KR100952103B1

KR100952103B1 - 고추의 소포자배양에 의해 얻어진 배로부터 식물체를생산하는 방법

Info

Publication number: KR100952103B1
Application number: KR1020070138876A
Authority: KR
Inventors: 김문자; 박은준; 한지학; 인동수; 정민
Original assignee: 목원대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2010-04-13
Also published as: KR20090070753A

Abstract

본 발명은 고추의 소포자 배양(microspore culture)으로부터 얻어진 성숙 또는 미성숙 자엽배(cotyledonary embryo)를 특정 재분화 배지에 이식하여 배양하는 단계를 포함하는 고추의 소포자 배로부터 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

반수성인 동시에 단세포 상태인 소포자로부터 다수의 식물체를 획득할 수 있는 본 발명은 반수체 육종은 물론 소포자 형질전환이나 소포자 돌연변이 연구 및 개발에 이용할 수 있게 되었으므로 우수 품종을 개발하는 식물생명공학 분야에 매우 유용하게 이용될 것이다.

소포자배양, 고추, 재분화, 반수체, 배가반수체

Description

고추의 소포자배양에 의해 얻어진 배로부터 식물체를 생산하는 방법{Method for plant production from embryos obtained by microspore culture of hot pepper (Capsicum annuum L.)}

본 발명은 고추의 소포자배양 결과 얻어진 배로부터 재분화 기술을 이용한 식물체 생산 방법에 관한 것이다.

염색체의 수가 정상개체의 반만 있는 식물을 반수체(haploid)라 명명하고 있다. 이러한 반수체는 약제처리에 의해 인위적으로 염색체수를 배가시킬 수 있으므로 유전적으로 순수한 계통을 손쉽게 만들어 낼 수 있다. 한편 반수체 식물의 유전자는 쌍으로 존재하지 않으므로 우성과 열성의 관계가 없어지고 모든 형질이 그대로 나타난다. 따라서 이러한 반수체 식물체로부터 돌연변이체나 형질전환체를 선발하게 되면 우성-열성관계로 나타나지 못하던 유용한 열성인자를 가진 식물체를 선발할 수 있다.

종래에는 반수체를 획득하는 방법으로 주로 약배양 (꽃밥배양, anther culture)이 이용되어 왔으나, 유채에서 소포자 배양에 의해 다량의 배를 획득하는 것이 가능해지면서 많은 식물에서 소포자 배양 (microspore culture)에 관한 연구 들이 이루어지고 있다. 약배양은 체세포조직(somatic tissue)인 약벽 (anther wall) 내에 들어있는 소포자 (microspore)를 배양 하는 것이지만 소포자 배양은 소포자만을 분리하여 배양하는 것이다. 따라서 약 배양은 체세포조직(somatic tissue)인 약벽 조직과 반수성인 소포자가 혼재되어 있는 상태로 배양하는데 비해 소포자 배양은 반수성인 동시에 단세포 상태인 소포자만을 배양하므로 반수체를 이용한 육종뿐만 아니라 형질전환과 돌연변이 연구 및 유기에 매우 유리하다.

이러한 장점에도 불구하고 소포자만 분리하여 배양할 경우 배나 캘러스를 얻기가 어려워 국·내외적으로 소포자 배양에 성공한 식물이 많지 않다. 보리 "Igri" 품종에서와 같이 소포자 배양 시 녹색 유식물체의 수가 약배양에 비해 100~200배나 많은 경우도 있으나 (Davies and Morton, 1998), 현재까지 소포자 배양이 비교적 용이하게 이루어져서 다량의 식물체를 획득할 수 있는 식물은 보리를 포함하여 유채, 밀, 벼, 담배 등 소수의 식물에 국한되어 있다.

소포자 배양기술이 실제 형질전환이나 돌연변이 연구 및 개발에 이용될 수 있으려면 1) 소포자배양에 의해 다수의 배를 생산할 수 있어야 하며, 2) 발생한 소포자 유래의 배가 용이하게 식물체로 발달하여야한다. 현재 배양소포자가 배우체인 화분으로 발달하지 않고 조포체로 발달하게 되는 기작을 규명하기 위한 기초연구와 다수의 배를 생산할 수 있는 소포자 배양 시스템을 개발하기 위해서는 많은 연구들이 이루어지고 있으나 발생한 배가 식물체로 발달하는데 적합한 조건을 밝히기 위한 연구는 많지 못하다. 대부분의 경우 자엽시기의 배를 생장조절물질이 첨가되지 않았으며, 수크로스는 2-3%로 감소된 고체배지에 이식하여 재분화시키고 있다 (Palmer et al. 1996; Luckett and Darvey 1992; Swanson 1990).

고추에서는 소포자배양에 의해 다핵소포자나 1~2개의 발아된 배를 획득하였을 뿐이며 다수의 배와 식물체를 획득하지 못하였다 (Gonzalez-Melendi et al. 1995; Regner 1996). 최근 Supena et al.(2006)은 소포자 배양을 시도하였으나 1개의 꽃봉오리에서 최대 0.2개의 식물체를 획득한 것이 가장 좋은 결과였으며 다수의 배와 식물체를 획득하는 데는 성공하지 못하였다. 대신 이들은 소포자 유래의 배와 식물체를 다수 획득하는 방법으로 shed-microspore culture 방법을 개발하였으나 이는 약을 배양한 후 열개된 약으로부터 배지로 터져 나온 소포자를 배양하는 것으로 처음 배양 재료가 소포자가 아닌 약이다.

최근 본 연구자들은 고추의 소포자배양에 성공하여 다수의 배와 식물체를 획득할 수 있었으며 이와 같은 결과는 논문으로 발표되었을 뿐만 아니라 (Kim et al. 2007; Park et al. 2005), 대한민국 등록 특허로 되어 있다 (한국 등록특허 제10-0526161호; 및 한국 등록특허 제10-0736150호).

그러나 소포자 배양 시 발생한 배들 중에는 유근과 배축만 있을 뿐 자엽이 발달하지 못한 것, 자엽이 1개만 있는 것, 자엽이 3개 이상인 것 등 비정상적으로 발달된 배상체 (ELS, embryo like structur) 들이 있을 뿐만 아니라, 배의 발생이 비동조적으로 일어나 배양 4주 후 발생한 배들 중에는 구형배, 심장형 배, 어뢰형 배, 자엽배 들이 혼재한다 (Kim et al. 2007; Park et al. 2005). 자엽배 들도 그 발달정도가 다양해서 배축의 끝부분에 자엽이 나타나기 시작한 것, 자엽이 발달되었으나 전개되지 못하고 두개의 자엽이 붙어있는 것, 자엽이 일부만 전개된 것, 자 엽이 완전히 전개된 것 등 여러 가지가 있다.

재분화 시 배가 식물체로 전환되는 비율은 배의 질(embryo quality)에 따라 달라지는데 자엽이 완전히 전개된 배들은 재분화 배지로 이식 시 비교적 용이하게 식물체로 발달하지만 자엽의 발달이 불완전한 배들은 식물체로 전환되는 비율이 매우 낮다. 고추에서는 소포자 배양이 아닌 shed-microspore culture인 경우에도 발생한 배들 중 약 20%만이 정상배이며, 약 30%는 자엽이 없이 배축과 유근만 있는 배이며, 약 50%는 유근만 있는 배였다. 이들 중 정상배는 거의 100%가 식물체로 발달하지만 자엽이 없는 배는 핀 모양의 유묘 (pin-shaped seedling)로 되며 이중 5%만 정상 유식물체로 발달 된다 (Supena et al. 2006).

현재 본 연구실의 배양조건에서는 소포자 배양에 이해 1개의 배양 접시에서 150개 이상의 배를 생산할 수 있게 되었으나, 자엽 발달이 완전하지 못한 배들이 많다. 따라서 고추의 소포자 배양 기술이 실제 반수체 육종이나 돌연변이와 형질전환의 연구 및 개발에 이용되려면 소포자 배양 결과 발생한 미성숙 자엽배들로부터 다수의 식물체를 획득할 수 있는 재분화 기술이 절실히 필요하다.

본 발명은 상기 요구에 의해 안출된 것으로서, 소포자 배양 결과 발생한 배들로부터 다수의 식물체를 획득할 수 있는 재분화 시스템을 확립하기 위해 1) 재분화 배지의 조성, 2) 재분화 배지로의 이식 시기, 3) 재분화 용기가 식물체 발달에 미치는 영향을 밝히고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고추의 소포자 배양(microspore culture)으로부터 얻어진 성숙 또는 미성숙 자엽배(cotyledonary embryo)를 특정 재분화 배지에 이식하여 배양하는 단계를 포함하는 고추의 소포자 배로부터 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추의 소포자 배양(microspore culture)으로부터 얻어진 성숙 또는 미성숙 자엽배(cotyledonary embryo)를 특정 재분화 배지에 이식하여 배양하는 단계를 포함하는 고추의 소포자 배로부터 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.

소포자 배양 후 발생한 배들 중에는 배의 발달이 비동조적으로 일어나 구형배, 심장형 배, 어뢰형 배, 자엽배 들이 혼재하며, 자엽배 들도 그 발달 정도가 다양해서 자엽이 완전히 전개된 것, 배축의 끝부분에 자엽이 나타나기 시작한 것, 자엽이 발달되었으나 전개되지 못하고 두개의 자엽이 붙어있는 것 등 여러 가지가 있다. 소포자 배양 시 배의 발달은 여러 가지 요인들에 의해 달라지지만 1개의 배양접시에서 발생한 배의 수가 많아질수록 자엽의 전개가 완전하지 못한 배들이 증가한다. 현재 본 연구실의 배양조건에서는 1개의 배양접시에서 다수의 배를 생산할 수 있게 되었으나 배의 발생이 적었던 경우에 비해 자엽발달이 완전하지 못한 배들이 많다.

소포자 배양 시 전처리 배지와 배양 배지를 여과 멸균할 때 사용되는 여과막 (filter membrane)을 수세하지 않고 사용하는 경우 배의 발생이 크게 줄어들게 되므로 멸균수와 배지로 수세하여 사용한다. 그러나 수세하지 않고 사용하는 경우 1개의 배양접시에서 발생한 배의 수는 적어지나 자엽이 전개된 배들이 발생한다 (도 1 참고).

본 발명에서는 도 2의 A에서와 같이 자엽이 완전히 전개된 배(fully developed cotyledonary embryo, 이후 성숙 자엽배라 칭함)들과 도 2의 A 및 B에서와 같이 배축의 끝 부분에 자엽이 나타나기 시작한 것과 자엽이 발달되었으나 전개되지 못하고 두개의 자엽이 붙어있는 것과 같이 자엽이 완전히 전개되지 못한 배 (이후 미성숙 자엽배라 칭함)들을 재분화 배지로 이식한 후 1) 재분화 배지의 조 성, 2) 재분화 배지로의 이식 시기, 3) 재분화 용기가 식물체 발달에 미치는 영향을 조사하였다.

재분화시에는 생장조절물질이 첨가되지 않고 수크로스 농도가 감소된 고체배지가 널리 사용되고 있으며 (Palmer et al. 1996), 사용되는 배지의 종류는 식물에 따라 다르다. 밀, 보리 등에서는 MS 배지가 (Luckett and Darvey 1992) 사용되고 있으며, 보리에서와 같이 MS 배지를 수정한 배지인 IMR 배지 (Li and Devaux 2003), 유채에서와 같이 MS 배지를 1/2로 줄인 1/2 MS 배지도 사용되고 있다 (Tian et al. 2004). 한편 유채에서는 B5 배지도 널리 사용되고 있으며 (Swanson, 1990), B5 배지보다는 NN 배지가 정상유식물체 발달에 더 좋다는 보고도 있다 (Chuong and Beversdorf 1985).

상기 특정 재분화 배지는 성숙 자엽배의 경우 1/2 MS, B5, 및 NN 배지를 모두 사용할 수 있고, 미성숙 자엽배의 경우 1/2 MS 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 당업자의 인식 범위 내에서 상기 재분화 배지의 농도는 변할 수 있다는 것을 예상할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 고추 식물체 생산 방법에 있어서, 상기 미성숙 자엽배의 재분화 배지로의 이식은 소포자배양 후 3~4 주된 배를 이식하는 것이 바람직하며, 소포자배양 후 3 주된 배를 이식하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 고추 식물체 생산 방법에 있어서, 상기 재분화 배지는 재분화 용기에 포함되며, 상기 재분화 용기는 지름x높이가 10x4 cm인 배양 접시를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 배양 접시는 원형인 것이 바람직하나, 이 에 제한되지 않고, 사각형 등도 가능할 수 있다. 또한, 당업자의 인식 범위 내에서 상기 재분화 용기의 치수는 변할 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 상기 배양 접시는 투명한 플라스틱으로 된 재질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 호밀 (Secale cereale L.)의 약배양 시 3.4 cm와 5.4 cm 배양 접시를 사용하는 경우 5.4 cm 배양 접시에서 발생한 캘러스를 재분화 배지로 이식하였을 때 녹색식물체의 발생이 5.5 배나 증가하여 배양 용기의 크기가 캘러스의 발생과 재분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Immonen and Anttila 2000). 한편, 재분화시에는 시험관, 배양 접시, 배양병 등 여러 가지가 배양용기가 사용되고 있으나 이들 배양용기가 식물체 발생에 미치는 영향을 조사한 연구는 매우 드물다. 그러나 배양 3주 후의 미성숙 자엽배를 재분화 배지에 이식한 후 바로 화분으로 옮길 수 있는 유식물체로 발달시키는데 적합한 배양용기의 사용은 소포자 유래의 식물체 생산은 물론 이들을 이용할 수 있는 기간을 크게 단축시킬 수 있으므로 실제 이용 면에서 매우 중요하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실시예

실험 방법

1) 고추의 소포자 배양 방법

(1) 모 식물의 생육조건 (growth condition of mother plants)

고추 (밀양재래)의 종자를 직경 25 cm의 플라스틱 화분에 파종하여 4주가 되었을 때 직경 30 cm 화분에 1개체씩 이식하여 사용하였다. 식물은 온도가 25/20℃ (주/야)이고, 광주기가 18 시간이며, 광도는 형광등과 metal lamp를 이용하여 15,000~20,000 Lux가 되도록 유지되는 생장실에서 생장시켰다.

(2) 적기의 꽃봉오리 채취 및 멸균 (harvest & sterilization of flower buds)

꽃봉오리의 채취는 1/4-3/4 정도가 보라색으로 된 약 (anther)이 들어있는 꽃봉오리를 채취하였다. 이와 같이 착색된 약 내에는 후기 1핵성 소포자 또는 초기 2핵성 화분이 들어 있었다.

꽃봉오리의 멸균은 2% sodium hypochlorite 용액에서 10 분간 멸균한 후 멸균수로 4회 수세(washing)하였다.

(3) 소포자의 나출 (isolation)

블렌딩(blending): micro-blender (Waring blender, 8575 micro container)에 약 30 개의 꽃봉오리를 넣고 10 ml의 전처리 배지 (소포자 전처리 참조)를 첨가한 후 고속 (약 18,000 rpm)에서 5초씩 2회 블렌딩하였다.

볼텍싱(vortexing): 블렌딩이 끝난 것을 Vortex Genie 2 Mixer를 사용하여 highest speed에서 15초씩 2회 볼텍싱하였다. 이 때, micro-blender와 전처리 배지는 냉장고에 보관하여 사용하였다.

(4) 소포자의 수확 및 수세 (harvest & washing)

여과(filtration): 75 ㎛ 및 38 ㎛의 체로 체세포조직 파편 (debris)들과 소포자를 분리하였다.

소포자의 수확: 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다.

소포자의 수세: 전처리 배지로 1,000 rpm에서 5분씩 3회 실시하였다.

(5) 소포자의 전처리 (microspore pretreatment)

전처리 배지에 소포자의 밀도가 1 ml에 약 200,000개가 되도록 hemocytometer를 사용하여 조정한 후 90x20 mm 크기의 Petri dish에 9~12 ml 씩 분주하고 파라필름(parafilm)으로 봉한 후 건조를 막기 위해 멸균수로 적신 filter paper가 들어있는 140x20 mm Petri dish에 넣어 다시 파라필름으로 봉하여 32℃에서 3일간 처리하였다.

전처리 배지는 0.37 M 만니톨에 수크로스가 제외된 NLNS 배지를 첨가하여 사용하였으며, pH는 5.8~6.0으로 조정하였다.

(6) 소포자 배양

소포자 배양 시 배지는 하층에는 고체 배지가, 상층에는 액체 배지가 있는 2층배지 (double layer medium)를 사용하였다. 이때 하층의 고체 배지는 1/2 NLNS 배지를 상층의 액체 배지는 NLNS 배지를 사용하였다. 배지의 수크로스 농도는 10%이었으며, pH는 5.8~6.0으로 조정하였다.

배양 1~7 일 전에 60x15 mm 크기의 배양 접시에 고체배지 7 ml을 분주하여 미리 준비하였다.

전처리가 끝난 소포자들을 50 ml 원심분리 튜브에 모아 원심 분리하여 모은 후, NLNS 액체 배지에 소포자의 밀도가 1 ml에 약 100,000개가 되도록 조정하여 고체 배지가 들어있는 Petri dish에 1.5 ml 씩 치상하였다. 치상이 끝난 것은 파라필름으로 봉한 후 시중에서 일반적으로 사용되는 투명한 플라스틱 박스에 넣어 25℃의 암 상태에서 배양하였다. 배양 1일 후 1.5 ml의 새 배지를 다시 첨가하였다.

(7) 배지의 멸균

전처리 배지와 배양 배지 모두 여과 멸균하였다. 구멍의 크기가 0.45 ㎛인 여과막 (filter membrane)을 사용하여 1차 여과한 후 다시 0.22 ㎛인 여과막을 사용하여 2차 여과하였다. 이때 사용한 여과막은 멸균수 100 ml을 사용하여 1차 세척하고 배지 10 ml을 사용하여 다시 세척한 후 사용하였다. 단, 성숙 자엽배의 획득이 목적인 경우에는 세척하지 않은 여과막 (filter membrane)을 사용하여 멸균하였다.

2) 재분화 ( regeneration ) 실험

(1) 상기 소포자배양 방법에 의해 발생한 배 (embryo)들을 재분화 배지로 옮긴 후 25/20℃ (주/야), 18 시간 광주기인 저온 배양기에서 배양하였으며, 배양기의 광도는 형광등을 사용하여 약 3,000 Lux가 되도록 하였다. 재분화 배지로 이식시 배는 1개의 배양 용기에 25개씩 치상하였다.

(2) 재분화 배지는 2% 수크로스가 포함되어 있으며, phytagel 0.4%가 첨가된 고체 배지를 사용하였다. 재분화시 배지의 영향을 조사한 실험에서는 1/2 MS, NN, B5, 및 NLNS의 4가지 배지를 사용하였으나, 이외의 실험에서는 1/2 MS 배지를 사용하였다.

(3) 배의 이식 시기는 이식시기의 영향을 조사한 실험에서는 소포자 배양 3, 4, 및 5주 후에 발생한 배들을 재분화 배지로 옮겼으나, 이외의 실험에서는 3주 후에 발생한 배들을 옮겼다.

(4) 재분화 용기는 배양용기의 영향을 조사한 실험에서는 9x1.5 cm, 10x4 cm, 12x8 cm, 8.5x7 cm, 7x14 cm, 및 6x7 cm의 6가지 배양용기를 사용하였으나, 이외의 실험에서는 10x4 cm 크기의 배양 접시를 사용하였다 (도 3).

(5) 결과조사

실험은 5~7 반복씩 2회 이상 실시하였다. 재분화 배지로 이식한 8주 후에 재분화 용기 1개에서 발생한 유식물체의 수를 계수하여 평균과 표준오차를 구하였다. 유식물체는 본엽이 3매 이상 나온 것만을 계수하였다.

실시예 1: 성숙 자엽배 이식시 재분화 배지가 식물체 발달에 미치는 영향

배양 3 주 후에 얻어진 성숙 자엽배 (도 2의 A)를 10x4 cm 크기의 배양 접시에 이식하였다. 재분화 배지가 유식물체 발달에 미치는 영향을 조사하기 위해 1/2 MS, NLNS, B5, 및 NN의 4가지 배지를 사용하였다 (표 1, 2, 3, 4).

[표 1] NLNS 배지의 조성

성분	함량(㎎/ℓ)
주영양소
질산칼륨(KNO₃)	125
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	125
질산칼슘[Ca(NO₃)₂·4H₂O]	500
제일인산칼륨(KH₂PO₄)	125

미량영양소
황산망간(MnSO₄·4H₂O)	22.3
붕산(H₃BO₃)	6.2
황산아연(ZnSO₄·7H₂O)	8.6
몰리브덴산나트륨(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.25
황산구리(CuSO₄·5H₂O)	0.025
염화코발트(CoCl₂·6H₂O)	0.025
요오드화칼륨(KI)	0.83

철
황산제일철(FeSO₄·7H₂O)	27.8
Na₂·EDTA	37.2

비타민
마이오이노시톨(Myo-inositol)	100
니코틴산(Nicotianic acid)	5
염산 피리독신(Pyridoxine HCl)	0.5
염산 치아민(Thiamine HCl)	0.5
엽산(Folic acid)	0.5
글리신(Glycine)	2
비오틴(Biotin)	0.05

아미노산 보충제
글루타민(Glutamine)	800
글루타티온(Glutathione)	30
세린(Serine)	100

[표 2] MS 배지의 조성

성분	함량(㎎/ℓ)
주영양소
질산칼륨(KNO₃)	1,900
질산암모늄(NH₄NO₃)	1,650
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	370
염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)	440
인산이수소칼륨(KH₂PO₄)	170

미량영양소
황산망간(MnSO₄·4H₂O)	22.3
붕산(H₃BO₃)	6.2
황산아연(ZnSO₄·7H₂O)	8.6
몰리브덴산나트륨(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.25
황산구리(CuSO₄·5H₂O)	0.025
요오드화칼륨(KI)	0.83
염화코발트(CoCl₂·6H₂O)	0.025

철
황산제일철(FeSO₄·7H₂O)	27.8
Na₂·EDTA	37.2

비타민 & 아미노산
마이오이노시톨(Myo-inositol)	100
니코틴산(Nicotianic acid)	0.5
염산 피리독신(Pyridoxine HCl)	0.5
염산 치아민(Thiamine HCl)	0.1
글리신(Glycine)	2.0

[표 3] B5 배지의 조성

성분	함량(㎎/ℓ)
주영양소
질산칼륨(KNO₃)	2,500
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	250
황산암모늄[(NH₄)₂SO₄]	134
제일인산나트륨(NaH₂PO₄·H₂O)	150
염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)	150

미량영양소
황산망간(MnSO₄·H₂O)	10.0
붕산(H₃BO₃)	3.0
황산아연(ZnSO₄·7H₂O)	2.0
요오드화칼륨(KI)	0.75
몰리브덴산나트륨(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.25
염화코발트(CoCl₂·6H₂O)	0.025
황산구리(CuSO₄·5H₂O)	0.025

철
황산제일철(FeSO₄·7H₂O)	27.8
Na₂·EDTA	37.2

비타민 & 아미노산
마이오이노시톨(Myo-inositol)	100
염산 치아민(Thiamine HCl)	10.0
염산 피리독신(Pyridoxine HCl)	1.0
니코틴산(Nicotianic acid)	1.0

[표 4] NN 배지의 조성

성분	함량(㎎/ℓ)
주영양소
질산칼륨(KNO₃)	950.0
질산암모늄(NH₄NO₃)	720.0
황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)	185.0
염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)	166.0
인산이수소칼륨(KH₂PO₄)	68.0

미량영양소
황산망간(MnSO₄·4H₂O)	25.0
붕산(H₃BO₃)	10.0
황산아연(ZnSO₄·7H₂O)	10.0
몰리브덴산나트륨(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.25
황산구리(CuSO₄·5H₂O)	0.025

철
황산제일철(FeSO₄·7H₂O)	27.8
Na₂·EDTA	37.2

비타민 & 아미노산
마이오이노시톨(Myo-inositol)	100.0
니코틴산(Nicotianic acid)	5.0
염산 피리독신(Pyridoxine HCl)	0.5
염산 치아민(Thiamine HCl)	0.5
엽산(Folic acid)	0.5
글리신(Glycine)	2.0
비오틴(Biotin)	0.05

배양 3주 후에 발생한 성숙 자엽배를 1/2 MS, B5, NN, 및 NLNS의 4가지 재분화 배지에 이식한 결과 1/2 MS, B5, NN 배지에서는 2주 후부터 자엽이 전개되고 배축이 발달하면서 직립하기 시작하였으며, 8주 후에는 본엽이 3개 이상인 유식물들로 발달하였다. 그러나 NLNS 배지에서는 8주 후에도 자엽이 전개되지 않았으며 유식물로 발달하지 못하였다. 재분화 배지 1/2 MS, B5, 및 NN을 사용한 경우 식물체의 발생이나 발달 모두 배지 간에 차이가 없었으며 이식한 배의 대부분이(최소 95% 이상) 식물체로 발달하였다 (도 4).

따라서, 성숙 자엽배의 경우 NLNS를 제외한 1/2 MS, B5, 및 NN 배지 모두 재분화에 적합하며, 이식된 배는 용이하게 식물체로 발달할 수 있는 것으로 나타났 다.

실시예 2: 미성숙 자엽배 이식시 재분화 배지가 식물체 발달에 미치는 영향

배양 3 주 후에 얻어진 미성숙 자엽배 (도 2의 B, C)를 10x4 cm 크기의 배양 접시에 이식하였다. 재분화 배지가 유식물체 발달에 미치는 영향을 조사하기 위해 1/2 MS, NLNS, B5, 및 NN의 4가지 배지를 사용하였다. 실험은 3 반복씩 3회 실시하였다.

본 발명에서는 소포자 배양 3 주 후에 발생한 배들이 크기가 작았고 대부분이 미성숙 자엽배들이었으므로 소포자 배양시 사용하였던 것과 동일한 NLNS 배지 (Kim et al. 2007)를 비롯하여 재분화시 널리 사용되는 배지인 1/2 MS, B5, NN의 4가지 재분화 배지를 사용하였다.

배양 3 주 후에 발생한 미성숙 자엽배를 1/2 MS, B5, NN, 및 NLNS의 4가지 재분화 배지에 이식한 결과 성숙 자엽배와는 달리 3주 후에도 자엽과 배축이 발달하지 못하였다. 8주 후 식물체의 발생 비율을 조사한 결과 1/2 MS 배지 사용 시에는 43.6%이었으나 B5와 NN 배지 사용 시에는 각각 37.2%와 18%로 크게 감소하였으며, NLNS 배지에서는 식물체가 발생하지 않았다 (표 5, 도 5).

따라서 미성숙 자엽배 이식시 재분화 배지는 사용한 배지 중 1/2 MS가 가장 적합한 것으로 나타났다.

[표 5] 미성숙 자엽배 이식시 재분화 배지가 식물체 발달에 미치는 영향

재분화 배지	이식한 배의 수/ 배양접시	재분화된 식물체의 수 /배양접시	재분화된 식물체의 비율 (%)
1/2 MS	25	10.0 ± 1.2	43.6 ± 5.5
B5	25	8.4 ± 1.3	37.2 ± 6.1
NN	25	4.1 ± 1.8	18.0 ± 8.6
NLN	25	0.0 ± 0.0	0.0 ± 0.0

본 성적은 각 처리 당 3 반복씩 3회 실시한 실험의 평균과 편차이다.

실시예 3: 미성숙 자엽배 이식시 이식 시기가 식물체 발달에 미치는 영향

소포자 배양 결과 얻어진 미성숙 자엽배를 1/2 MS 배지가 들어 있는 10x4 cm 크기의 배양 접시에 이식하였다. 배의 이식시기가 유식물체 발달에 미치는 영향을 조사하기 위해 소포자배양 3, 4, 및 5주 후에 발생한 배를 재분화 배지로 이식하였다. 실험은 4 반복씩 2회 실시하였다.

소포자 배양 3, 4, 및 5주 후에 발생한 미성숙 자엽배들을 재분화 배지로 이식한 후 식물체의 발생을 조사한 결과 재분화 배지로 이식한 1주 후에는 3주된 배를 이식한 경우 자엽이 녹색을 뛰면서 발달하기 시작하였으며 5주된 배를 이식한 경우에는 자엽 보다는 뿌리의 발달이 왕성하였다. 재분화 배지로 이식한 4주 후에는 3주된 배를 이식한 경우 자엽이 전개되면서 본엽이 나타나기 시작하였으나 5주된 배를 이식한 경우에는 본엽의 발생은 물론 자엽도 전개되지 않았다. 재분화 배지로 이식한 8주후 본엽이 3개 이상 나온 유식물의 발생 비율을 조사한 결과 3주된 배를 이식한 경우 46.2% 이었으나 4주된 배를 이식한 경우에는 이보다 크게 낮아 27% 이었으며 5주된 배를 이식한 경우에는 3.5%에 불과하였다 (표 6, 도 6).

[표 6] 미성숙 자엽배 이식시 이식시기가 식물체 발달에 미치는 영향

소포자 배양 기간(주)	이식한 배의 수/배양접시	재분화된 식물체의 수/배양접시	재분화된 식물체의 비율(%)
3	25	11.6±1.7	46.2±7.0
4	25	6.8±3.6	27.0±14.5
5	25	0.9±0.8	3.5±3.3

본 성적은 각 처리 당 4 반복씩 2회 실시한 실험의 평균과 편차이다.

이상에서와 같이 재분화 배지로 이식시 배의 크기는 소포자 배양 기간이 길어질수록 컸으나 식물체의 발생과 발달 정도는 소포자 배양 기간이 짧을수록 높아 3 주된 배의 이식시 가장 좋았으며, 다음은 4주와 5주 순으로 높았다.

따라서, 식물체의 발생 및 발달 모두 소포자 배양 후 3주된 된 배를 이식하는 것이 가장 좋은 것으로 나타났다.

실시예 4: 미성숙 자엽배 이식시 배양 용기가 식물체 발달에 미치는 영향

소포자 배양 3주 후에 얻어진 미성숙 자엽배를 1/2 MS 배지가 들어 있는 배양 용기에 이식하였다. 배양 용기가 유식물체 발달에 미치는 영향을 조사하기 위해, 9x1.5 cm, 10x4 cm, 12x8 cm, 8.5x7 cm, 7x14 cm, 및 6x7 cm 크기의 6가지 용기(도 3)를 사용하였다.

9x1.5 cm와 10x4 cm 용기는 투명한 플라스틱으로 된 배양 접시이며, 12x8 cm 용기는 불투명한 플라스틱으로 된 것이었으며, 8.5x7 cm 용기는 투명한 플라스틱으로 되었으나 뚜껑은 불투명하였으며 여과지로 봉한 구멍이 있었다. 7x14 cm와 6x7 cm 용기는 유리병으로 되어 있으며 뚜껑은 불투명한 플라스틱으로 되어 있었다. 실험은 4 반복씩 3회 실시하였다.

재분화 시 배양 용기가 식물체의 발생 및 발달에 미치는 영향을 조사하기 위 해, 소포자 배양 3주 후 발생한 미성숙 자엽배들을 9x1.5 cm, 10x4 cm, 12x8 cm, 8.5x7 cm, 7x14 cm, 및 6x7 cm 크기의 6가지 용기에 이식한 후 유식물의 발생 및 발달을 조사한 결과 재분화 배지로 이식한 4주 후에는 7x14 cm와 6x7 cm 크기의 것을 사용한 경우 식물체로의 발달이 다소 빨랐으나 9x1.5 cm, 10x4 cm, 12x8 cm, 및 8.5x7 cm 크기의 것을 사용한 경우, 4가지 배양 용기 간에 큰 차이가 없었다. 그러나 재분화 배지로 이식한 8주 후에는 깊이가 가장 낮은 9x1.5 cm의 배양접시나 폭이 가장 좁은 6x7 cm 배양병의 경우 더 이상의 생장이 이루어지지 않았으며, 10x4 cm의 배양용기 이외의 다른 용기들에서도 생육이 왕성하지 못하였다. 8주 후 본엽이 3개 이상인 유식물의 발생 비율을 조사한 결과, 10x4 cm의 배양 용기를 사용한 경우 47.2%로 가장 높았으며 다음은 8.5x7 cm 크기의 것으로 33.8%이였다. 이외의 배양 용기 사용시에는 이보다 크게 감소하여 22~25.5% 이었다. 10x4 cm의 배양 용기 사용시에는 본엽이 나온 식물체의 발생 비율뿐만 아니라 발생한 잎의 수도 가장 많았고 잎의 발달도 좋았다 (표 7, 도 7). 더욱이 10x4 cm의 배양접시는 크기가 큰 다른 용기들에 비해 많은 공간을 차지하지 않으며, 가격도 저렴하므로 매우 실용적이다.

따라서, 재분화 용기는 10x4 cm의 배양접시가 가장 적합한 것으로 나타났다.

[표 7] 미성숙 자엽배 이식시 배양용기가 식물체 발달에 미치는 영향

배양 용기의 크기 (cm)	이식한 배의 수/ 배양접시	재분화된 식물체의 수/배양접시	재분화된 식물체의 비율(%)
9x1.5	25	3.9±2.4	15.6±9.5
10x4	25	11.8±3.4	47.2±13.6
12x8	25	6.0±3.6	24.0±14.4
8.5x7	25	8.5±4.7	33.8±18.8
7x14	25	6.4±5.1	25.5±20.4
7x6	25	5.5±2.7	22.0±10.7

본 성적은 각 처리 당 4 반복씩 3회 실시한 실험의 평균과 편차이다.

실시예 5: 고추 소포자배 유래의 식물체 생산

본 발명의 결과 고추의 소포자배양 (microspore culture) 결과 얻어진 배 (embryo)를 재분화 배지에 이식하여 유식물체로 발달시키는데 적합한 조건은 1) 재분화 배지는 1/2 MS배지를 사용하고, 2) 재분화 배지로의 이식은 소포자 배양 3주후에 하며, 3) 재분화 용기는 크기가 10x4 cm인 배양접시를 사용하는 것이다. 이상의 재분화 조건에서는 성숙 자엽배는 거의 모두가 식물체로 발달하였으며, 미성숙 자엽배도 치상한 배 중 47% 이상이 식물체로 발달하였다. 또 이들 기내 식물들은 뿌리의 발달이 좋아 흙이 담긴 화분에 이식시 용이하게 활착하여 식물체로 생장하였다 (도 8). 본 발명의 결과 소포자 유래의 미성숙 자엽배들로부터 다수의 식물체를 획득할 수 있게 되었을 뿐만 아니라, 소포자 배양 3주 후에 발생한 배를 재분화 배지에 이식하여 8주 만에 식물체로 재분화시킬 수 있게 됨으로서 소포자 배양 11주 만에 식물체를 획득할 수 있게 되었다.

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도 1. 소포자 배양 3주 후에 발생한 배. (A) 세척하지 않은 여과막 (filter membrane)을 사용하여 멸균한 전처리 배지와 배양 배지를 사용하였을 때 발생한 배, (B) 세척한 여과막 (filter membrane)을 사용하여 멸균한 전처리배지와 배양 배지를 사용하였을 때 발생한 배.

도 2. 성숙 자엽배와 미성숙 자엽배. (A) 성숙자엽배, (B) 및 (C) 미성숙 자엽배.

도 3. 재분화 시 사용된 배양 용기. (A) 9x1.5 cm, (B) 10x4 cm, (C) 12x8 cm, (D) 8.5x7 cm, (E) 7x14 cm, (F) 6x7 cm.

도 4. 성숙 자엽배를 각기 다른 재분화 배지에 이식한 2주 (A-D)와 8주 (a-d) 후에 발생한 유식물체. (A) 1/2 MS, (B) B5, (C) NN, (D) NLNS.

도 5. 미성숙 자엽배를 각기 다른 재분화 배지에 이식한 3주 (A-D)와 8주 (a-d) 후에 발생한 유식물체. (A) 1/2 MS, (B) B5, (C) NN, (D) NLNS.

도 6. 소포자 배양 후 각기 다른 시기에 발생한 배 (A-C)와 이들을 재분화 배지에 이식한 1주 (a-c), 4주(a'-c'), 및 8주 (a"-c") 후에 발생한 유식물체. (A) 3주, (B) 4주, (C) 5주.

도 7. 미성숙 자엽배를 각기 다른 배양 용기에 이식한 후 4주 (A-F)와 8주 (a-f) 후에 발생한 유식물체.

(A) 9x1.5 cm, (B)10x4 cm, (C) 12x8 cm, (D) 8.5x7 cm, (E) 7x14 cm, (F) 6x7 cm.

도 8. 미성숙 자엽배로부터 발달한 식물들. (A) 미성숙 자엽배를 1/2 MS 재분화 배지에 이식한 8주 후 10x4 cm 배양 접시에서 발생한 유식물. (B) 화분으로 이식하기 전의 유식물, (C) 화분으로 이식한 4주 후의 식물들, (D) 화분에 정식한 6주 후의 식물들.

Claims

고추의 소포자 배양(microspore culture)으로부터 얻어진 성숙 또는 미성숙 자엽배(cotyledonary embryo)를 재분화 배지에 이식하여 배양하는 단계를 포함하는 고추의 소포자 배로부터 식물체를 생산하는 방법으로서,

상기 재분화 배지는 성숙 자엽배의 경우 2% 수크로스가 포함되어 있으며, phytagel 0.4%가 첨가된 1/2 MS 또는 NN 배지를 사용하고, 미성숙 자엽배의 경우 2% 수크로스가 포함되어 있으며, phytagel 0.4%가 첨가된 1/2 MS 배지를 사용하며,

미성숙 자엽배의 재분화 배지로의 이식은 소포자배양 후 3 주 된 배를 이식하며,

상기 재분화 배지는 재분화 용기에 포함되며, 상기 재분화 용기는 지름x높이가 10x4 cm인 배양 접시를 사용하는 것을 특징으로 하는 고추의 소포자 배로부터 식물체를 생산하는 방법.
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