CN109874782A - 一种nk细胞的冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞的冻存方法。本发明发现，5‑麦谷蛋白‑3‑醇对NK细胞具有冻存保护作用，可以提高NK细胞‑80℃冻存复苏率，可以维持NK细胞‑80℃冻存复苏后的杀伤活性和对肿瘤细胞的杀伤力，而且不会改变NK细胞的表型。因此，可以将5‑麦谷蛋白‑3‑醇制备成NK细胞的冻存保护剂。

Description

一种NK细胞的冻存方法
技术领域
本发明属于生物领域，涉及免疫细胞冻存，具体涉及一种NK细胞的冻存方法。
背景技术
肿瘤细胞免疫治疗技术作为一种新兴的肿瘤治疗手段，具有杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小等特点。自然杀伤细胞(NK)通过自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用，可不受MHC分子的限制，进而识别MHC-I类分子表达下调或缺失的肿瘤细胞并发挥杀伤功能。由于NK细胞在外周血中占有较小的比例，占淋巴细胞的5％～15％，并且肿瘤患者体内NK细胞的功能存在不同程度的缺失，难以产生良好抗肿瘤效果，需要通过体外培养增加NK细胞的数量和改善NK细胞的功能。
由于不能确保体外培养与临床使用时间节点的完全统一，为了避免长时间的培养而增加的成本、培养时间超过最佳对数生长期后细胞的生长状态及活性的下降而影响细胞的治疗质量，保存培养后的NK细胞也成了必要的方法之一。目前，常使用程控降温的方法对NK细胞进行冻存，但是程控降温操作繁琐。虽然-80℃直接冻存更受欢迎，但是该方法对NK细胞的冻存损伤较大，复苏率和复苏后的杀伤活性都会明显降低，应用受到局限。
公开号为CN105211051A的专利公开了一种培养后的NK细胞的冻存液及其制备方法，请求保护一种培养后的NK细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：0.5～2，其中：溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3～6：1；自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。但是，该冻存液成分较为复杂，含有茶多酚、葡萄籽提取物和维生素C，而且葡萄籽提取物是一种植物提取物，成分受原料来源影响较大，无法保证不同批次冻存液的质量一致。
公开号为CN107699543A的专利公开了一种莎草醌及类似物在NK细胞培养方面的应用，请求保护莎草醌及其衍生物在NK细胞冻存复苏和体外培养方面的应用。但是，该专利只研究了莎草醌及其衍生物可以提高NK细胞的复苏率，并未公开莎草醌及其衍生物对NK细胞杀伤活性的影响，而复苏率和杀伤活性对考察NK细胞冻存效果缺一不可。
可见，现有技术均存在一定的不足，有必要开发更多的NK细胞冻存方法和冻存液，丰富NK细胞的冻存选择。5-麦谷蛋白-3-醇(5-Glutinen-3-ol，CAS#:545-24-4)是最早从麦谷中分离得到的一种物质，其对NK细胞的冻存保护作用尚未见报道。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足，提供一种NK细胞的冻存方法，提供5-麦谷蛋白-3-醇用于制备NK细胞冻存保护剂的用途。
本发明目的通过如下技术方案实现：
5-麦谷蛋白-3-醇用于制备NK细胞冻存保护剂的用途。NK细胞冻存前后的活率如表1和图2所示，对照组冻存复苏后的NK细胞活率显著降低，与对照组相比，实验组冻存复苏后的NK细胞活率显著升高，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞的-80℃冻存具有显著的保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率。
5-麦谷蛋白-3-醇在NK细胞-80℃直接冻存方面的应用。NK细胞冻存前后的活率如表1和图2所示，对照组冻存复苏后的NK细胞活率显著降低，与对照组相比，实验组冻存复苏后的NK细胞活率显著升高，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞的-80℃冻存具有显著的保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率。
一种NK细胞-80℃直接冻存的方法，在冻存保护剂中添加5-麦谷蛋白-3-醇，于4℃预冷2h后直接转至-80℃低温冻存。NK细胞冻存前后的活率如表1和图2所示，对照组冻存复苏后的NK细胞活率显著降低，与对照组相比，实验组冻存复苏后的NK细胞活率显著升高，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞的-80℃冻存具有显著的保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率。
一种NK细胞冻存保护剂，含有5-麦谷蛋白-3-醇。NK细胞冻存前后的活率如表1和图2所示，对照组冻存复苏后的NK细胞活率显著降低，与对照组相比，实验组冻存复苏后的NK细胞活率显著升高，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞的-80℃冻存具有显著的保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率。
一种用于NK细胞冻存的5-麦谷蛋白-3-醇，纯度≥98％。
技术效果：
本发明发现，5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞具有冻存保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率，可以维持NK细胞-80℃冻存复苏后的杀伤活性和对肿瘤细胞的杀伤力，而且不会改变NK细胞的表型。因此，可以将5-麦谷蛋白-3-醇制备成NK细胞的冻存保护剂。
附图说明
图1为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养10d后的流式细胞术检测结果；该结果表明单个核细胞已基本诱导成NK细胞；
图2为NK细胞冻存前后的活率测定结果，表明5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞的-80℃冻存具有显著的保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率；
图3为CD107a的流式细胞术检测结果，该结果表明表明5-麦谷蛋白-3-醇可以维持NK细胞-80℃冻存复苏后的杀伤活性；
图4为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为冻存前的NK细胞表型流式检测结果，B为实验组冻存复苏后的NK细胞表型流式检测结果，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇不会影响NK细胞的表型；
图5为NK细胞对肿瘤细胞杀伤率测定结果，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇可以维持NK细胞-80℃冻存复苏后对肿瘤细胞的杀伤力。
具体实施方式
下面结合附图和实施例介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。
一、实验材料
淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；rhIL-2购自厦门特宝生物工程股份有限公司；人AB血浆购自上海慧颖生物科技有限公司；SCGM无血清培养基购自上海微科生物技术有限公司；DMSO购自阿拉丁；FITC-Anti-CD56、PE-Anti-CD3、APC-Anti-CD107a购自美国BD公司；PBS溶液自制；5-麦谷蛋白-3-醇(5-Glutinen-3-ol，CAS#:545-24-4)纯度≥98％；CCK-8试剂购自碧云天；0.4％台盼蓝溶液购自北京索莱宝科技有限公司；MKN-45人胃癌细胞购自上海康朗生物科技有限公司。
二、实验方法
1、NK细胞的培养和表型鉴定
取健康成年志愿者外周静脉血，低分子肝素钠抗凝后加入淋巴细胞分离液，2000r/min离心13min，离心半径10cm。吸取单个核细胞层，PBS洗涤3次，加入含有300U/mlrhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3d半量换液1次。收集培养10d的NK细胞，PBS洗涤3次后调整细胞浓度为1×106/ml。在细胞悬液中加入FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3，室温避光孵育15min，PBS洗涤并重悬细胞，采用流式细胞术检测NK细胞表型。
2、NK细胞的冻存和复苏
取培养10d的NK细胞，1000r/min离心10min，弃上清液，按照如下分组加入组成不同的冻存液，分别调整细胞浓度至5×106/ml，4℃预冷2h后直接转至-80℃低温保存3个月。
对照组：含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基:二甲基亚砜＝9:1(V/V)；
实验组：含有50μg/ml 5-麦谷蛋白-3-醇、300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基:二甲基亚砜＝9:1(V/V)。
复苏：从-80℃取出冻存的NK细胞，迅速放入37℃水浴锅内融化，PBS充分洗涤去除5-麦谷蛋白-3-醇，重悬于含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基中培养4h测定NK细胞活率。
3、台盼蓝染色法检测NK细胞冻存前后的活率
将冻存前后的NK细胞悬液(细胞浓度1×106/ml)与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀，染色2min后，分别计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率。
4、流式细胞术检测杀伤活性标志分子CD107a的表达
在冻存后的NK细胞悬液(细胞浓度1×106/ml)中分别加入FITC-Anti-CD56、PE-Anti-CD3和APC-Anti-CD107a，冻存前的NK细胞悬液(细胞浓度1×106/ml)中加入APC-Anti-CD107a，室温避光孵育15min，PBS洗涤并重悬细胞，采用流式细胞术检测冻存后的NK细胞表型和冻存前后的NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达。
5、CCK-8法检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
将冻存前后的NK细胞配成2×106/ml的细胞悬液，作为效应细胞；将对数生长期的胃癌MKN45细胞配成2×105/ml的细胞悬液，作为靶细胞。将效应细胞悬液和靶细胞悬液等体积(即效靶比10:1)接种于96孔培养板，同时设单独效应细胞孔、单独靶细胞孔和空白孔，每组5个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养8h；加入CCK8试剂10μL，孵育4h后，在450nm测定各孔吸光值(OD)，求其平均值，扣除空白孔本底OD值按下式计算杀伤活性。
杀伤活性(％)＝[1-(实验组OD值-单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞OD值]×100％。
5、统计学方法
数据采用SPSS17.0软件处理，以均数±标准差表示，组间的比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、NK细胞表型鉴定结果
NK细胞表型为CD3-CD56+，单个核细胞经含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基培养10d后，CD3-CD56+细胞由培养前的7.4％增加到培养后的85.6％，如图1所示，图1中A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养10d后的流式细胞术检测结果。该结果表明，单个核细胞已基本诱导成NK细胞。
2、5-麦谷蛋白-3-醇对NK冻存复苏率的影响
NK细胞冻存前后的活率如表1和图2所示，对照组冻存复苏后的NK细胞活率显著降低，与对照组相比，实验组冻存复苏后的NK细胞活率显著升高，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞的-80℃冻存具有显著的保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率。
表1 NK细胞冻存前后的活率测定结果
3、5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞杀伤活性的影响
CD107a的流式细胞术检测结果如表2和图3所示，与冻存前相比，实验组NK细胞冻存复苏后杀伤活性标志分子CD107a的表达未见明显降低，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇可以维持NK细胞-80℃冻存复苏后的杀伤活性。
表2 CD107a的流式细胞术检测结果
CD107a表达率
冻存前 63.2％
实验组冻存复苏后 64.9％
图4中A为冻存前NK细胞表型流式检测结果(CD3-CD56+细胞表达率为85.6％)，图4中B为实验组冻存复苏后NK细胞表型流式检测结果(CD3-CD56+细胞表达率为85.1％)，说明5-麦谷蛋白-3-醇不会影响NK细胞的表型。
4、5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞杀伤肿瘤细胞活力的影响
NK细胞对肿瘤细胞杀伤活力检测结果如表3和图5所示，与冻存前相比，实验组NK细胞冻存复苏后对肿瘤细胞杀伤活力未见明显降低，该结果表明5-麦谷蛋白-3-醇可以维持NK细胞-80℃冻存复苏后对肿瘤细胞的杀伤活性。
表3 NK细胞对肿瘤细胞杀伤率测定结果
杀伤率
冻存前 42.5％±4.9％
实验组冻存复苏后 41.3％±4.8％
以上实施例表明，5-麦谷蛋白-3-醇对NK细胞具有冻存保护作用，可以提高NK细胞-80℃冻存复苏率，可以维持NK细胞-80℃冻存复苏后的杀伤活性和对肿瘤细胞的杀伤力，而且不会改变NK细胞的表型。因此，可以将5-麦谷蛋白-3-醇制备成NK细胞的冻存保护剂。

Claims (5)

1.5-麦谷蛋白-3-醇用于制备NK细胞冻存保护剂的用途。
2.5-麦谷蛋白-3-醇在NK细胞-80℃直接冻存方面的应用。
3.一种NK细胞-80℃直接冻存的方法，其特征在于：在冻存保护剂中添加5-麦谷蛋白-3-醇，于4℃预冷2h后直接转至-80℃低温冻存。
4.一种NK细胞冻存保护剂，其特征在于：含有5-麦谷蛋白-3-醇。
5.一种用于NK细胞冻存的5-麦谷蛋白-3-醇，其特征在于：纯度≥98％。
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