KR100736150B1 - 소포자 배양 기술을 이용한 고추의 정상 배 생산 방법 - Google Patents

소포자 배양 기술을 이용한 고추의 정상 배 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소포자 배양기술을 이용한 고추의 정상 배 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추의 소포자 배양에 있어서 전처리 재료로 소포자를 사용하고, 전처리 배지는 0.37M 만니톨과 수크로오스만 제외한 NLN 배지가 포함된 것을 사용하며, 소포자를 NLN 배지에 치상한 후 동일한 조성의 배지를 첨가하며, 액체배양 대신 2중층 배양 방법을 이용하여 정상 배를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 고추의 정상 배 생산 방법은 반수성인 동시에 단세포 상태인 소포자로부터 다량의 정상 자엽배를 획득할 수 있으므로 반수체 육종뿐만 아니라 소포자 형질전환이나 돌연변이 기술을 이용한 우수 품종 연구 및 개발에 이용할 수 있게 되어 식물생명공학 분야에 유용한 발명이 될 것이다.
소포자 배양, 고추, 배 생산

Description

소포자 배양 기술을 이용한 고추의 정상 배 생산 방법{A method for normal embryo production through microspore culture in Capsicum annuum L.}
도 1은 약 전처리 시 전처리 배지가 배 발생에 미치는 영향을 나타내는 사진이다. A는 기아배지 A, B는 A+NLN 10%, C는 0.37M 만니톨+NLN 미네랄, 그리고 D는 0.37M 만니톨+ NLN (-수크로오스)배지를 처리하였을 때를 나타낸다. A의 바(bar)는 1㎜의 크기를 나타낸다.
도 2는 소포자 전처리 시 전처리 배지가 배 발생에 미치는 영향을 나타내는 사진이다. A는 기아배지 A, B는 A+NLN 10%, C는 0.37M 만니톨+NLN 미네랄, 그리고 D는 0.37M 만니톨+ NLN(-수크로오스)배지를 처리하였을 때를 나타낸다.
도 3은 소포자 전처리 후 배양 중 배지 첨가가 배 발생에 미치는 영향을 나타내는 사진이다. A, B, C, D 및 E는 각각 치상 후 0, 1, 2, 3 및 4일 후의 새 배지 첨가에 따른 영향을 나타낸다.
도 4는 소포자 배양 중 배지 첨가 횟수가 배 발생에 미치는 영향을 나타내는 사진이다. A, B, C 및 D는 각각 치상 후 0, 1, 2 및 3회의 새 배지 첨가 횟수에 따른 영향을 나타낸다.
도 5는 배지의 물리적 상태가 배 발생에 미치는 영향을 나타내는 사진이다. 치상 1 일 후 배지를 첨가하였으며, A는 NLN 액체배지, B~E는 2중층 배지에서 배양한 경우를 나타낸다. 이때 2중층 배지의 고체배지가 B는 NLN, C는 1/2 NLN, D는 NN, E는 B5 배지인 경우를 나타낸다.
도 6은 소포자 유래의 식물체 발달을 나타내는 사진이다. 치상 1일 후 배지를 첨가 하였으며, 소포자를 1/2 NLN 2중층 배지에 배양하여 4주 후 발달된 자엽배를 B5 고체배지에 옮겼을 때 유식물체로의 발달을 나타낸다.
본 발명은 소포자 배양 기술을 이용한 고추의 정상 배 생산 방법에 관한 것이다.
일반적으로 식물은 배낭의 난세포와 화분의 정세포가 결합하는 유성생식을 통하여 후대를 남기게 되는데 드물게 난세포나 정세포가 단독으로 발육하여 배를 형성하는 경우가 자연 상태에서 종종 있으며, 이러한 식물체는 염색체의 수가 정상개체의 반수에 해당하게 되므로 반수체(haploid)라 명명하고 있다. 이러한 반수체는 약제처리 등 인위적으로 염색체 수를 배가시킬 수 있으므로 유전적으로 순수한 계통을 손쉽게 만들어 낼 수 있다.
반수체 식물의 유전자는 쌍으로 존재하지 않으므로 우성과 열성관계가 없어지고 모 든 형질이 그대로 나타난다. 따라서 이러한 반수체 식물체로부터 돌연변이체나 형질전환체를 선발하게 되면 우성-열성관계로 나타나지 못하던 유용한 열성인자를 가진 식물체를 선발할 수 있다.
종래에는 반수체를 획득하는 방법으로 주로 약(꽃밥, anther)배양이 이용되어 왔으나, 유체에서 소포자 배양에 의해 다량의 배를 획득하는 것이 가능해지면서 많은 식물에서 소포자 배양에 관한 연구들이 이루어지고 있다. 이는 소포자 배양이 약배양에 비해 체세포조직(somatic tissue)인 약벽 조직과 반수성 조직(haploid tissue)인 소포자가 혼재하여 체세포 유래의 배와 소포자 배가 섞일 가능성이 없고, 각기 다른 화분 유래의 캘러스(callus)가 융합하여 식물체로 분화되어 키메라 식물(chimeric plant)이 생겨날 염려가 없으며, 배 및 유식물체의 발생이 매우 높으며, 출발물질(starting material)이 반수성인 동시에 단세포 상태이므로 형질전환 및 돌연변이 유기에 매우 유리하기 때문이다.
그러나 이러한 장점에도 불구하고 소포자만 분리하여 배양할 경우 배나 캘러스를 얻기가 어려워 국내·외적으로 소포자 배양에 성공한 식물이 많지 않으며, 현재까지 소포자 배양이 비교적 용이하게 이루어져서 다량의 배를 획득할 수 있는 식물은 유채(Jardinaud MF. et al., 1993, Plant Science, 93:177-184)를 포함하여, 밀(Folling L. and Olesen A., 2001, Plant Cell Rep., 20:1098-1105), 보리(Zheng M. et al., 2001, Plant Cell Rep., 20:685-690), 담배(Aionesei T. et al., 2006, Plant Cell Rep., 25:410-416) 등 소수의 식물에 국한되어 있으며, 대한민국 등록특허 제 10-0526161 호에는 고추의 소포자 배양 방법이 개시되어 있다. 그러나 소포자 배양에 성공한 식물에서도 배 발생 비율이 매우 낮아 실제로 형질전환이나 돌연변이 유기에 널리 이용되지 못하고 있다.
현재 소포자 배양 시 배양 소포자 중 일부만 배로 발달하고 대부분이 퇴화되며, 소포자가 배발생적(embryogenic)으로 되어도 구형시기의 배에서 생장이 중단되고 정상적인 배로 발달하지 못하는 경우가 많다. 그러므로 배양 소포자가 조포체인 배로 발달하는데 적합한 조건을 밝히고, 또한 배양 조건뿐만 아니라 전처리 조건에 의해서도 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있어 이들의 연구가 절실히 요구된다.
이에, 본 발명자들은 소포자 배양법이 형질전환이나 돌연변이 연구에 이용되려면 정상 자엽배의 발생이 높아야 하므로, 유식물체로 발달할 수 있는 정상 배들을 다량 획득하기 위하여 소포자 배를 유기하는 동시에 유기된 배가 정상 자엽배로 발달하는데 적합한 조건을 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 소포자 배양 방법을 이용한 고추의 정상 배의 생산 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 소포자 배양 방법을 이용한 고추의 정상 배의 생산 방법을 제공한다.
식물의 소포자 배양시 전처리 재료로는 화서, 꽃봉오리, 약 및 나출 소포자등 여러 가지가 이용되고 있다. 그러나 화서, 꽃봉오리, 약의 전처리 시에는 전처리 중 소포자의 분열이 일어나 단세포 상태가 아닌 다세포 상태가 될 수 있으므로 형질전환이나 돌연변이 연구에 불리하며, 약 전처리 시에는 꽃봉오리로부터 일일이 약을 꺼내야 하는 수고가 필요할 뿐만 아니라 이때 오염이 생기는 경우가 많다. 그러므로 소포자 전처리가 바람직하지만 배양에 성공하지 못하는 경우가 많으며, 이는 초기 소포자 분열에 필요한 양분이 약벽으로부터 공급되기 때문인 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 소포자 배양시 전처리 재료의 영향을 조사하기 위해 전처리 배지가 소포자 배양에 미치는 영향과 치상 후 새 배지의 첨가가 소포자 배양에 미치는 영향을 밝히기 위하여 전처리 재료로 약과 소포자를 사용한 후 배의 발생 및 발달에 미치는 영향을 비교 조사하였다.
소포자가 웅성배우체인 화분으로 발달하지 않고 배발생적인 소포자가 되어 조포체인 배로 발달하는 데에는 전처리 시 사용되는 배지의 영향이 큰 것으로 알려져 있다. 일반적으로는 기아 배지가 많이 이용되고 있으나, 배발생적인 소포자가 계속 분열하여 배로 발달하는 데에는 전처리시 지나친 기아상태 보다는 소포자에 영양을 공급할 수 있는 배지가 효과적(Liu W. et al., 2002, Plant Cell Rep., 20:821- 824)이라고 보고되어, 화본과 식물인 밀, 보리 등에서 널리 이용되고 있는 기아배지 A 또는 만니톨(mannitol)에 치상배지인 NLN 배지 전체 또는 일부를 첨가한 배지를 사용하여 전처리한 후 소포자배의 발생 및 발달에 미치는 영향을 조사하였다.
배양 중 소포자는 자가 독신(autotoxin)을 배출하므로 배의 발생 및 발달이 저해되는 것으로 알려져 있다. 실제 유채에서는 자가 독신을 줄이기 위해 치상 1일 후 배지를 교환하면 배의 발생은 물론 정상인 자엽배도 증가하게 된다. 본 발명에서도 배지를 교환하는 예비 실험을 실시하였으나 배의 발생이 심하게 감소하였다. 따라서 배지를 교환하는 대신 치상 후 1일부터 4일까지 시기를 달리하여 새 배지를 첨가한 후 소포자 배의 발생 및 발달에 미치는 영향을 조사하였다.
약이나 소포자 배양시 배의 발생 및 발달은 배지의 물리적 상태에 따라 크게 영향을 받는다. 본 발명에서는 배지의 조성이 1/2 NLN, NLN, B5, NN으로 각기 다른 4가지 고체배지 위에 소포자가 현탁된 NLN 액체 배지를 치상하는 2중층배지를 사용하여 배지의 물리적 상태가 배의 유기 및 발달에 미치는 영향을 조사하였다.
실시예 2, 3 및 4는 각 단계에서 독립적으로 실시되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정 되는 것은 아니다.
실시예 1. 소포자 배양 방법
(1-1) 모식물의 생육
고추(밀양 재래)의 종자를 직경 25cm의 플라스틱 화분에 파종하여 4주 후, 직경 30cm의 화분에 1개체씩 이식하여 사용하였다. 생장 조건은 온도는 25℃이고, 광주기의 낮의 길이가 18시간이며, 광도는 형광등과 금속램프를 이용하여 15,000~20,000 Lux가 되도록 유지하였다.
(1-2)적기의 꽃봉오리 채취 및 멸균
1/4~3/4 정도가 보라색으로 착색된 약(anther)이 들어있는 꽃봉오리를 채취하여, 2% 치아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 7분간 멸균한 후, 멸균수로 3~4회 수세하였다.
(1-3)소포자의 나출
마이크로-블랜더(waring blender, 8575 micro container)에 약 30개의 꽃봉오리를 넣고 10㎖의 기아 배지 A(표 1)를 첨가한 후, 18,000rpm에서 5초씩 2회 블랜딩(blending)하고, 이를 고속으로 15초씩 2회 볼텍싱(voltexing)하여 소포자를 나출하였다(마이크로-블랜더와 기아 배지 A는 냉장고에 보관하여 사용).
[표 1] 기아배지 A의 조성
성분 함량(㎎/ℓ)
염화칼슘(CaCl2) 1,110
황산마그네슘(MgSO4?7H2O) 246.47
질산칼륨(KNO3) 101.1
인산이수소칼륨(KH2PO4) 27.22
요오드화칼륨(KI) 0.166
황산구리(CuSO4?5H2O) 0.02498
만니톨(Manitol) 67.414g
(1-4)소포자의 수확 및 수세
상기의 소포자와 체세포 조직 파편(debris)들이 섞여있는 혼합액을 구멍의 크기가 75㎛ 및 38㎛인 체(sieve)에 여과하여 소포자를 분리하고, 1,000rpm에서 5분간 원심분리하여 모은 소포자 침전물을 전처리 배지로 수세하여 1,000rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 이와 같은 수세과정을 3회 실시하였다.
(1-5)소포자의 전처리
전처리 배지에 치상 밀도가 2×105 소포자/㎖이 되도록 하여 90× 20㎜ 크기의 세균배양접시에 9~12㎖씩 분주하고 파라필름으로 봉한 후 건조를 막기 위해 멸균수로 적신 필터종이가 들어 있는 140×20㎜ 크기의 세균배양접시에 넣어 다시 파라필름으로 봉하여 32℃에서 3일간 처리하였다. 전처리 배지는 전처리 배지 실험을 제외한 모든 실험에서 0.37M 만니톨+ NLN (-수크로오스)배지를 사용하였다.
(1-6)소포자의 치상
치상 배지(NLN 배지)에 소포자 밀도를 80,000~100,000 소포자/㎖이 되도록 하여 60×15㎜ 크기의 세균배양접시에 2.5㎖씩 분주하고 파라필름으로 접시를 봉하였다.
(1-7)소포자의 배양
소포자가 들어 있는 세균배양접시를 투명한 플라스틱 박스에 넣은 후, 27℃의 암상태에서 3~4주간 배양하였다.
(1-8)유식물체로의 전환
배양 4주 후 발생한 자엽시기 배를 배 발아 배지(수크로오스 2%가 첨가된 B5 고체배지)로 옮긴 후 25℃에서 18시간 광주기인 저온 배양기에서 배양하였다. 이때 광도는 형광등을 사용하여 약 1,500~2,000 Lux가 되도록 하였다.
실시예 2. 전처리 배지가 소포자 배양에 미치는 영향
소포자 배양 시 배의 유기 및 발달에 효과적인 전처리 배지의 조성을 밝히기 위하여 기아배지 A를 대조구(control)로 하여 A 배지에 치상배지인 NLN을 10% 첨가한 배지[A+NLN 10%], 0.37M 만니톨(mannitol)에 NLN의 미네랄을 첨가한 배지[0.37M 만니톨+NLN mineral], 0.37M 만니톨에 수크로오스를 제외한 NLN의 무기물과 유기물을 모두 첨가한 배지[0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)]의 4가지 전처리 배지를 사용하여 소포자 배양에 미치는 영향을 조사하였다.
[표 2] NLN 배지의 조성 (pH 5.8~6.0)
성분 함량(㎎/ℓ) 성분 함량(㎎/ℓ)
주영양소 비타민
질산칼륨(KNO3) 125 마이오이노시톨(Myo-inositol) 100
황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 125 니코틴산(Nicotianic acid) 5
질산칼슘[Ca(NO3)2·4H2O] 500 염산 피리독신(Pyridoxine HCl) 0.5
제일인산칼륨(KH2PO4) 125 염산 치아민(Thiamine HCl) 0.5
엽산(Folic acid)b 0.5
미량영양소 글리신(Glycine) 2
황산망간(MnSO4·4H2O) 22.3 비오틴(Biotin) 0.05
붕산(H3BO3) 6.2
황산아연(ZnSO4·7H2O) 8.6 아미노산 보충제
몰리브덴산나트륨(Na2MoO4·2H2O) 0.25 글루타민(Glutamine) 800
황산구리(CuSO4·5H2O) 0.025 글루타티온(Glutathione) 30
염화코발트(CoCl2·6H2O) 0.025 세린(Serine) 100
요오드화칼륨(KI) 0.83
수크로오스(Sucrose) 10%
철a
황산제일철(FeSO4·7H2O) 27.8
Na2·EDTA 37.2
a 철 성분은 각각 증류수에 넣고 열교반하여 용해시킨다. 두 용액을 혼합하고 증류수를 첨가하여 최종부피를 맞춘다(pH 5.5).
b 엽산과 비오틴은 각각 0.1N 수산화나트륨에 용해시킨다.
(1) 약 전처리
전처리 배지 3㎖이 들어있는 60×15㎜ 크기의 세균배양접시(petri dish)에 상기 실시예 1-2의 멸균한 꽃봉오리로부터 약을 꺼내어 150개씩 넣고 파라필름(parafilm)으로 접시를 봉한 후, 건조를 막기 위해 멸균수로 적신 필터 종이(filter paper)가 들어 있는 140× 20㎜ 크기의 세균배양접시에 넣고 파라필름으로 봉한 후, 32℃에 서 3일간 처리하였다. 전처리한 약으로부터 소포자를 수확하기 위하여 마이크로-블랜더에 150개의 약을 넣고 5㎖의 전처리 배지를 첨가한 후 18,000rpm에서 5초씩 2회 블랜딩하였다. 그 다음 소포자들을 50㎖ 원심분리관에 넣고 1,000rpm으로 원심분리하여 모은 후 치상배지로 1회 수세하였다. 그리고 실시예 1-6 및 1-7과 동일한 방법으로 소포자를 치상 및 배양하였다(도 1).
2) 소포자 전처리
상기 실시예 1에서 수확한 소포자를 전처리 배지에 치상 밀도(plating density)가 2×105 소포자/㎖가 되도록 하여 90×20㎜ 크기의 세균배양접시에 9~12㎖씩 분주하고 파라필름으로 봉한 후, 멸균수로 적신 필터 종이가 들어 있는 140×20㎜ 세균배양접시에 넣어 다시 파라필름으로 봉하여 32℃에서 3일간 처리하였다. 그리고 실시예 1-5, 1-6 및 1-7과 동일한 방법으로 소포자를 수세, 치상 및 배양하였다(도 2, 표3).
[표 3] 고추의 소포자 배양시 배의 생산에 미치는 전처리 배지의 영향
전처리 시료 전처리 배지 발생된 배의 수/배양접시 전체 배의 수/배양접시
구형 심장형 자엽배 ELSa의 수
약 기아배지 A 8.3±4.4 15.2±5.9 0.3±0.2 24.6±4.8 48.4±8.8
A+NLN 10% 0.3±0.2 0.5±0.5 4.1±1.4 1.6±1.2 6.5±2.8
0.37M 만니톨 +NLN 미네랄 6.3±4.1 10.1±4.4 0.3±0.1 10.3±4.0 27.0±7.0
0.37M 만니톨 +NLN(-수크로오스) 10.3±6.1 21.2±7.3 0.5±0.3 28.9±10.6 60.9±9.8
소포자 기아배지 A 0.4±0.2 3.2±2.0 0.3±0.2 6.2±5.3 10.2±5.7
A+NLN 10% 5.6±3.6 7.1±2.7 0.4±0.2 11.1±6.7 24.2±12.0
0.37M 만니톨 +NLN 미네랄 2.2±1.5 1.1±0.8 0 5.4±4.4 8.8±3.4
0.37M 만니톨 +NLN(-수크로오스) 54.0±32.0 44.7±20.8 1.0±0.8 49.3±20.4 149.0±41.9
a 배상체 (ELS: Embryo Like Structure, 비정상배)
약 전처리의 경우 1개의 배양 접시에서 발생한 배의 총 수는 전처리 배지 중 [0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)]에서 가장 많았다. 자엽배의 발생은 [A+NLN 10%]에서 가장 높았으나 발생한 배의 총 수가 6.5개로 [0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)]인 경우의 51.7개에 비해 크게 낮았다. 따라서 배의 발생이나 발달 모두 [0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)]가 가장 좋은 것으로 나타났다.
소포자 전처리의 경우 전처리 배지 중 [0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)]에서 발생한 배의 총수는 144.9개로 다른 전처리 배지에 비해 약 10배 정도 높았으며 자엽배의 수도 가장 높았다. 따라서 배의 발생이나 발달 모두 [0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)]가 가장 좋은 것으로 나타났다.
전처리 배지 중 0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)에서 배의 발생이 많았을 뿐만 아니 라 자엽배의 발생도 높아 소포자 배양에 가장 적합한 것으로 나타났는데, 그 효과는 약 전처리에 비해 소포자 전처리 시에 더욱 큰 것으로 나타났다. 따라서 전처리 재료는 꽃봉오리로부터 일일이 적출하여야만 하는 약 대신 소포자를 사용하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 3. 치상 후 새 배지의 첨가가 소포자 배양에 미치는 영향
상기 실시예 1에서 전처리가 끝난 소포자들을 50㎖ 원심분리관에 모아 원심분리하여 모은 후, NLN 치상배지에 치상밀도가 80,000~100,000 소포자/㎖이 되도록 조정하여 60×15㎜ 크기의 세포배양접시에 대조구는 3㎖, 배지첨가 시는 1.5㎖씩 분주하였다. 분주가 끝난 것은 파라필름으로 봉한 후 투명한 플라스틱 박스에 넣어 25℃의 암 상태에서 배양하였다.
상기와 같이 소포자를 치상하여 1, 2, 3 및 4일이 경과되었을 때 새 배지를 1.5㎖씩 첨가하여 배양한 후 배의 발생 및 발달을 조사하였다(도 3, 표 4).
[표 4] 고추의 소포자 배양 시 새 배지의 첨가가 배 생산에 미치는 영향
전처리 시료 새배지 첨가 시간(일) 발생된 배의 수/배양접시 전체 배의 수/배양접시
구형 심장형 자엽배 ELSa의 수
약 0 (대조구) 17.8±3.7 29.8±5.0 0.4±0.2 19.3±6.5 67.4±13.3
1 5.9±1.8 23.8±4.6 0 8.8±1.9 38.4±5.7
2 8.9±4.2 28.3±3.3 0 8.1±3.5 45.3±4.3
3 13.4±5.3 23.5±5.6 0 7.5±3.6 44.4±8.2
4 10.9±4.2 33.3±3.7 0.2±0.2 6.4±2.9 50.8±3.3
소포자 0 (대조구) 33.2±14.1 28.7±12.3 0.5±0.4 41.8±21.7 104.2±15.4
1 31.3±18.0 34.9±9.5 0.6±0.4 42.0±20.6 108.7±44.3
2 35.3±27.5 53.8±27.2 0.4±0.2 45.4±28.7 134.8±77.2
3 44.6±30.8 62.8±9.4 0.3±0.1 65.1±17.9 163.8±50.2
4 36.3±26.5 76.0±16.3 0.2±0.1 60.6±30.4 173.1±66.7
a 배상체 (ELS: Embryo Like Structure, 비정상배)
약 전처리의 경우 치상 후 배지를 첨가하지 않았을 때 발생한 전체 배의 수는 67.4개이었으나, 첨가하였을 때는 38.4~50.5개로 첨가시기에 따라 차이가 나지만 감소하였으며, 자엽배의 발생도 매우 드물어 배지 첨가 효과가 없었다.
소포자 전처리의 경우 치상 후 배지를 첨가하지 않았을 때 발생한 전체 배의 수는 104.2개이지만, 첨가한 경우 크게 증가하였는데 그 정도는 첨가시기가 늦어질수록 높아 4일후 첨가 시에는 173.1개였다. 자엽배의 발생은 1일 후 첨가 시에만 다소 증가하였으며 그 이후 첨가 시에는 증가하지 못하였는데 이는 배의 발생이 높으면 양분의 부족으로 배가 발달하지 못하기 때문인 것으로 추측된다. 배지를 첨가한 경 우 자엽배의 발생이 증가하지 못하였으나 배의 발달은 현저하게 차이가 나서 발생한 배의 크기가 커졌다.
치상 후 배지 첨가는 약 전처리 시에는 효과가 없었으나, 소포자 전처리 시에는 발생한 전체 배의 수가 크게 증가하고 배의 발달 정도도 높아 매우 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 4. 2중층 배양이 소포자 배양에 미치는 영향
배지의 물리적 성질이 소포자 배양에 미치는 영향을 밝히기 위하여 NLN 액체배지 및 고체배지의 조성이 1/2 NLN, NLN, B5, NN으로 각기 다른 4가지 2중층배지에 치상하고 1 및 3일 후 새 배지를 첨가하여 배양하였을 경우 배의 발생 및 발달을 조사하였다(도 5, 표 7).
[표 5] B5 배지의 조성
성분 함량(㎎/ℓ)
주영양소
질산칼륨(KNO3) 2,500
황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 250
황산암모늄[(NH4)2SO4] 134
제일인산나트륨(NaH2PO4·H2O) 150
염화칼슘(CaCl2·2H2O) 150
미량영양소
황산망간(MnSO4·4H2O) 10.0
붕산(H3BO3) 3.0
황산아연(ZnSO4·7H2O) 2.0
요오드화칼륨(KI) 0.75
몰리브덴산나트륨(Na2MoO4·2H2O) 0.25
염화코발트(CoCl2·6H2O) 0.025
황산구리(CuSO4·5H2O) 0.025
철
황산제일철(FeSO4·7H2O) 27.8
Na2·EDTA 37.2
비타민 & 아미노산
마이오이노시톨(Myo-inositol) 100
염산 치아민(Thiamine HCl) 10.0
염산 피리독신(Pyridoxine HCl) 1.0
니코틴산(Nicotianic acid) 1.0
[표 6] NN 배지의 조성
성분 함량(㎎/ℓ)
주영양소
질산칼륨(KNO3) 950.0
질산암모늄(NH4NO3) 720.0
황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 185.0
염화칼슘(CaCl2·2H2O) 166.0
인산이수소칼륨(KH2PO4) 68.0
미량영양소
황산망간(MnSO4·4H2O) 25.0
붕산(H3BO3) 10.0
황산아연(ZnSO4·7H2O) 10.0
몰리브덴산나트륨(Na2MoO4·2H2O) 0.25
황산구리(CuSO4·5H2O) 0.025
철
황산제일철(FeSO4·7H2O) 27.8
Na2·EDTA 37.3
비타민
마이오이노시톨(Myo-inositol) 100.0
니코틴산(Nicotianic acid) 5.0
염산 피리독신(Pyridoxine HCl) 0.5
염산 치아민(Thiamine HCl) 0.5
엽산(Folic acid) 0.5
글리신(Glycine) 2.0
비오틴(Biotin) 0.05
[표 7] 고추의 소포자 배양 시 치상배지의 물리적 상태가 배 생산에 미치는 영향
치상 후 새 배지 첨가 배양 배지 발생된 배의 수/배양접시 전체 배의 수/배양접시
구형 심장형 자엽배 ELSa의 수
1일 후 NLN 액체배지 50.4±13.8 56.6±9.8 0.4±0.3 32.4±7.4 139.8±8.7
NLN 이중층 4.6±2.6 8.9±5.4 14.6±5.3 40.4±11.7 68.4±10.8
1/2 NLN 이중층 6.7±4.7 15.6±9.3 15.8±4.7 41.3±13.0 79.4±6.4
NN 이중층 0.5±0.3 1.6±1.2 5.6±3.3 27.9±8.3 35.7±8.6
B5 이중층 4.3±3.4 7.3±3.9 7.8±2.5 35.4±9.9 54.8±10.4
3일 후 NLN 액체배지 24.8±15.1 39.4±11.5 0.3±0.1 21.0±6.7 85.5±29.7
NLN 이중층 0.9±0.6 10.2±8.0 10.7±5.1 16.6±3.8 38.4±12.3
1/2 NLN 이중층 0.6±0.3 5.0±3.6 9.0±6.1 17.4±6.6 32.0±11.7
NN 이중층 0 0.9±0.6 4.0±2.5 7.1±3.3 12.0±4.4
B5 이중층 0.5±0.3 6.8±3.8 13.7±5.8 33.7±12.3 54.7±20.1
a 배상체 (ELS: Embryo Like Structure, 비정상배)
2중층 배지를 사용한 경우 발생한 전체 배의 수는 액체배지를 사용하였을 때에 비해 감소하였으나 자엽배의 발생은 크게 증가하였다. 또 발생한 전체 배의 수나 자엽배의 발생 모두 3일후 첨가 시에 비해 1일 후 첨가 시에 높았다. 치상 1일 후 배지를 첨가한 경우 발생한 전체 배의 수는 액체배지를 사용하였을 때는 139.8개 이었으나 2중층배지를 사용하였을 때는 2중층의 고체배지의 종류에 따라 35.7~79.4개로 낮았다. 그러나 자엽배의 발생은 크게 증가하여 액체배지에서는 0.4개 이었으나 1/2 NLN 이중층의 경우 15.8개, NLN 이중층의 경우 14.6개로 크게 증가하였다.
1/2 NLN 이중층배지나 NLN 이중층배지를 사용한 경우 발생한 자엽배들은 비교적 가 늘고 자엽이 완전히 전개된 것이 많았으나 B5 이중층배지나 NN 이중층배지를 사용한 경우에는 배축이 길고 비대한 것들이 많았다. 1/2 NLN 이중층배지나 NLN 이중층배지에서 발생한 자엽배들은 B5 이중층배지나 NN 이중층배지에서 발생한 자엽배들에 비해 2% 수크로오스가 첨가된 B5 고체배지에 옮기면 용이하게 유식물로 발달하였으며, 본엽이 3~4매 되었을 때 배양토에 옮기면 대부분이 활착되어 식물체로 발달하였다(도 6).
따라서 2중층배지는 액체배지에 비해 배의 발생은 감소하나 정상 자엽배의 발생에는 매우 효과적이며, 사용한 배지 중에서는 1/2 NLN 2중층배지를 사용하였을 때 배의 발생 및 발달에 가장 좋은 것으로 나타났다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 연구 결과 고추의 소포자 배양 시 1) 전처리 재료는 꽃봉오리로부터 일일이 적출하여야만 하는 약 대신 소포자를 사용하며, 2) 전처리 배지는 일반적으로 널리 사용되고 있는 기아배지 보다는 수크로오스만 제외하였을 뿐 치상배지와 동일한 조성의 배지[0.37 M 만니톨+NLN(-수크로오스)]를 사용하고, 3) 치상 후 새 배지를 첨가하며 4) 1/2 NLN 2중층배지를 사용하는 것이 정상 자엽배 생산에 효과적임을 밝힐 수 있었다.
본 발명의 고추의 정상 배 생산 방법은 반수성인 동시에 단세포 상태인 소포자로부 터 다량의 정상 자엽배를 획득할 수 있으므로 반수체 육종뿐만 아니라 소포자 형질전환이나 돌연변이 기술을 이용한 우수 품종 연구 및 개발에 이용할 수 있게 되어 식물생명공학 분야에 유용한 발명이 될 것이다.

Claims (3)

  1. 고추의 소포자를 배양함에 있어서,
    고추 꽃봉오리에서 채취한 약을 블랜딩한 후 볼텍싱하여 소포자를 나출시키고, 나출된 소포자에서 체세포조직 파편들을 제거한 후 원심분리하여 소포자만을 수확한 다음, 상기 수확된 소포자를 전처리 배지에 치상하여 32℃에서 3일간 전처리하고, 상기 전처리된 소포자를 NLN 배지에 80,000~100,000 소포자/㎖의 밀도로 치상하고 난 1일 후, NLN 배지를 새로이 첨가하고 27℃의 암상태에서 3~4주 배양하여 배를 획득하는 방법에 의한 고추의 정상 배 생산 방법.
  2. 고추의 소포자를 배양함에 있어서,
    고추 꽃봉오리에서 채취한 약을 블랜딩한 후 볼텍싱하여 소포자를 나출시키고, 나출된 소포자에서 체세포조직 파편들을 제거한 후 원심분리하여 소포자만을 수확한 다음, 상기 수확된 소포자를 전처리 배지에 치상하여 32℃에서 3일간 전처리하고, 상기 전처리된 소포자를 1/2 NLN 고체 배지에 80,000~100,000 소포자/㎖의 밀도로 치상하고 난 1일 후, NLN 배지를 새로이 첨가하고 27℃의 암상태에서 3~4주 배양하여 배를 획득하는 방법에 의한 고추의 정상 배 생산 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 전처리 배지는 0.37M 만니톨+NLN(-수크로오스)배지인 것을 특징으로 하는 고추의 정상 배 생산 방법.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100952103B1 (ko) * 2007-12-27 2010-04-13 목원대학교 산학협력단 고추의 소포자배양에 의해 얻어진 배로부터 식물체를생산하는 방법
CN104357374A (zh) * 2014-10-15 2015-02-18 湖南省蔬菜研究所 一种辣椒花药组织培养方法
CN104663430A (zh) * 2014-12-09 2015-06-03 云南农业大学 一种能生吃且花青素含量高的紫色辣椒的培育方法
CN105028205A (zh) * 2015-08-03 2015-11-11 河南科技大学 一种辣椒花药培养直接成苗的方法
CN105638455A (zh) * 2014-11-14 2016-06-08 石河子大学 一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基
KR20200076167A (ko) 2018-12-19 2020-06-29 대한민국(농촌진흥청장) 고추 shed 소포자 배양에 의해 얻어진 배로부터 2-step 재분화에 의한 소포자 유래 반수체 또는 배가반수체 식물체를 생산하는 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04346729A (ja) * 1991-05-21 1992-12-02 House Food Ind Co Ltd トウガラシのプロトプラストから茎頂様組織を誘導する方法
KR100526161B1 (ko) 2004-03-04 2005-11-08 김문자 고추의 소포자 배양 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04346729A (ja) * 1991-05-21 1992-12-02 House Food Ind Co Ltd トウガラシのプロトプラストから茎頂様組織を誘導する方法
KR100526161B1 (ko) 2004-03-04 2005-11-08 김문자 고추의 소포자 배양 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100952103B1 (ko) * 2007-12-27 2010-04-13 목원대학교 산학협력단 고추의 소포자배양에 의해 얻어진 배로부터 식물체를생산하는 방법
CN104357374A (zh) * 2014-10-15 2015-02-18 湖南省蔬菜研究所 一种辣椒花药组织培养方法
CN105638455A (zh) * 2014-11-14 2016-06-08 石河子大学 一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基
CN105638455B (zh) * 2014-11-14 2018-03-20 石河子大学 一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基
CN104663430A (zh) * 2014-12-09 2015-06-03 云南农业大学 一种能生吃且花青素含量高的紫色辣椒的培育方法
CN105028205A (zh) * 2015-08-03 2015-11-11 河南科技大学 一种辣椒花药培养直接成苗的方法
KR20200076167A (ko) 2018-12-19 2020-06-29 대한민국(농촌진흥청장) 고추 shed 소포자 배양에 의해 얻어진 배로부터 2-step 재분화에 의한 소포자 유래 반수체 또는 배가반수체 식물체를 생산하는 방법

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