol. Prog. 26 (2010) 827-837]에는 저온보존제로서 카스파아제 억제제를 사용함으로써 성공적인 세포보존 및 세포회복을 증명하였다.

그러나, 선행 기술중 어디에도 양수 줄기세포의 저온보존 용액의 이상적인 조합에 대해서는 구체적으로 기재하고 있지 않다.

본 발명에서는 Me₂SO의 감소된 농도와 함께 AFSC의 저온보존을 위한 이당류, 산화방지제 및 카스파아제 억제제의 사용을 평가한다. 해동 세포를 MTT 어세이에 의해 생존도 시험을 실시하고, 개체배가시간(population doubling time)을 측정하기 위해 증식 곡선을 작성한다. 또한, 세포 표면 항원을 위한 흐름세포측정(flow cytometry) 분석, 줄기세포 마커(marker)의 mRNA 발현을 위한 RT-PCR, 및 세포의 근원성 분화능을 결정하기 위한 어세이를 실시한다.

본 발명에 따르면, 해동후 AFSC가 상당히 급속도로 증식한다. 증식곡선 패턴 및 개체 배가시간은 대조군(5% (v/v) Me₂SO + 30% FBS 및 2.5% (v/v) Me₂SO + 30% FBS)과 비교할 때 5% 및 2.5% (v/v) Me₂SO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk를 함유하는 용액중에서 유사하다.

면역아형검사(immunophenotyping)에서 5% 및 2.5% (v/v) Me₂SO와 함께 트레할로오즈 및 카탈라아제를 함유하는 용액중 모든 생존 세포는 다능성 중간엽 전구 계보와 유사한 마커를 발현한다. RT-PCR 분석 결과에 따르면, 분화다능성 줄기세포에 독특한 전사인자를 코딩하는 Oct-4 유전자가 본 발명의 시험 용액 모두에서 발현된다. 해동후 AFSC는 또한 근원성(myogenic) 세포로 분화될 수 있다.

본 발명에 따르면, 이당류(트레할로오즈), 산화방지제(카탈라아제) 및 카스파아제 억제제(zVAD-fmk)가 저온보존 용액에 사용되어서 Me₂SO 농도를 현재 표준인 10% (v/v)에서 5% (v/v) 또는 2.5%(v/v)로 낮추고 FBS를 제외시키는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 저 농도의 Me₂SO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk를 함유하는 용액중 AFSC는 아이덴티티(identity)를 유지하고 신속히 증식하면서도 저온보존될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하지만, 이는 예시를 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되지 않을 것임이 당업자들에게 명백하다.

검체 수집( Specimen collection )

정기적인 산전 진단을 위한 두 번째 석달(second trimester)에 실시한 양수천자로부터 AF 샘플을 채취하였다. 상기 샘플은 각 환자로부터 서면사전동의를 받은 후에 채취하였다.

AFSC 의 단리 및 일차 팽창( primary expansion )

AF 시료를 10분동안 1,200rpm으로 원심분리하였다. α-MEM (HyClone, 미국 유타주 로간 소재), Chang's B (Irvine Scientific, 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재), Chang's C (Irvine Scientific, 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재), 페니실린/스트렙토마이신 (HyClone, 미국 유타주 로간 소재), L-글루타민(HyClone, 미국 유타주 로간 소재), 배아줄기(ES)-소태아혈청(FBS)(HyClone, 미국 유타주 로간 소재) 및 세포로 이루어진 창(Chang) 배지에 펠릿을 재현탁시키고, 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기 및 37℃에서 세포를 배양시켰다. 7일 후에, 부착되지 않은 세포를 제거하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 이어서, 세포를 14일동안 배양하였다. 0.05% 트립신-EDTA (HyClone, 미국 유타주 로간 소재)를 사용하여 3분동안 37℃에서 세포를 수거하고, 동일한 배양 조건하에서 재플레이팅(replate)하였다. 이어서, 부착된 세포가 일주일 간격에서 70% 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때에 이들을 계대 배양하였다.

저온보존 용액의 제조

Me₂SO는 실온에서 세포에 유독하므로, 멸균 조건하에 4℃에서 용액을 제조하였다. 모든 동결 바이알은 세포 첨가 후에 최종 동결 배지 1 mL를 함유하였다. 모든 경우에, 트레할로오즈(시그마-알드리츠(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 카탈라아제(시그마-알드리츠, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 및 zVAD-fmk (R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 각각 60mmol/L, 100㎍/mL 및 30μM 농도로 세포동결바이알(cryovial)에 첨가하였다. 그러나, Me₂SO는 상이한 양(2.5%, 5% 및 10% (v/v))으로 세포동결바이알에 첨가하였다(하기 표 1 참조).

상이한 저온보존제 용액의 제조

용액	Me₂SO (% v/v)	FBS (% v/v)	트레할로오즈 (mmol/ L)	카탈라아제 (㎍/mL)	zVAD-fmk (μM)
1	10	30	0	0	0
2	5	30	0	0	0
3	5	0	60	100	0
4	5	0	60	100	30
5	2.5	30	0	0	0
6	2.5	0	60	100	0
7	2.5	0	60	100	30

AFSC 의 저온보존

상이한 조합을 가진 7가지 저온보존제를 AFSC에 의해 시험하였다(표 1 참조). 10% (v/v) Me₂SO + 30% FBS의 용액을 표준 저온보존 용액(100% 생존도)으로서 사용하였다. 모든 군에서, 100㎕ 중 1 x 10⁶ 세포 분액을, 각각의 저온보존제 용액을 함유하는 1mL들이 세포동결바이알로 옮겼다. 세포를 첨가한 직후에, 속도제어 동결기(controlled-rate freezing)(Cyro, 미국 매릴랜드주 록빌 소재)를 사용하여 세포동결바이알을 동결시켰다. 이어서, 해동 및 추가 분석 이전에 최소 3주동안 액체 질소 탱크에 모든 샘플을 보관하였다.

세포의 해동 및 2차 팽창

37℃로 설정된 수조에 상기 세포동결바이알을 신속하게 넣음으로써 저온보존 세포를 해동하고, 상기 세포를 단리 및 1차 팽창에 기재된 바와 동일 증식 배지에 희석시켰다. 배양물이 목적하는 세포 수에 도달할 때까지 세포를 2계대동안 배양하였다. 해동후 세포 생존도를 MTT 어세이에 의해 측정하였다. 생세포(viable cell)를 특이성 표면 항원의 흐름세포측정 분석, 증식 곡선의 작성, RT-PCR 및 근원성 분화능 어세이에 의해 다시 특징 분석하였다.

MTT 어세이

세포 용액 분액(1 x 10⁴ 세포수/mL)을 96-웰 조직배양 플레이트의 각 웰의 10㎕ MTT 용액과 함께 플레이팅(plating)하고, 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 이어서, MTT 시약을 환원시켜서 형성된 보라색 포르마잔 염료의 흡수도를 570nm 파장에서 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 이용하여 측정하였다.

이러한 MTT 어세이는 다양한 냉동 조건 이후의 세포 생존도를 측정하기 위하여 사용되었다. 시험 용액은 대조군(5% (v/v) Me₂SO + 30% FBS 및 2.5% (v/v) Me₂SO + 30% FBS)와 비교할 때 이와 동등하거나 우수하였다. 세포가 5% Me₂SO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk를 함유한 용액에서 보관될 때에 해동후 세포 생존도가 통계적으로 유의하게(p < 0.05) 증가하였다(도 1 참조).

증식 곡선(개체 배가)

AFSC를 트립신화하고, 24-웰 플레이트에 접종하였다. 상기 세포를 5% 가습 CO₂ 및 37℃에서 배양하고, 배지를 1주일에 3회 교체하였다. 세포를 24시간마다 계수하고, 평균 세포수를 그 날의 개체 세포수로 기록하였다. 각 배양물의 배가 시간은 3회 관측치를 이용하여 계산하였다.

그 결과, AFSC는 급속하게 증식하는 것으로 밝혀졌다. 모든 시험 용액중 해동후 AFSC의 증식 곡선은 하기 특징을 가졌다: (i) 접종후 처음 2일에 세포가 조직 배양 플레이트에 부착되었다; (ii) 3일째에 세포가 로그함수적으로(logarithmic) 증식 단계에 들어갔다; (iii) 6일째에 피크 증식이 있었다; 또한 (iv) 시험 용액중 세포의 배가 시간은 29.0 내지 31.9 시간이었다 (도 2 참조). 5% 및 2.5% (v/v) DMSO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk를 함유하는 용액이 사용될 때에 대조군(5% (v/v) Me₂SO + 30% FBS 및 2.5% (v/v) Me₂SO + 30% FBS)에 비해 증식 곡선 변화가 관찰되지 않았다 (도 2 참조).

흐름세포측정 분석

상기 세포에 의해 발현된 특이성 표면 항원을 흐름세포측정 분석에 의해 특징 분석하였다. 해동후 세포를 트립신화하고, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, SSEA-4, HLA-ABC 및 HLA-DR에 대한 피코에리트(phycoerythrin: PE)-결합된 인간 단분지성 항체로 착색시켰다. 상기 세포를 흐름세포측정 분석계(Becton, Dickinson and Co, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 이용하여 분석하였다.

모든 시험 용액 중의 세포는 CD73, CD90, CD44 및 CD105를 비롯한 다능성 중간엽 전구세포 계보에 상응하는 마커를 발현하였다. 예측된 바와 같이, 이들 세포는 SSEA-및 HLA-ABC (MHC 클래스 I)에 대해서는 양성(positive)이었으나, CD45 및 HLA-DR (MHC 클래스 II)에 대해서는 음성(negative)이었다. 5% 및 2.5% (v/v) Me₂SO와 함께 트레할로오즈 및 카탈라아제를 함유한 용액중에 보관되었던 해동후 세포의 표면 항원 발현에는 차이가 없었다. 해동후 AFSC의 대표적인 표현형 profile이 도 3에 도시되어 있다.

역전사 -중합효소 연쇄반응( RT - PCR )

제조업체 지시에 따라 Trizol 시약(TaKaRa Bio Inc., 일본 시가 소재)을 이용하여 배양 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 특이적 DNA 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다(표 2 참조). 1% 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 증폭된 DNA 단편을 분리하고, 그 밴드를 착색시키고, UV 빛 아래에서 사진촬영하였다.

RT-PCR에 사용된 프라이머

유전자	서열
CK-18	F GAGATCGAGGCTCTCAAGGA R CAAGCTGGCCTTCAGATTTC
비멘틴	F CCTTCGTGAATACCACGACCTGC R TAATATATCGCCTGCCACTGAG
FGF-5	F GCTGTGTCTCAGGGGATTGTAGGAATA R TATCCAAAGCGAAACTTGAGTCTGTA
SCF	F CCATTGATGCCTTCAAGGAC R CTTCCAGTATAAGGCTCCAA
Oct-4	F ACATGTGTAAGCTGCGGCC R GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG
GAPDH	F GCTTGTCATCAATGGAAATCCC R TCCACACCCATGACGAACATG
약어: CK-18 : 사이토케라틴 18 FGF-5 : 섬유모세포성장인자 5 SCF : 줄기세포 인자 Oct-4 : 옥타머-결합 전사인자 4 GAPDH : 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제

RT-PCR 분석에 따르면, Oct-4, FGF-5, SCF, 비멘틴 및 CK18과 같은 줄기세포 마커의 mRNA 발현이 모든 시험 용액중 해동후 AFSC에서 검출되었다.

근원성 분화 및 그의 확인

10% 말-혈청 (Gibco/BRL, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), 0.5% 계배 추출물(chick embryo extract)(Gibco/BRL, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(HyClone, 미국 유타주 로간 소재)을 함유하는 DMEM (저 포도당 배합물)중 Matrigel (BD Biosciences, 미국 매사츄세츠주 베드폴드 소재)로 예비 코팅된 플라스틱 조직 배양 플레이트에 AFSC를 씨딩(seeding)하였다. 씨딩 12시간 후에 24시간동안 5μM 5-아자-2‘-디옥시사이티딘 3(5-azaC; 시그마-알드리츠, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 첨가하였다. 이어서, 5-azaC를 함유하지 않은 배양 배지에서 배양을 계속하고, 배지를 3일마다 교체하였다.

(웨스턴 블롯 분석)

lysis 완충액(150mM NaCl, 20mM TRIS, 1% 트리톤 X-100 및 400U/mL RNase 억제제, pH 8) 100㎕로 플레이트를 처리한 후에 단백 추출물을 얻고, 메탄올로 침전시켰다. 단백질 40㎍을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리시키고, 니트로셀룰로오즈 막으로 옮겼다. 다분지성 항-인간 MyoD (1:500, Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재) 또는 데스민(1:1000, Cell signaling, 미국 매사츄세츠주 댄버스 소재), 2차 퍼옥시다아제-결합된 항체(1:1000, Amersham Bioscience, 스웨덴 웁팔라 소재)와 함께 후속 배양하고, 화학루미네센스 키트(ECL, Amersham Bioscience, 스웨덴 웁팔라 소재)를 특이성 단백질 확인을 위해 이용하였다.

(면역형광 착색)

상기 배양 배지를 함유하는 24-웰 플레이트에 AFSC를 플레이팅하였다. 5% 가습 CO₂ 배양기에서 37℃에서 세포를 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 10mM 포스페이트 완충 식염수(PBS), pH 7.4로 세척하고, 30분동안 4℃에서 2% 파라포름알데하이드(시그마-알드리츠, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 고정시켰다. 세포에 0.2% 트리톤-X (시그마-알드리츠, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 침투시키고, 블로킹(blocking) 완충액(PBS중 10% FBS) 중에서 추가로 20분동안 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS 중에서 1시간동안 MyoD 또는 데스민에 대한 일차 항체(마우스 항-인간 단분지성 항체, Santa Cruz, Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타크루즈 소재)로 착색시켰다. 이어서, 0.5㎍/ml 형광물질 아이소티오시아네이트(FITC)-결합된 염소 항-마우스(Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 PBS 중에서 45분동안 이차 항체로 사용하였다.

해동후 AFSC를 6일동안 근원성 배지에서 배양할 때, 웨스턴 블롯 분석에 따르면, 5% 또는 2.5% (v/v) Me₂SO와 함께 트레할로오즈 및 카탈라아제를 함유한 용액에 보관된 AFSC가 Myo D 및 데스민 단백질을 발현하였다(도 5a 참조). 이와 유사하게, 면역형광 착색에 따르면, (5% 또는 2.5% (v/v) Me₂SO와 함께 트레할로오즈 및 카탈라아제를 함유하는 용액 중) AFSC가 Myo D 및 데스민 단백질을 발현하였다(도 5b 참조). 이를 종합하면, 상기 데이터는 해동후 AFSC가 근원성 경로를 따라 분화할 수 있음을 분명히 하였다.

통계 분석

데이터를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. Student의 양방 검증(two-tailed test)을 이용하여 평균을 비교하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의하다고 간주하였다.

Claims

저 농도의 Me₂SO와 함께 트레할로오즈, 카탈라아제 및 zVAD-fmk(카보벤족시-v-알릴-알라닐-아스파르틸-(O-메틸)-플루오로메틸 케톤)를 함유하는 것을 특징으로 하는 양수 줄기세포의 저온보존을 위한 동결건조 배지 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 Me₂SO 농도가 2.5 내지 5% (v/v)이고, 트레할로오스 농도가 60 mmol/L 이며, 카탈라아제 농도가 100 mg/mL 이고, zVAD-fmk 농도가 30 μM 인 것을 특징으로 하는 동결건조 배지 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2의 동결건조 배지 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 양수 줄기세포의 저온보존 방법.