ES2540108T3 - Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga - Google Patents

Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga Download PDF

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Abstract

Método para detectar cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende: detectar la acumulación de un péptido o proteína marcadora de tumor de vejiga urinario o un ácido nucleico que codifica dicha proteína o péptido ("UBTM") en orina, dicha acumulación en dicho sujeto siendo superior a aproximadamente 1.2 veces la acumulación de dicho UBTM en la orina de un grupo de sujetos normales que no tienen cáncer de vejiga maligno, caracterizado porque el UBTM es la proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP5).

Description

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durante un tiempo dado. Como alternativa, la concentración del marcador puede ser corregida según el número total de células en la muestra de orina, y en otras formas de realización puede ser corregida según las proteínas totales presentes en la orina. Por otro lado, un aumento en la producción de la orina puede diluir un marcador tumoral, y por lo tanto tiende a enmascarar la presencia del cáncer de vejiga. Dichas situaciones pueden estar asociadas con un aumento en la ingesta de agua, una disminución en la ingesta de sal, un aumento en el uso de diuréticos o la supresión en la producción o en la actividad de la hormona antidiurética.
En algunas formas de realización se puede medir la función renal mediante el uso de métodos conocidos en la materia. Estos incluyen, a modo de ejemplo, la medición del aclaramiento de creatinina. Sin embargo, puede apreciarse que existen muchos métodos adecuados para la medición de la función renal. En las afecciones en las que se encuentra una función renal anormal, puede ajustarse la acumulación medida de un marcador mediante el uso de las correcciones apropiadas. Por lo tanto, el cáncer de vejiga puede ser diagnosticado de forma más precisa.
Los marcadores del cáncer pueden ser detectados en una muestra mediante el uso de cualquier técnica adecuada, y puede incluir, pero no se limita a, sondas oligonucleotídicas, una qPCR o anticuerpos creados contra los marcadores del cáncer.
Se apreciará que la muestra que va a ser ensayada no está restringida a una muestra del tejido sospechoso de ser un tumor. El marcador puede ser secretado en el suero, descamado de las membranas celulares o estar asociado con células perdidas en la orina. Por lo tanto, una muestra puede incluir cualquier muestra corporal, e incluye sangre, suero, lavados peritoneales, líquido cefalorraquídeo, muestras de orina y de heces. En los métodos de la invención según se definen en las reivindicaciones anexas, la muestra ensayada es una muestra de orina.
La detección de un marcador de cáncer en una muestra será indicativa de la presencia de un tumor en ese sujeto. Sin embargo, se apreciará que mediante el análisis de la presencia y de las cantidades de expresión de una pluralidad de marcadores de cáncer, la sensibilidad del diagnóstico aumentará y disminuirá la frecuencia de resultados falsos positivos y/o falsos negativos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, para aumentar tanto la detección como el diagnóstico precoz del cáncer pueden usarse múltiples marcadores.
Metodologías generales para la detección del cáncer
Las siguientes metodologías son métodos no limitantes que pueden usarse para la detección del cáncer, incluyendo el cáncer de vejiga, mediante el uso de miembros de la familia de BTM o de UBTM.
Métodos de hibridación que usan sondas de ácidos nucleicos selectivas para un marcador
Estos métodos implican la unión de la sonda de ácido nucleico a un soporte y la hibridación, en condiciones apropiadas, con un ARN o con un ADNc derivado de la muestra de prueba (Sambrook, J., E Fritsch, E. y T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). Estos métodos pueden ser aplicados a un BTM o a un UBTM según sea apropiado, derivado de un tejido tumoral o de una muestra de fluido. Las preparaciones de ARN o de ADNc normalmente se marcan con una molécula fluorescente o radiactiva para permitir la detección y la cuantificación. En algunas aplicaciones, el ADN hibridante puede ser marcado con una estructura de marcaje ramificada fluorescente para mejorar la intensidad de la señal (Nolte, F. S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of acid nucleic sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201 -35 (1998)). El marcaje no hibridado se elimina mediante un lavado intensivo con soluciones bajas en sal tales como 0,1 x SSC, 0,5 % de SDS antes de cuantificar la cantidad de hibridación mediante una detección por fluorescencia o una densitometría de las imágenes del gel. Los soportes pueden ser sólidos, tales como membranas de nailon o de nitrocelulosa, o consistir en microesferas que se hibridan cuando están en una suspensión líquida. Para permitir el lavado y la purificación, las microesferas pueden ser magnéticas (Haukanes, B-I y Kvam, C., Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60 -63 (1993)) o estar marcadas con fluorescencia para permitir una citometría de flujo (véase, por ejemplo: Spiro, A., Lowe, M. y Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258 -4265 (2000)).
Una variación de la tecnología de hibridación es el ensayo QuantiGene Pl ex® (Genospectra, Fremont) que combina un soporte con microesferas fluorescentes con una amplificación de la señal del ADN ramificado. Otra variación más de la tecnología de hibridación es el ensayo Quantikine® mRNA (R&D Systems, Minneapolis). La metodología es según se describe en las instrucciones del fabricante. En resumen, el ensayo usa sondas de hibridación oligonucleotídicas conjugadas con Digoxigenina. La hibridación se detecta mediante el uso de anticuerpos anti-Digoxigenina acoplados a fosfatasa alcalina en ensayos colorimétricos.
Otros métodos adicionales son bien conocidos en la materia y no necesitan describirse adicionalmente en el presente documento.
PCR cuantitativa (qPCR)
La PCR cuantitativa (qPCR) puede llevarse a cabo en muestras tumorales, en muestras de suero, de plasma y de orina, mediante el uso de cebadores y de sondas específicos para los BTM. En unas reacciones controladas, la
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cerebro, y para la inmunodetección de miembros de la familia del marcador en la orina y en las heces de pacientes con cáncer de vejiga.
Los BTM y los UBTM también pueden ser detectados en los tejidos o en la orina mediante el uso de otras técnicas de inmunodetección habituales tales como la inmunotransferencia o la inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). En la inmunotransferencia preparaciones de proteínas procedentes de tejidos o de fluidos que contienen el BTM / UBTM se someten a electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes o no desnaturalizantes. Después, las proteínas se transfieren a un soporte de membrana tal como de nailon. Después el BTM / UBTM se hace reaccionar directa o indirectamente con anticuerpos monoclonales o policlonales según se describió para la inmunohistoquímica. Como alternativa, en algunas preparaciones, las proteínas pueden ser manchadas directamente sobre las membranas sin una separación electroforética previa. La señal puede ser cuantificada mediante una densitometría.
En la inmunoprecipitación se incuba una preparación soluble que contiene el BTM o el UBTM con un anticuerpo monoclonal o policlonal contra el BTM / UBTM. La reacción se incuba entonces con microesferas inertes hechas de agarosa o de poliacrilamida con proteína A o proteína G unida covalentemente. Las microesferas de proteína A o G interactúan específicamente con los anticuerpos que forman un complejo inmovilizado de anticuerpo-BTM / UBTMantígeno unido a la microesfera. Después de un lavado, el BTM / UBTM unido puede ser detectado y cuantificado mediante una inmunotransferencia o un ELISA.
Análisis de los datos de la matriz o de la qPCR mediante el uso de ordenadores
Se recogen los datos primarios y el análisis del nº de veces de cambio se realiza mediante la comparación de los niveles de expresión génica del tumor de vejiga con la expresión de los mismos genes en tejido no tumoral. Se proporciona un umbral para concluir que la expresión está aumentada (por ejemplo, un aumento de 1,5 x, un aumento de 2 veces, y en formas de realización alternativas, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o un aumento de 5 veces). Puede apreciarse que pueden elegirse otros umbrales para concluir que se ha producido un aumento en la expresión sin desviarse del ámbito de esta invención. Un análisis adicional de la expresión génica del tumor incluye el emparejamiento de aquellos genes que muestran un aumento en la expresión con los perfiles de expresión de tumores de vejiga conocidos, para proporcionar un diagnóstico de los tumores.
Uso de BTM y de UBTM para monitorizar la progresión de las terapias del TCC
Además de un diagnóstico rápido y una detección precoz del TCC, los marcadores BTM y UBTM detectados en tejido, suero u orina pueden usarse para monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia. En estas aplicaciones pueden tomarse muestras de orina y/o de suero a unos intervalos después del inicio de la quimioterapia, de la radioterapia o de la inmunoterapia sistémica, intravesical o intravascular. Un descenso en la acumulación del marcador puede indicar una reducción en el tamaño del tumor, indicativa de un tratamiento eficaz. La tasa de descenso puede usarse para predecir las dosis terapéuticas óptimas para cada paciente o tratamiento.
Los marcadores evaluados se eligen de entre genes humanos conocidos. Los genes evaluados están indicados en las Figuras 3 y 4. En las Figuras 3 y 4 están incluidos en nombre del gen, el identificador HUGO, el número del oligo MWG, el número de la secuencia de referencia del ARNm NCBI y el número de referencia de la proteína. Las secuencias completas pueden encontrarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/.
Los marcadores identificados como útiles para el diagnóstico y la evaluación del cáncer de vejiga están identificados en la Figura 2 y en la Lista de Secuencias anexa a esta solicitud.
Aspectos de la invención
Por lo tanto, en ciertos aspectos, esta invención incluye métodos para la detección del cáncer de vejiga, que comprenden la detección de la acumulación de un miembro de la familia de UBTM en la orina según se define en las reivindicaciones anexas.
En otros aspectos, el miembro de la familia de UBTM no está asociado a la sangre en un grado sustancial.
En algunos aspectos adicionales, el UBTM se elige de entre el grupo mostrado en las Figuras 3 o 4.
Adicionalmente, en ciertos aspectos, la etapa de detección se realiza mediante la detección de la acumulación del ARNm del BTM o del UBTM.
En algunos aspectos, la etapa de detección se realiza mediante el uso de una micromatriz.
En otros aspectos, la etapa de detección se realiza mediante el uso de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o métodos de hibridación.
En algunos aspectos adicionales, la etapa de detección se realiza mediante la detección de la acumulación de una proteína del UBTM.
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vejiga invasivo en fase 2 -3.
En algunos aspectos adicionales más, esta divulgación incluye métodos para la determinación de la eficacia de la terapia para el cáncer de vejiga, que comprenden la comparación de la presencia de uno o más marcadores elegidos de las Figuras 3 o 4 en una primera muestra de un paciente, con la presencia de uno o más marcadores elegidos de las Figuras 3 o 4 en una segunda muestra de un paciente después de un periodo de tratamiento.
Según se describe en el presente documento, la detección de los tumores puede llevarse a cabo mediante la medición de la expresión de uno o más marcadores tumorales. Inesperadamente se ha averiguado que la asociación entre un aumento en la expresión de cualquiera de una pluralidad de BTM o de UBTM y la presencia de un cáncer de vejiga diagnosticado es extremadamente alta. La mínima asociación significativa detectada tenía un valor de p de aproximadamente 0,018. Muchas de las asociaciones eran significativas a unos valores de p de menos de 10-10. Con dicha elevada significación, puede no ser necesario detectar un aumento en la expresión o en la acumulación en más de un BTM o UBTM. Sin embargo, la redundancia en los BTM de esta invención puede permitir la detección de los cánceres de vejiga con una fiabilidad aumentada.
Los métodos proporcionados en el presente documento también incluyen ensayos de alta sensibilidad. La qPCR es extremadamente sensible y puede usarse para detectar los productos génicos en un número de copias muy bajo (por ejemplo, 1 -100) en una muestra. Con dicha sensibilidad se posibilita una detección muy precoz de los acontecimientos que están asociados con el cáncer de vejiga.
Métodos
Recolección de los tumores
Las muestras de tumores de vejiga y de urotelio no maligno se recogieron a partir de especímenes quirúrgicos extirpados en el Kyoto University Hospital, Japón, y en otros hospitales japoneses colaboradores.
Recolección de la orina
Las muestras de orina de los controles no malignos y de los pacientes con cáncer de vejiga se obtuvieron en el Kyoto University Hospital, Japón (Fig. 1). Las muestras de los controles sanos se obtuvieron a partir de voluntarios caucásicos y japoneses.
Extracción del ARN
Los tejidos tumorales se homogenizaron en una mezcla TriReagent:agua (3:1), después se extrajeron con cloroformo. El ARN total se purificó entonces a partir de la fase acuosa mediante el uso del procedimiento RNeasy™ (Qiagen). También se extrajo el ARN de 16 líneas celulares oncológicas y se agrupó para que sirviera como ARN de referencia.
Se extrajo el ARN de la orina mezclando la muestra de orina con un volumen igual de tampón de lisis (guanidina-HCl 5,64 M, sarcosilo al 0,5 %, acetato de sodio 50 mM (pH 6,5) y β-mercaptoetanol 1 mM; el pH se ajustó a 7,0 con Hepes 1,5 M a pH 8). Después se extrajo el ARN total mediante el uso de Trizol y el procedimiento RNeasy™. Las preparaciones de ARN fueron purificadas adicionalmente antes de la síntesis del ADNc mediante el uso del un kit de purificación de PCR Qiagen QIAquick™.
Se extrajo el ARN de la sangre de tres voluntarios sanos mediante la realización de una extracción Trizol/RNeasy™ en células enriquecidas a partir de sangre completa mediante el uso de una sedimentación en dextrano al 3,6 %.
Preparación de micromatriz en porta
Se imprimieron portas de vidrio recubiertos con epoxi (MWG Biotech) con ~ 30.000 oligonucleótidos 50mer (MWG Biotech) mediante el uso de un robot de micromatrización Gene Machines, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Marcaje del ARN e hibridación
El ADNc se transcribió a partir de 5 μg de ARN total mediante el uso de la transcriptasa inversa Superscript II™ (Invitrogen) en reacciones que contienen 5-(3-aminoalil)-2’desoxiuridina-5’-trifosfato. La reacción fue a continuación desionizada en una columna Microcon antes de ser incubada con Cy3 o Cy5 en tampón de bicarbonato durante 1 hora a la temperatura ambiente. Los colorantes no incorporados se eliminaron mediante el uso de una columna Qiaquick (Qiagen) y la muestra se concentró hasta 15 μl en una SpeedVac. Los ADNcs marcados con Cy3 y Cy5 se mezclaron entonces con tampón Ambion ULTRAhyb™, se desnaturalizaron a 100 ºC durante 2 min y se hibridaron en los portas de micromatrices en cámaras de hibridación a 42 ºC durante 16 horas. Después los portas se lavaron y se escanearon dos veces en un escáner Axon 4000A™ con dos configuraciones de potencia.
Análisis con micromatriz de los genes marcadores del cáncer
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histogramas se basaban en los datos de la qPCR obtenidos de los doce primeros marcadores mostrados en la Figura 5. De los 30 tumores invasivos en el análisis de la PCR, 27 (el 90 %) sobreexpresaban al menos cuatro genes por encima del percentil 95º (Figura 12a). De los 25 tumores superficiales del análisis, 23 (92 %) sobreexpresaban al menos cuatro genes por encima del percentil 95º (Figura 12b). Estos hallazgos indican que, en las situaciones en las que hay múltiples genes sobreexpresados con respecto al tejido normal, la fiabilidad de la detección del cáncer puede ser muy alta, haciendo que el diagnóstico del cáncer sea más inequívoco. Sin embargo, en algunos casos, la elevación de la expresión de un único gen marcador es suficiente para dar lugar a un diagnóstico de cáncer.
La fiabilidad de la discriminación con éxito entre muestras tumorales y no tumorales mediante el uso de combinaciones de marcadores se ilustra adicionalmente mediante el análisis estadístico representado en la Figura
13. Este análisis comparaba las distribuciones normales de los datos de la expresión génica de la qPCR de muestras tumorales y no malignas. Los datos de la qPCR se han resumido en la Figura 5. El análisis muestra el efecto del aumento del número de marcadores usados para discriminar entre muestras tumorales y no malignas sobre la sensibilidad del ensayo (con una especificidad fija del 95 %). Aunque pocos de los 18 marcadores tienen una sensibilidad de más del 90, del 95 o del 99 % cuando se usan solos en este análisis, la combinación de dos o tres marcadores permitió alcanzar una elevada sensibilidad con grandes cifras, de combinaciones de dos o tres marcadores (Figuras 14a y 14b).
Las Figuras 14a y 14b muestran la sensibilidad de los marcadores y las combinaciones de marcadores específicas para la detección del carcinoma de células de transición invasivo y superficial (TCC), cuando la especificidad se ha fijado en el 95 %. Únicamente se han mostrado las combinaciones con una sensibilidad de > 90 %. De los 15 marcadores mostrados en la Figura 14a, el cáncer de vejiga invasivo puede ser detectado con una sensibilidad de aproximadamente el 95 % para TOP2A, SPAG5 y CDC2 de forma individual. Otros marcadores mostrados tienen una sensibilidad menor cuando se usan de forma individual.
Sin embargo, las combinaciones de dos de los anteriores marcadores mejoraron drásticamente la sensibilidad de la detección del cáncer de vejiga invasivo (Figura 13a y Figura 14a). Una sensibilidad mayor del 95 % puede conseguirse mediante el uso de 13 de las 105 combinaciones de dos marcadores. De hecho, mediante el uso de dos marcadores se obtiene una sensibilidad mínima del 90 % en 42 de las 105 combinaciones de marcadores.
Para el cáncer de vejiga superficial (Figura 13b y Figura 14b), no puede conseguirse una sensibilidad mayor del 90 % con ninguno de los marcadores de forma individual, sin embargo, este umbral se alcanzó con 11 de las 136 combinaciones de dos marcadores. Una sensibilidad del > 95 % se alcanzó con 22 combinaciones de tres marcadores.
El uso de combinaciones de marcadores también puede mejorar drásticamente la sensibilidad de la detección del cáncer de vejiga mediante el uso de muestras de orina. Las Figuras15 y 16 muestran la sensibilidad de la detección de los marcadores individuales y de las combinaciones de marcadores mediante el uso de los datos de la qPCR de la orina.
Como se observa en la Figura 16, aunque únicamente el IGFBP5 solo tenía una sensibilidad del > 95 %, ocho combinaciones de dos marcadores y 37 combinaciones de tres marcadores alcanzaron este umbral.
Ejemplo 4: acumulación diferencial de transcritos en pacientes con cáncer de vejiga superficial e invasivo
A partir de la Figura 5 puede observarse que varios BTM, incluyendo SEMA3F, HOXA13, TOP2A y SPAG5, muestran una expresión diferencial entre los cánceres de vejiga invasivos y los cánceres de vejiga superficiales. Para ampliar esta observación se comparó la acumulación de estos transcritos en la orina de pacientes con cáncer de vejiga invasivo y superficial.
Se extrajo ARN a partir de volúmenes iguales de orina procedentes de los pacientes descritos en la Figura 1 y se determinó la acumulación de los BTM mediante una qPCR. La acumulación de las combinaciones específicas de BTM se expresó entonces en forma de proporciones. Las combinaciones de BTM consistían en un BTM con una mayor sobreexpresión en los tumores de vejiga invasivos en comparación con los tumores de vejiga superficiales, y un BTM con una mayor sobreexpresión en los tumores superficiales en comparación con los tumores invasivos.
La Figura 17 muestra una combinación de tres marcadores analizados en muestras de orina de 20 pacientes con TCC superficial y 14 con invasivo. Las tres combinaciones mostradas son: (i) TOP2A y HOXA13, (ii) TOP2A e IGFBP5, y (iii) TOP2A y SEMA3F. Puede observarse que estas combinaciones de marcadores son capaces de diferenciar entre las muestras de orina de los pacientes con un TCC superficial y con uno invasivo. Otros marcadores de la Figura 5 que muestran una diferencia en la expresión entre los tipos superficial e invasivo de TCC también son capaces de determinar el tipo de TCC, basándose en el análisis de una muestra de orina.
Además, la Figura 18 muestra que el uso de la combinación de dos marcadores que incluyen TOP2A puede usarse para distinguir entre el cáncer de vejiga invasivo en fase 1 -2 y los tumores en fase 3.
Estas observaciones muestran que la determinación de la acumulación de varios transcritos de BTM en la orina
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