CN110839612A - 脐血造血干细胞保存液及其制备方法 - Google Patents

脐血造血干细胞保存液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脐血造血干细胞保存液及其制备方法，属于细胞保存技术领域，该保存液的原料包括：低分子右旋糖酐、二甲基亚砜、DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸，通过原料混匀得到保存液，再经过两段变温预处理后与造血干细胞混匀，对造血干细胞进行保存。制备出的保存液保存时间长，所保存的干细胞在复苏后细胞损伤较小，干细胞的存活率较高，同时制备及保存方法较为简单、价廉。

Description

脐血造血干细胞保存液及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种脐血造血干细胞保存液及其制备方法。
背景技术
脐血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，脐血中含有大量可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病，同时，其采集方便、来源充足，对母婴并无不良影响，因此被广泛应用。通常，脐血造血干细胞需要进行保存，一段时间后再继续培养或临床应用。传统的脐血保存通常采用慢速冻存法，但该方法难以避免慢速降温过程中冰晶对细胞造成的损伤，因此仍需要进一步完善，同时该方法设备要求较高，设备价格也较为昂贵。为了避免冷冻条件下细胞的损伤，常常将细胞置于保存液中进行冻存。
中国专利CN201510120370.3公开了一种脐血造血干细胞分离及建库方法，该方法中冻存过程将右旋糖酐和二甲基亚砜以1:1比例混合，在4℃条件下预冷15min作为冻存液，进而使用程序降温仪降温，放入液氮中冻存，该方法简洁方便、分离成本低、分离效率高，避免了微生物污染，但该方法中使用的冻存液中含有的二甲基亚砜对细胞有一定的毒性，冻存、复苏处理不当时，可能对细胞造成较为严重的影响。
中国专利CN201710678108.X公开了一种脐血造血干细胞的冻存液，由冻存保护剂、胎牛血清、培养基组成，该培养基由基础培养基、人血清白蛋白、杨梅素、三七总皂苷、大黄素、亚油酸、胰蛋白酶、抑肽酶、光蛋白聚糖、碱性成纤维细胞生长因子、叶酸、β-巯基乙醇、黄芪多糖、转铁蛋白、维生素和氨基酸组成，使用该冻存液对脐血造血干细胞进行冻存，大大减少了冻存液对脐血造血干细胞的损伤作用，有利于脐血造血干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力的提高，能够更好的保持脐血造血干细胞的生物学特征。但该冻存液中含有胎牛血清，通常动物来源的血清存在感染病毒病菌等病原体的风险，同时，当干细胞复苏后进行临床应用时，部分蛋白质可能会导致异源蛋白引起免疫排斥反应，进而影响患者身体健康。
针对脐血造血干细胞保存液中存在的毒性、风险性以及保存方法存在的复杂、昂贵以及对细胞易造成损伤等问题，应寻找一种保存液及其制备方法，使得使用该保存液所保存的干细胞在复苏后细胞损伤较小，干细胞的存活率均较高，同时制备及保存方法较为简单、价廉。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种脐血造血干细胞保存液及其制备方法。保存液所保存的干细胞在复苏后细胞损伤较小，干细胞的存活率均较高，同时制备及保存方法较为简单、价廉。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种脐血造血干细胞保存液，按重量份数计，包括：10-18份低分子右旋糖酐、6-18份二甲基亚砜、65-80份DMEM培养基、4-8份甘油、0.05-0.2份叶酸、0.1-0.5份甘露低聚糖和1-5份磷脂酰丝氨酸。
优选地，所述脐血造血干细胞保存液按重量份数计，包括：12-16份低分子右旋糖酐、8-15份二甲基亚砜、70-78份DMEM培养基、5-7份甘油、0.08-0.15份叶酸、0.2-0.4份甘露低聚糖和2-4份磷脂酰丝氨酸。
进一步优选地，所述脐血造血干细胞保存液按重量份数计，包括：15份低分子右旋糖酐、9份二甲基亚砜、75份DMEM培养基、6份甘油、0.1份叶酸、0.3份甘露低聚糖和3份磷脂酰丝氨酸。
优选地，所述二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的重量比范围为20-30:1:8-15。
进一步地，所述DMEM培养基为低糖型DMEM培养基。
进一步地，本发明还提供了一种由所述的脐血造血干细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入羟乙基淀粉冲洗并混匀，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；
③将DMEM培养基加入步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将CFU-GM半固体培养基加入培养板内，培养板外围加入生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养后得到造血干细胞集落；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后冷却平衡，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落冷却平衡后与保存液混匀。
进一步地，所述羟乙基淀粉的质量分数为6％。
进一步地，步骤①中所述脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1。
进一步地，所述降温离心在冷冻离心机中进行，所述三次降温离心的第一次降温温度为4-10℃，转速为480rpm，时间为5-8min，所述三次降温离心的第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为4-10℃，转速均为1500pm，时间均为4-6min；步骤②中所述DMEM、羟乙基淀粉与造血干细胞的体积比为5:2:5；所述沉降，沉降时间为15min；步骤③中，白细胞悬液的体积为50μL；步骤中④所述CFU-GM半固体培养基为200μL，所述培养板为48孔培养板，所述生理盐水加入量为0.25mL，以便保持培养板内湿度，所述静置，静置时间为10min，以便使培养基内气体排出；步骤④和步骤⑤中所述CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；步骤⑤中所述培养的时间为14天，培养14天后观察细胞是否形成集落。
进一步地，步骤①中所述收集上层含有白细胞的血浆层的方法为：将第一次降温离心结束后装有脐血的血袋取出，打开导管卡夹，单手持血袋靠在卡式分浆夹刻度板上，另一只手持分浆夹，分浆夹金属框的横杆于白细胞层下方约3cm处开始向上挤压，至白细胞层下方约0.5cm卡住，让含白细胞的血浆层流入转移袋，转移完成后，松开分浆夹，用手挤压转移袋内空气使管内细胞返回采血袋，并关闭血袋导管上的夹子。将第二次降温离心结束后的血袋取出，于采血袋白细胞层下方约3cm处开始向上挤压，至白细胞层下方约1～1.5cm处卡住，让含白细胞的血浆层流入转移袋，松开分浆夹，用手挤压采血袋内空气使管内细胞进入转移袋，并关闭血袋导管上的夹子，第三次降温离心后上层含有白细胞的血浆层的收集方法同第二次降温离心结束后的收集方法。
进一步地，步骤(2)中所述第一段降温处理，处理温度为-15～-8℃，处理时间为10-15min；所述第二段升温处理，温度为4℃，处理时间为5-10min；所述冷却平衡，温度为4℃以下，时间为5-15min。
进一步地，步骤(3)中所述冷却平衡，时间为10-15min，温度为4℃。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明不含非人源的血清和蛋白质等，避免了临床应用时免疫过敏等问题的产生，同时能够对细胞产生保护作用，降低对细胞的毒性作用；
2.本发明的保存液对脐血造血干细胞的保存时间较长，细胞的存活率较高，同时制备方法简单、方便。
具体实施方式
本发明中的脐血由中南大学湘雅三医院提供，低糖型DMEM培养基为购买自长沙凯诺生物科技有限公司的Hyclone低糖型DMEM培养基，其余原料及仪器均为普通市售材料和仪器，因此，对其来源不做具体限定。
实施例1
一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：10份低分子右旋糖酐、6份二甲基亚砜、65份DMEM培养基、4份甘油、0.05份叶酸、0.1份甘露低聚糖和1份磷脂酰丝氨酸。
该保存液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入质量分数为6％的羟乙基淀粉冲洗并混匀，脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，温度为4℃，转速为480rpm，时间为8min，第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为4℃，转速均为1500pm，时间均为6min，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将低糖型DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降15min，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；其中，DMEM、羟乙基淀粉与造血干细胞的体积比为5:2:5；
③将低糖型DMEM培养基加入50μL步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将200μLCFU-GM半固体培养基加入48孔培养板内，培养板外围加入0.25mL生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置10min；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养14天后得到造血干细胞集落；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、低糖型DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后在4℃条件下冷却平衡5min，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；其中，第一段降温处理，处理温度为-15℃，处理时间为10min；第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为5min；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落在4℃条件下冷却平衡10min后与保存液混匀。
实施例2
一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：18份低分子右旋糖酐、18份二甲基亚砜、80份DMEM培养基、8份甘油、0.2份叶酸、0.5份甘露低聚糖和5份磷脂酰丝氨酸。
该保存液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入质量分数为6％的羟乙基淀粉冲洗并混匀，脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，温度为10℃，转速为480rpm，时间为5min，第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为10℃，转速均为1500pm，时间均为4min，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将低糖型DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降15min，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；其中，DMEM、羟乙基淀粉与造血干细胞的体积比为5:2:5；
③将低糖型DMEM培养基加入50μL步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将200μLCFU-GM半固体培养基加入48孔培养板内，培养板外围加入0.25mL生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置10min；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养14天后得到造血干细胞集落；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、低糖型DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后在4℃条件下冷却平衡10min，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；其中，第一段降温处理，处理温度为-8℃，处理时间为15min；第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为10min；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落在4℃条件下冷却平衡15min后与保存液混匀。
实施例3
一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：15份低分子右旋糖酐、9份二甲基亚砜、75份DMEM培养基、6份甘油、0.1份叶酸、0.3份甘露低聚糖和3份磷脂酰丝氨酸。
该保存液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入质量分数为6％的羟乙基淀粉冲洗并混匀，脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，温度为6℃，转速为480rpm，时间为6min，第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为6℃，转速均为1500pm，时间均为5min，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将低糖型DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降15min，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；其中，DMEM、羟乙基淀粉与造血干细胞的体积比为5:2:5；
③将低糖型DMEM培养基加入50μL步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将200μLCFU-GM半固体培养基加入48孔培养板内，培养板外围加入0.25mL生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置10min；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养14天后得到造血干细胞集落；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、低糖型DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后在4℃条件下冷却平衡8min，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；其中，第一段降温处理，处理温度为-10℃，处理时间为12min；第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为8min；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落在4℃条件下冷却平衡12min后与保存液混匀。
实施例4
一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：12份低分子右旋糖酐、8份二甲基亚砜、70份DMEM培养基、5份甘油、0.08份叶酸、0.2份甘露低聚糖和2份磷脂酰丝氨酸。
该保存液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入质量分数为6％的羟乙基淀粉冲洗并混匀，脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，温度为4℃，转速为480rpm，时间为8min，第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为4℃，转速均为1500pm，时间均为6min，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将低糖型DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降15min，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；其中，DMEM、羟乙基淀粉与造血干细胞的体积比为5:2:5；
③将低糖型DMEM培养基加入50μL步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将200μLCFU-GM半固体培养基加入48孔培养板内，培养板外围加入0.25mL生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置10min；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养14天后得到造血干细胞集落；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、低糖型DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后在4℃条件下冷却平衡5min，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；其中，第一段降温处理，处理温度为-15℃，处理时间为10min；第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为5min；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落在4℃条件下冷却平衡10min后与保存液混匀。
实施例5
一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：16份低分子右旋糖酐、15份二甲基亚砜、78份DMEM培养基、7份甘油、0.15份叶酸、0.4份甘露低聚糖和4份磷脂酰丝氨酸。
该保存液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入质量分数为6％的羟乙基淀粉冲洗并混匀，脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，温度为10℃，转速为480rpm，时间为5min，第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为10℃，转速均为1500pm，时间均为4min，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将低糖型DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降15min，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；其中，DMEM、羟乙基淀粉与造血干细胞的体积比为5:2:5；
③将低糖型DMEM培养基加入50μL步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将200μLCFU-GM半固体培养基加入48孔培养板内，培养板外围加入0.25mL生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置10min；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养14天后得到造血干细胞集落；CO2培养箱为5％CO2培养箱，温度为37℃；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、低糖型DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后在4℃条件下冷却平衡10min，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；其中，第一段降温处理，处理温度为-8℃，处理时间为15min；第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为10min；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落在4℃条件下冷却平衡15min后与保存液混匀。
对比例1
与实施例3的区别仅在于，该脐血造血干细胞保存液，按重量份数计，包括：8份低分子右旋糖酐、20份二甲基亚砜、60份DMEM培养基、10份甘油、0.03份叶酸、0.6份甘露低聚糖和0.8份磷脂酰丝氨酸。
对比例2
与实施例3的区别仅在于，该脐血造血干细胞保存液，按重量份数计，包括：20份低分子右旋糖酐、4份二甲基亚砜、82份DMEM培养基、3份甘油、0.3份叶酸、0.08份甘露低聚糖和6份磷脂酰丝氨酸。
对比例3
与实施例3的区别仅在于，二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的重量比为18:1:16(二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的总重量与实施例3一致)。
对比例4
与实施例3的区别仅在于，二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的重量比为32:1:6(二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的总重量与实施例3一致)。
对比例5
与实施例3的区别仅在于，步骤(2)中第一段降温处理，处理温度为-16℃，处理时间为8min；第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为12min。
对比例6
与实施例3的区别仅在于，步骤(2)中不进行变温预处理的步骤。
保存液对脐血造血干细胞存活率影响试验
将实施例1-5和对比例1-6中与保存液混合后的脐血造血干细胞装入冻存袋，在-80℃条件下长期保存，分别在冻存前、6个月、12个月、24个月和36个月时进行取样，利用台盼蓝染色法测定不同时间段细胞的存活率，得到表1。
表1
由表1可知，实施例1-5细胞存活率在冻存前、6个月、12个月、24个月和36个月时均较高，其中，实施例3细胞存活率最高，在6个月、12个月、24个月和36个月时分别为98.9±1.32％、93.78±0.72％、92.87±0.91％、90.36±1.36％和87.31±0.65％。对比例1-6均低于实施例3，由此可知，细胞保存液的成分配比以及保存液的预处理步骤均能影响着后续保存时细胞的活率。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：10-18份低分子右旋糖酐、6-18份二甲基亚砜、65-80份DMEM培养基、4-8份甘油、0.05-0.2份叶酸、0.1-0.5份甘露低聚糖和1-5份磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞保存液，其特征在于：按重量份数计，原料包括：12-16份低分子右旋糖酐、8-15份二甲基亚砜、70-78份DMEM培养基、5-7份甘油、0.08-0.15份叶酸、0.2-0.4份甘露低聚糖和2-4份磷脂酰丝氨酸。
3.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞保存液，其特征在于：所述二甲基亚砜、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸的重量比范围为20-30:1:8-15。
4.如权利要求1-3任一项所述的脐血造血干细胞保存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)脐血造血干细胞的分离与培养：
①采集脐血，向脐血中加入羟乙基淀粉冲洗并混匀，进行三次降温离心，每一次降温离心后均收集上层含有白细胞的血浆层，将三次降温离心后收集到的血浆层混匀，经PBS缓冲液冲洗后得到造血干细胞；
②将DMEM培养基与羟乙基淀粉加入步骤①得到的造血干细胞中，混匀后沉降，取上清液吹打混匀，得到白细胞悬液；
③将DMEM培养基加入步骤②中的白细胞悬液中，调节白细胞终浓度为0.5×106/mL；
④将CFU-GM半固体培养基加入培养板内，培养板外围加入生理盐水，再将培养板放入CO2培养箱中静置；
⑤将步骤③中调好浓度的白细胞悬液加入培养板中的CFU-GM半固体培养基中，将培养板放入CO2培养箱中培养后得到造血干细胞集落；
(2)保存液的制备与预处理：将配方用量二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、DMEM培养基、甘油、叶酸、甘露低聚糖和磷脂酰丝氨酸混匀后，即得保存液，将保存液进行两段变温预处理，而后冷却平衡，所述两段变温预处理包括第一段降温处理与第二段升温处理；
(3)造血干细胞的保存：将步骤(1)中的造血干细胞集落冷却平衡后与保存液混匀。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤①中所述脐血与羟乙基淀粉的体积比为4:1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤①中所述三次降温离心的第一次降温温度为4-10℃，转速为480rpm，时间为5-8min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤①中所述三次降温离心的第二次降温离心和第三次降温离心的温度均为4-10℃，转速均为1500pm，时间均为4-6min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述第一段降温处理，处理温度为-15～-8℃，处理时间为10-15min；所述第二段升温处理，处理温度为4℃，处理时间为5-10min。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述冷却平衡，时间为5-15min，温度为4℃以下。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述冷却平衡，时间为10-15min，温度为4℃。
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