CN104726405A - 一种脐血造血干细胞分离及建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人的脐带血造血干细胞库的分离及建库方法，方案包括以下步骤：一：脐血加入HES,混匀，静置于4℃冰箱10min后，40g离心；二：将上层液体转移至100ml转移袋1内，离心，将上层血浆转移到原始袋子内备用；三：再将原始袋40g离心5min，上清转移至转移袋1内备用；四：将转移袋1以600g、10min离心，取下层干细胞悬液20-40ml备用；五：将步骤四混匀的脐血干细胞悬液转移到冻存袋中；六：将右旋糖酐和二甲基亚砜（DMSO）以1：1比例混合，在4℃条件下预冷15min为冻存液备用；七：冻存液混匀，使DMSO终浓度为10%；八：使用程序降温仪降温，放入液氮中冻存，本发明使得造血干细胞的分离过程更加简洁方便，分离成本低，分离效率高，最大程度地避免了微生物污染。
Description
技术领域
本发明涉及到一种干细胞的分离及建库方法，尤其是一种人的脐带血造血干细胞库的分离及建库方法。
背景技术
脐带血是胎儿被产妇娩出、脐带结扎并剪断后残留在胎盘和脐带中的血液，长期以来由于人们认识的匮乏，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，脐带血中的造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤如急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合症、淋巴瘤等、血红蛋白病如海洋性贫血、骨髓造血功能衰竭如再生障碍性贫血、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤如小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌，进行性肌营养不良等；同时还能为经受高剂量化疗或放疗的病人维持和恢复髓系的造血功能。胎儿脐血已被认为是除骨髓和外周血以外，又一个理想的造血干细胞资源。
因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源,同时也是一种非常重要的人类生物资源。在临床应用方面，国内已经建立了几座大型脐血库，不少医院已经在尝试利用脐带血干细胞分化治疗血液病，脑血管疾病，自身免疫性疾病等，并且取得可喜的成果。
脐带血造血干细胞具有以下优点：采集方法简单，来源充足；对母亲和新生儿无任何不良影响；比骨髓和外周血来源的造血干/祖细胞更原始，细胞增殖速度更快；被病毒感染如巨细胞病毒、艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等的风险降低；移植后引起抗宿主病(GVHD)的风险降低；脐血移植相对于骨髓移植而言，对HLA配型要求相对降低，缩短供体寻找时间；移植费用降低，移植成功率更高。
目前，国内外关于脐带血中有核细胞的分离有多种方法，常见的有：密度梯度离心法（Ficoll和Percoll溶液）、甲基纤维素法、3%眀胶法、6%羟乙基淀粉法、NH4Cl溶解法、试剂盒提取法等。
综合国内外学者的研究发现，3%眀胶沉降法和6%羟乙基淀粉沉降法的分离效果比较好，CD34+细胞（造血干细胞表面标志分子）和有核细胞回收率高，多数能达到90%以上；其次是试剂盒提取法和NH4Cl溶解法。
由于脐血量大，使用 Ficoll或Percoll溶液的费用高，技术要求高，操作繁琐、处理时间长，易污染等原因，密度梯度离心法不适宜在细胞库中使用。并且运用密度梯度离心法分离后，CD34+细胞和有核细胞回收率一般不超过50%。而NH4Cl溶解法分离后的细胞液终体积较大，所以没有实际的应用价值。
刘斌等研究发现，羟乙基淀粉和明胶沉降分离后，CD34+细胞的损失率平均不到5.0%，CFCs（集落形成细胞）的损失率平均为10.0%左右，这满足了建立脐血库的要求。为了减少冻存体积，降低成本，需要采取一种有效的方法分离脐血中的有核细胞，从而使大规模、广泛地建立脐血库成为可能。
从细胞液终体积来看，羟乙基淀粉分离法可以尽可能地去除血浆，使其终体积占原体积的1/4或更少。而明胶分离后细胞液终体积占脐血原体积的3/4左右。从临床应用上来看，眀胶的熔点较高，细胞冻存后复苏时眀胶不易溶解，在临床应用上存在一定的缺陷。而羟乙基淀粉来源广，在临床上也可直接注入病人体内。另外Rubinstein等报道可在封闭系统中应用HES分离脐血有核细胞，这样可避免病原菌的污染，因此国内外许多脐血库均采用羟乙基淀粉沉降法分离脐血，要想建立大规模的、稳定成熟的脐血库，有核细胞的分离方法应该简洁、方便、易操作，有核细胞的活性和回收率要高，所有操作过程要尽量避免病原菌的污染。同时为了减少冻存体积，降低成本，需要采取一种有效的方法分离脐血中的有核细胞，从而使大规模、广泛地建立脐血库成为可能。
发明内容
真对现有的脐血造血干细胞分离及脐血库建库中遇到的诸多问题，本发明的目的是提供一种脐血造血干细胞分离及脐血库建库的新方法，有效解决脐血量少，造血干细胞活性低，细胞回收率低，脐血造血干细胞分离过程中的微生物污染，分离过程繁琐，分离成本高的问题。
其解决问题的具体方案是：
一种脐血造血干细胞分离及脐血库建库的方法，包括以下步骤
步骤一：计算脐血纯血体积，以1:3比例向脐血中加入羟乙基淀粉（HES）,充分混匀，静置于4℃冰箱10min后，40g离心，离心时间根据脐血量确定；50ml-60ml之间：离心5min；60ml-70ml之间：离心6min；以此类推，100ml以上均离心10mim；
步骤二：将脐血上层液体转移至100ml转移袋1内，红细胞留在原始袋中；将转移袋1以600g、10min离心，将上层血浆转移到原始袋子内备用；
步骤三：再将原始袋40g离心5min，上清转移至转移袋1内备用；
步骤四：将转移袋1以600g、10min离心，取下层干细胞悬液20-40ml备用；
步骤五：将步骤四混匀的脐血干细胞悬液转移到冻存袋中；
步骤六：将右旋糖酐和二甲基亚砜（DMSO）以1：1比例混合，在4℃条件下预冷15min为冻存液备用；
步骤七：将预冷后的冻存液用注射泵缓慢加入到冻存袋内并不断混匀，使DMSO终浓度为10%；
步骤八：留取小样1ml并称重，计算回收率，使用程序降温仪降温，降至-120℃后转入液氮罐保存并登记,程序为：以1℃/min的速率降至-5℃后，以3℃/min的速率降至-20℃，再以1℃/min的速率降至-60℃，最后以5℃/min的速率降至-120℃，结束后放入液氮中冻存。
本发明具备多种分离方法的优点，本发明使得造血干细胞的分离过程更加简洁方便，分离出的细胞活性可以达到97.68%±0.94%，分离成本低，分离效率高，分离过程封闭性强，最大程度地避免了微生物污染。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明作进一步的的详细说明
实施例一
一种脐血造血干细胞分离及脐血库建库的方法，包括以下步骤
步骤一：计算脐血纯血体积，以1:3比例向脐血中加入羟乙基淀粉（HES）,充分混匀，静置于4℃冰箱10min后，40g离心，离心时间根据脐血量确定；50ml-60ml之间：离心5min；60ml-70ml之间：离心6min；以此类推，100ml以上均离心10mim；
步骤二：将脐血上层液体转移至100ml转移袋1内，红细胞留在原始袋中，将转移袋1以600g、10min离心，将上层血浆转移到原始袋子内备用；
步骤三：再将原始袋40g离心5min，上清转移至转移袋1内备用；
步骤四：将转移袋1以600g、10min离心，取下层干细胞悬液20-40ml备用；
步骤五：将步骤四混匀的脐血干细胞悬液转移到冻存袋中；
步骤六：将右旋糖酐和二甲基亚砜（DMSO）以1：1比例混合，在4℃条件下预冷15min为冻存液备用；
步骤七：将预冷后的冻存液用注射泵缓慢加入到冻存袋内并不断混匀，使DMSO终浓度为10%；
步骤八：留取小样1ml并称重，计算回收率，使用程序降温仪降温，降至-120℃后转入液氮罐保存并登记,程序为：以1℃/min的速率降至-5℃后，以3℃/min的速率降至-20℃，再以1℃/min的速率降至-60℃，最后以5℃/min的速率降至-120℃，结束后放入液氮中冻存。
Claims (1)
1.一种脐血造血干细胞分离及脐血库建库的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：计算脐血纯血体积，以1:3比例向脐血中加入羟乙基淀粉,充分混匀，静置于4℃冰箱10min后，40g离心，离心时间根据脐血量确定；50ml-60ml之间：离心5min；60ml-70ml之间：离心6min；以此类推，100ml以上均离心10mim；
步骤二：将脐血上层液体转移至100ml转移袋1内，红细胞留在原始袋中，将转移袋1以600g、10min离心，将上层血浆转移到原始袋子内备用；
步骤三：再将原始袋40g离心5min，上清转移至转移袋1内备用；
步骤四：将转移袋1以600g、10min离心，取下层干细胞悬液20-40ml备用；
步骤五：将步骤四混匀的脐血干细胞悬液转移到冻存袋中；
步骤六：将右旋糖酐和二甲基亚砜（DMSO）以1：1比例混合，在4℃条件下预冷15min为冻存液备用；
步骤七：将预冷后的冻存液用注射泵缓慢加入到冻存袋内并不断混匀，使DMSO终浓度为10%；
步骤八：留取小样1ml并称重，计算回收率，使用程序降温仪降温，降至-120℃后转入液氮罐保存并登记,程序为：以1℃/min的速率降至-5℃后，以3℃/min的速率降至-20℃，再以1℃/min的速率降至-60℃，最后以5℃/min的速率降至-120℃，结束后放入液氮中冻存。
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