CN111280057A - 一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法及其专用培养基，属于植物组织培养技术领域。该方法将未成熟的火炬松种子置于诱导培养基上进行诱导培养，获得生长迅速、活力旺盛的胚性细胞系，其中，诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有2，4‑D、6‑BA、NAA、ABA、油菜素内酯、L‑谷氨酰胺、水解酪蛋白、肌醇、2‑(N‑吗啉)乙磺酸一水物。本发明建立了一套稳定、高效的火炬松胚性愈伤组织的诱导方法，提高了胚性愈伤组织的产量和质量，且胚性愈伤组织继代增殖正常，保持了良好的胚性，为进一步开展体胚育苗、遗传转化、种质创新等研究提供了重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地说，涉及一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法及其专用培养基。
背景技术
火炬松(Pinus taeda L.)是原产于美国东南部，为美国南方松中最重要的速生针叶用材树种，因其生长快、用途广、适应性强等优良特性，目前我国已成功引种，并成为我国亚热带低山丘陵地区的重要速生丰产树种。我国20世纪80年代初开始火炬松遗传改良工作，在引种栽培、种源试验、种子园营建、子代测定、早期选择等方面开展了大量工作，并取得一定成效。江西是我国火炬松栽培的重要分布区之一，连续参加了“七五”、“八五”和“九五”火炬松协作组的联合攻关项目，共同开展了火炬松种源试验、纸浆材良种选育等试验，选育了一批火炬松良种。火炬松常规繁育方法是利用种子进行有性繁殖，但种子园存在更新慢、建园和维护成本高、结实率下降及后代存在变异等问题，限制良种快速推广应用。因此，开展无性繁育势在必行。
目前火炬松无性繁殖技术的研究有扦插、嫁接、常规组织培养等方法，但成本高，效率低，难以达到生产要求。植物体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)具有稳定性好、繁殖系数高、同步化水平高等优点，在规模化无性繁殖、人工种子制备、种质保存及遗传转化体系构建等领域具有重要的应用价值，是当前国内外进行无性繁殖技术研究的主要手段。在火炬松体胚发生技术中，胚性愈伤组织的诱导是体胚生产体系的第一步，也是关键一步。因此，有必要建立一种高效、稳定的胚性愈伤组织诱导方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法；本发明所要解决的另一技术问题是提供一种诱导火炬松胚性愈伤组织的专用培养基。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，将未成熟的火炬松种子置于诱导培养基上进行诱导培养，获得生长迅速、活力旺盛的胚性细胞系，其中，诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA3.0-5.0mg·L-1。
进一步的，诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA 3.0-5.0mg·L-1、油菜素内酯0-0.05mg·L-1。
进一步的，诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有蔗糖30g·L-1、卡拉胶7.5g·L-1、2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA 3.0-5.0mg·L-1、油菜素内酯0-0.05mg·L-1、L-谷氨酰胺450mg·L-1、水解酪蛋白500mg·L-1、肌醇500mg·L-1、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1。
进一步的，未成熟的火炬松种子通过以下步骤获得：在火炬松1代种子园中选择长势旺盛、无病虫害、结果量多的母树作为外植体采集来源，采集其中上部树冠外围的、健康的、合子胚处于裂生多胚期的未成熟球果作为外植体，经外植体消毒后用无菌解剖刀和镊子去除种子的外皮和内皮得到未成熟的火炬松种子。
进一步的，外植体消毒为：用枝剪剥出未成熟球果的种子，去除种翅后首先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3-5次，然后用0.1％的升汞浸泡7-8min，期间不断晃动瓶子5-6次，用无菌水冲洗5-7次，最后将其置于放有无菌滤纸的接种盘中，吸干种子表面水分。
进一步的，诱导培养基的pH值为5.8。
进一步的，诱导培养的条件为培养温度22±1℃，湿度60％-65％，暗培养。
一种诱导火炬松胚性愈伤组织的专用培养基，以DCR培养基为基础培养基，添加有蔗糖30g·L-1、卡拉胶7.5g·L-1、2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA 3.0-5.0mg·L-1、油菜素内酯0-0.05mg·L-1、L-谷氨酰胺450mg·L-1、水解酪蛋白500mg·L-1、肌醇500mg·L-1、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1。
体细胞胚发生受到许多因素的影响，有基因型、外植体球果发育时期、基础培养基、诱导激素的选择、有机添加物以及其它成分等，只有在多种因素相互协调促进的基础上才能诱导出未成熟种子胚胚性愈伤组织。因此，本发明结合江西本地火炬松优良遗传材料，摸索出一套行之有效的提高火炬松胚性愈伤组织诱导率的方法。在胚性愈伤组织诱导过程中，选用有效量的生长素2，4-D及NAA、细胞分裂素6-BA和脱落酸ABA，同时添加低浓度的油菜素内酯，促进了愈伤组织的分化，添加水解酪蛋白、L-谷氨酰胺等有利于提高愈伤组织的胚性，2-(N-吗啉)乙磺酸一水物有利于维持培养过程中培养基内环境的pH值。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)本发明选择火炬松1代种子园中优良无性系的未成熟种子为繁殖材料，且其子代测定表现优异，后期在本发明技术上获得的体胚苗可直接应用于生产，为火炬松优良无性系的快速推广应用提供了技术保障，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。
(2)本发明外植体消毒是直接针对未成熟种子，而不是对球果，对未成熟种子直接消毒，速度快、效率高、污染率低，效果显著。
(3)本发明步骤简单、培养时间短、诱导效率高，建立了一套稳定、高效的火炬松胚性愈伤组织的诱导方法，提高了胚性愈伤组织的产量和质量，且胚性愈伤组织继代增殖正常，保持良好的胚性，为建立火炬松体胚发生技术体系，快繁火炬松体胚苗，提供了技术基础。
附图说明
图1是火炬松未成熟种子诱导出胚性愈伤组织图；
图2是火炬松胚性愈伤组织增殖图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：
1.外植体的采集
7月中下旬，取火炬松1代种子园中树体长势好、无病虫害、结果量多的火炬松母株树冠中上部外围的自然授粉未成熟球果，采集当天带回实验室4℃冰箱保存。
2、外植体消毒处理
将未成熟火炬松球果从冷藏冰箱中取出，用枝剪剥出未成熟种子，去除种翅后置于无菌接种瓶中，然后将其放入超净工作台上进行消毒处理，首先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3-5次，然后用0.1％的升汞浸泡7-8min，期间不断晃动瓶子5-6次，用无菌水冲洗5-7次，最后将其置于放有无菌滤纸的接种盘中，吸干种子表面水分备用。
3、胚性愈伤组织诱导
火炬松胚性愈伤组织诱导培养基的制备包括如下步骤：
(1)以DCR为基础培养基，添加蔗糖30g·L-1、卡拉胶7.5g·L-1、2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、L-谷氨酰胺450mg·L-1、水解酪蛋白500mg·L-1、肌醇500mg·L-1、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1，用1M HCl或1MNaOH调整pH值5.8后，装于锥形瓶中高压灭菌(灭菌121℃，15min)；
(2)在无菌台上用针筒式过滤灭菌器过滤灭菌油菜素内酯0-0.05mg·L-1、ABA3.0-5.0mg·L-1并添加于步骤(1)的灭菌培养基中，然后分装于直径11cm培养皿内，每皿25mL，放置于无菌操作台上，凝固。
将消毒处理好的未成熟种子用无菌镊子和解剖刀去除内外种皮后，接种到火炬松胚性愈伤组织诱导培养基中培养，每皿接种10粒种子。以培养温度(22±1)℃，湿度60％-65％培养条件下暗培养，3-4周后在未成熟种子的靠近子叶一端出现胚性愈伤组织。如图1所示。
实施例2不同基因型对火炬松胚性愈伤组织诱导的影响
按实施例1的操作方法，将采集到的荣山52等6个不同基因型外植体置于诱导培养基上进行胚性愈伤组织诱导，每皿接种10粒，诱导结果见表1。
表1不同基因型对胚性愈伤组织诱导的影响
表1可以看出，胚性愈伤组织诱导率在不同基因型之间存在显著差异，胚性愈伤组织诱导率最高的为荣山52，平均诱导率达到63.33％，最低的为武林1，诱导率仅为10％，且不同基因型的胚性愈伤组织诱导率存在显著差异，说明基因型是影响胚性愈伤组织的重要影响因素之一。
实施例3不同基础培养基对火炬松胚性愈伤组织诱导的影响
按实施例1的操作方法，将外植体接种到LP、DCR、mWV5、LV、B5和WPM等6种不同基础培养基诱导，并在其中添加1.0mg·L-12，4-D、0.5mg·L-16-BA、500mg·L-1肌醇、450mg·L- 1L-谷氨酰胺、500mg·L-1水解酪蛋白、30g·L-1蔗糖和7.5g·L-1卡拉胶，不同基础培养基对胚性愈伤组织诱导的效果如表1所示。
表2结果表明，在DCR培养基中胚性愈伤组织的诱导率最高，达到34.00％；其次WPM和LP培养基胚性愈伤组织诱导率分别为15.00％和10.00％；而LV、mMV5和B5培养基中诱导率较低，且DCR培养基与其他培养基之间呈显著性差异，说明基础培养基对诱导胚性愈伤组织至关重要。
表2基础培养基对火炬松未成熟种子诱导胚性愈伤组织的比较
实施例4不同激素组合及其浓度对火炬松胚性愈伤组织诱导的影响
在DCR基础培养并添加蔗糖30g·L-1、卡拉胶7.5g·L-1、L-谷氨酰胺450mg·L-1、水解酪蛋白500mg·L-1、肌醇500mg·L-1、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1及油菜素内酯0.048mg·L-1条件下，采用四因素三水平正交设计试验了不同激素组合及其浓度对火炬松胚性愈伤组织诱导的差异，结果如表3。
表3表明，外植体在激素组合③的培养基上胚性愈伤组织诱导率显著高于其他组合，达到50％，其他组合之间无显著差异，说明4种激素共同作用且浓度较高时，胚性愈伤组织诱导效果最好，且诱导出胚性愈伤组织生长状态较好，细胞间有粘连。
通过实施例获得最优火炬松胚性愈伤组织诱导培养基为DCR+2，4-D 1.0mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA 2.0mg·L-1+ABA 5.0mg·L-1+油菜素内酯0.048mg·L-1+L-谷氨酰胺450mg·L-1+水解酪蛋白500mg·L-1+肌醇500mg·L-1+2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1+蔗糖30g·L-1+卡拉胶7.5g·L-1，pH值5.8。
表3不同激素组合及其浓度对火炬松胚性愈伤组织诱导的影响
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，将未成熟的火炬松种子置于诱导培养基上进行诱导培养，获得生长迅速、活力旺盛的胚性细胞系，所述诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA3.0-5.0mg·L-1。
2.根据权利要求1所述的诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA0.5-1.0mg·L-1、NAA1.0-2.0mg·L-1、ABA3.0-5.0mg·L-1、油菜素内酯0-0.05mg·L-1。
3.根据权利要求2所述的诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述诱导培养基以DCR培养基为基础培养基，添加有蔗糖30g·L-1、卡拉胶7.5g·L-1、2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA3.0-5.0mg·L-1、油菜素内酯0-0.05mg·L-1、L-谷氨酰胺450mg·L-1、水解酪蛋白500mg·L-1、肌醇500mg·L-1、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1。
4.根据权利要求1所述的诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述未成熟的火炬松种子通过以下步骤获得：在火炬松1代种子园中选择长势旺盛、无病虫害、结果量多的母树作为外植体采集来源，采集其中上部树冠外围的、健康的、合子胚处于裂生多胚期的未成熟球果作为外植体，经外植体消毒后用无菌解剖刀和镊子去除种子的外皮和内皮得到未成熟的火炬松种子。
5.根据权利要求4所述的诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述外植体消毒为：用枝剪剥出未成熟球果的种子，去除种翅后首先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3-5次，然后用0.1％的升汞浸泡7-8min，期间不断晃动瓶子5-6次，用无菌水冲洗5-7次，最后将其置于放有无菌滤纸的接种盘中，吸干种子表面水分。
6.根据权利要求1所述的诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述诱导培养基的pH值为5.8。
7.根据权利要求1所述的诱导火炬松胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述诱导培养的条件为培养温度22±1℃，湿度60％-65％，暗培养。
8.一种诱导火炬松胚性愈伤组织的专用培养基，其特征在于，以DCR培养基为基础培养基，添加有蔗糖30g·L-1、卡拉胶7.5g·L-1、2，4-D 1.0-2.0mg·L-1、6-BA 0.5-1.0mg·L-1、NAA 1.0-2.0mg·L-1、ABA 3.0-5.0mg·L-1、油菜素内酯0-0.05mg·L-1、L-谷氨酰胺450mg·L-1、水解酪蛋白500mg·L-1、肌醇500mg·L-1、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg·L-1。
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