KR20140142447A - 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양 및 부정근 유도 방법 - Google Patents

기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양 및 부정근 유도 방법 Download PDF

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권수정
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우송정보대학 산학협력단
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Abstract

본 발명은 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법 및 이를 이용한 부정근 유도를 위한 배지 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법 및 이를 이용한 부정근 유도를 위한 배지 제조 방법은 (a)기내 배양한 도라지를 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계; (b) 현탁 배양한 도라지는 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계; 및 (c) 발아된 도라지 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법 및 이를 이용한 부정근 유도를 위한 배지 제조 방법은 종래 방법에 비해 효과적으로 도라지를 대량생산할 수 있어 농가의 소득 향상에 기여할 수 있는 효과가 있다.

Description

기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양 및 부정근 유도 방법{Method of development for effective inducing tetraploid platycodon grandflorum and adventitious roots using in vitro culture}
본 발명은 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양 및 부정근 유도 방법에 관한 것이다.
도라지는 한의학에서는 길경(桔梗)이라고 하며, 초롱과에 속하는 다년생초로서 한국을 비롯한 중국, 일본 등지에 자생하며, 배농, 거담, 기관지염, 천식 등의 호흡기계 질환에 사용되어온 생약재이다. 또한, 도라지는 이를 이용한 한방처방 수가 동의보감에 273건, 방약합편에 49건이 수록되어 있을 정도로 다양한 약리작용을 가지고 있는데, 도라지의 주요 약리성분은 트리테르페노이드(triterpenoid)계 사포닌(saponin)이 알려져 있고, 이러한 성분은 진해, 거담작용, 중추신경억제작용(진정, 진통, 해열효과), 급만성염증에 대한 항염증 작용, 항궤양 및 위액분비 억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤대사 개선작용 등이 있는 것으로 알려져 있다.
이외에도 도라지의 추출물은 곰팡이의 아프라톡신을 억제하며, 이눌린 분획은 식균작용과 고형암 및 복수암에 대한 강력한 항종양 효능이 있고, 40% 도라지엑기스는 알코올흡수 억제작용을 가지고 있다.
한편, 도라지를 포함하여 생체 유용한 생리활성물질을 함유한 식물은 1차 생산자로서 사람을 비롯한 모든 동물의 식량이 되기 때문에 이의 개량이나 증산에 대한 연구가 필요하다.
그 결과 식물의 세포 및 조직배양 기술이 발달하였고 미분화 세포 덩어리인 캘러스로부터 완전히 식물체의 재분화가 가능해지면서 식물자원의 효과적 활용이 가능케 되었는데, 연구 결과의 예로 식물생장조절 물질들을 사용하여 식물의 생장을 촉진시킬 수 있게 되었고, 식물의 조직이나 기관을 특수한 기내 환경 조건을 구비하여 재배함으로써 외부의 악영향을 받지 않고 기내에서 지속적인 식물 생산물을 얻을 수 있게 되었다. 이 외에도 배수체를 제조하여 식물의 생산을 증가시키는 연구도 진행되고 있다.
한편, 개발된 종래 방법에 있어서, 4배체 식물을 유도하는 방법으로는 콜히친 방법에 사용되고 있으나, 종래는 종자를 콜히친 용액에 처리하여 식물체를 획득하는 것으로 4배체의 유기 효율이 적은 단점이 있다.
또한, 기내라는 특수 환경 하의 식물 생장 증식은 여러 가지 기내 환경에 맞는 선별적인 영양분이 필요하며, 대상이 되는 식물의 종류 및 특성에 따른 적정배지가 필요한 문제점이 있다.
이에 본 발명에서는 체내 유용한 활성성분을 다량 함유하고 있는 도라지의 생산 확대를 위한 방법으로, 4배체 도라지를 높은 획득율로 생산하고 부정근을 효율적으로 유기할 수 있는 방법을 고안하였다.
한국공개특허 10-2012-0053210
상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명의 목적은 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 기내배양을 이용하여 재배한 4배체 도라지의 부정근 유도를 위한 배지제조 방법을 제공하는 것이다.
이에 본 발명은 (a)기내 배양한 도라지를 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계; (b) 현탁 배양한 도라지는 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계; 및 (c) 발아된 도라지 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하는 단계를 포함하는 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 기내 배양한 도라지는 절을 하나 포함하는 0.6 내지 1.2cm 길이의 도라지 줄기부분일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 콜히친 용액은 콜히친이 0.005 내지 0.2 질량%로 증류수에 용해된 용액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 침지는 3 내지 24시간 동안 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 기내 배양한 도라지로서 절을 하나 포함하고 0.6 내지 1.2cm의 줄기부분 도라지를 0.005 내지 0.2 질량% 농도의 콜히친이 용해된 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계; (b) 현탁 배양한 도라지를 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계; (c) 발아된 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하여 4배체 도라지를 유도하는 단계; 및 (d) 상기 유도된 4배체 도라지의 엽절편을 부정근 유도배지로 배양하는 단계를 포함하는 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 부정근 유도방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부정근 유도배지는 0.00001~0.00002%의 식물생장조절물질, 0.00002~0.05%의 무기영양소, 5%의 탄소원, 0.003~0.01%의 비타민 및 0.6%의 교질재료를 포함하는 배지일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물생장조절물질은 인돌-3-아세트산(IAA) 또는 1-나프탈렌아세트산(1-naphthaleneacetic acid; NAA)이고, 상기 무기영양소는 황산염, 질산염, 할라이드, 인산염 또는 FeEDTA이고, 상기 탄소원은 수크로즈이고, 상기 교질재료는 한천일 수 있다.
본 발명은 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법, 이를 이용한 부정근 유도방법 및 부정근 유도 배지 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 4배체 도라지를 획득하기 위해 종자에 직접 처리하지 않고, 기내 배양체에 직접 처리하여 4배체 도라지의 획득 효율을 높이고 또한, 여기서 얻어진 4배체 도라지의 엽졀편을 배양재료로 부정근 유도를 위한 배지에서 부정근을 유도한 경우, 기존 MS 배지보다 부정근 형성이 월등히 우수한 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에서 제공하는 배체 도라지의 배양방법 및 이를 이용한 부정근 유도방법은 기내에서 도라지를 대량생산할 수 있는 새로운 기술로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 2배체와 4배체의 유세포분석기 (Flow cytometry(Patec PA-1, Germany))를 이용하여 DNA의 함량을 비교한 사진도이다.
도 2는 기내에서 배양중인 2배체 도라지와 본 발명을 통해 얻은 기내 4배체 도라지의 사진도이다.
도 3은 4배체 도라지의 절과 엽절편을 본 발명에서 제조한 부정근 유도 배지에 한달간 배양한 사진도이다.
도 4는 대조군 배지(MS 배지)와 본 발명에서 제조한 부정근 유도 배지에 4배체 도라지의 절을 한달간 배양한 사진도이다.
본 발명은 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법 및 이를 이용한 도라지의 부정근 유도 배지 제조 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 4배체 도라지의 배양방법은, (a)기내 배양한 도라지를 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계; (b) 현탁 배양한 도라지는 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계; 및 (c) 발아된 도라지 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하는 단계를 포함한다.
특히 본 발명에서는 4배체 도라지를 배양하는 새로운 방법을 제공하는데, 일반적으로“배수체(polyploidy)"란 2쌍 이상의 유전체가 있는 개체를 의미하며, 체세포는 통상 이배체(2n로 나타냄)이지만 유전체가 중복하여 3배체(3n), 4배체(4n)등으로 되는 경우가 있다. 유전체의 중복은 자연에서도 일어나지만, 콜히친 등의 약품 처리 또는 온도처리 등의 물리적 자극에 의해서도 고빈도로 일어나는 것으로 알려져 있다. 동일유전체를 중복하여 포함하는 개체를 동질배수체, 다른 유전체를 포함하는 경우를 이질배수체라고 하며, 본 발명에 따른 4배체 도라지는 4배의 도라지 염색체수를 갖는 도라지 개체(4n)를 말한다.
또한, 본 발명에서 4배체 도라지의 제조를 위해 콜히친 용액을 사용하였는데,“콜히친(colchicine)"은 백합과 식물인 콜키쿰(Colchicum autumnale)의 씨앗이나 구근에 포함되어 있는 알칼로이드(식물 독성)성분으로 세포 내에서 근육과 골격 역할을 하는 것을 알려져 있는 단백질인 튜불린(tubulin)에 결합해서 그 기능을 방해하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이 때문에 세포분열을 할 때 튜블린이 사용되는 방추사의 기능을 저해해서 염색체가 잘 분리되지 않도록 하는 효과가 있다.
이러한 효과로 인해 식물이 세포분열을 할 때 염색체의 분리를 저해하여 생식세포를 배수체로 만들 수 있으며, 현재까지는 식물의 종자에 처리하여 4배체 식물을 유도하는데 사용하고 있다. 그러나 종래 종자에 처리하는 방법은 그 효과가 낮아 4배체 식물을 유도하는데 어려움이 있다.
한편, 본 발명에서는 이러한 단점을 극복하기 위해 콜히친을 종자에 처리하지 않고 기내 배양한 도라지를 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양함으로써 4배체 도라지를 유도하는데 성공하였다.
특히, 본 발명에 따른 상기 기내 배양한 도라지는 절을 하나 포함하여 0.6내지 1.2cm 길이의 도라지 줄기부분을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 0.8내지 1.0cm길이의 도라지 줄기 부분을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 콜히친 용액은 콜히친을 0.005 내지 0.2% 질량비의 농도로 증류수에 용해된 용액을 사용할 수 있으며, 콜히친 용액에서의 침지는 3~24시간 동안 침지시킬 수 있다.
이러한 방법으로 콜히친이 처리된 도라지는 다시 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상한 다음, 발아된 도라지 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하여 4배체 도라지를 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용한 상기 1/2 MS 배지는 당업계에서 사용되고 있는 1/2 MS를 사용할 수 있다.
또한 본 발명자들은 상기 기술된 본 발명의 방법이 4배체 도라지를 제조할 수 있는지 확인하기 위해, 수득한 4배체 도라지로부터 DNA를 추출한 후, 유속흐름기(flow cytometry) 분석을 통해 4배체 도라지가 성공적으로 제조되었음을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명의 경우, 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 부정근 유도방법을 제공할 수 있는 특징이 있는데, 보다 구체적으로 상기 부정근 유도방법은, (a) 기내 배양한 도라지로서 절을 하나 포함하고 0.6 내지 1.2cm의 줄기부분 도라지를 0.005 내지 0.2% 질량비 농도의 콜히친이 용해된 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계; (b) 현탁 배양한 도라지를 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계; (c) 발아된 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하여 4배체 도라지를 유도하는 단계; 및 (d) 상기 유도된 4배체 도라지의 엽절편을 부정근 유도배지로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
특히 본 발명에서는 기내에서 4배체 도라지의 부정근을 유도할 수 있는 유도배지를 제공할 수 있는 특징을 가지기도 하는데, 본 발명에서 제공하는 상기 유도배지는 0.00001~0.00002%의 식물생장조절물질, 0.00002~0.05%의 무기영양소, 5%의 탄소원, 0.003~0.01%의 비타민 및 0.6%의 교질재료를 포함하는 배지이며, 상기 식물생장조절물질은 인돌-3-아세트산(IAA) 또는 1-나프탈렌아세트산(1-naphthaleneacetic acid; NAA)이고, 상기 무기영양소는 황산염, 질산염, 할라이드, 인산염 또는 FeEDTA이고, 상기 탄소원은 수크로즈이고, 상기 교질재료는 한천을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 부정근 유도를 위해 사용한 배지의 형태는 고체배지일 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 배양액에 교질재료를 첨가하여 반고체 상태로 만들었다.
본 발명에 따른 상기 4배체 도라지 부정근 유도배지에 함유된 성분 중, 식물생장조절물질은 식물의 특정 생장반응을 조절하는 물질의 총칭으로 생장을 촉진 작용하는 것과 촉진 저해작용을 하는 것이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 식물생장조절물질은 인돌-3-아세트산(IAA) 또는 1-나프탈렌아세트산(1-naphthaleneacetic acid; NAA)일 수 있으며, 이러한 식물생장조절물질은 세포의 신장, 조직의 비대, 세포분열, 부정아와 액아형성 억제 및 배형성을 유도하는 활성이 있다. 한편, 이러한 식물생장조절물질에 의한 효과는 세포의 분화상태에 따라 크게 달라질 수 있는데, 즉, 분열하지 않는 세포에서는 세포증식을 촉진시키는 효과가 있으나, 왕성하게 분열하는 생장점 세포에서는 분열을 억제하는 작용을 한다. 따라서 본 발명자는 종래 방법과는 달리 기내에서 배양중인 도라지 절편에 직접 처리하여 부정근 유도 효율을 높인 특징이 있다.
또한, 본 발명의 부정근 유도 배지에 함유된 각 성분인 0.00001~0.00002%의 식물생장조절물질, 0.00002~0.05%의 무기영양소, 5%의 탄소원, 0.003~0.01%의 비타민 및 0.6%의 교질재료는 기재된 함량의 범위 내로 배지에 포함되는 것이 바람직한데, 이는 각 성분이 상기 범위에 미치지 못하는 경우, 도라지 부정근이 제대로 유도되지 못하는 문제점이 있고, 반면 각 성분이 상기 범위를 초과하는 경우, 사용하는 함량 대비 부정근의 유도 효율이 미비한 문제점이 있다.
따라서 앞서 기술한 성분의 적정 농도 범위로 함유된 배지를 사용할 경우, 단기간에 걸쳐 도라지의 부정근을 효과적으로 유도시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 4배체 도라지 및 상기 도라지의 부정근 유도를 기내에서 배양 및 증식시킬 수 있는 조건을 확립한 특징이 있는데, 특히 식물의 조직이나 기관이 기내라는 특수한 환경에서 생장 증식하기 위해서는 여러 가지 영양분이 필요하다. 또한 영양분의 요구도는 식물에 종류에 따라 배양조직이나 기관의 종류에 따라 크게 달라질 수 있다. 따라서 각 식물에 대한 조직배양기술과 이에 따라 각각의 식물이나 조직에 맞는 배지의 개발이 필요하다.
또한 일반적으로 식물조직배양 체계는 대량증식 초기에 단독으로 분화된 신초가 발근이 되기까지 각각의 단계 또는 여러 단계를 거쳐 진행되기 때문에 경비가 많이 드는 문제가 있다. 따라서 이러한 경비 절감을 위해서는 배양 단계를 축소시킬 수 있는 목적에 맞는 배지 개발이 필요하다.
또한, 부정근의 경우에는 절편 조직의 종류에 따라 배양반응 및 효과가 아주 다르기 때문에 부정근 형성에 효과적인 절편 조직을 선택하고 적정배지의 개발이 필요하다고 볼 수 있다.
이러한 점에서 본 발명은 4배체 도라지의 부정근을 효과적으로 유도하기 위한 조건으로서, 유도된 4배체 도라지의 엽절편을 부정근 유도배지로 배양할 경우, 부정근이 효과적으로 생성됨을 확인할 수 있었다.
이는 본 발명의 일실시예를 통해 확인할 수 있었는데, 4배체 도라지를 대상으로 도라지의 절과 엽절편을 재료로 본 발명에 따른 부정근 유도배지를 이용하여 부정근을 유도한 결과, 엽절편을 배양한 경우, 캘러스의 유기가 왕성한 절을 재로로 한 경우에 비해 부정근 형성이 월등히 높은 것을알 수 있었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 효과적인 도라지 부정근 유도를 위해 도라지의 부위 중 엽절편을 사용하는 것이 매우 유용함을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
4배체 도라지 제조
4배체 도라지를 제조하기 위해 콜히친은 0.01, 0.05, 0.1%의 콜히친을 증류수에 녹인 후 클린 벤치내에서 멤브레인 필터(0.45㎛)를 사용하여 멸균하였다. 기내에서 배양중인 도라지는 절을 하나 포함하여 줄기 0.8~1cm를 미리 준비한 콜히친 용액에 3, 6, 12, 24시간 침지하여 암상태에서 현탁 배양하였으며, 각각 처리 후 침지된 절편체를 멸균수에 3회 세척하였으며, 필터페이퍼를 사용하여 물기를 제거 후 1/2 MS 배지에 치상하였다. 상기 1/2 MS 배지에 치상 후, 배양 2개월 후 발아된 도라지 식물체는 다시 1/2 MS 배지에서 배양하여 유지하였고, 본 발명의 재현성 확보를 위하여 3회에 걸쳐 실험하여 4배체 도라지를 제조하였다.
<실험예 1>
배수체 판정 실험
상기 실시예 1을 통해 제조한 4배체 도라지의 DNA함량의 차에 따른 배수체 판정을 위하여 절편체에서 재생된 식물체의 잎을 약 0.5 × 0.5cm의 크기로 자른 후, DNA를 추출한 후 염색한 다음 유세포분석기(Flow cytometry : Patec PA-1, Germany)를 이용하여 DNA 함량의 배가여부를 확인하였으며, 각 처리는 재현성 확보를 위하여 500개체씩 3회에 걸쳐 실험하였다. 이 결과로 배수성을 판정하였다.
콜히친의 농도보다는 시간에 의해 생존율의 영향을 크게 받는 것으로 나타났으며, 하기 표 1와 같이 콜히친의 침지 시간이 길어질수록 생존율은 감소하는 것으로 나타났다.
3회의 실험 결과, 도라지의 절 1,500개의 콜히친 처리수 중 1,175개체의 식물체가 재생되어 생존율을 78.3%였으며, 이들의 DNA함량을 분석한 결과, 216개체가 4배체 식물로 판명되어 4배체 획득율은 18.4%로 매우 높은 획득율을 보였다. 2배체와 4배체 식물의 DNA 함량비교 결과는 도 1에 나타내었고, 2배체와 4배체 식물의 기내 배양식물체 사진은 도 2에 나타내었다.
콜히친 용액의 농도에 따른 도라지 절 생존율
시간
농도(%)		 3 6 12 24
0.01 100 100 95 65
0.05 100 95 85 15
0.1 100 100 45 40
< 실시예 2>
4배체 도라지의 부정근 유도를 위한 배지 제조
상기 실시예 1을 통해 제조된 4배체 도라지의 부정근 유도를 위한 배지를 제조하였다. 4배체 도라지의 부정근 유도를 위해 사용한 배지의 형태는 고체배지로 이는 배지의 기본 형태이며, 배양액에 교질재료를 첨가하여 반고체 상태로 만든 것이다. 가장 널리 사용하는 형태이므로 일반적으로 배지라고 하면 고체배지를 의미하게 된다. 본 발명에서 배지의 성분은 식물생장조절물질, 무기영양소(황산염, 질산염, 할라이드, 인산염 또는 FeEDTA), 탄소원, 비타민, 탄소원(수크로오즈), 물로 구성된다. 본 발명 배지의 조성은 식물생장조절물질 0.00001~0.00002%, 교질재료(한천) 0.6%, 무기영양원소 0.00002~0.05%, 탄소원 5%, 비타민 0.003~0.01% 및 잔량이 물로 이루어진 배지를 제조하였다. 4배체 도라지의 부정근 유도를 위해 사용한 절편체는 엽절편과 절을 사용하였고, 상기 식물생장조절물질은 NAA의 농도는 0.5mg, IAA 농도는 5mg을 사용하였다. 물은 배지의 95%를 차지하며 정제하여 순도를 높인 물을 사용하는데 일반적으로는 증류수를 사용한다. 본 발명에서 배지에 첨가한 무기영양분으로 ①MgSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4의 Sulfate, ② NH4NO3, KNO3의 Nitrate, ③ CaCl2, KI 등의 Halide, ④ KH2PO4, Na2MoO4 등의 Phosphate, ⑤ FeEDTA류를 배지에 첨가하였다. 또한, 4배체 도라지 부정근의 형성에 탄소원의 농도가 중요한 역할을 하며 상기 탄소원은 수크로오스(sucrose) 5%를 첨가하였고, 조직의 생장을 촉진하기 위해 비타민을 첨가하여 4배체 도라지 부정근 유도 배지를 제조하였다.
하기 표 2에 부정근 유도를 위한 배지의 조성을 표기하였다.
부정근 유도를 위한 배지의 조성
구분 성분 함량(mg/L)
황산염(Sulfate)


 MgSO4 ·7H2O 92.5
MnSO4 ·4H2O 5.6
ZnSO4 ·7H2O 2.2
CuSO4 ·5H2O 0.0063
질산염(Nitrate)
 NH4NO3 412.5
KNO3 475
할라이드(Halide)

 CaCl2 ·2H2O 110
KI 0.21
CoCl2 ·6H2O 0.00625
인산염(Phosphate)

 KH2PO4 42.5
H3BO3 1.6
Na2MoO4 ·2H2O 0.0625
킬레이트철(FeEDTA)
 Na2EDTA 9.325
FeSO4 ·7H2O 6.95
비타민



 thiamin HCl 0.025
myo-inositol 25
nicotinic acid 0.125
glycine 0.5
pyridoxine HCl 0.125
식물생장조절물질 NAA 0.5
IAA 5
교질재료 Agar 6,000
탄소원 Sucrose 50,000
물 Distilled H2O 잔량
< 실험예 2>
4배체 도라지의 절과 엽절편을 재료로 한 부정근 형성 효과 비교
상기 실시예 2를 통해 제조한 부정근 유도배지에 4주간 4배체 도라지의 엽절편과 절을 배양한 결과 절과 엽절편을 배양한 경우 캘러스의 유기가 왕성한 절을 재료로 한 경우보다 부정근의 형성이 현저히 높은 것을 알 수 있었다. 상기 실험의 결과는 도 3에 나타내었다.
< 실험예 3>
기본 MS 배지와 부정근 유도 배지와의 부정근 형성 효과 비교
상기 실시예 2를 통해 제조한 부정근 유도배지와 기존 MS배지에서의 부정근 형성 효과를 알아보기 위한 실험을 하였다.
상기 실시예 2를 통해 제조한 부정근 유도배지에 4배체 도라지 엽절편을 4주간 배양하였고, 하기 표 3의 조성대로 기존 MS 배지를 제조하여 상기 실시예 2를 통해 제조한 부정근 유도바지에 4배체 도라지 엽절편을 4주간 배양하였다. 그 결과는 도 4에 나와있는 것과 같이 기존 MS 배지에 비해 부정근의 형성 및 생장이 높은 것으로 나타났다.
일반적인 MS 배지의 조성
구분 성분 함량(mg/L)
황산염(Sulfate)


 MgSO4 ·7H2O 370
MnSO4 ·4H2O 22.3
ZnSO4 ·7H2O 8.6
CuSO4 ·5H2O 0.025
질산염(Nitrate)
 NH4NO3 1650
KNO3 1900
할라이드(Halide)

 CaCl2 ·2H2O 440
KI 0.83
CoCl2 ·6H2O 0.025
인산염(Phosphate)

 KH2PO4 170
H3BO3 6.2
Na2MoO4 ·2H2O 0.25
킬레이트철(FeEDTA)
 Na2EDTA 37.3
FeSO4 ·7H2O 27.8
비타민



 thiamin HCl 0.1
myo-inositol 100
nicotinic acid 0.5
glycine 2.0
pyridoxine HCl 0.5
교질재료 Agar 8,000
탄소원 Sucrose 30,000
물 Distilled H2O 잔량
따라서, 본 발명에 따른 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법 및 이를 이용한 부정근 유도를 위한 배지 제조 방법은 일반도라지에 비해 활성정도가 더 좋은 4배체 도라지 부정근의 기내대량생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
이상 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. (a)기내 배양한 도라지를 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계;
    (b) 현탁 배양한 도라지는 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계; 및
    (c) 발아된 도라지 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하는 단계를 포함하는,
    기내배양을 이용한 4배체 도라지의 배양방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 기내 배양한 도라지는 절을 하나 포함하는 0.6 내지 1.2cm 길이의 도라지 줄기부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 콜히친 용액은 콜히친이 0.005 내지 0.2 질량%로 증류수에 용해된 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 침지는 3 내지 24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. (a) 기내 배양한 도라지로서 절을 하나 포함하고 0.6 내지 1.2cm의 줄기부분 도라지를 0.005 내지 0.2 질량% 농도의 콜히친이 용해된 콜히친 용액에 침지하여 암 상태에서 현탁 배양하는 단계;
    (b) 현탁 배양한 도라지를 멸균수로 세척하고 1/2 MS 배지에 치상하는 단계;
    (c) 발아된 식물체를 1/2 MS 배지에 다시 배양하여 4배체 도라지를 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 유도된 4배체 도라지의 엽절편을 부정근 유도배지로 배양하는 단계를 포함하는,
    기내배양을 이용한 4배체 도라지의 부정근 유도방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 부정근 유도배지는 0.00001~0.00002%의 식물생장조절물질, 0.00002~0.05%의 무기영양소, 5%의 탄소원, 0.003~0.01%의 비타민 및 0.6%의 교질재료를 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 부정근 유도방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 식물생장조절물질은 인돌-3-아세트산(IAA) 또는 1-나프탈렌아세트산(1-naphthaleneacetic acid; NAA)이고, 상기 무기영양소는 황산염, 질산염, 할라이드, 인산염 또는 FeEDTA이고, 상기 탄소원은 수크로즈(sucrose)이고, 상기 교질재료는 한천인 것을 특징으로 하는 기내배양을 이용한 4배체 도라지의 부정근 유도방법.
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