KR101047306B1 - 백합나무의 체세포배 발생 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백합나무의 체세포배 발생 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와 상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법에 관한 것이다.

본 발명은 백합나무의 체세포배 발생에 있어 기존의 발생법보다 훨씬 간단하면서도 대량으로 생산이 가능한 배양법 개발에 관한 것이다. 이러한 보다 진보된 체세포배 발생 기술은 세포방사 배양법(cell spreading culture)이라 불리우며 기존의 필터배양(filter culture) 혹은 덩어리배양(mass culture) 방법보다 훨씬 더 많은 체세포배 발생이 가능하며 기타 방식으로 유도된 체세포배 발아 비교에서도 높은 식물체 형성율을 나타내어 차후 백합나무 생산 실용화를 위한 체세포배의 대량발생 및 묘목생산에 꼭 필요한 기술로 사료된다.

백합나무, 체세포배 발생, 세포방사 배양법, 필터배양, 덩어리배양

Description

백합나무의 체세포배 발생 방법{Preparing method of somatic embryo production in Liriodendron tulipifera}

본 발명은 백합나무의 체세포배 발생 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와 상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법에 관한 것이다.

임목조직으로부터 체세포배 발생을 시킨 첫 사례는 감귤나무(Citrus) 및 종려나무(date palm)의 주심조직을 이용한 것이 최초이며, 1970년과 1980년대에 이 기술의 적용대상은 주로 활엽수 종에 국한되었다. 현재까지 활엽수종의 경우 30가계, 60종, 80속 이상에서 기초 연구실험 결과가 보고되고 있으나 사실상 대부분 실용적인 측면보다는 기초연구에 그치고 있는 실정이다. 한편, 침엽수종의 경우 Hakman 등(1985)이 독일가문비나무(Norway spruce)의 체세포배 유도를 통한 식물체 재분화를 최초로 보고한 이래 침엽수종의 체세포배 발생 기술은 상당히 발전되어 현재에는 더글러스 훠(Pseudotsuga mensiezii), 테다소나무(Pinus taeda) 및 독일가문비(Picea abies)로부터 세포배양 기술을 이용해 다량의 체세포배 발생, 인공종자의 종피 연구 및 자동화 시스템을 이용한 식물체 생산 등으로 실용화 단계까지 진입한 상태이다.

한편 백합나무의 체세포배 발생 연구의 첫 사례는 1986년 Merkle과 Sommer가 미숙한 상태의 종자배로부터 배발생조직을 유도하고 체세포배를 발생시킨 다음 식물체의 재분화를 보고하고 있다. 최근의 연구는 2001년에 Dai 등이 잡종 백합나무 (Liriodendron tulipifera × L. chinense)의 배발생조직 세포를 4cm 정도 크기의 종이필터에 배양하여 약 1,400여개의 체세포배를 대량으로 발생시켜 묘목 생산의 실용화 가능성을 보여 주웠다. 반면 이 수종에 대한 국내연구는 이 등(2003)이 배발생조직 유도를 위한 백합나무의 미숙종자 채취시기에 관한 연구가 있고 손 등(2005)은 배발생조직 발생을 위한 모수 유전자형 및 배양시 관계하는 광(light)의 상호관계에 관한 연구결과만 언급할 뿐, 체세포배 발생을 위한 구체적인 실험데이터는 없다. 특히 위의 두 연구보고에서는 백합나무의 대량생산을 위한 재료가 되는 체세포배 유도에 관한 효율적인 배양방법에 관한 데이터 제시는 이루어지지 않고 있다.

본 발명의 목적은 백합나무의 체세포배의 보다 경제적이고 효율적인 대량생산방법을 제공하고자 함이다.

상기의 과제를 해결하고자, 본 발명은 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와 상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법을 제공한다.

본 발명은 백합나무의 체세포배 발생에 있어 기존의 발생법보다 훨씬 간단하면서도 대량으로 생산이 가능한 배양법 개발에 관한 것이다. 이러한 보다 진보된 체세포배 발생 기술은 세포방사 배양법(cell spreading culture)이라 불리우며 기존의 필터배양(filter culture) 혹은 덩어리배양(mass culture) 방법보다 훨씬 더 많은 체세포배 발생이 가능하며 기타 방식으로 유도된 체세포배 발아 비교에서도 높은 식물체 형성율을 나타내어 차후 백합나무 생산 실용화를 위한 체세포배의 대량발생 및 묘목생산에 꼭 필요한 기술로 사료된다.

본 발명은 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와 상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 배발생조직의 증식은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 18~22g/L sucrose, 0.3~0.5% gelrite, 1.8~2.2mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3mg/L BA가 첨가된 배지를 이용할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 체세포배 발생은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 35~45g/L sucrose, 450~550mg/L casamino acid 및 0.3~0.5% gelrite가 첨가된 배지를 이용할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 체세포배 발생은, 암 조건 하에서 7~9주간 배양할 수 있다.

이하 본 발명의 백합나무의 체세포배 발생 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 백합나무의 체세포배 발생에 있어 기존의 발생법보다 훨씬 간단하면서도 대량으로 생산이 가능한 배양법 개발 및 체세포배 발생시 광 혹은 암배양으로 유도효율을 높이고자 고안되었다. 보다 진보된 체세포배 발생 기술은 세포방사 배양법(cell spreading culture)이라 불리우며, 기존의 필터배양(paper filter culture) 혹은 덩어리배양(mass culture) 방법보다 훨씬 더 많은 체세포배 발생이 가능하며 기타 방식으로 유도된 체세포배 발아 비교에서도 높은 식물체 형성율을 나타내어 차후 백합나무 생산 실용화를 위한 체세포배의 대량발생 및 묘목생산에 꼭 필요한 기술로 사료된다.

또한 암 조건에서 체세포배를 발생시킬 경우 광 조건에서보다 훨씬 높은 체세포배 획득율을 보였다. 최종적으로는 이 발명의 목적은 체세포배 발생을 통한 우수형질의 백합나무를 대량생산 실용화를 이루기 위한 체세포배의 대량생산을 위한 기술개발에 있다.

백합나무의 종자결실은 종자임성이 매우 저조하여 묘목생산을 위해 부득히 외국으로부터 많은 양의 종자를 수입해야만 하는 실정에 있다. 다행히 최근 조직배양 기술 중 체세포배 발생을 통한 식물체 재분화 기술개발이 많이 이루어져 특히 캐나다 및 뉴질랜드와 같은 임업선진국가에서는 독일가문비나무 및 라디아타소나무 등의 유용 침엽수종 대량생산 및 상업화에 성공했다. 반면 국내의 경우 과거 상수리나무 등 몇몇 활엽수종 및 낙엽송 등 침엽수종 수종을 대상으로 재분화연구가 진행되었지만 실용화에는 못 미치고 있는 실정이다. 그것은 실용화를 이룰 만큼 대량의 체세포배 발생이 불가능했기 때문이다.

따라서 백합나무의 경우에서도 마찬가지로 체세포배 발생기술을 적용시켜 묘목대량생산의 실용화를 이루기 위해서는 먼저 체세포배의 대량생산이 가능한 배양방법이 강구되어야 한다. 이전의 연구에서는 mass 배양 혹은 filter 배양법으로 다수 체세포배 유도가 가능하였지만 실험실수준에 그쳤을 뿐이었다. 그러나 이제는 cell spreading 배양방법의 개발로 체세포배의 대량발생이 가능해져 궁극적으로는 묘목의 대량생산 또한 가능해져 결국 실용화 달성이 가능해졌다. 나아가 이 기술의 개발로 유전자조작 등의 첨단 생물공학 기법을 임업에 적용하는 것 또한 가능해졌으며 가까운 장래에 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성증진 등의 산림자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 백합나무의 체세포배 발생 방법은 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와 상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 배발생조직의 증식은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 18~22g/L sucrose, 0.3~0.5% gelrite, 1.8~2.2mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3mg/L BA가 첨가된 배지를 이용할 수 있다.

바람직하게는 상기 배발생조직의 증식은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 20g/L sucrose, 0.4% gelrite, 2.0mg/L 2,4-D 및 0.25mg/L BA가 첨가된 배지를 이용할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 체세포배 발생은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 35~45g/L sucrose, 450~550mg/L casamino acid 및 0.3~0.5% gelrite가 첨가된 배지를 이용할 수 있다.

바람직하게는 상기 체세포배 발생은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 40g/L sucrose, 500mg/L casamino acid 및 0.4% gelrite가 첨가된 배지를 이용할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 체세포배 발생은, 암 조건 하에서 7~9주간 배양할 수 있다.

바람직하게는 상기 체세포배 발생은, 암 조건 하에서 8주간 배양할 수 있다.

본 발명의 방법은 백합나무의 배발생조직 05라인으로 3종류의 체세포배 발생 기술 효과 비교, 배발생조직 05라인으로 3종류의 체세포배 발생 기술 발아 효과 비교, 배발생조직 06라인으로 3종류의 체세포배 발생 기술 효과 비교 및 배발생조직 05라인으로 광과 암 배양의 체세포배 발생 효과 비교 등을 통하여 현저한 효과를 증명할 수 있다. 상기의 05라인, 06라인 등은 여러가지 샘플을 같은 조건의 환경에서 실시한 것으로 여러 실험의 구별을 위하여 편의적으로 붙인 기호이다.

이하 본 발명의 실시예 및 실험예에 대하여 설명한다. 다만, 이하의 실시예 등은 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 백합나무의 체세포배 유도

1. 배발생조직 증식 단계

백합의 미숙종자로부터 배발생조직 유도는 암소에서 실시하는데 배양 4주 후, 배발생조직 유도가 시작되는 것을 관찰할 수 있으며 계속 두면 증식을 지속한다는 것을 알 수 있었다. 배양 7주 후, 조직이 증식을 거듭하여 새로운 배지로 옮겨줄 만큼 조직이 생장하게 되었다. 이때 배발생조직의 유도 배지와는 조성을 다소 변형을 시켜 배양을 계속하였는데, 증식배지의 조성은 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 20g/L sucrose, 0.4% gelrite, 2.0mg/L 2,4-D 및 0.25mg/L BA가 첨가된 배지로 옮겨주었다. 그 후 2주 간격으로 동일조성의 배지로 계대배양하여 체세포배 발생을 위한 시험재료의 충분한 양이 될 때까지 증식시켰다.

2. 체세포배 발생 단계

상기 1.의 배발생조직이 충분한 양으로 증식이 되면 이 조직을 이용하여 체세포배를 발생시켰다. 체세포배 유도배지는 고체배지(1/2 MS배지에 40g/L sucrose, 500mg/L casamino acid 및 0.4% gelrite)에서 이루어졌다. 체세포배 발생은 배발생조직을 체세포배 발생배지와 동일조성의 액체배지에 시약스푼을 이용해 부수어 놓은 다음 약 2.5mg/ml 농도로 맞춘 후, 일회용 플라스틱 피펫으로 2ml를 취해 곧장 고체배지위로 고루 뿌린(spreading) 후 30분 지난 다음 치상한 세포가 딸려오지 않게 나머지 액체를 조심스럽게 뽑아내었다. 그 후 암 조건 하에서 8주 간 배양 후 체세포배를 유도하였다.

<실시예 2> 백합나무의 체세포배 유도

상기 실시예 1과 같은 방법으로 체세포배를 유도하여 증식하되, 2. 체세포배 발생 단계에서 암조건이 아닌 광(50μEm^-2s-) 조건 하에서 8주간 배양 후 체세포배를 유도하였다.

<비교예 1> 백합나무의 체세포배 유도

상기 실시예 1과 같이 체세포배를 유도하되, 세포방사 배양법(cell spreading culture)이 아닌, 기존의 필터배양(paper filter culture)방법으로 체세포배를 유도하였다.

<비교예 2> 백합나무의 체세포배 유도

상기 실시예 1과 같이 체세포배를 유도하되, 세포방사 배양법(cell spreading culture)이 아닌, 기존의 덩어리배양(mass culture) 방법으로 체세포배를 유도하였다.

<실험예 1> 3종류의 체세포배 발생기술 효과 비교

세포방사 배양법(cell spreading culture) 등 3종류의 배양방법(실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2)에 따른 백합나무 체세포배 유도 효율을 비교한바(도 1 참조), spreading 방식으로 배양시 조직라인에 상관없이 전체적으로 높은 유도 수(512~548개/5mg)를 보였으나, Mass 배양시에는 전혀 체세포배가 유도되지 않는 대조적인 결과를 보였다. Filter 배양방법으로는 라인에 따라서 26~125개/5mg의 낮은 체세포배 유도수를 보여 spreading 배양방식이 고빈도의 체세포배를 유도하는데 훨씬 효율적인 배양방식임을 알 수 있었다(도 4 참조).

<실험예 2> 발생된 체세포배의 발아 효과 비교

Spreading 및 filter 배양방식으로 유도된 체세포배를 가지고 식물체의 재분화의 효율을 비교한바, 조직라인에 관계없이 spreading 방식에서 유도된 05-38라인 유래 체세포배에서 가장 높은 84.1%의 높은 식물체 재분화율을 보였다.

또한 filter 배양방식으로 유도된 05-38라인의 체세포배에서도 81.3%의 높은 재분화율을 보여 라인에 따라 재분화율이 크게 좌우됨을 알 수 있다. 그러나 05-6 조직라인에서는 filter 방식유래 체세포배의 식물체 재분화율(68.5%)이 spreading 방식(43.5%) 보다 높은 결과를 보였으나 대체로 filter 배양방식으로 유도된 체세포배의 식물체 재분화율이 spreading 배양방식 유래의 체세포배 보다는 낮은 재분화율을 보였다(도 5 참조).

<실험예 3> 2종류의 체세포배 발생기술 효과 비교

05라인의 배발생조직을 재료로 하여 spreading 및 filter 배양방식으로 체세포배 유도 효율을 비교시(도 2 참조), 확실히 spreading 배양방식이 우수함을 보였다. 그러나 배발생조직 라인에 따라 배양방식에 따른 체세포배 발생 효율정도가 달라질 수 있기 때문에 다른 조직라인에 이 기술을 적용시켰을 경우 동일하게 spreading 배양방식의 우수함을 입증하기 위해 이 실험이 실시되었다.

도 6에서와 같이 06조직 라인에서도 spreading 배양기술의 체세포배 유도 기술이 filter 배양기술 보다 월등히 높은 체세포배 유도 효율을 보였다. 최대치는 06-1라인에서 588개/5mg로 가장 높은 수치를 보였으나 filter 배양방식의 경우 겨 우 153개/5mg를 보여 spreading 배양방식이 훨씬 효율적임을 보여주었다. 그리고 06-2, 3, 및 4라인에서도 spreading 배양방식에서 높은 체세포배 유도 수를 보인 반면 filter 배양방식에서 낮은 수치를 보여 큰 대조를 이루었다. 그러나 06-5라인의 경우 filter 배양방식에서 270개/5mg로 spreading 배양방식(248개/5mg) 보다 다소 높은 유도수를 보여 이 경우에도 조직라인에 따라 다소 영향을 받는 것으로 보이나 전체적으로는 조직라인에 상관없이 spreading 배양방식이 고빈도의 체세포배 발생에 유리함을 입증해 주었다.

<실험예 4> 광 및 암배양으로 체세포배 발생 및 발아 효과 비교

약 8주간의 체세포배 유도 동안 암소(512~548/5mg)배양조건(실시예 1)이 광배양 조건(50μEm^-2s-)(실시예 2)에서 보다 훨씬 체세포배 유도효율이 양호한 것으로 나타났다(도 3 참조). 최대의 체세포배 유도는 4종류의 라인 간에는 별 차이를 보이질 않았고 그중 05-6라인에서 548개/5mg로 가장 높았으나 05-1라인(540.7개/5mg) 유도숫자와 유사하였다. 그러나 광조건 하에서 체세포배를 발생시켰을 경우, 조직라인에 상관없이 매우 저조한 체세포배 발생수를 보였는데 이는 체세포배 발생시에는 절대적으로 암 상태에서의 배양이 유리한다는 것을 보여주었다(도 7 참조).

또한 식물체 재분화의 경우에서도 체세포배 발생 경우와 마찬가지로 암조건에서 발생된 체세포배가 훨씬 높은 재분화율을 보였으며 암배양 유래 3라인 모두 높은 식물체 재분화율(88.4~91.8%)을 보였다. 그 중 05-38라인에서 가장 높은 수 치(91.8%)를 보인 반면, 광배양 조건에서 유도된 체세포배는 05-38(81.4%)라인을 제외하고는 저조한 발아율(26.7~31.3%)을 나타냈는데 이것은 광배양 조건 하에서 발생된 체세포배가 식물체 재분화에는 적합하지 않은 것으로 나타났다(도 8 참조).

본 발명의 방법은 기존의 배양법에 비하여 보다 효율적인 백합나무의 체세포배 증식기술을 제공하여, 임업에 종사하는 관계업자의 이윤을 창출하며 궁극적으로는 국가의 임업발전에 이바지할 것이다.

도 1은 cell spreading, filter 및 mass 배양방법에 따른 05라인 조직(4라인: 05-1, 05-6, 05-21 및 05-38)의 체세포배 발생양상 비교 사진이다.

도 2는 cell spreading 및 filter 배양방법에 따른 06라인 조직(5라인: 06-1, 06-2, 06-3, 06-4 및 06-5)의 체세포배 발생양상 비교 사진이다.

도 3은 05라인 조직(4라인 : 05-1, 05-6, 05-21 및 05-38)의 암 배양을 이용한 체세포배 발생양상 비교 사진이다.

도 4는 05라인 조직 4라인으로 3종류의 체세포배 발생기술의 효과를 비교한 그래프이다.

도 5는 05라인 조직 배발생조직 라인으로부터 발생된 체세포배의 발아양상 비교 사진이다.

도 6은 06라인 조직 배발생조직 라인으로 2종류의 체세포배 발생기술 효과를 비교한 그래프이다.

도 7은 광, 암배양 조건에 따른 체세포배 발생효과를 비교한 그래프이다.

도 8은 광, 암배양 유래 체세포배의 식물체 재분화 효과를 비교한 그래프이다.

Claims (4)

1. 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와

   상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배발생조직의 증식은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 18~22g/L sucrose, 0.3~0.5% gelrite, 1.8~2.2mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3mg/L BA가 첨가된 배지를 이용하여 증식시킴을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 체세포배 발생은, 염류의 양을 반으로 줄인 1/2 MS배지에 35~45g/L sucrose, 450~550mg/L casamino acid 및 0.3~0.5% gelrite가 첨가된 배지를 이용하여 발생시킴을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 체세포배 발생은, 암 조건 하에서 7~9주간 배양하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법.

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