CN110012835A

CN110012835A - 一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法

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Publication number: CN110012835A
Application number: CN201910296957.8A
Authority: CN
Inventors: 程强强; 杨春霞; 丁伟; 谷振军; 肖复明; 杜强
Original assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Current assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-07-16

Abstract

本发明提供了一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，包括以下步骤：(1)胚性愈伤组织的诱导培养：将未成熟的湿地松种胚置于胚性愈伤组织诱导培养基(以DCR培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)1.0mg/L‑2.0mg/L、N6‑呋喃甲基腺嘌呤(KT)1.0mg/L‑2.5mg/L、L‑谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白250mg/L‑500mg/L、肌醇1g/L、2‑(N‑吗啉)乙磺酸一水物250mg/L)上进行诱导培养，获得初代胚性愈伤组织。(2)胚性愈伤组织增殖：将步骤(1)获得的胚性愈伤组织转移到增殖培养基(以DCR培养基为基础培养基，并添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L、2,4‑D0.5mg/L‑1.0mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤(6‑BA)0.5mg/L‑1.0mg/L、L‑谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白250mg/L‑500mg/L)中进行增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织。

Description

一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法。

背景技术

湿地松(Pinus elliottii Engelm)是原产于美国东南部低海拔温暖地区的一种高大乔木，由于其耐贫瘠、生长快、材性好以及松脂产量高等优良性征，现已经广泛种植于我国江西、福建、湖南等南方多个省份。由于湿地松较高的经济和生态价值，已成为我国人工林经营中主栽树种之一。多年来科研工作者围绕湿地松遗传改良研究一直在持续，但传统湿地松多世代杂交育种周期长，严重制约了湿地松的优良品种选育，如何缩短湿地松育种周期就变的十分迫切。

无性系林业是世界林业发展的一个趋势，通过选、引、育等方法选育出林木优良无性系，并将优良无性系经过无性繁殖进行扩繁，短时间内繁育大量性状统一的优良苗木用于人工林经营，可以缩短湿地松良种推广进程，提高生态和经济效益。目前湿地松无性繁殖技术的研究有扦插、嫁接、常规组织培养等方法，但成本高，效率低，难以达到生产要求。

体细胞胚发生技术是现阶段无性系林木种苗繁育效率最高的技术。湿地松体胚发生技术是在人工条件下通过诱导体细胞转向胚性细胞发育，再增殖获得大量胚性细胞系，经合适的条件诱导形成体细胞胚，进而萌发成植株，原则上一个胚性细胞发育成一株苗。在湿地松体胚发生技术中，胚性愈伤组织的诱导和胚性细胞增殖是体胚生产体系的第一步，也是关键一步。因此，有必要建立一种高效、稳定的胚性愈伤诱导组织和增殖方法。

发明内容

本发明目的是提供了一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，具有较高的湿地松胚性愈伤组织的诱导率和增殖效果，良好的保留了愈伤组织的胚性，为湿地松体胚工厂化生产提供基础。

本发明通过如下技术方案实现上述目的：

一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：取生长势好、无虫害，天然授粉的湿地松球果，将球果在超净工作台中进行消毒，剥出种子，挑去种皮获得未成熟的种胚作为外植体；

(2)胚性愈伤组织的诱导培养：将步骤(1)获得的未成熟的种胚置于湿地松胚性愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，获得初代胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织诱导培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.0mg/L-2.5mg/L、KT(N6-呋喃甲基腺嘌呤)1.0mg/L-2.5mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白250mg/L-500mg/L、肌醇1g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L；

(3)胚性愈伤组织增殖：将步骤(2)获得的胚性愈伤组织转移到增殖培养基中进行增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织增殖培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D0.5mg/L-1.0mg/L、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L-1.0mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白250mg/L-500mg/L。

所述步骤(2)中诱导胚性愈伤组织的诱导培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D2.0mg/L、6-BA2.5mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇1g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L。

所述步骤(2)中诱导胚性愈伤组织的诱导培养基的pH值为5.8。

所述步骤(2)中诱导胚性愈伤组织的条件为：培养温度(23±1)℃，湿度60％-65％，持续暗培养2个月。

所述步骤(3)中胚性愈伤组织的增殖培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D0.5mg/L、6-BA1.0mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白500mg/L。

所述步骤(3)中胚性愈伤组织的增殖培养基的pH值5.8。

所述步骤(3)中胚性愈伤组织增殖培养条件为：培养温度(23±1)℃，湿度60％-65％，每15d继代一次。

湿地松体细胞胚发生受到许多因素的影响，有基因型、外植体球果发育时期、基本培养基、诱导激素的选择、有机添加物以及其它成分等，只有在多种因素相互协调促进的基础上才能诱导出未成熟种子胚胚性愈伤组织。因此，在结合江西本地湿地松遗传材料背景的基础上，我们摸索出一套行之有效的湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖方法。在胚性愈伤组织诱导过程中，选用有效量的细胞分裂素2，4-D和KT，促进了愈伤组织的分化，添加水解酪蛋白、L-谷氨酰胺等有利于提高愈伤组织的胚性，2-(N-吗啉)乙磺酸一水物有利于维持培养过程中培养基内环境的pH值。在胚性愈伤组织增殖过程中，为了保持胚性愈伤组织的胚性活力，又要尽可能快的获得大量胚性愈伤组织，选用了有效量的2，4-D，能够很好的保持增殖愈伤的细胞胚性，同时保持了愈伤组织的增殖量。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)本发明提供了适宜湿地松胚性愈伤组织诱导和增殖培养基，这两种培养基是以DCR培养基为基础培养基，并配合诱导或增殖用特定种类和用量的激素及其他成分，可以有效的诱导并增殖出湿地松胚性愈伤组织，在多次增殖后胚性愈伤组织也能很好的保存胚性。

(2)本发明步骤简单、培养时间短、诱导和增殖效率高，建立了一套稳定、高效的湿地松胚性愈伤组织的培养方法，提高了胚性愈伤组织的产量，有效的解决的湿地松胚性愈伤组织诱导困难、增殖后愈伤组织胚性活力低的问题，为建立湿地松体胚发生技术体系，快繁湿地松体胚苗，提供了技术基础。

附图说明

图1为湿地松未成熟种子诱导出胚性愈伤组织；

图2为湿地松胚性愈伤组织增殖。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步地说明。

实施例1：

1.外植体的选择

6月底，取吉安市峡江林木良种场的湿地松种子园内树体长势好、无病虫害湿地松母株上自然授粉未成熟球果，采集当天用冰盒储藏带回实验室用冰箱4℃保存。球果使用前用水冲洗干净球果上的污渍等杂质，用滤纸吸干水分，然后在无菌操作台上进行以下步骤：将球果浸入75％酒精5min后，用无菌水冲洗1次，放入0.1％升汞溶液中浸泡10min，取出用无菌水冲洗3-4次滤纸吸干水分，然后剥离出未成熟种子，轻轻用解剖刀去除种子外表皮，得到含合子胚和胚乳的外植体。

2.胚性愈伤组织诱导

以上湿地松胚性愈伤组织诱导培养基的制备包括如下步骤：

(1)以DCR为基本培养基(配方如表1)，添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D1.0mg/L-2.5mg/L、KT 1.0mg/L-2.5mg/L、水解酪蛋白250mg/L-500mg/L、肌醇1g/L，用1M HCl或1MNaOH调整pH值5.8后，盛装于锥形瓶中高压灭菌(灭菌121℃，15min)，灭菌后未凝固；

(2)在无菌台上用针筒式过滤灭菌器过滤灭菌L-谷氨酰胺300mg/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L并添加于步骤(1)的灭菌培养基中，及时分装于直径11cm培养皿内，每皿25ml，放置于无菌操作台上，凝固。

将外植体接种到湿地松胚性愈伤组织诱导培养基中培养，每皿接种1-6个外植体不等。以培养温度(23±1)℃，湿度60％-65％培养条件下培养，持续暗培养2个月，可发现在外植体顶端出现胚性愈伤组织。如图1所示。

表1：DCR培养基配方

3.胚性愈伤组织的增殖

以上湿地松胚性愈伤组织增殖培养基的制备包括如下步骤：

(1)以DCR为基本培养基，添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D0.2mg/L-1.0mg/L、6-BA0.5mg/L-1.0mg/L、水解酪蛋白250mg/L-500mg/L，用1MHCl或1MNaOH调整PH值5.8后，盛装于锥形瓶中高压灭菌(灭菌121℃，15min)，灭菌后未凝固。

(2)在无菌台上用针筒式过滤灭菌器过滤灭菌L-谷氨酰胺300mg/L并添加于培养基中，及时分装于直径11cm培养皿内，每皿25ml，放置于无菌操作台上，凝固。

将上胚性愈伤组织放于湿地松胚性愈伤组织增殖培养基中增殖培养，每皿接种1至2块愈伤组织，愈伤组织用镊子轻轻夹取大约1cm至2cm大小，用于增殖。培养条件为培养温度(23±1)℃，湿度60％-65％，每个15d继代一次，组织块增大，获得胚性愈伤增殖。如图2所示。

实施例2：不同基本培养基对湿地松未成熟胚诱导胚性愈伤组织的影响

按实施例1的操作方法，将外植体接种到不同基本培养基上进行诱导增殖，通过试验基本培养基DCR、WPM、MS、B5以及1/2MS对诱导湿地松胚性愈伤组织的结果如表2所示。

表2表明：在DCR培养基中湿地松未成熟种子诱导胚性愈伤组织的诱导率最高，达到30.65％；其次WPM、MS、B5培养基胚性愈伤组织诱导率分别为25.40％、14.29％、7.14％；而1/2MS培养基中诱导率最低，诱导率为0。从试验结果我们认为基本培养基对诱导未成熟种子胚性愈伤组织分化至关重要。对比五种基本培养基发现，湿地松胚性愈伤组织诱导培养可能需要较低的大量元素以及较高比例的钙离子，培养基DCR更适合。

表2：基本培养基DCR、WPM、MS、B5以及1/2MS对湿地松未成熟种子诱导胚性愈伤组织的比较

实施例3：不同激素对湿地松未成熟种子胚性愈伤组织诱导效率的影响

在同一DCR基本培养并添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇1g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L条件下，试验了不同激素及其组合对湿地松未成熟胚诱导胚性愈伤组织的比较，结果如表3。

表3表明：不添加任何激素的培养基中，没有诱导出胚性愈伤组织；单一添加激素6-BA、KT、TDZ和2，4-D的培养基中只有2，4-D能诱导胚性愈伤形成。当2，4-D与6-BA、KT组合使用胚性愈伤组织诱导率明显高于各激素单独使用，2，4-D与KT组合使用明显好于与6-BA组合使用，试验对比结果表明2，4-D 2.0mg+KT 2.5mg中湿地松胚性愈伤诱导率最高，诱导率为27.78％。

在胚性愈伤组织诱导过程中，细胞分裂素的使用是非常重要的。细胞分裂素2，4-二氯苯氧乙酸、N6-呋喃甲基腺嘌呤促进了愈伤组织的分化，添加水解酪蛋白、L-谷氨酰胺等有利于提高愈伤组织的胚性，2-(N-吗啉)乙磺酸一水物有利于维持培养过程中培养基内环境的pH值。

通过试验，我们获得最优湿地松胚性愈伤组织诱导培养基为DCR+2，4-D 2.0mg/L+6-BA2.5mg/L+L-谷氨酰胺300mg/L+水解酪蛋白500mg/L+肌醇1g/L+2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值5.8。

表3：不同激素及其组合对湿地松未成熟种子诱导胚性愈伤组织的影响

实施例4：胚性愈伤增殖培养

在增殖培养基中最佳目的是为了通过一次次的继代获得大量愈伤组织，而且愈伤组织又要保持很好的胚性。在本试验方案中，湿地松胚性愈伤组织的增殖，激素2，4-D取到了重要作用。试验表明，高浓度的2，4-D能诱导胚性细胞的形成，但过高浓度的2，4-D会不利于胚性细胞胚性的保存，经过多次继代，在湿地松胚性愈伤组织增殖过程中使用低浓度0.5mg/L-1.0mg/L，能够很好的保存增殖愈伤的细胞胚性。

在同一DCR基本培养并添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L条件下，试验了不同激素组合对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响，在增殖试验过程中，我们将试验进行持续4次增殖，每个15d从上一代中取一团愈伤组织进行增殖，增殖过程中观察愈伤组织的形态，颜色、生长速度、水渍化以及细胞表面突起形态，甚至细胞间粘连情况，结果如表4。

在此基础上我们获得最佳湿地松胚性愈伤组织增殖继代培养基为DCR+2，4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+L-谷氨酰胺300mg/L+水解酪蛋白500mg/L+麦芽糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值5.8。

表4：不同激素及其组合对湿地松未成熟种子诱导胚性愈伤组织的影响

注：胚性愈伤增殖过程中愈伤组织的状态用“+”表示程度：“+”表示愈伤死亡；“++”表示愈伤暗黄、有水渍化现象、生长状态较差；“+++”表示愈伤组织生长较慢、愈伤白色、表明无突起；“++++”表示愈伤组织白色，生长速度较快，愈伤表明有少量突起，细胞间无粘性；“+++++”表示愈伤组织洁白、生长较快、愈伤表明有大量突起、无水渍化现象，细胞间有粘性。

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)胚性愈伤组织的诱导培养：将未成熟的湿地松种胚置于胚性愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，获得初代胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织诱导培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D1.0mg/L-2.5mg/L、KT1.0mg/L-2.5mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白250mg/L-500mg/L、肌醇1g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L；

(2)胚性愈伤组织增殖：将步骤(1)获得的胚性愈伤组织转移到增殖培养基中进行增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织增殖培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D 0.5mg/L-1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L-1.0mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白250mg/L-500mg/L。

2.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的外植体的选择方法是：取生长势好、无虫害，天然授粉的湿地松球果，将种子球果消毒后剥离出种子，再将种子种皮剥去获得未成熟的种胚作为外植体。

3.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中诱导胚性愈伤组织的诱导培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D2.0mg/L、KT2.5mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇1g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水物250mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中诱导胚性愈伤组织的诱导培养基的pH值为5.8。

5.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中诱导胚性愈伤组织的条件为：培养温度(23±1)℃，湿度60％-65％，持续暗培养2个月。

6.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中胚性愈伤组织的增殖培养基是以DCR培养基为基础培养基，并添加麦芽糖30g/L、卡拉胶7g/L、2，4-D0.5mg/L、6-BA1.0mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、水解酪蛋白500mg/L。

7.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中胚性愈伤组织的增殖培养基的pH值5.8。

8.根据权利要求1所述的一种湿地松胚性愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中胚性愈伤组织增殖培养条件为：培养温度(23±1)℃，湿度60％-65％，每15d继代一次。