KR101795872B1 - 생물반응기를 이용한 4배체 도라지 부정근의 대량생산용 배지 조성물 및 그 대량생산방법 - Google Patents

생물반응기를 이용한 4배체 도라지 부정근의 대량생산용 배지 조성물 및 그 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4배체 도라지 부정근의 대량생산에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 기내 배양기술을 이용하여 육성된 4배체 도라지의 부정근을 대량생산하기 위한 배지 조성물 및 그 배양방법에 관한 것으로 아미노산이 풍부한 부정근을 단시간에 대량생산할 경우 건강기능성 식품으로 사용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

생물반응기를 이용한 4배체 도라지 부정근의 대량생산용 배지 조성물 및 그 대량생산방법{Culture medium for mass production of tetraploid adventitious root from Platycodon grandflorum using bioreactor and mass producing method thereof}
본 발명은 기내 배양기술을 이용하여 육성된 4배체 도라지 부정근의 대량생산을 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물반응기를 이용하여 부정근의 대량생산을 위한 배지 조성물 및 그 배양방법에 관한 것이다.
도라지(길경 Platycodon grandiflorum A. DC)는 배농, 거담, 기관지염, 천식, 소염 등의 호흡기계 질환에 사용되어온 생약제로서 도라지가 배합되어 있는 한방 처방은 동의보감에 273건, 방약합편에 49건이 수록되어 있을 정도로 다양한 약리작용이 있는 것으로 알려져 있다. 도라지의 주요 약리성분은 테르펜계 사포닌(프레티코틴 A, C, D, D6, 폴리갈라신 D, D2 등 18종)으로서 뿌리의 약 2%를 차지하고 있고, 테르펜계 사포닌은 용혈, 국소자극, 진해, 거담작용, 중추신경억제작용(진정, 진통, 해열효과), 급·만성 염증에 대한 항염증작용, 항알레르기, 항궤양 및 위액 분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사개선작용 등이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 식물조직배양기술은 식물의 세포 및 기관을 연중 균일하게 대량생산하는 가장 보편적인 방법이다. 그러므로 균일한 품질관리가 필요한 산업시장의 원료로 도라지를 공급하기 위해서는 식물조직배양기술을 이용하여 대량생산하는 것이 수요자의 욕구를 만족시킬 수 있는 효과적인 생산방법이라고 할 수 있다. 최근 약용식물의 세포, 체세포배 및 부정근 등의 식물조직에서 조직배양기술을 이용하여 생리활성물질을 생산하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이 중 부정근을 이용한 배양은 배양체의 생장이 빠르고, 연속적인 증식과 안정적인 공급이 가능하며, 상업적 대량화가 용이하다. 또한, 조직배양기술을 이용하여 생리활성물질을 생산하는 기내 배양의 경우 환경조절이 용이하기 때문에 연중 균일한 품질의 생리활성 물질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 인위적으로 함량을 증가시킬 수 있는 장점도 있다. 이를 이용한 방법을 엘리시테이션(elicitation)이라하며 생물적 엘리시터
(elicitor) 또는 비생물적 엘리시터를 이용하여 미치광이풀(Scopolia parviflora) , 인삼(Panax ginseng) 및 에키네시아(Echinacea purpurea)등 다양한 약용식물 부정근의 생리활성물질 함량을 증가시키려는 실험들이 활발히 진행되었다.
본 발명의 선행기술로는 생물반응기를 이용한 산삼 부정근의 대량생산 방법이 대한민국 등록특허 제 10-2001-0070932호에 공지되어 있으나 이는 생물반응기를 이용한 산삼 부정근의 대량생산 방법에 관한 것이고, 한편 기내배양법에 대한 도라지 부정근의 유도방법에 대하여는 본 발명자 등이 특허 공개 제 10-2014-0142447호로 공지한 바 있다. 그러나 상기 본 발명자들의 발견에 기초하여 생물반응기를 이용한 4배체 도라지 부정근의 대량생산 방법은 전무한 실정이어서 보다 과학적이고 실증적인 연구가 필요하였다. 따라서 본 발명은 생물반응기를 이용한 4배체 도라지 부정근의 대량생산 방법은 본 발명이 최초이다.
따라서, 본 발명의 목적은 기내 배양기술을 이용하여 육성된 4배체 도라지 부정근의 대량생산을 위한 배지 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용하여 4배체 도라지 부정근을 대량생산하는 배양방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물 및 배양방법에 따라 수득한 4배체 도라지가 함유된 건강기능성식품의 재료를 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 기내 배양 도라지 절편체를 콜히친 용액을 이용하여 4배체 도라지를 제조하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 4배체 도라지의 효과적인 부정근 유도에 적합한 재료를 선정하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 4배체의 도라지를 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 생장조절제의 종류 및 농도, sucrose 농도 및 배지 구성물질의 농도를 선정하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 4배체 도라지 부정근의 대량증식을 위한 바이오 리엑터에 MS배지의 농도, sucrose 농도, IBA 농도, pH, 적정 접종밀도 및 생물반응기내 공기주입량을 선정하는 단계로 이루어지고 기외에서 재배되고 있는 2배체 및 4배체의 뿌리와 바이오 리엑터에서 증식된 부정근이 함유한 성분을 비교, 분석한 후 4배체 도라지 부정근의 대량생산을 위한 배지 조성물 및 그 생산방법을 확인함으로써 달성하였다.
본 발명은 기내 배양기술을 이용한 4배체 도라지의 부정근 유도방법 및 그 배지 조성물을 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라, 상기 방법 및 그 조성물을 이용하여 아스파르트산과 글루탐산이 현저히 증강된 4배체 도라지 부정근을 기내에서 단기에 대량생산할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 4배체 도라지 부정근의 대량생산 과정을 모식도로 나타낸 사진도이다.
도 2는 2배체와 4배체의 유세포분석기를 이용하여 DNA 함량을 비교한 그래프이다.
도 3은 기내에서 배양중인 2배체 도라지와 본 발명을 통해 얻은 기내에서 배양중인 4배체 도라지의 사진이다.
도 4는 4배체 도라지의 부정근 형성에 영향을 미치는 생장조절물질 옥신류의 효과를 확인하기 위해 부정근의 길이를 조사한 결과를 도식화한 그래프이다.
도 5는 4배체 도라지의 부정근 형성에 영향을 미치는 sucrose의 효과를 확인하기 위해 부정근의 길이를 조사한 결과를 도식화한 그래프이다.
도 6은 4배체 도라지의 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위해 배지의 종류와 농도별로 부정근의 무게를 측정한 그래프이다.
도 7은 4배체 도라지의 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위해 배지의 종류와 농도별로 부정근의 무게를 측정한 실험의 결과 사진이다.
도 8은 4배체 도라지의 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위해 sucrose 농도별로 부정근의 무게를 측정한 그래프이다.
도 9는 4배체 도라지의 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위해 sucrose 농도별로 부정근의 무게를 측정한 실험의 결과 사진이다.
도 10은 4배체 도라지의 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위해 배지 구성물질 농도별로 부정근의 무게를 측정한 그래프이다.
도 11은 4배체 도라지의 액체배양시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위해 배지 구성물질 농도별로 부정근의 무게를 측정한 실험의 결과 사진이다.
도 12는 4배체 도라지의 생물반응기 배양 시 MS배지의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 13은 4배체 도라지의 생물반응기 배양 시 sucrose의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 14는 4배체 도라지의 생물반응기 배양 시 IBA 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 15는 4배체 도라지의 생물반응기 배양 시 배지의 pH가 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 16은 4배체 도라지의 생물반응기 배양 시 접종밀도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 17은 4배체 도라지의 생물반응기내 공기주입량에 따른 부정근의 생장에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 18은 기외에서 재배한 2배체 및 4배체와 기내에서 재배한 4배체 도라지 부정근의 아미노산 함량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 본 발명자들이 선공개한 발명에서 개시한 기내 배양기술을 이용하여 육성된 4배체 도라지의 배양방법을 이용한 발명으로서 도라지 부정근의 대량생산을 위한 배지 조성물 및 그 배양방법에 관한 것이다..
본 발명에 따르면 4배체 도라지를 이용하여 기내배양시 부정근의 생장율은 생장조절물질 옥신류 IAA NAA 및 IBA를 첨가했을 때 IBA 첨가구에서 생장율이 가장 왕성한것을 확인하였다.
또, 본 발명에 따르면 4배체 도라지 부정근 유도배지의 탄소원으로 sucrose를 첨가한 구에서 가장 왕성한 성장을 보였으므로 생물반응기에서 4배체 도라지의 대량생산에서도 이를 원용하였다.
본 발명에 따르면 본 발명 4배체 부정근과 함께 식품학적으로 허용 가능한 식품보조제를 포함하는 건강기능성식품을 제공할 수 있다. 본 발명을 통해 얻은 4배체 도라지 부정근을 이용하여 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 과자 등 각종 건강 기능성 식품류 제형을 제공할 수 있다.
또, 본 발명에 따르면 본 발명 4배체 도라지 부정근으로 건강기능성식품으로 사용될 경우 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등 다양한 제형의 식품을 제공할 수 있다.
본 발명은 하기의 구체적인 실시예와 실험예에 의해 보다 구체적으로 설명되나, 하기 실시예와 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예1. 4배체 도라지의 제조
4배체 도라지의 제조를 위해 0.01 내지 0.1% 콜히친을 증류수에 녹인 후 0.45㎛ 필터를 사용하여 멸균하였다. 기내에서 배양중인 도라지의 절 및 줄기를 1cm로 잘라 콜히친 용액에 3, 6, 12, 24시간 침지하여 암상태에서 현탁배양하였다. 침지된 절편체를 멸균수에 3회 세척하고 물기 제거 후 1/2 MS배지에 치상하였다. 배양 2개월 후 발아된 도라지 식물체는 다시 1/2 MS배지에서 배양, 유지하였다. 본 발명은 3회 반복하였다.
상기 콜히친 용액은 백합과 식물인 콜키쿰의 씨앗이나 구근에 포함되어 있는 알칼로이드 성분으로 세포 내에서 근육과 골격 역할을 하는 것으로 알려져 있는 단백질인 튜블린에 결합해서 그 기능을 방해하는 것으로 알려져 있다. 이로 인해 세포분열을 할 때 튜블린이 사용되는 방추사의 기능을 저해해서 염색체가 잘 분리되지 않도록 하는 효과가 있다. 이러한 효과로 식물이 세포분열을 할 때 염색체의 분리를 저해하여 생식세포가 4배수체인 도라지를 제조하였다..
상기 MS배지란 무라시게 스쿠그 배지 (Murashige & Skoog)로 일반적으로 식물세포를 키울수 있는 증식배지로 KNO3, NH4NO3, CaCl2-2H2O, MgSO4-7H2O, KH2PO4, NA2EDTA, FeSO4-7H2O, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KI, Na2MoO4, CuSO4, CoCl2, Nicotinic acid, Pyridoxine-HCl, Thiamine-HCl 등의 시약들을 추가하여 만든다. 여기에는 대량영양소, 금속계, 미량원소, 비타민 등 첨가물로 구성이 되어 있고, 보통 다른 배지에 비하여 NO3-N, NH4-N 및 K의 함량이 매우 높은 것이 특징이다.
이하, 4배체 도라지 부정근 유도 배지 조성은 하기 표1과 같다.
부정근 유도 배지 조성.
구분 성분 함량(mg/L)
황산염(Sulfate) MgSO47H2O
MnSO44H2O
ZnSO47H2O
CuSO45H2O		 370
22.3
8.6
0.025
질산염(Nitrate) NH4NO3
KNO3 		1650
1900
할라이드(Halide) CaCl22H2O
KI
CoCl26H2O		 440
0.83
0.025
인산염(Phosphate) KH2PO4
H3BO3
Na2MoO42H2O		 170
6.2
0.25
FeEDTA Na2EDTA
FeSO47H2O		 37.3
27.8
비타민 thiamin HCl
myo-inositol
nicotinic acid
glycine
pyridoxine HCl		 0.1
100
0.5
2.0
0.5
식물생장조절물질 IAA
NAA
IBA		 5
0.5
5
탄소원 Sucrose 5.0
교질재료 Agar 8.0
물 Distilled H2O 잔량
실험예1. 배수체 판정 실험
본 발명에 따른 상기 실시예1에서 얻은 4배체 도라지의 DNA함량의 차이에 따른 배수체 판정을 위하여 유세포분석기기(Flow cytometry : Patec PA-1, Germany)를 이용하여 DNA 함량의 배가 여부를 확인하였다. 유세포분석기기는 유액 상태의 입자나 세포가 일정 감지지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 한 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정하고 세포들만을 선택하여 분리할 수 있는 장비이다.
이를 평가하기 위해 절편체에서 재생된 식물체의 잎을 약 0.5 x 0.5cm의 크기로 자른 후 DNA를 추출한 후 염색한 다음 유세포분석을 이용하여 DNA 함량의 배가여부를 확인하였다. 각 실험은 500개체씩 3회 반복하여 재현성을 확보하였다.
실험 결과, 도 2 및 하기 표2에서 알 수 있듯이 콜히친의 농도보다는 시간에 의해 생존률의 영향을 크게 받는 것으로 나타났고 콜히친의 침지 시간이 길어질수록 생존율은 감소하는 것으로 나타났다. 콜히친 처리한 1500개의 도라지의 절 중에서 1175개체의 식물체가 재생되어 생존율을 78.3%였으며 이들의 DNA함량을 분석한 결과 216개체가 4배체 식물로 판명되어 4배체 획득률은 18.4%로 매우 높은 획득률을 보였다.
콜히친 용액의 농도에 따른 도라지의 절 생존율
시간
농도(질량%) 		3 6 12 24
0.01 100 100 95 65
0.05 100 95 85 15
0.1 100 100 45 40
이상의 실험 결과, 4배체 도라지를 제조하는데 적합한 콜히친 처리 농도는 0.01 ~0.1%에서 12시간 이내인 것으로 확인되었다.
실험예2. 4배체 도라지의 부정근 형성에 영향을 미치는 생장조절물질 옥신류의 효과
본 발명에 따른 상기 실시예1을 통해 제조된 4배체 도라지의 부정근 유도를 위한 적정 재료를 선정하기 위하여 배양재료 및 생장조절물질인 옥신류의 IBA의 농도별 효과를 확인하였다. 식물생장조절물질은 식물의 특정 생장반응을 조절하는 물질의 총칭으로 미량의 농도로도 활성이 있으며 촉진작용하는 것과 저해작용하는 것이 있다. 본 발명에서 사용한 식물생장조절물질 옥신류는 IAA, NAA, IBA 등이었다.
도라지 4배체 부정근 유도의 형성에 옥신류의 효과를 평가하기 위해 엽절편을 배양재료로 하고 생장조절제인 옥신류를 기본 MS배지에 각각 0.1 내지 5mg/L 농도로 첨가하여 배양하였다. 배양조건은 25±1℃, 40umol/m2/s의 광으로 16시간 조명하였으며 8주간 배양한 후 부정근의 길이를 조사하여 확인하였다.
실험 결과, 도 4에서 알 수 있듯이 옥신류의 종류는 IBA, NAA, IAA 순으로 부정근의 형성이 양호한 것으로 나타났다. IBA의 첨가는 농도가 높아질수록 부정근의 형성이 촉진되는 경향이 있었고, IBA 5mg/L 첨가구에서 3cm 이상의 부정근이 형성되었다. NAA의 첨가는 농도가 낮을수록 부정근 형성에 양호하게 나타났다. IAA의 경우에는 전체적으로 생장이 저조하였다. 이상의 실험결과, 4배체 도라지 부정근 형성에는 배양조건 25±1℃, 40umol/m2/s 광에서 16시간 조명하에 8주간 배양 시 IBA 0.5 ~ 5mg/L 처리가 가장 바람직한 것으로 확인되었다.
실험예3. 4배체 도라지의 부정근 형성에 영향을 미치는 sucrose의 효과
본 발명에 따른 상기 실시예1을 통해 제조된 4배체 도라지의 부정근 유도를 위하여 배양에 사용되는 적정 배지를 선정하기 위하여 sucrose의 농도별 효과를 확인하였다.
엽절편을 재료로 하여 sucrose를 각각 0 내지 7%의 농도로 첨가한 기본 MS배지에 IBA를 5mg/L로 첨가하여 배양하였다. 배양조건은 상기 실험예2와 동일하게 25±1℃, 40umol/m2/s의 광으로 16시간 조명하였으며 8주간 배양한 후 부정근의 길이를 조사하여 확인하였다.
실험 결과, 도 5에서 알 수 있듯이 sucrose의 농도가 높을수록 부정근의 형성이 양호하게 나타났고, sucrose를 첨가하지 않은 처리구에서는 부정근의 형성이 저조하였다.
실시예2. 4배체 도라지의 액체배양을 통한 부정근의 증식
액체배양 시 부정근 증식에 효과적인 배지를 선정하기 위하여 적정 생장조절제의 종류(IBA, NAA, IAA) 및 농도(0.5, 1 ,2mg/L), 적정 sucrose 농도(1, 3, 5, 7%), 적정 배지 구성물질 농도 (1/4, 1/2, 1, 2 MS)에 대하여 조사하였다. 공시재료로 IBA 2mg/L가 첨가된 고체 배지에서 유도된 부정근 0.5g(1cm)을 사용하였으며, 50mL 액체 배지가 들어있는 100mL 삼각플라스크에서 배양하였다. 모든 실험은 암조건하에서 110rpm으로 현탁배양하였으며, 배양 6주 후 부정근의 무게를 조사하였다.
실험예4. 액체배양 시 4배체 도라지의 부정근 생장에 미치는 생장조절제 종류 및 농도의 영향
본 발명에 따른 상기 실시예2의 방법에 따라 생장조절제 종류 및 농도가 4배체 도라지의 부정근 생장에 미치는 영향을 확인하기 위한 적정 생장조절제의 종류 및 농도를 확인하기 위해 기본 MS배지에 종류 및 농도별로 첨가하고 pH 5.8로 조절하였다. 생장조절제는 0.5 내지 2mg/L의 농도로 첨가하였다.
실험 결과, 도 6 및 도 7에서 알 수 있듯이 액체배양 시 생장조절제의 종류 및 농도에 따른 4배체 도라지 부정근의 형성 효과는 IBA는 1 내지 2mg/L 첨가구에서 양호한 부정근의 생장을 보였으며, 특히 IBA 1mg/L 첨가한 배지에서 양호한 결과가 나타났으며 IBA 2mg/L 배지에서는 캘러스가 같이 유기되었다. NAA는 농도가 낮아질수록 양호한 경향으로 0.5mg/L 첨가구에서 부정근의 생장이 좋았으나 주로 캘러스가 형성되어 부정근 생장에는 적합하지 않았다. IAA의 경우 모든 처리구가 저조한 결과로 생장에 큰 변화를 나타내지 않았다.
실험예5. 액체배양 시 4배체 도라지의 부정근 생장에 미치는 sucrose의 영향
본 발명에 따른 상기 실시예2의 방법에 따라 sucrose의 농도가 4배체 도라지의 부정근 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 기본배지는 IBA 1mg/L가 첨가된 MS배지, pH 5.8로 조절된 액체 배지에 sucrose를 0 내지 7%를 첨가하였다.
실험 결과, 도 8 및 도 9에서 알 수 있듯이 sucrose의 농도가 높을수록 부정근의 생장이 왕성하였다. sucrose를 첨가하지 않은 첨가구에서는 부정근의 생장이 저조하였다. sucrose를 처리하지 않은구 및 저농도인 1%의 첨가구에서는 부정근의 생장이 저조하였고 농도가 높았던 5% 또는 7% 첨가구에서는 부정근의 생장이 왕성함을 보였다.
실험예6. 액체배양 시 4배체 도라지의 부정근 생장에 미치는 무기물 농도의 영향
본 발명에 따른 상기 실시예2의 방법에 따라 sucrose의 농도가 4배체 도라지의 부정근 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 기본배지는 IBA 1mg/L가 첨가된 MS배지, 3% sucrose, pH 5.8로 조절된 액체 배지를 사용하였다. 상기 MS배지는 1/4 내지 2 MS배지를 사용하였다.
실험 결과, 도 10 및 도 11에서 알 수 있듯이 MS배지에 첨가되는 무기물의 농도가 낮을수록 양호한 경향으로 1/4 내지 1/2 MS배지에서 양호한 생장을 나타냈고, 고농도의 무기물이 첨가된 처리구에서는 부정근의 생장이 억제되었다.
실험예 3 내지 5의 실험 결과, 부정근 증식에 사용하는 재료로 1cm의 4배체 도라지 부정근 사용시 증식배지조성으로 1/4 내지 1/2 MS기본배지, sucrose 3% 내지 7%, IBA 1 내지 2 mg/L가 첨가된 액체배지가 4배체 도라지 부정근의 생장에 가장 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.
실험예7. 4배체 도라지의 생물반응기(bioreactor) 배양시 MS배지의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향
1L 바이오 리엑터에서 4배체 도라지 배양시 MS배지 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 기본 MS배지의 농도를 1/4 내지 1로 하고 IBA 1mg/L, sucrose 3%, pH 5.8로 조절한 배지에 1달간 배양하였고 결과를 비교하기 위해 부정근의 무게와 뿌리의 길이를 측정하였다.
실험 결과, 도 12에서 알 수 있듯이 배양 2주 후부터 MS배지의 농도가 높을수록 빠르게 부정근이 형성되는 것이 관찰되었고, 부정근의 형태는 농도가 높은 MS배지의 경우 부정근의 길이가 길게 성장하는 것으로 나타났다. 그러나 부정근의 길이로 인하여 배양 3주 후부터는 배지 내에서 움직이지 않고 정치된 상태에서 성장하였다.
실험예8. 4배체 도라지의 생물반응기 배양시 sucrose의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향
3L 바이오 리엑터에서 4배체 도라지 배양시 sucrose의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 기본 1/2 MS배지에 0% 내지 5% sucrose를 첨가하여 1달간 배양하였고 결과를 비교하기 위해 부정근의 무게를 측정하였다.
실험 결과, 도 13에서 알 수 있듯이 초기의 생장은 3% sucrose가 첨가된 배지에서 왕성한 경향이 있었으나 후기로 갈수록 생장이 sucrose의 농도가 높을수록 높은 것으로 나타났다.
실험예9. 4배체 도라지의 생물반응기 배양시 IBA의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향
3L 바이오 리엑터에서 4배체 도라지 배양시 IBA의 농도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 기본 MS배지에 0.5 내지 2mg/L로 첨가하고 1달간 배양하였다. 결과를 비교하기 위해 부정근의 무게를 측정하였다.
실험 결과, 도 14에서 알 수 있듯이 IBA의 농도가 높아질수록 총 생체중이 높은 것으로 나타난 반면 부정근이 갈변 되는 경향이 있었다. IBA 0.5mg/L의 경우 캘러스의 형성은 관찰되지 않았으나 생장은 다른 처리구에 비해 저조하였다.
실험예10. 4배체 도라지의 생물반응기 배양시 pH가 부정근의 생장에 미치는 영향
1L 바이오 리엑터에서 4배체 도라지 배양시 pH가 부정근의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 sucrose 3%, IBA 1mg/L가 첨가된 기본 MS배지에 배지의 pH를 3.8 내지 7.8로 조절하여 부정근을 1달간 배양하였고 결과를 비교하기 위해 부정근의 무게를 측정하였다.
실험 결과, 도 15에서 알 수 있듯이 pH 3.8에서 가장 많은 부정근의 생장을 확인하였고 pH 7.8로 조절된 배지에서는 생장반응이 나타나지 않았다.
실험예11. 4배체 도라지의 생물반응기 배양시 접종밀도가 부정근의 생장에 미치는 영향
바이오 리엑터에서 4배체 도라지 배양시 접종밀도가 부정근의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 3L 바이오 리엑터에 sucrose 3%, IBA 1mg/L가 첨가된 기본 MS배지에 접종량을 1 내지 3g/L로 1달간 배양하였다.
실험 결과, 도 16에서 알 수 있듯이 배양 20일 후에는 3g/L 처리구의 부정근이 움직이지 못하고 정치되어 있는 것이 관찰되었고 28일 후에는 2g/L 처리구의 부정근이 정치되어 1g/L 처리구만이 움직이는 것으로 관찰되었다.
실험예12. 4배체 도라지의 생물반응기 배양시 공기주입량에 따른 부정근의 생장 비교
4배체 도라지의 바이오 리엑터 배양시 공기주입량에 따른 부정근의 생육 및 배지 소모량을 비교하기 위해 배양 시 공기 주입량을 0.1 내지 0.3vvm으로 처리하여 6주간 배양하였고 결과를 비교하기 위해 생육조사 하였다.
실험 결과, 도 17에서 알 수 있듯이 부정근의 생장은 0.1vvm 처리 시 가장 뛰어난 생장을 보였으며, 부정근의 길이는 0.1vvm에서 다른 처리구에 비해 좋았다. 배지의 소모량 또한 0.1vvm에서 가장 적었다.
실험예 6 내지 11의 실험 결과, 바이오 리엑터를 이용한 4배체 도라지의 부정근 대량생산을 위해 4 내지 6주간 배양할 때 배양재료로는 기내 액체배양에서 증식중인 부정근 2 내지 3g/L가 가장 바람직하고 배양 배지로는 기본 배지 농도가 1/4 내지 1/2일 때, sucrose 5% 내지 7%, 생장조절제 IBA 1 내지 2mg/L 배지 내 pH 3.8 내지 5.8, 바이오 리엑터 내 공기 주입량 0.1 내지 0.2vvm 일 때 가장 바람직하였다.
실험예13. 2배체, 4배체 도라지 및 부정근의 아미노산 분석
기외에서 재배한 2배체 및 4배체 도라지의 뿌리와 바이오 리엑터에서 증식된 부정근의 아미노산을 분석하였다. 이를 위해 자연조건상태에서 건조하여 분말로 만든 후, tube에 넣고 산화 방지를 위해 6N HCl 5mL을 가하였고 질소가스를 주입 후 마개를 막고 110℃에서 24시간 방치하였다. 상기 샘플을 가수분해한 다음 방냉시키어 시료를 취하였고 heating block에 넣어 HCl을 제거하였다. HITACH L-8900 아미노산 분석기를 통하여 구성 아미노산 18종을 분석하였다.
분석 결과, 도 18에서 알 수 있듯이 기외에서 재배되고 있는 도라지 뿌리에 비해 부정근에서 많은 아미노산이 있는 것으로 확인되었다. 특히 아스파르트산과 글루탐산은 도라지 뿌리보다 5 내지 9배 이상 많았다.
상기 아스파르트산은 단백질을 구성하는 아미노산의 하나로 영양적으로는 비필수아미노산으로 분류되지만 생체 내 아미노기 전이반응에서 중심적 역할을 하고, 글루탐산은 영양학적으로 우수한 아미노산으로 여러 가지 아미노산을 형성하는데 아미노기 공급효과가 크다. 또한, 프롤린은 글루탐산으로 전환되어 아미노산 대사에 중요한 역할을 하고 아르기닌은 arginine succinic acid lyase 결핍환자의 치료에 유효하고 조직 단백질 합성을 증가시키는 자극물질이다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명은 기내 배양기술을 이용하여 육성된 4배체 도라지의 부정근을 대량생산하기 위한 배지 조성물 및 배양방법을 제공하는 효과가 있을뿐만 아니라 배양된 4배체 도라지는 아스파르트산, 글루탐산, 프롤린 및 아르기닌 등 아미노산이 기외배양 도라지에 비해 현저히 풍부한 효과가 있으므로 건강기능성식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (4)

  1. 기내 액체배양중의 4배체 도라지 부정근 2 ~ 3g/L를 1/4 ~ 1/2 MS배지가 첨가된 바이오 리엑터에 5% ~ 7% sucrose, 1 ~ 2mg/L IBA를 첨가한 다음 pH를 3.8 ~ 5.8로 조절한 후 기내 공기주입량 0.1 ~ 0.2vvm에서 4 내지 6주간 배양하는 것을 특징으로 하는 4배체 도라지 부정근의 대량생산 방법.
  2. 제 1항의 방법에 따라 생산되어 아스파르트산과 글루탐산이 증강된 4배체 도라지 부정근.
  3. 제 2항의 4배체 도라지 부정근이 함유된 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 과자로 구성된 식품 중 어느 하나의 건강기능성 식품 조성물.
  4. 제 3항의 4배체 도라지 부정근이 함유된 식품 조성물이 정제, 캡슐제, 환제 및 액제로 구성된 제형 중 어느 하나의 제형을 갖는 건강기능성 식품 조성물.

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