JPH04346729A - トウガラシのプロトプラストから茎頂様組織を誘導する方法 - Google Patents

トウガラシのプロトプラストから茎頂様組織を誘導する方法

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JPH04346729A JP3116159A JP11615991A JPH04346729A JP H04346729 A JPH04346729 A JP H04346729A JP 3116159 A JP3116159 A JP 3116159A JP 11615991 A JP11615991 A JP 11615991A JP H04346729 A JPH04346729 A JP H04346729A
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、カプシクム・フルテッ
センス(Capsicum frutescens L
.) に属するトウガラシのプロトプラストから茎頂様
組織を誘導する方法に関し、更に詳しくは、植物体再生
の中間体である茎頂様組織を誘導することができるプロ
トプラストから茎頂様組織を誘導する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】植物の細胞壁を取り除いた裸の細胞であ
るプロトプラストは、最外層が細胞膜に取り囲まれてい
るため、遺伝子等の高分子物質の導入や、プロトプラス
ト同志の融合が可能である。そのため、このようなプロ
トプラストから植物体を再生することが可能になれば、
今まで存在しなかった新しい有用形質を持つ植物を育成
できる可能性がある。
【0003】従って、トウガラシ属(Capsicum
)の辛みを有する植物のプロトプラストから植物体を再
生する技術が確立すれば、細胞融合等の技術を用いて他
の植物と交配することにより、新しい辛みを有した植物
を育成できる可能性がある。従来、トウガラシ属(Ca
psicum)の植物のプロトプラストから植物体を再
生する技術は、カプシクム・アニウム(Capsicu
m annuum L.) に属する栽培品種のCal
ifornia Wonder(Saxena, P.
K. et al., Protoplasma, 1
80,357−360,1981),Dulce lt
aliano(Diaz, l.et al., Pl
ant Cell Reports 7,210−21
2,1988)を用いた2例が報告されているだけであ
る。しかし、これらの栽培品種は、いずれもトウガラシ
属(Capsicum)の植物のなかでも辛みを有しな
い品種であることから、他の植物と交配できたとしても
新しい辛みを有した植物を育成することはできない。そ
こで、ここに記載された方法を用いて、辛みを有するト
ウガラシ(Capsicum frutescens 
L.cv.Tabasco、及び Capsicum 
annuum L.cv.Tochigisantak
a) について、プロトプラストからカルスを経て茎頂
様組織を誘導しようと試みたが、辛みを有するトウガラ
シでは辛みを有しないトウガラシと異なり茎頂様組織が
得られないことがわかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、辛みを有す
るトウガラシ属(Capsicum)の植物、特にカプ
シクムフルテッセンス(Capsicum frute
scens L.) に属するトウガラシのプロトプラ
スト由来のカルスから、植物体再生の中間体である茎頂
様組織を誘導するプロトプラストからの茎頂様組織の誘
導方法の提供を目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、Capsic
um frutescens L.に属するトウガラシ
を特定の期間培養して得られた植物体の葉、根、茎等の
器官から調製したプロトプラストを、ジベレリンとサイ
トカイニン類を含む培地を用いて培養することにより、
上記目的を達成することができるとの知見に基づいてな
されたのである。すなわち、本発明は、カプシクム・フ
ルテッセンス(Capsicum frutescen
s L.) に属するトウガラシの発芽幼苗を7〜21
日間培養して得られた植物体の器官から調製したプロト
プラストを生育させ、得られたカルスを、ジベレリンと
サイトカイニン類を含む培地で培養することを特徴とす
るプロトプラストから茎頂様組織を誘導する方法である
【0006】本発明で用いるCapsicum fru
tescens L.に属するトウガラシの栽培品種と
しては、Tabasco が例示できる。本発明は、ま
ず、上記Capsicum frutescens L
.に属するトウガラシからプロトプラストを調製するが
、このプロトプラストは、幼苗を7〜21日間、好まし
くは12〜18日間培養して得られた植物体の器官、例
えば、葉、根、茎等から調製したものを使用する。つま
り、この期間に得られた器官から調製したプロトプラス
トを用いることにより、はじめて、カルスを生育させる
ことができ、更には、そのカルスに、植物体を再生する
中間体である茎頂様組織を誘導させることができるので
ある。この期間以外に得られた器官を用いた場合には、
プロトプラストの収量は極めて少なく、このプロトプラ
ストを生育させたとしても、分裂は起きず、カルスを得
ることは困難である。
【0007】次に、本発明におけるプロトプラストの調
製方法の好適態様を例示するが、本発明はこの方法に限
定されるものではない。本発明の処理は、全て無菌下で
行わなければならないため、まず、植物体の器官に、例
えば、エタノール、HgCl、次亜塩素酸ナトリウム、
次亜塩素酸カルシウム等を用いて殺菌処理を施す。この
場合、器官を死滅させないように、或るいは器官の生物
活性が損われないように注意しなければならない。殺菌
後は、無菌蒸留水等を用いて洗浄する。例えば、トウガ
ラシの種子からプロトプラストを調製する場合、該種子
を濃度1%〜2%程度の次亜塩素酸ナトリウム溶液に約
20〜30分間浸漬し、次いでこれを無菌蒸留水で洗浄
する。
【0008】次に、この種子が発芽するまで、培養する
。ここで、使用する培地は、種子が発芽するように水分
を含むものであれば如何なるものでもよく、水寒天培地
、Knop寒天培地、MS寒天培地等が例示できる。培
養するに当たってその温度条件は、15℃〜40℃、好
ましくは、20℃〜30℃の温度雰囲気であることが望
ましい。又、光の条件としては、常に暗い状態、明るい
状態、明/暗を交互にする状態の如何なる条件でもよい
。 例えば、約25℃、16時間日長(蛍光灯照射4000
lux )/8時間暗黒の条件で培養することにより、
約10〜14日後には種子が発芽し、発芽幼苗(双葉)
を展開させることができる。
【0009】次に、発芽した幼苗(双葉)を、植物体生
育培地に移植し、培養する。ここで、使用する植物体生
育培地としては、約10〜数百mg/l の濃度範囲の
無機イオン群(いわゆる多量要素、例えば、硝酸塩、り
ん酸塩、硫酸塩、カリウム、マグネシウム、鉄)最大限
で数mg/l の別の無機イオン群(いわゆる微量要素
、例えばコバルト、亜鉛、銅、マグネシウム)、ビタミ
ン(例えばイノシトール、ニコチン酸、チアミン)、シ
ュークロースまたはグルコースのような炭素源を含むも
のであればよく、TM−2寒天培地、MS寒天培地、L
S寒天培地等が例示できる。
【0010】培養するに当たってその温度条件は、15
℃〜40℃、好ましくは、20℃〜30℃の温度雰囲気
であることが望ましい。又、光の条件としては、常に明
るい状態、或るいは明/暗を交互にする状態の如何なる
条件でもよい。例えば、約25℃、16時間日長(蛍光
灯照射4000lux )/8時間暗黒の条件で培養す
るのが好ましい。尚、常時暗い状態の場合は、植物体が
正常に生育し難く好ましくない。
【0011】次に、生育した植物体の器官からプロトプ
ラストを調製するが、前記したように7〜21日間、好
ましくは12〜18日間培養して得られた植物体の器官
を使用する。例えば、葉を使用する場合、まず、この葉
を約5mm程度の幅の短冊状に細断する。次に、短冊状
に細断した葉を、ペクチナーゼ等のペクチン分解酵素、
ヘミセルラーゼ、セルラーゼ等のセルロース分解酵素を
含む液体培地に浸漬し、暗所に約14〜16時間時間静
置し、プロトプラストを遊離させる。上記液体培地とし
ては、マンニトール、ソルビトール等の成分を含有させ
、シュークロース等の炭素源等は含有させないものであ
れば如何なるものでもよく、上記成分以外は、MS培地
、LS培地等、通常組織培養に使用される培地を利用す
ればよい。ここで、マンニトール等の成分を含有させる
のは、酵素を含む液体培地の浸透圧を保持させることに
より、プロトプラストの破裂死を防止するためであり、
その添加量は、所期の目的が達成できる量であればよく
、具体的には、マンニトールの場合は、0.5〜0.7
M程度が望ましい。一方、シュークロース等の炭素源等
を含有させないのは、この成分が含まれている場合には
、プロトプラストが死滅したり、或るいはプロトプラス
トの生物活性が著しく損なわれてしまうからである。
【0012】又、液体培地に、ペクチン分解酵素及びセ
ルロース分解酵素を添加するのは、細胞間に存在するペ
クチン質、及び細胞壁の主成分であるセルロースを溶解
させるためである。又、暗所に静置するのは、細胞の光
合成作用を抑制し、細胞の生物活性の低下を防止し、更
には、振とう等による物理的衝撃によって、遊離したプ
ロトプラストが破壊され死滅してしまうことを防止する
ためである。
【0013】次に、葉の断片、その他夾雑物等を除去す
ることにより、プロトプラストのみを採取する。採取す
る方法としては、まず、メッシュサイズ100〜300
メッシュ程度の篩を用いてろ過することにより葉の断片
を除去する。次に、ろ液に、0.5〜0.7M程度のマ
ンニトールを添加し、遠心分離処理を施し、酵素液、ご
み等を除去する。この場合、遠心分離処理は、100×
g、3分間の条件で数回施すのが好ましい。更に、残存
する夾雑物等を除去するために、浸透圧が保持でき、か
つ比重がマンニトールよりも重い液体、例えば0.45
〜0.6M程度のシュークロースの液上に、上記遠心分
離処理を施した液を、混合しないように層状に載せ、こ
れに100×g、5分間の条件で遠心分離処理を施す。 これにより、シュークロースと、マンニトールとの界面
に、健全なプロトプラストが分布し、小さな夾雑物はマ
ンニトールの上層部に、大きな夾雑物はシュークロース
の下層部に分布するため、上記健全なプロトプラストの
みを採取することができる。
【0014】次に、本発明は、上記したように調製した
プロトプラストを培養生育させ、カルスを生成させる。 ここで、プロトプラストを生育させるに当たり、該プロ
トプラストを、多量要素、微量要素、イノシトール、チ
アミン等のビタミン、ホルモン、カザミノ酸、ココナツ
ウオーター等の有機物、フルクトース、マンノース等の
糖、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸、グルコース等の浸
透圧調整剤等の成分を含む液体培地、例えば8p液体培
地で培養する。特に、上記したホルモンとしては、2.
4−ジクロロフェノキシ酢酸(2.4−D)とt−Ze
atin、ベンジルアミノプリン等のサイトカイニン類
を用い、必要に応じてこれらにナフタレン酢酸(NAA
)等を加えて用いてもよい。
【0015】上記培養に当たり、プロトプラストは、1
04 個〜5×105 個/ml の濃度範囲になるよ
う培地中に懸濁するのが好ましい。培養するに当たって
その温度条件は、15℃〜40℃、好ましくは、20℃
〜30℃の温度雰囲気であることが望ましい。又、光の
条件としては、常に暗い状態、明るい状態、明/暗を交
互にする状態の如何なる条件でもよい。尚、明るい状態
の場合には、プロトプラストの死滅を防止するために、
培養当初は約300lux 程度の弱い照射であること
が望ましく、2週間程度経過したならば、4000lu
x 程度の強い照射をしても特に問題はない。例えば、
約25℃、16時間日長(蛍光灯照射300lux )
/8時間暗黒の条件で培養することにより、約40〜5
0日で直径1〜2mmのミニカルスが生成される。尚、
栄養分をプロトプラストに補給するために、約7〜10
日おきに新しい培地を1/3〜2/3容量で添加するの
が望ましい。
【0016】本発明は、上記のようにして得られたカル
スを、培養することにより茎頂様組織(meriste
matic regions)が誘導される。ここで、
使用する培地としては、ジベレリンとサイトカイニン類
を含む培地であればよく、これらの成分を含むMS寒天
培地、LS寒天培地等が例示できる。上記ジベレリンと
しては、ジベレリンGA3 を用いることが好ましく、
その使用量は、0.1〜10mg/l 、好ましくは0
.1〜5mg/l になるようにするのが好ましい。一
方、サイトカイニン類としては、カイネチン、ベンジル
アミノプリン、ゼアチンリボシド、シス−ゼアチン、2
−イソペンテニルアミノプリン(2ip) 、N−フェ
ニル−N′−(4−ピリジル)尿素(4PU)等が例示
できる。この中で、例えば、カイネチンを使用する場合
には、0.001〜1mg/l 、好ましくは0.00
1〜0.01mg/l 、ベンジルアミノプリンを使用
する場合には、0.0001〜0.1mg/l 、好ま
しくは0.0005〜0.01mg/l の範囲になる
ようにするのが好ましい。
【0017】培養するに当たってその温度条件は、15
℃〜40℃、好ましくは、20℃〜30℃の温度雰囲気
であることが望ましい。又、光の条件としては、常に暗
い状態、明るい状態、明/暗を交互にする状態の如何な
る条件でもよい。次に実施例により本発明を説明する。
【0018】
【実施例】実施例1 I.プロトプラストの調製 (1) 以下の方法でトウガラシ(Capsicum 
frutescens L.cv. Tabasco)
の種子を殺菌した。
【0019】■  次亜塩素酸ナトリウム溶液(2%濃
度)に30分間浸漬する。■  無菌蒸留水で3回洗浄
する。 (2) 殺菌したトウガラシの種子を以下の方法で発芽
培養した。■  Knop寒天培地を用いて、25℃、
16時間日長(蛍光灯照射4000lux)/8時間暗
黒の条件で、発芽して幼苗(双葉)が展開するまで、1
4日間培養した。 (3) 発芽幼苗(双葉)が本葉に発育するまで以下の
方法により培養した。
【0020】■  発芽幼苗(双葉)をTM−2寒天培
地に移植する。 ■  培養条件 ・25℃、16時間日長(蛍光灯照射4000lux)
/8時間暗黒の条件で、本葉が6〜8枚程度展開するま
で、約15日間培養した。 (4) 以下の方法によりプロトプラストを調製した。
【0021】■  本葉を幅が約5mm程度の短冊状に
細断する。■  細断した本葉をペクチン分解酵素(ペ
クチナーゼ)、及びセルロース分解酵素(ヘミセルラー
ゼ、セルラーゼ)を含むTo 液体培地に浸漬、暗所に
約15時間静置する。■  ろ過(300メッシュ)に
より葉の断片を除去する。
【0022】■  ろ液に0.6Mのマンニトールを添
加して、100×g、3分間の条件で遠心分離処理を3
回施し、酵素液、ごみ等を除去する。■  0.54M
のシュークロースの上に、得られたプロトプラストを含
む0.6Mのマンニトールを混合しないように層状に載
せ、これに100×g、5分間の条件で遠心分離処理を
施し、純粋なプロトプラストを得た。 II. カルスの生育 ■  プロトプラストを105 個/ml の細胞濃度
で、ホルモン(2.4−ジクロロフェノキシ酢酸(2.
4−D)…0.2mg/l、ナフタレン酢酸(NAA)
…1.6mg/l、t−Zeatin…0.5mg/l
)を含む8p液体培地に植え付け、46日間、下記の条
件で培養し、直径1〜2mmのミニカルスを生育した。
【0023】■  培養条件 ・25℃、16時間日長(蛍光灯照射300lux)/
8時間暗黒 ・7日おきに新しい培地を1/3〜2/3容量で添加す
る。 III.茎頂様組織の誘導方法 ■  カルスを、ホルモン(ジベレリン…1mg/l、
カイネチン…0.01mg/l)を含むMS寒天培地で
培養した。 実施例2 茎頂様組織の誘導に当たり、ホルモン(ジベレリン、カ
イネチン)を含むMS寒天培地に換えて、ホルモン(ジ
ベレリン…3mg/l、ベンジルアミノプリン…0.0
1mg/l)を含むMS寒天培地を用いる以外は、実施
例1と同様の方法によりカルスを培養した。 比較例1 トウガラシ(Capsicum frutescens
 L. cv. Tabasco) の種子に換えて、
カプシクム・アニウムに属するトウガラシ(Capsi
cum annuum L. cv. Tochigi
santaka)の種子を用いる以外は、実施例1と同
様の方法によりカルスを培養した。 比較例2 茎頂様組織の誘導に当たり、ホルモン(ジベレリン、カ
イネチン)を含むMS寒天培地に換えて、カイネチン0
.01mg/lを含み、ジベレリンは含まないMS寒天
培地を用いる以外は、実施例1と同様の方法によりカル
スを培養した。 比較例3 茎頂様組織の誘導に当たり、ホルモン(ジベレリン、カ
イネチン)を含むMS寒天培地に換えて、ベンジルアミ
ノプリン0.01mg/lを含み、ジベレリンは含まな
いMS寒天培地を用いる以外は、実施例1と同様の方法
によりカルスを培養した。 評  価 実施例1〜比較例1において、カルスを培養した結果を
以下に示す。
【0024】 実施例1……約30日後に茎頂様組織が誘導され、その
誘導率は、83.3%であった。 実施例2……約50日後に茎頂様組織が誘導され、その
誘導率は、83.3%であった。 比較例1……茎頂様組織は誘導されなかった。
【0025】 比較例2……茎頂様組織は誘導されなかった。 比較例3……茎頂様組織は誘導されなかった。 比較例1から明らかなように、トウガラシ属(Caps
icum)の辛みを有するトウガラシのなかでも、カプ
シクム・アニウムに属するトウガラシでは、ジベレリン
とサイトカイニン類を組み合わせた培地でカルスを培養
しても、茎頂様組織を誘導することはできなかった。
【0026】比較例2及び3から明らかなようにサイト
カイニン類のみでは、Capsicum frutes
cens L.に属する辛味を有するトウガラシのカル
スから茎頂様組織を誘導することはできなかった。
【0027】
【発明の効果】本発明によれば、プロトプラストからの
植物体再生が困難であったから味を有するトウガラシ、
特にCapsicum frutescens L.に
属するトウガラシの、プロトプラスト由来のカルスから
、植物体再生の中間体である茎頂様組織を誘導すること
ができ、その誘導率も極めて高いものであった。 比較例2 サイトカイニンのみではfrutescensのカルス
は生成しないことを示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】  カプシクム・フルテッセンス(Cap
    sicum frutescens L.) に属する
    トウガラシの発芽幼苗を7〜21日間培養して得られた
    植物体の器官から調製したプロトプラストを生育させ、
    得られたカルスを、ジベレリンとサイトカイニン類を含
    む培地で培養することを特徴とするプロトプラストから
    茎頂様組織を誘導する方法。
  2. 【請求項2】  サイトカイニン類が、カイネチン又は
    ベンジルアミノプリンである請求項1記載のプロトプラ
    ストから茎頂様組織を誘導する方法。
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