CN115873782A - 一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液、试剂盒和方法。本发明所述用于制备青花菜原生质体的酶解液，包括混合酶和甘露醇；所述混合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，所述纤维素酶与果胶酶的质量比为5～15:1，所述纤维素酶在所述酶解液中的质量浓度为0.5～1.5％；所述甘露醇在所述酶解液中的浓度为0.3～0.6M。利用上述的酶解液酶解可以获得较高的甘蓝类植物原生质体产量和活力。

Description

一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液、试剂盒和方法。

背景技术

青花菜(Brassica oLeracea L.var.itLica PLanch，2n＝18)，又名西蓝花(西兰花)、绿菜花等，是十字花科芸薹属甘蓝类的一个变种，其主要食用器官为花球。青花菜营养全面，富含蛋白质、维生素和矿物质，被誉为“蔬菜皇冠”。研究发现，青花菜中有益硫甙4-甲基亚磺酰基丁基硫甙(GLucoraphanin，GRA)含量最高，在咀嚼和食用青花菜过程中，能够发生水解反应生成一种抗癌活性成分莱菔硫烷，或是GRA经人体消化道菌群作用也能生成莱菔硫烷(萝卜硫素)，据霍普金斯大学、哈弗医学院等国内外知名医学机构和大学研究，结合临床医学和流行病学数据，莱菔硫烷是目前蔬菜中发现的抗癌活性最强的成分。作为一种公认的国际流行蔬菜，其营养备受国内外关注。

植物原生质体是指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。这种裸露细胞在适当的外界条件下还可以形成细胞壁，进行正常的有丝分裂，最终形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。原生质体培养就是指以这种裸露细胞作为外植体进行的离体培养。

原生质体的培养按过程可以分为原生质体分离纯化和培养再生两个阶段，而分离纯化是该技术环节的关键部分，决定了原生质体的质量和活力，以及其后期的应用，如单细胞测序、空间转录组和体细胞杂交等前沿科技领域的研究，以此来解析植物细胞分化和个体形成的调控机制研究。

作为前沿科技研究的首要环节，原生质体的分离与纯化质量直接决定了其应用领域和价值。目前，生物原生质体高效分离纯化技术仍是多数前沿科技与领域的难题和瓶颈，是国内外研究生命体进化和形态建成的决定因素，是前沿科技的核心技术和“卡脖子”环节。

在植物原生质体研究的早期，人们采用机械法分离原生质体，即将叶肉细胞或其它类型的植物细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使其发生质壁分离，再通过机械破碎细胞的细胞壁，少量原生质体就会释放出来。最早可追溯到1892年，KLercher用机械法从藻类分离出原生质体。机械法制备原生质体产率非常低，而且无法从分生组织中提取原生质体，因为分生组织细胞的细胞质稠密，液泡少而小，发生质壁分离比较困难。这种机械法一直延续到上世纪五十年代末，直到1960年英国植物生理学家Cocking首次用纤维素酶降解番茄根尖细胞获得原生质体，从而开创了用酶解法分离植物原生质体的新时期。

影响原生质体分离的因素有很多，最主要的是外植体的来源及使用的酶解液组合及浓度。外植体材料的生理状态会直接影响到原生质体分离的活力、融合效率及其融合细胞的培养效率。为了控制材料的一致性，无菌培养条件下试管苗叶片、胚性细胞悬浮系、子叶、下胚轴等是现在用于原生质体分离的主要来源。Borgato等(2007)分别使用无菌试管苗叶片和温室种植材料叶片对黄果茄(SoLanum virginianum)进行原生质体分离，结果发现利用无菌试管苗叶片分离获得的原生质体产量要高于取自温室种植叶片。用于分离芸薹属植物的材料来源主要有无菌苗的子叶、下胚轴、真叶(孙慧慧，2010；廉玉姬等，2011)，少数植物可来源于幼根(Xu et aL.，1982)，悬浮细胞系(Simmonds et aL.，1991)及小孢子胚(Swanson et aL.，1988)。一般认为下胚轴是作为芸薹属植物原生质体分离及培养效果较好的材料来源。

王晓佳等(1993)通过对结球甘蓝CMS系及皱叶甘蓝的子叶和下胚轴培养发现下胚轴原生质体植株再生效果好。赵军良等(2005)报道大白菜下胚轴原生质体的分裂频率明显高于子叶，分裂时间也早于子叶，但孙慧慧(2010)以甘蓝型油菜品种(系)中双6号下胚轴、子叶和叶片为材料，实验发现子叶和真叶的原生质体产量比下胚轴高，且子叶原生质体比真叶原生质体分裂及再生能力强，故子叶最适宜分离原生质体。因此，对于不同物种和基因型间的植物其最适宜原生质体分离与培养条件差异较大。

现有技术中缺少一种高效率、高质量分离青花菜原生质体的方法。

发明内容

本发明提供一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液、试剂盒和方法，用以解决现有技术中缺少一种高效率、高质量制备青花菜原生质体方法的缺陷，获得较高的青花菜原生质体产量和活力。

本发明提供一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液，包括混合酶和甘露醇；

所述混合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，所述纤维素酶与果胶酶的质量比为5～15:1，所述纤维素酶在所述酶解液中的质量浓度为0.5～1.5％；

所述甘露醇在所述酶解液中的浓度为0.3～0.6M。通过特定浓度的甘露醇、纤维素酶、果胶酶配合，本发明制备的酶解液可以更高效率、更高质量的制备原生质体。

优选的，所述果胶酶浓度为0.1％。根据酶解情况可在范围内提高纤维素酶浓度。

优选的，所述纤维素酶在所述酶解液中的质量浓度为1％。

根据本发明提供的用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液，所述酶解液中还包括CM溶液，所述纤维素酶与所述CM溶液的用量比为5-15g/L(优选8～12g/L)，所述CM溶液包括KNO₃ 180-200mg/L、MgSO₄ 35-39mg/L、CaCl₂·2H₂O 42-46mg/L、KH₂PO₄ 15-19mg/L、FeSO₄·7H₂O 2.6-2.9mg/L、Na₂-EDTA 3.6-3.9mg/L、MnSO₄·4H₂O2.1-2.4mg/L、H₃BO₃ 0.55-0.75mg/L、ZnSO₄·7H₂0 0.7-0.95mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.02-0.03mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.002-0.003mg/L、KI0.08-0.09mg/L、CoCl·6H₂O 0.002-0.003mg/L、肌醇9-11mg/L、烟酸0.4-0.6mg/L、甘氨酸0.1-0.3mg/L、水解酪蛋白90-110mg/L，所述CM溶液的pH值为5.7-5.8。通过所述CM溶液与甘露醇、纤维素酶、果胶酶配合，可以使制备出的原生质体具备更好的完整性与活力。

优选的，所述CM溶液包括KNO₃ 190mg/L、MgSO₄ 37mg/L、CaCl₂·2H₂O 44mg/L、KH₂PO₄ 17mg/L、FeSO₄·7H₂O 2.79mg/L、Na₂-EDTA3.73mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.23mg/L、H₃BO₃0.62mg/L、ZnSO₄·7H₂0 0.86mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0025mg/L、KI0.083mg/L、CoCl·6H₂O 0.0025mg/L、肌醇10mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸0.2mg/L、水解酪蛋白100mg/L，所述CM溶液的pH值为5.7-5.8。

优选的，还包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或牛血清白蛋白(BSA)；PVP和BSA现配现用，PVP可提高原生质体产量，维持细胞膜表面张力，对细胞膜有保护作用；BSA可以维持酶活性。

进一步优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述酶解液中的质量浓度为1.8～2.2％，进一步优选为2％。

进一步优选的，所述牛血清白蛋白在所述酶解液中的质量浓度为0.18～0.22％，进一步优选为0.2％。

本发明还提供一种用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒，包括所述的CM溶液。利用本发明所述的CM溶液可以使原生质体的分化活力更高。

根据本发明提供的用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒，还包括W5缓冲液。

优选的，所述W5缓冲液包括152～156mM NaCl、123～127mM CaCl₂、4～6mM KCl和1.8～2.2mM MES，进一步优选的，所述W5缓冲液的pH值为5.6～5.8；现有技术中W5缓冲液一般还含有葡萄糖，在分离分化期间维持酶解液渗透稳定。本发明W5溶液中无需使用葡萄糖，无机离子提供渗透压足以维持原生质体生存。

进一步优选的，所述W5缓冲液包括154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl和2mM MES，所述W5缓冲液的pH值为5.7。

根据本发明提供的用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒，包括所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液。

本发明还提供一种分离甘蓝类植物原生质体的方法，利用所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液或所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒。

优选的，所述甘蓝类植物是油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、花椰菜、青花菜、花椰菜、芥蓝、球茎甘蓝或埃塞俄比亚芥。本发明所述的分离原生质体的方法，可以适用于多种植物的原生质体分离。

进一步优选的，所述甘蓝类植物是青花菜。

根据本发明提供的分离甘蓝类植物原生质体的方法，利用甘蓝类植物子叶或真叶分离原生质体。

优选利用甘蓝类植物子叶。

进一步优选的，利用无菌培养的甘蓝类植物子叶或真叶。

进一步优选的，利用7-10d叶龄的无菌苗子叶和/或子叶节间转生根培养基培养20-25d叶龄的上部完全展开的真叶。

根据本发明提供的分离甘蓝类植物原生质体的方法，包括预处理步骤，所述预处理步骤包括：

将无菌甘蓝类植物子叶和/或真叶铺于CM溶液中，在2-4℃下黑暗处理12-24h。发明人发现分离甘蓝类植物原生质体时，温度和光敏感对分离质量影响非常大，若在光照条件下，或常温条件下，不能获得获得高质量、高产量的原生质体。

根据本发明提供的分离甘蓝类植物原生质体的方法，将预处理之后的叶片利用所述酶解液酶解13-15h。

优选的，摇床上53-57r/min酶解2-6h(观察酶解液呈绿色酶解终止)。

在本发明的一些实施例中，摇床上55r/min酶解4-6h。

根据本发明提供的分离甘蓝类植物原生质体的方法，当所述甘蓝类植物为青花菜时，甘蓝类植物子叶或真叶的获取方法为：

将无菌青花菜种子播种于第一培养基上发芽，所述第一培养基的配方包括4.4-4.5g/L MS和24-26g/L蔗糖；

将青花菜子叶从第一培养基转接于生根培养基，所述生根培养基的配方包括4.4-4.5g/L MS、0.18-2.2mg/L IBA和22-24g/L蔗糖。

本发明的有益效果：

(1)利用本发明提供用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液对甘蓝类植物进行原生质体分离，可以获得更高的原生质体产量和活力。

(2)本发明提供用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒包括CM溶液，利用本发明配制的CM溶液对制备原生质体的叶片进行预处理，可以保证原生质体的活力。

(3)针对不同青花菜材料与基因型，可采用本发明方法可高效获得活力在90％-95％原生质体，且产量较好，已达到国内外领先水平。该方法具有操作简单、稳定可靠、快速高效、科学合理的特点，是十字花科植物单细胞测序、空间转录组分析、植物形态建成与分化等核心科技研究领域的重要技术支撑和必要前体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.是本发明不同叶龄和部位对B16原生质体分离培养的影响；

图2是本发明不同纤维素酶对B16原生质体产量和活力的影响；

图3是本发明不同果胶酶浓度对B16原生质体产量和活力的影响；

图4是本发明不同甘露醇浓度对青花菜B16原生质体产量和活力的影响；

图5是本发明不同酶解时间对B16原生质体产量和活力的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.材料与方法

1.1试验材料

供试材料为青花菜雄性不育杂交种‘中青16号’(B16)和自交系材料B1、B40、B42、B99。

将种子用酒精(75％体积分数)浸泡3.0min后，倒入8％的次氯酸钠溶液中上下颠倒浸泡8.0min后，再用无菌水冲洗三次，播种在MS培养基上(4.43g/L MS，25g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH 5.8)，25℃弱光(150μmol m-2s-1,16h light,8h dark)条件下等待其发芽。7-10d取上部完全展开的子叶转接于生根培养基，所述生根培养基配方为4.43g/L MS+0.2mg/LIBA+2.3％(W/V)蔗糖，生长20d左右取上部完全展开的真叶或播种7-10d完全展开的子叶用于原生质体的提取。

1.2预处理

准备无菌的9.0cm的玻璃培养皿，倒入CM液铺满底部。取上述无菌子叶和真叶平铺于CM液中，叶面朝下且彼此之间尽量不重叠。放入4℃冰箱中黑暗处理12-24h。

表1CM溶液配方

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1.3原生质体分离

酶解液配比和酶解时间影响原生质体的分离效果和原生质体的产量、活力。

本实验选择纤维素酶和果胶酶来分离原生质体，确定酶解时间为13h。对纤维素酶浓度设四个处理：0.5％(w/v)、1.0％(w/v)、1.5％(w/v)、2.0％(w/v)，对果胶酶浓度设三个处理：0.1％(w/v)、0.3％(w/v)、0.5％(w/v)，甘露醇浓度设两个处理：0.3moL/L、0.6moL/L。

原生质体纯化后，通过显微镜观察原生质体的形态，用血球计数板统计原生质体的产量，通过FDA法测原生质体的活力，选出最优的酶解液组合。具体操作为提前配置好10.0mL酶解液：纤维素酶、果胶酶、2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、3mmoL/L甘露醇，放在4℃冰箱中备用。取出预处理叶片，在超净工作台中用手术刀在叶背上划出1.0mm左右的划痕，弃掉培养皿中的CM液，酶解液通过过滤灭菌的方法加入到培养皿中。然后将其放入到光照培养箱中25℃黑暗条件下进行酶解。

酶解结束后，沿一个方向轻轻摇晃释放原生质体，吸取原生质体悬浮液用无菌的50目的尼龙筛过滤加入到10.0mL的玻璃离心管中。用离心机700r/min离心5min。离心后倾斜管壁弃上清，沿试管壁缓缓加入7mL W5重悬浮原生质体(最终8-9mL悬浮液)，室温条件下(25℃±1)静置3-5min后700r/min离心3min，此过程重复两次。弃上清后加入适量W5溶液(2-4mL)重悬浮原生质体。

2、结果

不同叶龄叶片原生质体分离和培养情况详见图1。利用青花菜子叶与真叶均可达到较佳的原生质体分离效果，但是利用子叶作为原材料获得的原生质体活力更高、原生质体产量更高。

不同纤维素酶浓度下，B16原生质体产量和活力的变化情况详见图2。结果表明，原生质体活力随果胶酶浓度升高呈下降趋势，在纤维素酶浓度为1％(w/v)时获得最高的原生质体产量和活力。

研究纤维素酶和果胶酶对青花菜B16叶片分离原生质体的影响并筛选出最适合的酶解液浓度(详见图3)。不同纤维素酶和果胶酶浓度变化对青花菜子叶原生质体的产量和活力影响显著(p＜0.05)。比较不同纤维素酶、果胶酶浓度下，B16原生质体产量和活力的变化情况。结果表明，在纤维素酶浓度为1.0％(w/v)、果胶酶浓度为0.1％(w/v)时能够获得最高的原生质体产量和活力(图3)。

不同甘露醇浓度对B16子叶原生质体产量和活力影响不显著(p＞0.05)，镜检观察比较两处理(0.3M,0.6M)原生质体形态无明显差异，说明B16原生质体游离适宜的甘露醇浓度在0.3M～0.6M。本研究采用的甘露醇浓度为0.3moL/L(图4)。

不同酶解时间对B16子叶原生质体产量和活力影响显著(p＜0.05)。酶解13h获得的原生质体产量和活力最高，原生质体形态完整破碎少，为最优酶解时间(图5)。

不同青花菜基因型真叶叶片在1.0％纤维素酶+0.1％果胶酶，甘露醇浓度为0.3M，酶解13h都获得较高的原生质体产量和活力，满足后续试验的要求(表2)。

表2不同青花菜基因型叶片(真叶)原生质体产量和活力

3.试剂盒开发

3.1、试剂组成

酶解液A(现配现用)：向10.0mL CM溶液中加入0.1g纤维素酶、0.01g果胶酶、0.02gBSA、0.546g甘露醇和0.2g PVP(最后加入)，放到磁力搅拌器上至所有固体粉末完全溶解，置于4℃保存；

W5缓冲液：浓度为CaCL₂溶液(154mM NaCL,125mM CaCL₂,5mM KCL和2mM MES，pH5.7)；

CM溶液：35mL，详见表1。

3.2、使用操作说明

1.准备无菌的9.0cm的玻璃培养皿，倒入CM液铺满底部，取无菌子叶(无菌生长7-10d)和幼嫩真叶(无菌生长20d左右)平铺于CM液中，叶面朝下且彼此之间尽量不重叠，放入4℃冰箱中黑暗处理。

2.预处理时间影响原生质体的分离效果，黑暗条件下，4℃静止放置12.0 -24.0h(叶背面勿出现水痕)。

3.在超净工作台中，将预处理过的叶片用刀在叶背面上划出1.0mm左右的细条，弃掉培养皿中的CM液。取出酶解液A，过滤灭菌(45μm滤膜)后加入到培养皿中，然后将其放入到光照培养箱中25℃黑暗条件下进行酶解13.0h(若想缩短酶解时间，可降低酶解液A中纤维素酶浓度至0.5％(w/v)，置于摇床上酶解2.0-3.0h，观察酶解液呈浅绿色及时取出，室温23℃±1)。

3.酶解结束后，沿一个方向轻轻摇晃释放原生质体(酶解液呈浅绿色为最佳)，吸取原生质体悬浮液用无菌的50目的尼龙筛过滤加入到10.0mL的玻璃离心管中。用离心机700r/min离心5min。离心后倾斜管壁弃上清，沿试管壁缓缓加入7mL W5(最终8-9mL悬浮液)，室温条件下(25℃±1)静置3-5min。700r/min离心3min，此过程重复两次。弃上清后加入适量W5溶液(2-4mL)重悬浮原生质体(可用具体实验相关培养基重悬浮原生质体)。

4.加入W5溶液重悬浮原生质体后，通过血球计数板计算原生质体的产量，通过W5溶液调整原生质体的密度(显微镜观察如有较多碎片，重新加入W5溶液至8mL重悬浮原生质体，静置10-15min，待大部分原生质体沉于底部后，弃去上清)。

5.通过FDA法测定原生质体的活力。

本发明以国际流行蔬菜青花菜为研究对象，通过科学设计、独辟蹊径与深入验证，最终建立了一种从青花菜叶肉细胞(子叶和真叶)高效分离纯化获得高质量的原生质体方法，将为破解青花菜乃至十字花科作物高效分离纯化原生质体和深入研究植物细胞的分化功能、形态建成，以及通过体细胞杂交创制优异抗病虫、雄性不育和高营养等独特的核心资源，提供强有力的科技支撑和科学依据。

对比例1

与实施例1的区别在于，CM溶液不同，CM溶液的成分为：

KNO₃ 190mg/L、MgSO₄ 37mg/L、CaCl₂·2H₂O 44mg/L、KH₂PO₄17mg/L、FeSO₄·7H₂O2.79mg/L、Na₂-EDTA 3.73mg/L、MnSO₄·4H₂O2.23mg/L、H₃BO₃ 0.62mg/L、ZnSO₄·7H₂00.86mg/L、NaMoO₄·2H₂O0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025mg/L、KI 0.083mg/L、CoCl·6H₂O0.0025mg/L

结果显示，去除CM液中的有机成分，B16原生质体活力下降为65-76％。

对比例2

与实施例1的区别在于，预处理步骤中，放入4℃冰箱中光照处理36h。

结果显示，B16原生质体产量下降为19.4ⅹ10⁵个/mL/g，活力下降为53％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液，其特征在于，包括混合酶和甘露醇；

所述混合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，所述纤维素酶与果胶酶的质量比为5～15:1，所述纤维素酶在所述酶解液中的质量浓度为0.5～1.5％；

所述甘露醇在所述酶解液中的浓度为0.3～0.6M。

2.根据权利要求1所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液，其特征在于，所述酶解液中还包括CM溶液，所述纤维素酶与所述CM溶液的用量比为5～15g/L(优选8～12g/L)，所述CM溶液包括KNO₃ 180-200mg/L、MgSO₄ 35-39mg/L、CaCl₂·2H₂O 42-46mg/L、KH₂PO₄ 15-19mg/L、FeSO₄·7H₂O 2.6-2.9mg/L、Na₂-EDTA 3.6-3.9mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.1-2.4mg/L、H₃BO₃ 0.55-0.75mg/L、ZnSO₄·7H₂0 0.7-0.95mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.02-0.03mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.002-0.003mg/L、KI 0.08-0.09mg/L、CoCl·6H₂O 0.002-0.003mg/L、肌醇9-11mg/L、烟酸0.4-0.6mg/L、甘氨酸0.1-0.3mg/L、水解酪蛋白90-110mg/L，所述CM溶液的pH值为5.7-5.8；

优选的，所述CM溶液包括KNO₃ 190mg/L、MgSO₄ 37mg/L、CaCl₂·2H₂O 44mg/L、KH₂PO₄17mg/L、FeSO₄·7H₂O 2.79mg/L、Na₂-EDTA3.73mg/L、MnSO₄·4H₂O 2.23mg/L、H₃BO₃ 0.62mg/L、ZnSO₄·7H₂0 0.86mg/L、NaMoO₄·2H₂O 0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025mg/L、KI0.083mg/L、CoCl·6H₂O 0.0025mg/L、肌醇10mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸0.2mg/L、水解酪蛋白100mg/L，所述CM溶液的pH值为5.7-5.8；

优选的，还包括聚乙烯吡咯烷酮和/或牛血清白蛋白；

进一步优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述酶解液中的质量浓度为1.8～2.2％，进一步优选为2％；

进一步优选的，所述牛血清白蛋白在所述酶解液中的质量浓度为0.18～0.22％，进一步优选为0.2％。

3.一种用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2中的CM溶液。

4.根据权利要求3所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒，其特征在于，还包括W5缓冲液；

优选的，所述W5缓冲液包括152～156mM NaCl、123～127mM CaCl₂、4～6mM KCl和1.8～2.2mM MES，进一步优选的，所述W5缓冲液的pH值为5.6～5.8；

进一步优选的，所述W5缓冲液包括154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl和2mM MES，所述W5缓冲液的pH值为5.7。

5.根据权利要求3或4所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液。

6.一种分离甘蓝类植物原生质体的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的酶解液或权利要求3-5任一项所述的用于制备甘蓝类植物原生质体的试剂盒；

优选的，所述甘蓝类植物是油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、花椰菜、青花菜、花椰菜、芥蓝、球茎甘蓝或埃塞俄比亚芥；

进一步优选的，所述甘蓝类植物是青花菜。

7.根据权利要求6所述的分离甘蓝类植物原生质体的方法，其特征在于，利用甘蓝类植物子叶或真叶分离原生质体；

优选利用甘蓝类植物子叶；

进一步优选的，利用无菌培养的甘蓝类植物子叶或真叶；

进一步优选的，利用7-10d叶龄的无菌苗子叶和/或子叶节间转生根培养基培养20-25d叶龄的上部完全展开的真叶。

8.根据权利要求6或7所述的分离甘蓝类植物原生质体的方法，其特征在于，包括预处理步骤，所述预处理步骤包括：

将无菌甘蓝类植物子叶和/或真叶铺于CM溶液中，在2-4℃下黑暗处理12-24h。

9.根据权利要求8所述的分离甘蓝类植物原生质体的方法，其特征在于，将预处理之后的叶片利用所述酶解液酶解13-15h；

优选的，摇床上53-57r/min酶解2-6h，酶解液呈绿色酶解终止。

10.根据权利要求6-9任一项所述的分离甘蓝类植物原生质体的方法，其特征在于，当所述甘蓝类植物为青花菜时，甘蓝类植物子叶或真叶的获取方法为：

将无菌青花菜种子播种于第一培养基上发芽，所述第一培养基的配方包括4.4-4.5g/LMS和24-26g/L蔗糖；

将青花菜子叶从第一培养基转接于生根培养基，所述生根培养基的配方包括4.4-4.5g/L MS、0.18-2.2mg/L IBA和22-24g/L蔗糖。

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