CN110643573A - 一种链式nk细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种链式NK细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：培养NK细胞前，先提前用单克隆抗体CD56、CD16，以及细胞因子IL‑21、IL‑15包被培养瓶/皿，培养当天收集人外周血、脐血、骨髓等来源的单个核细胞，采用自体细胞饲养层与因子组合2步链式激活，以后根据细胞生长情况及时补液并于第5天添加因子组合再次激活。本发明在前5天内期可以获得高基数活化的高表达CD3—CD56+的NK细胞，通过14天的扩增培养可以获得大量高纯度的自然杀伤NK细胞，能够满足临床治疗肿瘤的需求。

Description

一种链式NK细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种一种链式NK细胞的扩增培养方法，属于细胞生物学领域。
背景技术
NK细胞即自然杀伤细，主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，主要存在于外周血，占外周血淋巴细胞的5%-15%，NK细胞的表型为CD3-CD56+。NK细胞是人体固有免疫系统的重要效应细胞，具有抗肿瘤和抗病毒的作用；不紧对血液肿瘤具有杀伤作用，同时对实体肿瘤也具有一定得作用。相比于T细胞，纯度高的NK细胞一般不会引起移植物物抗宿主病（GVHD），因而成为肿瘤治疗的候选细胞之一。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多，导致对NK细胞的需求也越来越大。
目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法:①采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养PBMC中的NK细胞；②是采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；③单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。
本实验采用因子培养法，独特之处是我们采用因子包被的方法，两步链式刺激，再结合细胞因子组合的扩增法。
发明内容
一种链式NK细胞的培养方法的操作步骤如下：
抗体的包被：分别将CD56单抗、CD16单抗、IL-21因子、IL-15因子溶于5～12毫升的DPBS中充分溶解得到包被液，然后加入到底面积为T75cm2的培养瓶中，4℃避光4～24小时或者室温避光2～4个小时或者37℃避光0.5～1个小时。包被浓度为：CD56单抗1～10ug/ml ；CD16单抗1～10ug/ml；IL-21因子1～100ng/ml；IL-15因子1～100ng/ml。
单个核细胞（PBMC）的分离：人脐带血或者外周血单个核细胞（PBMC）和血浆分离后，血浆56℃灭活30分钟后离心，取上层血清加入到无血清培养基中，同时加入IL-2，配成含血清10%、IL-2终浓度为300～1000IU/ml的完全培养基。PBMC用上述培养基重悬平均分成A和B两等份，每份5～20ml，最终控制细胞细胞浓度0.5～3×106/ml。
第1步激活培养：取上面包被的培养瓶，倒掉包被液，用DPBS缓冲液冲洗2遍后，加入A细胞，放入37℃、5%CO2培养箱。
因子组合刺激培养：培养3h后，取出3）培养瓶，添加细胞因子IL-21和IL-15，IL-21终浓度为1～100ng/ml，IL-15 终浓度1～100ng/ml。混匀继续培养。
第2步激活培养：培养3h后，取出4）培养瓶,吹打混匀，把另一份B细胞吹打混匀后加入上述培养瓶中，混匀继续培养。
扩大培养：隔天观察细胞状态并计数，及时添加GT-T551完全培养基，保持细胞浓度为1x106/ml。当培养基超过60ml时转入透气的GT-T610细胞培养袋，继续培养。
第5天时：观察细胞状态并计数，添加GT-T551完全培养基，保持细胞浓度为1x106/ml。同时添加因子IL-15,终浓度为1～100ng/ml，添加因子IL-21,终浓度为1～100ng/ml继续培养。以后隔天观察细胞生长状态并取样计数，添加GT-T551完全培养基，保持细胞浓度为1x106/ml继续培养。
4天细胞时：取1毫升的细胞悬液进行细胞计数和流式检测CD3 -CD56+含量，计算NK细胞的增殖倍数和纯度。

Claims (8)

1.一种链式NK细胞的培养方法，其特征在于，培养过程包括如下步骤：提前用抗体和细胞因子包被培养瓶，培养第1天先进行细胞第1步激活，3h后进行细胞因子组合刺激培养，再3h后进行细胞第2步激活，以后每天根据细胞密度添加培养基扩大培养，第5天时添加细胞因子组合继续培养，直至培养至第14天。
2.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，包被用的抗体和细胞因子以及浓度分别为CD56单抗1～10ug/ml 、CD16单抗1～10ug/ml、IL-21因子1～100ng/ml、IL-15因子1～100ng/ml。
3.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，所述培养基为无血清培养基, 含IL-2终浓度为300～1000IU/ml。
4.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，所述的第1天细胞第1步激活，方法如下：把血液中分离得到的单个核细胞分为A和B俩等份细胞悬液，细胞悬液A体积为5～20ml,浓度控制在0.5～3×106/ml，含自身血清10%，激活时间为3h。
5.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，所述的3h后细胞因子组合刺激培养，具体细胞因子组合为IL-21和IL-15，IL-21终浓度为1～100ng/ml，IL-15 终浓度1～100ng/ml，刺激培养时间为3h。
6.根据权利要求1、4所述的步骤，其特征在于，所述的细胞第2步激活，方法如下：B等份细胞悬液体积为5～20ml,浓度控制在0.5～3×106/ml，含自身血清10%。
7.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，所述的第5天添加细胞因子组合为因子IL-15和IL-21，IL-15终浓度为1～100ng/ml，因子IL-21终浓度为1～100ng/ml。
8.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，所述的以后每天根据细胞密度添加培养基扩大培养，方法如下：每天计数细胞密度，及时添加GT-T551完全培养基，及自身血清体积10%，控制细胞浓度为1×106/ml。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113403273A (zh) * 2021-06-25 2021-09-17 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种扩增脐带血来源的nk细胞的培养方法
CN115074326A (zh) * 2022-07-07 2022-09-20 广州希灵生物科技有限公司 Cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103756964A (zh) * 2013-12-30 2014-04-30 天津斯坦姆生物科技有限公司 一种高效扩增cd3-cd56+的自然杀伤细胞培养系统的方法
CN104357390A (zh) * 2014-10-15 2015-02-18 深圳源正细胞医疗技术有限公司 同时高效扩增cd3+cd56+cik细胞和cd3-cd56+nk细胞的方法
CN105754942A (zh) * 2016-05-18 2016-07-13 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞
CN106554942A (zh) * 2016-11-18 2017-04-05 吉林省拓华生物科技有限公司 一种高效的临床级cd56+群免疫细胞的制备方法
CN107083363A (zh) * 2017-06-29 2017-08-22 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种外周血nk细胞体外高效扩增方法
CN107326008A (zh) * 2017-08-09 2017-11-07 上海莱馥医疗科技有限公司 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
CN107460167A (zh) * 2017-09-21 2017-12-12 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种无滋养细胞的nk细胞的扩增方法
CN107475196A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 天津长和生物技术有限公司 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN108624559A (zh) * 2018-05-04 2018-10-09 北京中灜壹通生物科技有限公司 无饲养层体外扩增原代nk细胞的培养组合物及其应用
CN108642012A (zh) * 2018-07-03 2018-10-12 广东龙帆生物科技有限公司 一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法
WO2018194215A1 (ko) * 2017-04-20 2018-10-25 주식회사 이뮤니스바이오 자연살해세포의 대량증식방법
CN108893443A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 陕西九州细胞基因工程有限公司 一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103756964A (zh) * 2013-12-30 2014-04-30 天津斯坦姆生物科技有限公司 一种高效扩增cd3-cd56+的自然杀伤细胞培养系统的方法
CN104357390A (zh) * 2014-10-15 2015-02-18 深圳源正细胞医疗技术有限公司 同时高效扩增cd3+cd56+cik细胞和cd3-cd56+nk细胞的方法
CN105754942A (zh) * 2016-05-18 2016-07-13 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞
CN106554942A (zh) * 2016-11-18 2017-04-05 吉林省拓华生物科技有限公司 一种高效的临床级cd56+群免疫细胞的制备方法
WO2018194215A1 (ko) * 2017-04-20 2018-10-25 주식회사 이뮤니스바이오 자연살해세포의 대량증식방법
CN107083363A (zh) * 2017-06-29 2017-08-22 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种外周血nk细胞体外高效扩增方法
CN107326008A (zh) * 2017-08-09 2017-11-07 上海莱馥医疗科技有限公司 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
CN107460167A (zh) * 2017-09-21 2017-12-12 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种无滋养细胞的nk细胞的扩增方法
CN107475196A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 天津长和生物技术有限公司 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN108624559A (zh) * 2018-05-04 2018-10-09 北京中灜壹通生物科技有限公司 无饲养层体外扩增原代nk细胞的培养组合物及其应用
CN108642012A (zh) * 2018-07-03 2018-10-12 广东龙帆生物科技有限公司 一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法
CN108893443A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 陕西九州细胞基因工程有限公司 一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈伟等: "IL-15与IL-21细胞因子组合优化临床级人NK细胞培养体系", 《临床军医杂志》 *
黄诗建等: "利用单个核细胞培养扩增NK细胞体系探索", 《中国实验血液学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113403273A (zh) * 2021-06-25 2021-09-17 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种扩增脐带血来源的nk细胞的培养方法
CN113403273B (zh) * 2021-06-25 2023-04-25 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种扩增脐带血来源的nk细胞的培养方法
CN115074326A (zh) * 2022-07-07 2022-09-20 广州希灵生物科技有限公司 Cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法

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