WO2018194215A1 - 자연살해세포의 대량증식방법 - Google Patents

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WO2018194215A1
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natural killer
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cells
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황성환
최진관
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주식회사 이뮤니스바이오
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    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a proliferation technique of natural killer cells (NK cells).
  • cell therapy using immune cells is a therapy that uses the body's immune system because it uses its own cells, which can lead to fewer side effects and increased efficacy, and the memory function of the immune system can lead to cancer recurrence or metastasis. It has been reported that there is a significant effect compared to conventional drug treatment or radiation therapy in blocking.
  • NK cells natural killer cells
  • T cells and B cells with antigen-specific receptors various innate immune receptors are expressed on the cell surface and cancer cells can be distinguished through them.
  • various clinical studies are attempting to treat cancer using natural killer cells, and promising results for certain cancers have been reported.
  • An object of the present invention is to provide a method for mass-proliferating natural killer cells, which efficiently increases the expansion capacity of human-derived natural killer cells.
  • Another object of the present invention is to provide a composition added to the culture medium related to natural killer cell proliferation and activity.
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention and treatment of cancer comprising natural killer cells prepared by the above method.
  • Mass production method of natural killer cells the first step of collecting and separating the lymphocytes from human blood, and the primary suspension of the cell suspension suspension of the isolated lymphocytes in the first culture medium in a first flask
  • a second step a second step of adding a second culture solution to the cell suspension of the second step, and a second culture of the second flask; and a third culture solution to a third suspension of the cell suspension of the third step
  • the first culture medium to the fourth culture medium plasma; At least one antibody selected from anti-CD56, anti-CD16 and anti-NKp46; One or more cytokines selected from interleukin-12, interleukin-2, interleukin-18, interleukin-15, interleukin-21, SCF, FL and GM-CSF.
  • the content of the first to third culture characterized in that the cell correlation factor defined as the total amount of the cell suspension compared to the cell number is added so that the range of 25 ⁇ 100 [ ⁇ 10 -8 ] (ml / cell number). It is done.
  • the culture area of the second flask is larger than the culture area of the first flask, and the culture area of the third flask is larger than the culture area of the second flask.
  • the culture day in the second step is 1 to 2 days
  • the culture day in the third step is 2 to 3 days
  • the culture day in the fourth step is preferably 2-3 days.
  • first culture medium or the second culture medium may further include polygamma glutamic acid ( ⁇ -PGA), and the third culture medium may further include ginsenoside GRg1.
  • the present invention provides a composition for the prevention and treatment of cancer comprising natural killer cells cultured according to the method for mass proliferation of natural killer cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for culturing natural killer cells for propagating natural killer cells using lymphocytes collected and separated from human blood, wherein the composition comprises plasma; At least one antibody selected from anti-CD56 antibodies, anti-CD16 antibodies and anti-NKp46 antibodies; And at least one cytokine selected from interleukin-2, interleukin-12, interleukin-15, interleukin-18, interleukin-21, SCF, FL, and GM-CSF.
  • the said composition further contains polygamma glutamic acid ((gamma) -PGA), and it is preferable that it further contains ginsenoside GRg1.
  • natural killer cells having a larger cell number can be obtained than the conventional culture method without degrading the function of the natural killer cells.
  • the natural killer cell activity and proliferation culture composition is different in each step of culturing the natural killer cells reliably cultivate it is possible to more efficiently secure natural killer cells for the production of immune cell therapy.
  • Example 1 is a graph showing the results of confirming the cell number change of natural killer cells cultured in Example A according to the present invention on the 7th day of culture.
  • Example 3 is a graph showing the results of confirming the killing ability of natural killer cells in Example A and Comparative Example B on the 7th day of culture.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of confirming the change in cell number of natural killer cells cultured according to each of the culture methods 1 to 4 according to the present invention on the 14th day of culture.
  • Figure 5 shows the results of measuring the degree of apoptosis using the Annexin V binding assay after culturing natural killer cells according to each of the culture methods 1 to 4 according to the present invention.
  • Figure 6 is a graph showing the result of confirming the secretion amount of IFN- ⁇ in each cell after culturing natural killer cells according to each of the culture methods 1 to 4 according to the present invention.
  • Mass production method of natural killer cells the first step of collecting and separating the lymphocytes from human blood, and the primary suspension of the cell suspension suspension of the isolated lymphocytes in the first culture medium in a first flask
  • a second step a second step of adding a second culture solution to the cell suspension of the second step, and a second culture of the second flask; and a third culture solution to a third suspension of the cell suspension of the third step
  • the first culture medium to the fourth culture medium plasma; At least one antibody selected from anti-CD56, anti-CD16 and anti-NKp46; One or more cytokines selected from interleukin-12, interleukin-2, interleukin-18, interleukin-15, interleukin-21, SCF, FL and GM-CSF.
  • the content of the first to third culture characterized in that the cell correlation factor defined as the total amount of the cell suspension compared to the cell number is added so that the range of 25 ⁇ 100 [ ⁇ 10 -8 ] (ml / cell number). It is done.
  • the culture area of the second flask is larger than the culture area of the first flask, and the culture area of the third flask is larger than the culture area of the second flask.
  • the culture day in the second step is 1 to 2 days
  • the culture day in the third step is 2 to 3 days
  • the culture day in the fourth step is preferably 2-3 days.
  • first culture medium or the second culture medium may further include polygamma glutamic acid ( ⁇ -PGA), and the third culture medium may further include ginsenoside GRg1.
  • the present invention provides a composition for the prevention and treatment of cancer comprising natural killer cells cultured according to the method for mass proliferation of natural killer cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for culturing natural killer cells for propagating natural killer cells using lymphocytes collected and separated from human blood, wherein the composition comprises plasma; At least one antibody selected from anti-CD56 antibodies, anti-CD16 antibodies and anti-NKp46 antibodies; And at least one cytokine selected from interleukin-2, interleukin-12, interleukin-15, interleukin-18, interleukin-21, SCF, FL, and GM-CSF.
  • the said composition further contains polygamma glutamic acid ((gamma) -PGA), and it is preferable that it further contains ginsenoside GRg1.
  • the inventor of the present invention has studied to obtain a larger number of natural killer cells by inducing activation within a short time by smoothly interacting with cells during natural killer cell activation and mass culturing.
  • the present invention has been completed to increase the cultivation efficiency of natural killer cells while maintaining cancer cell killing ability of natural killer cells in vitro.
  • the results of studies on the activation of natural killer cells with various cytokines and antibodies have been reported, but there are no reports on natural substances that help the proliferation of NK cells.
  • the present inventors attempted to find a substance that helps NK cell proliferation in natural products in addition to the existing cytokines and antibodies.
  • reagent In addition to the above-mentioned reagents (reagent), the interaction between cells is very important for the activation of natural killer cells. Intercellular interactions are involved in cell differentiation and fate determination early in the onset of development, and in adults play an important role in the maintenance of individuals such as immunity, growth, and always-onset.
  • NK cells In order to use NK cells for treatment of immune cells such as cancer, a large number of activated NK cells are required. However, it is difficult to multiply immune cells in vitro. Therefore, activation of natural killer cells is important in natural killer cell culture technology. Normal proliferation is possible only when activated, and natural killer cells that are not activated are reported to have apoptosis in culture. NK cells do not remain active for a long time in vitro. Excessive mass growth naturally leads to cell aging or cell death. Such cell aging or cell death may be caused by free radicals. Therefore, there is an urgent need for a method of inhibiting cell death of NK cells for the mass securing of natural killer cells.
  • the inventors of the present invention have repeatedly studied the mass growth of natural killer cells, and when cultured in a culture medium in which ginsenoside GRg1 is added at the stage of mass proliferation at the stage of mass proliferation, not at the stage of activation, It has been found that mass proliferation is possible by inhibiting cell death. It was confirmed that ginsenoside GRg1 not only inhibits the apoptosis effect of free radicals, but also inhibits free radicals from adversely affecting cell number and cell survival.
  • the inventors of the present invention as a result of studies on the activity and mass proliferation of natural killer cells in the in vitro culture of PBMC, the secretion of IFN- ⁇ (cytokine) of natural killer cells cultured in the culture medium containing polygamma glutamic acid It was confirmed that the increase.
  • Comparative Example B is illustrated in comparison with Example A so that the characteristic technical configuration of the present invention is clearly understood, but the technical configuration corresponding to Comparative Example B has a general knowledge in the technical field to which the present invention belongs. It should not be understood as acknowledging that it is well known technology to the person.
  • Human peripheral blood is collected from 30 ml to 60 ml using a heparinized 10 ml vacuum vessel (BD Vacutainer TM). Subsequently, 15 ml of Ficoll-Paque Plus (endotoxin tested, density 1.077 g / ml, GE Healthcare, USA) was added to a 50 ml lymphocyte separation tube (Leuco sep, Greiner Bio-One, Swiss), 2000 rpm The solution is centrifuged at to settle the solution down the glass membrane in the tube. The collected blood is transferred to a separation tube and centrifuged at 2500rpm to separate red blood cells and granulocyte layers down, and monocyte layer and platelets, etc., to separate blood components.
  • Ficoll-Paque Plus endotoxin tested, density 1.077 g / ml, GE Healthcare, USA
  • the divided plasma of the upper layer is inactivated (inactivation) for 30 minutes in a 56 °C water bath.
  • the divided lymphocyte layer is collected using a sterile pipette and collected in a 15 ml tube. The supernatant is removed after centrifugation of the 15 ml tube containing the collected lymphocytes. 10 ml of buffer solution (PBS) is added to the lymphocytes from which the supernatant is removed, and the cells are suspended and washed. A portion of the suspension is counted using a hemocytometer and centrifuged again to collect only lymphocytes. At this time, the number of harvested lymphocytes was measured to a total of 20 ⁇ 10 6 cells, which are incubated in accordance with Example A and Comparative Example B below.
  • PBS buffer solution
  • Lymphocytes harvested above are cultured according to Example A and Comparative Example B, respectively, by varying the culture time and the amount of the culture solution as shown in Table 1.
  • Example A was cultured in a total of three stages starting from the T25 flask from the monocytes (PBMC) isolated from the peripheral blood, Comparative Example B starting from a T75 flask from the monocytes (PBMC) isolated from the peripheral blood in total 2 Incubate through the steps.
  • Step 2-1 NK cell Primary culture
  • Example A Lymphocytes prepared in the first step were taken, and culture medium and plasma were added to 1-2 ml of T25 flask (SPL Life Sciences) and incubated for 1 to 2 days at 37 ° C. and 5% CO 2 incubator.
  • anti-CD56 # 555513, BD
  • anti-CD16 # 555403, BD
  • anti-NKp46 # MAB1850, R & D
  • IL-12 interleukin-12
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-18 interleukin-18
  • IL-15 interleukin-15
  • interleukin- At least one cytokine selected from 21 (IL-21), stem cell factor (SCF), fit ligand (FL) and GM-CSF (autologous granulocyte-macrophage colony-stimulation factor) (Peprotech) is further administered. That is, lymphocytes measured in a total of 20 ⁇ 10 6 cells are added to 5-10 ml of KBM502 medium containing plasma, antibodies and cytokines described above, and cultured in a CO 2 incubator for 1-2 days.
  • the composition added to the culture is added to the culture day 0.
  • the cells to be cultured are grown at a height of 0.4 cm and a growth area of 25 cm 2 .
  • Example B All procedures are the same as in Example A, except that lymphocytes measured by a total of 20 ⁇ 10 6 cells are added to 20 to 30 ml of KBM502 medium containing a composition containing plasma, antibodies, and cytokines, Incubate for 1-2 days in a T75 flask. In this case, the cultured cells are cultured at a height of 0.4 cm and a growth area of 75 cm 2 .
  • Step 2-2 NK Secondary culture of cells
  • Example A After the primary culture in the step 2-1, the T25 flask in which the cells are being cultured is taken out of the incubator, the cells are collected, and then transferred to the T75 flask.
  • Interleukin-12 (IL-12), interleukin-2 (IL-2), interleukin-18 (IL-18), interleukin-15 (IL-15), interleukin-21 (IL-21), SCF (stem) 15 to 20 ml of KBM502 medium containing one or more cytokines (Peprotech) selected from cell factor), FL (Fit ligand) and GM-CSF were further added to a T75 flask to prepare a 37 ° C. and 5% CO 2 incubator ( incubator) for 2-3 days.
  • the total cell suspension used in the secondary culture is to be 20 ⁇ 30ml.
  • the composition added to the culture is added to the third day of culture.
  • the cells to be cultured are grown at a height of 0.4 cm and a growth area of 75 cm 2 .
  • Example B All the procedures are the same as in Example A, except that the T75 flask is taken out to collect the cells and transferred to the T175 flask. 40 ml KBM502 medium containing a composition containing plasma, antibodies and cytokines was further added to the T175 flask, followed by incubation for 2-3 days. Preferably, the composition added to the culture is added to the third day of culture. The cells to be cultured are grown at a height of 0.4 cm and a growth area of 175 cm 2 .
  • Step 2-3 NK Tertiary culture of cells
  • Example A After the second culture in the step 2-2, the T75 flask in which the cells are being cultured is taken out of the incubator, the cells are collected, and then transferred to the T175 flask. 3-4 mL of autologous plasma, 0.02-0.03 mL of one or more antibodies selected from anti-CD56 (# 555513, BD), anti-CD16 (# 555403, BD) and anti-NKp46 (# MAB1850, R & D), interleukin -12 (IL-12), interleukin-2 (IL-2), interleukin-18 (IL-18), interleukin-15 (IL-15), interleukin-21 (IL-21), stem cell factor (SCF) , 40 ml KBM502 medium containing at least one cytokine (Peprotech) selected from Fit ligand (FL) and GM-CSF was added to the T175 flask, and then in a 37 ° C. and 5% CO 2 incubator. Incubate for 3 days.
  • Example A After culturing all cells cultured in Example A and Comparative Example B for 7 days, the supernatant was removed by centrifugation at 2000 rpm for 5 minutes and then suspended in phosphate buffered saline. 10 ⁇ l of the cell suspension was diluted with phosphate buffered saline, 10 ⁇ l of the diluted solution was mixed with 10 ⁇ l of trypan blue, and placed on a hemocytometer to measure cell number and viability. The cell number was determined by the formula [(live cell number + dead cell number) ⁇ 1/4 ⁇ 2 ⁇ dilution factor ⁇ total volume ⁇ 10 4 ].
  • the amount of medium was controlled to maximize cell activation so that the interaction between the cells present in the cell suspension could be maintained at a distance between the appropriate cells to facilitate the induction. to be.
  • the cell relation factor may be defined as the total amount of the cell suspension (including the medium and the composition) relative to the number of cells present in the cell suspension.
  • the total amount of the cell suspension was controlled so that the CRF value was in the range of 25 to less than 100 [ ⁇ 10 ⁇ 8 ] (ml / cell number), and the CRF value in each step was as follows.
  • the number of cells in Table 2 means the number of cells immediately before each culture step.
  • the cell correlation factor of each culture step is 100 [ ⁇ 10 -8 ] (ml / cell number) or more. This is because in Comparative Example B, the distance between cells is too large in each culture step. It means that the action is not made smoothly.
  • Example A the culture was divided into a total of three stages, in order to maintain the cell association factor in an appropriate range during cell activation and proliferation in cell culture.
  • Comparative Example B the cells were cultured without any consideration of cell correlation factors, and thus, cell activation was not sufficiently induced, indicating that the total number of cultured cells was small.
  • Example A After culturing all the cells cultured in Example A and Comparative Example B, 1 ml of the supernatant was transferred to a new tube by centrifugation at 2000 rpm for 5 minutes. NK cell activity was confirmed by IFN- ⁇ secretion using an IFN- ⁇ ELISA kit (PBL Assay Science, Piscataway, NJ).
  • Figure 3 is a graph confirming the secretion of IFN- ⁇ at 7 days of culture in order to determine the killing capacity of natural killer cells in peripheral blood monocytes (PBMC).
  • PBMC peripheral blood monocytes
  • Culture stage Culture method 1 Culture method 2 Culture method 3 Culture method 4 Primary culture (T25) Culture A Culture medium B Culture A Culture medium B Secondary culture (T75) Culture A Culture medium B Culture A Culture medium B Tertiary Culture (T175) Culture A Culture A Culture medium C Culture medium C 4th culture (1L bag) Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture A Culture
  • culture A refers to a culture medium containing a medium and a composition (including plasma, antibodies and cytokines) used in each culture step in Example A
  • culture B is a polygamma glutamic acid (Poly Gamma Glutamic Acid; ⁇ ) in culture A.
  • -PGA polygamma glutamic Acid
  • culture medium C means that ginsenoside GRg1 is added to culture A at a concentration of 1 to 20 ⁇ M (preferably 10 ⁇ M).
  • Figure 4 is a graph showing the results of confirming the change in cell number of natural killer cells according to each culture method 1 to 4 different culture medium in peripheral blood monocytes (PBMC) on the 14th day of culture. As shown in Figure 4, it can be confirmed that the final cell number of natural killer cells cultured in the culture medium (culture medium C) to which GRg-1 is added during the third culture.
  • PBMC peripheral blood monocytes
  • Annexin V binding assays were performed. Annexin V binds to cells displaying phosphatidylserine (PS) on the cell membrane, and propidium iodide (PI) stains cellular DNA with damaged cell membranes. After culturing four groups of natural killer cells cultured according to the culture methods 1 to 4, each cell was washed twice with cold phosphate buffer solution (PBS) and resuspended in 500 ⁇ l binding buffer.
  • PS phosphatidylserine
  • PI propidium iodide
  • NK cells were harvested and centrifuged at 1500 rpm for 20 minutes to transfer 1 ml of supernatant to a new tube.
  • the activity of NK cells was confirmed by IFN- ⁇ secretion using an IFN-gamma ELISA kit (PBL Assay Science, Piscataway, NJ).
  • the present invention by dividing the cultivation step according to the cell activity to ensure that the cell association factor is optimal in each culturing step, it is possible to optimize the interaction between cells to improve activation and proliferation of natural killer cells. . As a result, high activity and a large number of cells can be obtained on day 7.
  • interferon-gamma interferon-gamma (IFN- ⁇ )
  • GRg-1 inducing the interferon-gamma (interferon-gamma (IFN- ⁇ ) by the addition of polygamma glutamic acid in the initial culture step to further promote the activity of natural killer cells
  • GRg-1 in the mass culture step
  • the present invention provides a culture method capable of recovering a large amount of natural killer cells having excellent killing ability against infection and tumor cells.

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Abstract

본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법은, 사람의 혈액으로부터 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계와, 상기 분리된 림프구를 제1 배양액에 현탁시킨 세포현탁액을 제1 플라스크에서 1차 배양하는 제2 단계와, 상기 제2 단계의 상기 세포현탁액에 제2 배양액을 투입하여 제2 플라스크에서 2차 배양하는 제3 단계와, 상기 제3 단계의 상기 세포현탁액에 제3 배양액을 투입하여 제3 플라스크에서 3차 배양하는 제4 단계와, 상기 제4 단계 이후에 상기 세포현탁액에 제4 배양액을 투입하여 자연살해세포를 대량 증식하는 제5 단계를 포함하여 달성된다. 여기서, 상기 제1 내지 제3 배양액의 함량은, 세포수 대비 세포현탁액의 총량으로 정의되는 세포연관팩터가 25 ~ 100 [×10-8](㎖/세포수)의 범위가 되도록 투입되는 것을 특징으로 한다.

Description

자연살해세포의 대량증식방법
본 발명은 자연살해세포(natural killer cell; NK 세포)의 증식 기술에 관한 것이다.
암 치료 노력이 직면한 가장 큰 문제 중의 하나는 정상 세포에 대한 독성을 해결하지 못하고 있는 것이다. 정상 세포에 영향을 주지 않고 종양만을 선택적으로 파괴하도록 하는 종양 특이 면역의 유도 및 기능 향상은 항암치료의 새로운 가능성으로 대두되고 있다.
한편, 면역세포를 활용한 세포치료제는 인체의 면역체계를 이용한 치료법으로 자신의 세포를 이용하기 때문에 부작용이 적고 효능은 증가되는 효과를 유도할 수 있으며, 면역 시스템의 기억기능은 암의 재발이나 전이를 차단하는데 기존의 약물치료나 방사선 치료와 비교할 때 상당한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
면역체계를 구성하는 세포들 중 특히, 자연살해세포(natural killer cell, 이하 'NK 세포'라 약칭함)는 비특이적으로 암세포 및 바이러스 감염세포를 살상할 수 있는 세포살해활성을 특징으로 하는 선천림프구이다. 항원특이적인 수용체를 가진 T세포, B세포와 달리 다양한 선천면역 수용체를 세포 표면에 발현하며 이들을 통해 암세포를 구분할 수 있다. 현재 자연살해세포를 이용해 암을 치료하려는 다양한 임상연구들이 시도되고 있으며, 특정 암들에 대해 유망한 결과들이 보고되고 있다.
본 발명의 목적은, 인간유래 자연살해세포의 확장능을 종래보다 효율적으로 증대시키는 자연살해세포 대량증식방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자연살해세포 증식 및 활성에 관련된 배양액에 첨가하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 자연살해세포를 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법은, 사람의 혈액으로부터 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계와, 상기 분리된 림프구를 제1 배양액에 현탁시킨 세포현탁액을 제1 플라스크에서 1차 배양하는 제2 단계와, 상기 제2 단계의 상기 세포현탁액에 제2 배양액을 투입하여 제2 플라스크에서 2차 배양하는 제3 단계와, 상기 제3 단계의 상기 세포현탁액에 제3 배양액을 투입하여 제3 플라스크에서 3차 배양하는 제4 단계와, 상기 제4 단계 이후에 상기 세포현탁액에 제4 배양액을 투입하여 자연살해세포를 대량 증식하는 제5 단계를 포함하여 달성된다. 여기서, 상기 제1 배양액 내지 상기 제4 배양액은, 혈장; 항-CD56, 항-CD16 및 항-NKp46 중에서 선택된 1종 이상의 항체; 인터루킨-12, 인터루킨-2, 인터루킨-18, 인터루킨-15, 인터루킨-21, SCF, FL 및 GM-CSF 중에서 선택된 1종 이상의 사이토카인을 포함한다. 아울러, 상기 제1 내지 제3 배양액의 함량은, 세포수 대비 세포현탁액의 총량으로 정의되는 세포연관팩터가 25 ~ 100 [×10-8](㎖/세포수)의 범위가 되도록 투입되는 것을 특징으로 한다.
나아가, 상기 제2 플라스크의 배양면적은 상기 제1 플라스크의 배양면적보다 크고, 상기 제3 플라스크의 배양면적은 상기 제2 플라스크의 배양면적보다 큰 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2 단계에서의 배양일은 1 ~ 2일이고, 상기 제3 단계에서의 배양일은 2 ~ 3일이며, 상기 제4 단계에서의 배양일은 2 ~ 3일인 것이 바람직하다.
아울러, 상기 제1 배양액 또는 제2 배양액은 폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 더 포함할 수 있고, 상기 제3 배양액은 진세노사이드 GRg1을 더 포함할 수 있다.
본 발명은, 상술한 자연살해세포의 대량증식방법에 따라 배양된 자연살해세포를 유효활성성분으로 포함하는 암예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 사람의 혈액으로부터 채취 및 분리한 림프구를 이용하여 자연살해세포를 증식하기 위한 자연살해세포 배양용 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은, 혈장; 항-CD56 항체, 항-CD16 항체 및 항-NKp46 항체 중에서 선택된 적어도 1종의 항체; 및 인터루킨-2, 인터루킨-12, 인터루킨-15, 인터루킨-18, 인터루킨-21, SCF, FL 및 GM-CSF 중에서 선택된 적어도 1종의 사이토카인;을 포함할 수 있다.
나아가, 상기 조성물은, 폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 더 포함하는 것이 바람직하고, 또한 진세노사이드 GRg1을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 자연살해세포 대량증식방법에 따라 자연살해세포를 배양하면, 자연살해세포의 기능에는 저하가 없이 기존 배양방법에 비해 더 많은 세포수의 자연살해세포를 얻을 수 있다. 또한, 자연살해세포 활성 및 증식용 배양액 조성물은 배양 각 단계에서 달리하여 자연살해세포를 안정적으로 배양하므로 면역세포치료제의 생산을 위한 자연살해세포를 더욱 효율적으로 확보할 수 있다.
도 1은, 본 발명에 따른 실시예 A에 의해 배양된 자연살해세포의 세포수 변화를 배양 7일차에 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 비교예 B에 의해 배양된 자연살해세포의 세포수 변화를 배양 7일차에 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 실시예 A 및 비교예 B에서 자연살해세포의 살상능 변화를 배양 7일차에 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 본 발명에 따른 배양법 1 내지 4 각각에 따라 배양된 자연살해세포의 세포수 변화를 배양 14일차에 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 본 발명에 따른 배양법 1 내지 4 각각에 따라 자연살해세포를 배양한 후에 각각의 세포사멸정도를 아넥신V 결합 분석법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은, 본 발명에 따른 배양법 1 내지 4 각각에 따라 자연살해세포를 배양한 후에 각각의 세포에서 IFN-γ의 분비량을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법은, 사람의 혈액으로부터 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계와, 상기 분리된 림프구를 제1 배양액에 현탁시킨 세포현탁액을 제1 플라스크에서 1차 배양하는 제2 단계와, 상기 제2 단계의 상기 세포현탁액에 제2 배양액을 투입하여 제2 플라스크에서 2차 배양하는 제3 단계와, 상기 제3 단계의 상기 세포현탁액에 제3 배양액을 투입하여 제3 플라스크에서 3차 배양하는 제4 단계와, 상기 제4 단계 이후에 상기 세포현탁액에 제4 배양액을 투입하여 자연살해세포를 대량 증식하는 제5 단계를 포함하여 달성된다. 여기서, 상기 제1 배양액 내지 상기 제4 배양액은, 혈장; 항-CD56, 항-CD16 및 항-NKp46 중에서 선택된 1종 이상의 항체; 인터루킨-12, 인터루킨-2, 인터루킨-18, 인터루킨-15, 인터루킨-21, SCF, FL 및 GM-CSF 중에서 선택된 1종 이상의 사이토카인을 포함한다. 아울러, 상기 제1 내지 제3 배양액의 함량은, 세포수 대비 세포현탁액의 총량으로 정의되는 세포연관팩터가 25 ~ 100 [×10-8](㎖/세포수)의 범위가 되도록 투입되는 것을 특징으로 한다.
나아가, 상기 제2 플라스크의 배양면적은 상기 제1 플라스크의 배양면적보다 크고, 상기 제3 플라스크의 배양면적은 상기 제2 플라스크의 배양면적보다 큰 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2 단계에서의 배양일은 1 ~ 2일이고, 상기 제3 단계에서의 배양일은 2 ~ 3일이며, 상기 제4 단계에서의 배양일은 2 ~ 3일인 것이 바람직하다.
아울러, 상기 제1 배양액 또는 제2 배양액은 폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 더 포함할 수 있고, 상기 제3 배양액은 진세노사이드 GRg1을 더 포함할 수 있다.
본 발명은, 상술한 자연살해세포의 대량증식방법에 따라 배양된 자연살해세포를 유효활성성분으로 포함하는 암예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 사람의 혈액으로부터 채취 및 분리한 림프구를 이용하여 자연살해세포를 증식하기 위한 자연살해세포 배양용 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은, 혈장; 항-CD56 항체, 항-CD16 항체 및 항-NKp46 항체 중에서 선택된 적어도 1종의 항체; 및 인터루킨-2, 인터루킨-12, 인터루킨-15, 인터루킨-18, 인터루킨-21, SCF, FL 및 GM-CSF 중에서 선택된 적어도 1종의 사이토카인;을 포함할 수 있다.
나아가, 상기 조성물은, 폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 더 포함하는 것이 바람직하고, 또한 진세노사이드 GRg1을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 발명자는, 상술한 목적을 달성하기 위하여 자연살해세포 활성화 및 대량 배양하는 과정 중 세포 간 상호 작용이 원활하게 하여 빠른 시간 내에 활성화를 유도하여 더 많은 수의 자연살해세포를 획득하고자 연구하였으며, 다수의 자연살해세포의 활성화와 관련된 시약들을 이용하여 체외 자연살해세포의 암세포 살상능은 유지하면서 자연살해세포의 배양효율을 높일 수 있는 본 발명을 완성하였다. 아울러, 자연살해세포가 다양한 사이토카인과 항체로 활성화된 연구 결과가 보고되고 있으나, NK 세포의 증식에 도움이 되는 천연물질에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다. 이에, 본 발명자는 기존의 사이토카인과 항체 이외에 천연물 중에서 NK 세포 증식에 도움에 되는 물질을 찾고자 하였다. 자연살해 세포의 활성화에는 위와 같은 시약(reagent) 이외에도 세포간 상호작용이 매우 중요하다. 세포 간 상호 작용은 개체 발생 초기에는 세포의 분화와 운명 결정에 관여하고, 성체에서는 면역, 성장,　항상성 등 개체의 유지에 중요한 역할을 담당한다.　
NK 세포를 항암 등 면역세포 치료에 이용하기 위해서는 많은 수의 활성화 된 NK 세포가 요구된다. 하지만, 체외에서 면역세포를 다량 증식시키기 어렵다. 따라서, 자연살해세포 배양 기술에서는 자연살해세포의 활성화가 중요하다. 활성화가 되어야 정상적인 증식이 가능하며, 활성화되지 못한 자연살해세포는 배양 시에 세포자멸사(apoptosis)된다고 보고되어 있다. NK 세포는 체외에서 오랜 기간 동안 활성을 유지하지 못한다. 과도하게 대량증식 하다 보면 자연스레 세포노화나 세포사에 빠지게 된다. 이러한 세포노화나 세포사는 활성산소로 인해 야기 될 수 있다. 따라서 자연살해세포의 대량확보를 위한 NK 세포의 세포사를 억제하는 방법이 절실히 요구된다.
본 발명의 발명자는 자연살해세포의 대량증식에 대하여 연구를 거듭한 결과, 활성화에 해당 단계가 아닌, 대량증식이 시작되는 단계에서 진세노사이드 GRg1이 첨가된 배양액으로 배양하면, 체외에서 대량증식에 영향을 미치는 세포사를 억제하여 대량증식이 가능함을 알게 되었다. 진세노사이드 GRg1은 활성산소의 세포사멸 효과를 억제할 뿐만 아니라, 활성산소가 세포 수와 세포 생존에 해로운 영향을 미치는 것을 억제할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 발명자는, PBMC 체외 배양 시 자연살해세포의 활성도와 대량증식에 대하여 연구한 결과, 폴리감마글루탐산이 첨가된 배양액에서 배양한 자연살해세포의 IFN-γ(사이토카인)의 분비가 증가하였음을 확인하였다.
이하에서는, 다양한 실시예를 통하여, 본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법에 대해 상세히 설명한다. 참고로, 이하에서는 본 발명의 특징적 기술구성이 분명하게 이해되도록 실시예 A에 대비하여 비교예 B를 예시하였으나, 비교예 B에 해당하는 기술구성이 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 공지기술임을 인정하는 것으로 이해되어서는 아니될 것이다.
[1. NK 세포의 제조 및 배양]
[ 제1 단계 : 말초혈액 단핵구로부터 NK 세포의 제조]
사람의 말초혈액을 헤파린 처리된 10㎖ 진공채혈관(BD Vacutainer TM)을 이용하여 30㎖ ~ 60㎖ 채혈한다. 이후에 50㎖ 림프구 분리튜브(Leuco sep, Greiner Bio-One, Swiss)에 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus; endotoxin tested, 밀도 1.077g/㎖, GE Healthcare, USA) 용액을 15㎖ 넣고, 2000rpm에서 원심분리하여 용액을 튜브 내의 글래스 멤브레인(glass membrane)의 아래로 침강되게 한다. 채혈한 혈액을 분리튜브에 옮기고 2500rpm에서 원심분리하여 적혈구와 과립구층은 아래로, 그리고 단핵구층과 혈소판 등은 위로 나뉘게 하여, 혈액성분을 분리한다.
원심분리 후 나뉘어진 상층의 혈장을 56℃ 수조에서 30분간 불활성화(inactivation)시킨다. 원심분리 후 나뉘어진 림프구층은 멸균된 피펫을 이용하여 채취한 후 15㎖ 튜브(tube)에 모은다. 채취한 림프구가 있는 15㎖ 튜브(tube)를 원심분리한 후 상층액을 제거한다. 상층액이 제거된 림프구에 완충용액(PBS) 10㎖을 넣고 현탁시켜 세포를 세정(washing)한다. 현탁액의 일부를 혈구계산판(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고, 다시 원심분리하여 림프구만을 모은다. 이때, 수확된 림프구의 세포수는 총 20×106 개로 측정되었고, 이를 아래 실시예 A 및 비교예 B에 따라 각각 배양한다.
[ 제2 단계 : NK세포의 배양]
위에서 수확한 림프구를 표 1과 같이 배양 시기 및 배양액의 양을 달리하여 각각 실시예 A 및 비교예 B에 따라 배양한다. 여기서, 실시예 A는 말초혈액에서 분리한 단핵구(PBMC)를 T25 플라스크에서 시작하여 총 3단계를 거쳐 배양하고, 비교예 B은 말초혈액에서 분리한 단핵구(PBMC)를 T75 플라스크에서 시작하여 총 2단계를 거쳐 배양한다.
배양단계 실시예 A 비교예 B
1차 배양(1~2일) T25 플라스크(5 ~ 10㎖) T75 플라스크(20 ~ 30㎖)
2차 배양(2~3일) T75 플라스크(20 ~ 30㎖) T175 플라스크(60 ~ 70㎖)
3차 배양(2~3일) T175 플라스크(60 ~ 70㎖) T175 플라스크(60 ~ 70㎖)
[제2-1 단계: NK세포의 1차 배양]
[실시예 A] 제1 단계에서 준비된 림프구를 취하여, T25 플라스크(SPL Life Sciences)에 배양액 및 혈장 1 ~ 2㎖를 넣고, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 1~2일간 배양한다. 아울러, 자연살해세포의 세포 표면에 존재하는 활성화 수용체와의 반응을 유도하기 위해, 항-CD56(#555513, BD), 항-CD16(#555403, BD) 및 항-NKp46(#MAB1850, R&D)에서 선택된 1종 이상의 항체 0.02 ~ 0.03㎖와, 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨- 21(IL-21), SCF(stem cell factor), FL(Fit ligand) 및 GM-CSF(자가유래 과립세포-대식세포 집락자극인자; granulocyte/macrophage colony-stimulation factor)에서 선택된 1종 이상의 사이토카인(Peprotech)을 추가로 투여한다. 즉, 세포수 총 20×106 개로 측정된 림프구를, 상술한 혈장, 항체 및 사이토카인을 포함하는 5 ~ 10㎖의 KBM502 배지에 첨가하여, CO2 인큐베이터에서 1 ~ 2일간 배양한다. 바람직하게 상기 배양에 첨가하는 조성물은 배양 0일차에 넣는다. 아울러, 배양되는 세포는 높이 0.4cm 및 배양면적(growth area) 25cm2 에서 배양된다.
[비교예 B] 위 실시예 A와 모든 절차는 동일하되, 혈장, 항체 및 사이토카인을 포함하는 조성물이 투입된 KBM502 배지 20 ~ 30㎖ 에 세포수 총 20×106 개로 측정된 림프구를 첨가하여, T75 플라스크에서 1 ~ 2일간 배양한다. 이때, 상기 배양되는 세포는 높이 0.4cm 및 면적(growth area) 75cm2 에서 배양된다.
[제2-2 단계: NK 세포의 2차 배양]
[실시예 A] 제2-1 단계에서 1차 배양 후, 배양기에서 세포가 배양되고 있는 T25 플라스크를 꺼내서 세포를 모은 후 T75 플라스크로 옮긴다. 아울러, 추가적으로 자가혈장 2 ~ 3㎖와, 항-CD56(#555513, BD), 항-CD16(#555403, BD) 및 항-NKp46(#MAB1850, R&D)에서 선택된 1종 이상의 항체 0.02 ~ 0.03㎖와, 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨- 21(IL-21), SCF(stem cell factor), FL(Fit ligand) 및 GM-CSF에서 선택된 1종 이상의 사이토카인(Peprotech)을 포함하는 KBM502 배지 15 ~ 20㎖를 추가로 T75 플라스크에 투입하여, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 2 ~ 3일간 배양한다. 즉, 2차 배양에서 사용된 세포현탁액은 총 20 ~ 30㎖가 되도록 한다. 아울러, 바람직하게 상기 배양에 첨가하는 조성물은 배양 3일차에 넣는다. 배양되는 세포는 높이 0.4cm 및 면적(growth area) 75cm2 에서 배양된다.
[비교예 B] 위 실시예 A와 모든 절차는 동일하되, T75 플라스크를 꺼내서 세포를 모은 후 T175 플라스크로 옮긴다. T175 플라스크에 혈장, 항체 및 사이토카인을 포함하는 조성물이 함유된 40㎖ KBM502 배지를 추가로 투입하여, 2 ~ 3일간 배양한다. 바람직하게 상기 배양에 첨가하는 조성물은 배양 3일차에 넣는다. 배양되는 세포는 높이 0.4cm 및 면적(growth area) 175cm2 에서 배양된다.
[제2-3 단계: NK 세포의 3차 배양]
[실시예 A] 제2-2 단계에서 2차 배양 후 배양기에서 세포가 배양되고 있는 T75 플라스크를 꺼내서 세포를 모은 후 T175 플라스크로 옮긴다. 자가혈장 3 ~ 4㎖와, 항-CD56(#555513, BD), 항-CD16(#555403, BD) 및 항-NKp46(#MAB1850, R&D)에서 선택된 1종 이상의 항체 0.02 ~ 0.03㎖와, 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-21(IL-21), SCF(stem cell factor), FL(Fit ligand) 및 GM-CSF에서 선택된 1종 이상의 사이토카인(Peprotech)을 함유한 40㎖ KBM502 배지를 T175 플라스크에 추가로 투입하여, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 2 ~ 3일간 배양한다. 바람직하게 상기 배양에 사용되는 조성물은 배양 5일차에 넣는다. 배양되는 세포는 높이 0.4cm 및 면적(growth area) 175cm2 에서 배양된다.
[비교예 B] 제2-2 단계와 동일하게 배양된다. 배양되는 세포는 높이 0.4cm 및 면적(growth area) 175cm2 에서 배양된다.
[2. 배양된 NK 세포의 증식 및 활성화의 확인]
실시예 A 및 비교예 B 각각에 따라 총 7일간 배양된 세포에 대하여 NK 세포의 증식 및 활성화를 확인하였다.
[2-1. 배양된 세포의 총 세포 수]
실시예 A 및 비교예 B에서 각각 7일간 배양된 세포를 모두 수거한 후, 2000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 인산완충식염수에 부유시켰다. 세포 부유액에서 10㎕를 취하여 인산완충식염수로 희석한 다음, 희석액 10㎕를 취하여 트리판블루 10㎕와 섞은 후, 혈구계산판(hemocytometer)에 올려놓고 세포수 및 생존율을 측정하였다. 세포수는 [(생 세포수 + 죽은 세포수)×1/4×2×희석배수×총 부피×104]의 수식으로 구했다.
그 결과, 도 1(실시예 A의 세포 수를 나타난 그래프) 및 도 2(비교예 B의 세포 수를 나타낸 그래프)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 A의 경우가 비교예 B의 경우보다 1.75 배 이상의 NK 세포의 증식 효과가 있음을 확인하였다. 여기서, 7일 배양한 NK 세포 수는 1L 배양백에 들어가기 전에 대량증식에 있어서 매우 중요한 요소이다.
실시예 A에 따라 배양된 경우, 세포현탁액 내에 존재하는 각 세포들간의 상호작용이 원활하게 유도될 수 있는 적절한 세포들 사이의 거리로 유지될 수 있도록 배지의 양이 제어되어 세포 활성화가 극대화되었기 때문이다. 즉, 세포연관팩터(Cell Relation Factor; CRF)는, 세포현탁액에 존재하는 세포수 대비 세포현탁액 총량(배지 및 조성물 포함)으로 정의될 수 있는데, 실시예 A에서는 제1차 내지 제3차의 각 배양단계에서 CRF의 값이 25 이상 ~ 100 미만 [×10-8](㎖/세포수)의 범위가 되도록 세포현탁액의 총량이 제어되었으며, 각 단계에서의 CRF 값은 다음과 같다. 여기서, 표 2의 세포수는 각 배양 단계 직전의 세포수를 의미한다. 참고로, 비교예 B에서는 각 배양단계별 세포연관팩터가 100[×10-8](㎖/세포수) 이상이며, 이는 비교예 B의 경우 각 배양단계에서 세포간 거리가 지나치게 크기 때문에 세포간 상호작용이 원활하게 이루어지지 못함을 의미한다.
배양단계 세포현탁액 함량(㎖) 세포수(×106) CRF([×10-8](㎖/세포수)
1차 5 ~ 10 20 25 ~ 50
2차 20 ~ 30 50 40 ~ 60
3차 60 ~ 70 80 75 ~ 88
아울러, 실시예 A에서는 배양을 총 3단계로 나누어 진행하였는데, 이는 세포배양에서 세포활성화 및 증식이 진행되는 동안 세포연관팩터가 적절한 범위로 유지될 수 있도록 하기 위함이다. 이에 반해, 비교예 B에서는 세포연관팩터에 대해 전혀 고려하지 않은 상태로 배양되었기 때문에, 세포 활성화가 충분히 유도되지 못하여 총 배양된 세포수가 적음을 알 수 있다.
[2.2. 배양된 세포의 활성 확인]
실시예 A 및 비교예 B에서 배양된 세포를 모두 수거한 후, 2000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액 1㎖를 새로운 튜브로 옮겼다. NK세포의 활성은 IFN-γELISA 키트(PBL Assay Science, Piscataway, NJ)를 이용하여 IFN-γ 분비량으로 확인하였다.
도 3은 말초혈액 단핵구(PBMC)에서 자연살해세포의 살상능 변화를 확인하기 위하여 배양 7일차에서 IFN-γ의 분비를 확인한 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 실시예 A(도 3의 A)에서 배양한 세포의 경우가 비교예 B(도 3의 B)에서 배양한 세포의 경우보다, IFN-γ(사이토카인)의 분비량이 15 ~ 20%정도 증가함을 알 수 있었다.
[3. 배양액을 달리하여 배양한 NK 세포의 배양]
자연살해세포를 배양할 때 세포 활성화와 증식이 중요하게 작용하는데, 세포 활성화 및 증식에 도움이 되는 물질을 배양액에 첨가해 A, B, C 배양액에 따라 세포배양을 제1 배양에서 제4 배양까지 진행하였다.
배양단계 배양법 1 배양법 2 배양법 3 배양법 4
1차 배양(T25) 배양액 A 배양액 B 배양액 A 배양액 B
2차 배양(T75) 배양액 A 배양액 B 배양액 A 배양액 B
3차 배양(T175) 배양액 A 배양액 A 배양액 C 배양액 C
4차 배양(1L 백) 배양액 A 배양액 A 배양액 A 배양액 A
여기서, 배양액 A는 실시예 A에서 각 배양 단계별로 사용된 배지 및 조성물(혈장, 항체 및 사이토카인 포함)을 포함하는 배양액을 말하고, 배양액 B는 배양액 A에 폴리감마글루탐산(Poly Gamma Glutamic Acid; γ-PGA)이 0.001 ~ 0.010%의 농도(바람직하게는 0.005%)로 첨가된 것을 말하고, 배양액 C는 배양액 A에 진세노사이드 GRg1이 1 ~ 20μM의 농도(바람직하게는 10μM)로 첨가된 것을 말한다.
[3.1. 배양법 1에 따른 NK 세포의 배양]
실시예 A와 모든 절차는 동일하게 수행한다.
[3.2. 배양법 2에 따른 NK 세포의 배양]
배양법 1의 경우와 모든 절차를 동일하게 수행하되, 제1차 및 제2차 배양에서 γ-PGA이 첨가된 KBM502 배지(배양액 B)를 사용하는 것만 달리하여 배양한다.
[3.3. 배양법 3에 따른 NK 세포의 배양]
배양법 1의 경우와 모든 절차를 동일하게 수행하되, 제3차 배양시 GRg-1이 첨가된 KBM502 배지(배양액 C)를 사용하는 것만 달리하여 배양한다.
[3.4. 배양법 4에 따른 NK 세포의 배양]
배양법 1의 경우와 모든 절차를 동일하게 수행하되, 제1차 및 제2차 배양에서는 γ-PGA이 첨가된 KBM502 배지(배양액 B)를 사용하고, 제3차 배양에서는 GRg-1이 첨가된 KBM502 배지(배양액 C)를 사용하는 것만 달리하여 배양한다.
[3.5. NK 세포의 다량증식]
배양법 1 내지 4 모두, 각각의 3차 배양 후에, T-175 플라스크에서 배양 중인 세포를 모아서 1000mL 용량의 가스투과성 백에 들어있는 배양액에 옮긴 후 6 ~ 7일간 더 배양하여 세포를 다량 증식시킨다.
[4. 배양액을 달리 배양한 NK 세포의 증식, 세포사멸 정도 및 활성화 확인]
[4.1. 배양액에 따른 세포의 총 세포 수 확인]
배양법 1 내지 4 각각에 따라 배양된 4가지 군의 세포를 모두 수거한 후, 1500rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 인산완충식염수에 부유시켰다. 세포 부유액에서 10㎕를 취하여 인산완충식염수로 희석한 다음, 희석액 10㎕를 취하여 트리판블루 10㎕와 섞은 후, 혈구계산판(hemocytometer)에 올려놓고 세포수 및 생존율을 측정하였다. 세포수는 [(생 세포수 + 죽은 세포수)×1/4×2×희석배수×총 부피×104]의 수식으로 구했고, 세포 생존율은 생 세포수÷(생 세포수 + 죽은 세포수)×100의 수식으로 구했다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4는 말초혈액 단핵구(PBMC)에서 배양액을 달리한 각 배양법 1 내지 4에 따른 자연살해세포의 세포 수 변화를 배양 14일 차에 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 3차 배양시에 GRg-1이 첨가된 배양액(배양액 C)에서 배양한 자연살해세포의 최종 세포수가 높아지는 것을 확인할 수 있다.
[4.2. 배양액에 따른 세포 배양의 생존율 및 세포 사멸 정도 확인]
배양법 1 내지 4에 따라 배양된 4가지 군의 세포를 1 x 106 cells/ml 수거하였다. 세포사멸 분석을 위해, 아넥신V 결합 분석을 수행하였다. 아넥신V는 세포 멤브레인에 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS)을 나타내는 세포와 결합하고, 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide, PI)는 손상된 세포막을 가진 세포 DNA를 염색한다. 배양법 1 내지 4에 따라 배양된 4가지 군의 자연살해세포를 배양 후에 각각의 세포를 차가운 인산염완충용액(PBS)로 두 번 세척하고, 500㎕ 결합버퍼에서 재현탁한다. 그 다음 각 샘플마다 아넥신 V-FITC 1.25㎕을 추가하고, 빛이 없는 곳에서 15분 배양한 후, PI 10㎕를 혼합물에 추가하고, 형광활성화세포분류기(fluorescence activated cell sorter; BD Biosciences, USA)에서 세포를 분석하였다. PI에 염색되지 않고 형광에만 양성인 세포를 사멸세포로 간주하였다.
FITC-표지된 아넥신V 세포 염색을 통한 세포사멸 분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 공통으로 3차 배양 단계에서 배양액 C를 이용하여 배양한 자연살해세포에서 사멸세포가 적어짐을 확인하였다. 즉, 대량증식으로 인해 유발된 세포사멸은 GRg-1이 첨가된 배양액에 의해 억제되는 것으로 나타났다.
[5.3. 배양액에 따른 자연살해세포 활성 확인]
배양법 1 내지 4에 따라 배양된 각각의 세포를 모두 수거한 후, 1500rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액 1㎖를 새로운 튜브로 옮겼다. NK세포의 활성은 IFN-gamma ELISA 키트(PBL Assay Science, Piscataway, NJ)를 이용하여 IFN-γ 분비량으로 확인하였다.
도 6에서 보듯이, 1차 배양 및 2차 배양에서 폴리감마글루탐산이 첨가된 배양액 B를 이용하여 배양한 자연살해세포의 IFN-γ(사이토카인)의 분비량이 증가함을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 배양단계를 세포활성도에 따라 단계를 구분하여 각 배양단계에서 세포연관팩터가 최적인 상태가 되도록 함으로써, 세포간 상호작용을 최적화하여 자연살해세포의 활성화 및 증식을 향상시킬 수 있다. 그 결과, 7일차에서 높은 활성과 많은 수의 세포를 얻을 수 있다. 아울러, 본 발명에 따르면, 초기 배양단계에서 폴리감마글루탐산의 추가로 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ)를 유도하여 자연살해세포의 활성을 더욱 촉진시키고, 대량 배양 단계에서 GRg-1을 첨가하여 활성산소를 줄여 기존의 배양방법보다 더 많은 수의 NK세포를 수확할 수 있다. 따라서, 본 발명은 감염 및 종양세포에 대하여 우수한 살상능을 지닌 자연살해세포를 다량 회수할 수 있는 배양방법을 제공한다.

Claims (10)

  1. 사람의 혈액으로부터 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계와,
    상기 분리된 림프구를 제1 배양액에 현탁시킨 세포현탁액을 제1 플라스크에서 1차 배양하는 제2 단계와,
    상기 제2 단계의 상기 세포현탁액에 제2 배양액을 투입하여 제2 플라스크에서 2차 배양하는 제3 단계와,
    상기 제3 단계의 상기 세포현탁액에 제3 배양액을 투입하여 제3 플라스크에서 3차 배양하는 제4 단계와,
    상기 제4 단계 이후에 상기 세포현탁액에 제4 배양액을 투입하여 자연살해세포를 대량 증식하는 제5 단계를 포함하고,
    상기 제1 내지 제3 배양액의 함량은, 세포수 대비 세포현탁액의 총량으로 정의되는 세포연관팩터가 25 이상 ~ 100 미만 [×10-8](㎖/세포수)의 범위가 되도록 투입되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 배양액 내지 상기 제4 배양액은, 혈장; 항-CD56, 항-CD16 및 항-NKp46 중에서 선택된 1종 이상의 항체; 인터루킨-12, 인터루킨-2, 인터루킨-18, 인터루킨-15, 인터루킨-21, SCF, FL 및 GM-CSF 중에서 선택된 1종 이상의 사이토카인;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2 플라스크의 배양면적은 상기 제1 플라스크의 배양면적보다 크고, 상기 제3 플라스크의 배양면적은 상기 제2 플라스크의 배양면적보다 큰 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2 단계에서의 배양일은 1 ~ 2일이고, 상기 제3 단계에서의 배양일은 2 ~ 3일이며, 상기 제4 단계에서의 배양일은 2 ~ 3일인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 배양액 또는 제2 배양액은 폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 제3 배양액은 진세노사이드 GRg1을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 배양된 자연살해세포를 유효활성성분으로 포함하는 암예방 및 치료용 조성물.
  8. 사람의 혈액으로부터 채취 및 분리한 림프구를 이용하여 자연살해세포를 증식하기 위한 자연살해세포 배양용 조성물로서,
    혈장;
    항-CD56 항체, 항-CD16 항체 및 항-NKp46 항체 중에서 선택된 적어도 1종의 항체; 및
    인터루킨-2, 인터루킨-12, 인터루킨-15, 인터루킨-18, 인터루킨-21, SCF, FL 및 GM-CSF 중에서 선택된 적어도 1종의 사이토카인;
    을 포함하는, 자연살해세포 배양용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    폴리감마글루탐산(γ-PGA)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양용 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    진세노사이드 GRg1을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양용 조성물.
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