CN101292023A - 制造纯且高品质的微藻的起始试剂盒 - Google Patents

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Abstract

从水产养殖塘底部沉积物中提取的富营养物孔隙水或间隙水(interstitial water，IW)的新颖用途是用于培养不同纯微藻物种的替代培养基。所述培养基是通过提取、过滤、杀菌从富营养淤泥沉积物收集的间隙水且最后将所述间隙水浓缩为富营养物液体提取物或粉末，并通过将之分别稀释或溶解于水中来制备培养基。微藻生长启始试剂盒是通过包装微藻分离物与富营养物液体提取物和/或粉末来制造。

Description

制造纯且高品质的微藻的起始试剂盒
技术领域
本发明涉及用于由海洋水产养殖塘泥制备微藻培养基的方法。所述培养基又可用作启始具有纯微藻分离物的微藻培养物生长以制造高品质微藻的起始试剂盒。
背景技术
实际上纯藻的需求量很大，特别是在水产养殖工业领域、研究机构和学校。这是因为纯微藻具有高含量的重要多不饱和脂肪酸，例如二十碳四烯酸(20:4n-6)、二十碳五烯酸(EPA)(20:5n-5)、二十二碳五烯酸(DPA)(22:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA)(22:6n-3)。因此，微藻是人类和动物健康的重要营养物的极好来源。此外，其也增强水栖息地内的鱼颜色以及作为鱼和虾幼虫生产的活食物。另外，纯且高品质的微藻通常用于饲料添加剂、医药产品、保健产品和化妆产品。
归因于难以获得和维持纯微藻分离物的事实，因为此需要专业知识和专用设备。举例来说，使用供制造微藻用的有机肥料产生污染，例如重金属、抗生素和其它有害生物体。另外，取决于有机肥料来源，所制得的藻类的品质较低且可变化。使用例如脲或重钙的化学肥料不会提供所有的必需成分，例如存在于间隙水中的痕量矿物质。实际上，实验室中广泛使用的微藻的完全培养基须由15种不同化学品组成。因此，有必要开发低廉且容易的起始纯藻培养的方法。
水产养殖塘的底部沉积物通常含有大量呈饲料、肥料和排泄物形式的高品质有机物，从而产生富营养淤泥。虽然这些底部沉积淤泥富含磷酸盐、氮、碳、氧化硅和其它微量营养素，但未经处理的水产养殖淤泥实际上是水生环境的污染源。排放这一富营养淤泥可导致公共用水的严重富营养化问题。此可破坏所有水生工业(包括水产养殖)的可持续性。
另一方面，水产养殖实施的有机物使底部沉积物富含营养。可使用从淤泥提取的间隙水中的生长营养物(例如氮、磷和其它微量营养素)用于制造高品质微藻。实际上，所述淤泥的处理或再循环可通过提取含有这些营养物的间隙水来进行。排放所述经处理的淤泥将使河流和沿海地区的污染最小化。
发明内容
本发明提供制造微藻培养基的方法，所述方法包含以下步骤：从水产养殖塘沉积物中获得塘泥，接着通过离心或加压提取间隙水，将提取物过滤和杀菌以及最后将浓缩提取物冻干以变成粉末。这样产生的培养基可以用作起始纯培养且最小污染。
本发明的主要目的在于提供低廉、容易制造纯净且高品质的微藻的方法。这是因为难以获得和维持纯微藻分离物，此需要专业知识和专用设备。这一培养基制备步骤相对容易且其制造成本比标准培养基便宜得多。将所制得的培养基制成粉末形式以便处理和储藏。
除此以外，根据所揭露的方法制备的培养基可通过将所提供的纯微藻分离物以想要浓度添加到经稀释的所述培养基中来起始纯微藻培养。这使纯微藻的大量培养变得容易且污染最小。与在标准培养基中生长的微藻相比，在所述培养基中生长的微藻含有更高水平的营养价值。
附图说明
图1：所揭露的方法的示意性流程图。
具体实施方式
本发明提供由水产养殖塘底部淤泥制备用于培养纯微藻类物种的培养基的方法。收集从水产养殖塘底部沉积物提取的富营养物间隙水(interstitial water，IW)且使所述间隙水经受提取，接着过滤和杀菌以获得营养物浓缩提取物。通过冻干将营养物浓缩提取物制成粉末。将定制纯微藻分离物补充到所述浓缩提取物或粉末中以提供作为微藻培养目的微藻生长启始试剂盒。所揭露的本发明的步骤如图1中所说明。
首先，手动或借助于抽吸泵收集富营养水产养殖塘底部沉积物(或此后称为塘泥)。取决于沉积物的质地，1千克塘泥可产生500-1000毫升浓缩液体提取物。待收集的塘泥的量取决于所需的提取物的量。
使所收集的塘泥经提取以获得孔隙水或间隙水(IW)，此后称为液体浓缩物。使淤泥在6000至8000转/分的速度下经离心(使用离心机)20至40分钟。仅经一次离心以从离心容器中的各塘泥负载中提取孔隙水或间隔水。或者，可使淤泥经加压(使用压缩机)以使淤泥下沉从而留下所述富含微量营养素的液体浓缩物。在所述过程期间，不添加其它化学品。
提取过程后，将所述液体浓缩物转移到洁净容器中。通过玻璃纤维过滤器进行过滤，接着通过0.45微米和0.22微米的过滤膜进行过滤。所述过滤步骤在于滤出细菌和其它活微生物。这一步骤最好在无菌条件下进行。然后使所述过滤液体浓缩物经受化学分析以确定其营养物含量。
接着，通过紫外(ultraviolet，UV)光(254纳米的远紫外范围)曝露1-2小时使所述经分析液体浓缩物经受杀菌。紫外光根除所有那些先前未滤出的较小微生物。通过这一方法而不是高压灭菌锅进行杀菌是为确保所有富营养培养基得以维持而不被高压灭菌锅的热和压力破坏。经灭菌液体提取物在取决于先前所确定的营养物含量稀释到想要浓度后可随时使用。
将所述无菌液体浓缩物无菌转移到冰块制造机中以形成冰块。然后将所述浓缩成冰块形式的液体转移到无菌塑料薄膜中且放置到冻干机容器中。在-40℃至-55℃的温度下和130-150×103毫巴的真空压力下在3天内冻干所述冰块。所获得的富营养物粉末在冻干后可随时使用。在20℃至30℃下，将所述富营养物粉末储藏于气密容器中。取决于所确定的营养物含量，1克所述富营养物粉末可产生5至10升液体培养基。将所述液体培养基储藏于气密瓶中且在2-6℃下储藏。
此外，富营养物液体浓缩物或粉末可进一步加工成试剂盒，微藻生长启始试剂盒形式。所述试剂盒包含富营养物液体浓缩物或粉末和几种类型的定制微藻分离物。所述定制微藻分离物可与富营养物液体浓缩物或粉末混合且用户可根据所给的说明书简单地通过稀释所述混合物培养定制微藻。上述定制微藻为角毛藻属(Chaetoceros spp.)、骨条藻属(Skeletonema spp.)、等鞭金藻属(Isochrysis spp.)、月形藻属(Amphoraspp.)、桥弯藻属(Cymbella spp.)、舟形藻属(Navicula spp.)、小球藻属(Chlorella spp.)、拟球藻属(Nannochloropsis spp.)、扁藻属(Tetraselmisspp.)、颤藻属(Oscillatoria spp.)、螺旋藻属(Spirulina spp.)和假鱼腥藻属(Pseudanabaena spp.)。在另一优选实施例中，所述定制微藻分离物可以其它无富营养物液体浓缩物或粉末的补充物形式提供或反之亦然。所揭露的试剂盒可由任何有或无培养微藻专业知识的人员随时使用，因为培养步骤可根据试剂盒内随附的说明书容易地进行。
实例1
由富营养物液体浓缩物或粉末制造的培养基富含符合健康制造高品质藻类物种要求的磷、氮、二氧化硅、必需矿物质和微量营养素。上述培养基可用于在无污染的情况下大量培养纯物种。在塑料袋曝露于日光或其他光源的情况下，纯藻类培养物将繁盛生长，在7至10天内达到稳定期。实验证明在所述培养基中培养的海藻(钙质角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)(硅藻)、颤藻属(蓝绿藻)和微绿球藻(Nannochloropsis oculata)(绿藻)、四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)和螺旋藻属)产生比标准培养基(康维(Conway))显著更高的密度(p＜0.05)和培养速率。下图展示硅藻钙质角毛藻和绿藻微绿球藻在标准培养基(康维(Conway))和经稀释间隙水(diluted interstitial water，DIW)中的培养。
Figure A20068003844800081
实例2
其他生物鉴定证明经稀释藻类培养基是培养纯微藻储备物的最佳培养基。在所述培养基中所培养的藻类展示比生长于标准(康维(Conway))培养基中的那些藻类明显更高的营养品质。举例来说，与生长于含有约15种不同化学品的标准康维(Conway)培养基中的那些藻类相比，所培养的藻类含有较高浓度的必需氨基酸和多不饱和脂肪酸(尤其Ω3和6)。
下图展示标准培养基(康维(Conway))和经稀释间隙水(DIW)中的硅藻钙质角毛藻的脂肪酸(克/100克脂质)分布图。(EPA：二十碳五烯酸；DHA：二十二碳六烯酸；n3：Ω3；n6：Ω6；PUFA：多不饱和脂肪酸)。将微藻分离物在2-6℃下储藏于黑瓶中且可持续最少6个月。藻类培养可容易地通过将液体提取物或粉末稀释于例如塑料袋或瓶的透明容器中，接着接种所提供的藻类细胞来启始。所述微藻培养基可通过在其中添加琼脂来用作培养微藻储备物的固体培养基。
Figure A20068003844800091
实例3
使所过滤的液体提取物经化学分析以确定其营养物含量。下表展示所述来自虾塘和康维(Conway)培养基的经过滤提取物的化学成分和物理参数。值为平均值±标准偏差。
  参数   来自虾塘的间隙水   康维(Conway)   康维(Conway)+二氧化硅
  传导率(mS/cm)   26.5-53.9   44.9   43.0
  盐度(ppt)   16.2-38.0   28.5   27.5
  PH值   7.9-9.8   8.0   8.0
  总氨-N(TAN)(mg/L)   18.5-55.1   10.3±0.1   10.2±0.1
  硝酸盐(NO3-N)(mg/L)   0.1-12.1   ＜0.1   ＜0.01
  亚硝酸盐(NO2-N)(mg/L)   ＜0.1-3.0   0.2±0.1   0.2±＜0.1
  磷酸盐-P(PO4-P)(mg/L)   4.2-12.7   6.1±0.9   6.5±1.5
  反应性二氧化硅(mg/L)   32.1-71.8   21.0±0.5   36.3±0.3
  总氮(TN)(mg/L)   30.4-125.5   17.8±＜0.1   20.6±＜0.1
  总磷(TP)(mg/L)   8.1-46.5   10.9±＜0.1   10.6±＜0.1

Claims (14)

1.一种制造微藻培养基的方法，其包含以下步骤：
a)收集淤泥；
b)从所述所收集的淤泥中提取间隙水以获得液体浓缩物；
c)过滤所述所提取的液体浓缩物；
d)评定所述经过滤的液体浓缩物的营养含量；
e)对所述经过滤的液体浓缩物进行杀菌；以及
f)浓缩所述无菌液体浓缩物以获得富营养物粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间隙水的所述提取是通过离心或加压来进行。
3.根据权利要求1和2所述的方法，其中所述提取是以6000至8000转/分(rpm)的速度进行20至40分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取的液体浓缩物的所述过滤是玻璃纤维过滤和膜过滤。
5.根据权利要求1和4所述的方法，其中所述膜过滤是在0.22微米和0.45微米(μm)的微孔尺寸下进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述经过滤液体浓缩物的所述杀菌是将所述间隙水曝露于紫外(UV)光下1-2小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述无菌液体浓缩物的所述浓缩进一步包含以下步骤：
a)由所述无菌液体浓缩物形成冰；
b)在冻干机中冻干所述冰以获得所述富营养物粉末。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述冻干是在-40℃至-55℃的温度下和130-150×103毫巴(mbar)的真空压力下进行。
9.根据权利要求7和8所述的方法，其中所述方法的所有步骤是在无菌条件下执行。
10.一种液体浓缩物或富营养物粉末，其是由前述权利要求中任何一个权利要求制造。
11.一种根据权利要求10所述的液体浓缩物或富营养物粉末的用途，其是用于制造微藻培养基的方法中。
12.一种制造微藻培养基的方法，其是通过将1克根据权利要求10所述的富营养物粉末混合至5至10升水中来实现。
13.一种起始微藻生长的试剂盒，其包含：
a)根据权利要求11所述的富营养物液体浓缩物和/或粉末，以及
b)以所述富营养物液体浓缩物或粉末补充至少一种类型的微藻分离物。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述微藻分离物为角毛藻属(Chaetoceros spp.)、骨条藻属(Skeletonema spp.)、等鞭金藻属(Isochrysis spp.)、月形藻属(Amphora spp.)、桥弯藻属(Cymbella spp.)、舟形藻属(Navicula spp.)、小球藻属(Chlorella spp.)、拟球藻属(Nannochloropsis spp.)、扁藻属(Tetraselmis spp.)、颤藻属(Oscillatoriaspp.)、螺旋藻属(Spirulina spp.)和假鱼腥藻属(Pseudanabaena spp.)。
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