JP2022553825A

JP2022553825A - 尿路上皮がん用の尿中ｅｖｒｎａバイオマーカー

Info

Publication number: JP2022553825A
Application number: JP2022525804A
Authority: JP
Inventors: ムラカミ，タク; 崇宏大澤
Original assignee: Resonac Corporation; Hokkaido University NUC; Hitachi Chemical Co Ltd; Showa Denko Materials Co Ltd
Current assignee: Resonac Corporation; Hokkaido University NUC; Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-12-26
Also published as: EP4051807A1; WO2021087388A1

Abstract

本開示の特定の態様は概して、尿路上皮がんに関する患者の状態を評価する低侵襲の、又は非侵襲の方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、尿路上皮がんに関する患者の状態を評価、診断又はそうでなければ判断するために患者の尿サンプル由来のエキソソーム及び微小胞などの細胞外小胞（ＥＶ）のｍＲＮＡプロファイルを特徴づける方法に関する。

Description

全ての優先出願に対する参照による引用
本出願は、２０１９年１０月３１日に出願された米国仮出願第６２／９２８，９９６号の優先権を主張し、その全内容を参照により本明細書に援用される。

共同研究契約の当事者
特許請求された発明は、ヒタチケミカルカンパニーアメリカ（現在はＳｈｏｗａＤｅｎｋｏＭａｔｅｒｉａｌｓ（Ａｍｅｒｉｃａ），Ｉｎｃ．として知られている）と北海道大学（現在は国立大学法人北海道大学として知られている）との間の共同研究契約についての１人又は複数人の以下の当事者により、代表して及び／又は関してなされた。本契約は、特許請求された発明がなされた日及びそれ以前に効力を有し、特許請求された発明は、本契約の範囲内で着手された活動の結果としてなされた。

アスキーテキストファイル中の配列表の参照による引用
本出願は、本出願と同時に提出されている以下のアスキーテキストファイルに含まれる配列表を参照により援用する。ファイル名、２０２０－１０－２９＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＨＩＴＡＣＨＩ－１３１ＰＲ；作成日、２０２０年１０月２９日、ファイルサイズ、１４．６Ｋｂ。

背景
技術分野
本開示の特定の態様は概して、尿路上皮がんに関する患者の状態を評価する低侵襲の、又は非侵襲の方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、尿路上皮がんに関する患者の状態を評価、診断又はそうでなければ判断するために患者の尿サンプル由来のエキソソーム及び微小胞などの細胞外小胞（ＥＶ）のｍＲＮＡプロファイルを特徴づける方法に関する。

関連技術の説明
アメリカ国立癌研究所は２０１５年に、アメリカ合衆国だけでおよそ７４，０００件の新規膀胱がんの症例が生じ、そして１４，０００人が死亡するだろうと推定した。膀胱がん及び他の尿路上皮がん（例えば、尿管及び腎盂の悪性腫瘍）の大多数は、尿路の移行上皮から惹起する。膀胱がん以外の尿路上皮がんは各種尿路上皮がんの５～１０％を占めるにすぎないが、これらのがんがあると、将来膀胱がんを発症する確率が増加する。

尿路上皮がん（膀胱がんなど）の治療は、がんのステージ及びグレードに依存する。筋層非浸潤性がん（ｐＴａ、ｐＴｉｓ及びｐＴ１）は、経尿道的腫瘍除去又は膀胱内化学療法により治療することができる。一方、筋層浸潤性がん（ｐＴ２、ｐＴ３及びｐＴ４）では、膀胱全摘除術及び静脈内化学療法などのより積極的な治療が必要となる。筋層非浸潤性がんの再発率は５０～７０％で、筋層浸潤性がんについてはずっと高いので、膀胱がんの病歴がある患者は、再発を生涯監視する必要があり、アメリカ合衆国において膀胱がんは診断から治療までもっとも費用のかかるがんとなる。さらに、尿管がん又は腎盂がんの患者のうち約３０％は、数年後に膀胱がんが発生する。

膀胱がん検出の現在のゴールドスタンダードは、尿細胞診を伴う膀胱鏡検査である。尿細胞診を伴う膀胱鏡検査は、約９６％の特異性を有する一方、感度は約４４％にすぎない。低グレードの腫瘍については、尿細胞診を伴う膀胱鏡検査の感度はずっと低い（４～３
１％）。膀胱鏡検査は、カメラ及び光源を有する細い管を尿道に挿入し、この管を膀胱へと前進させることを含む侵襲的手法である。

尿に基づく尿路上皮がんマーカーをスクリーニングするためのいくつかのＦＤＡに認可された試験キットを利用できる（例えば、ＢＴＡｓｔａｔ／ＢＴＡｔｒａｋ（Ｐｏｌｙｍｅｄｏｃｏ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、ＮＭＰ２２ＢｌａｄｄｅｒＣｈｅｋ（Ａｌｅｒｅ，Ｆｌｏｒｉｄａ）、ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ／ｕＣｙｔ＋（Ｓｃｉｍｅｄｘ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（ＡｂｂｏｔｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））。これらの診断キットは、現在のゴールドスタンダードである膀胱鏡検査及び細胞診と非常に良く似た感度及び特異性を示す。したがって、より良好な非侵襲的バイオマーカー、特に感度が高いバイオマーカーが依然として必要とされている。

そのうえ、高リスクの筋層非浸潤性膀胱がん（すなわち、ＨＲ－ＮＭＩＢＣ）（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＮｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）分類において高グレードのｐＴａ、ｐＴ１、全てのｐＴｉｓ）の患者は、低リスクの（ＬＲ）ＮＭＩＢＣ（すなわち、低グレードのｐＴａ）と比較して再発及び増悪の両方のリスクが高い（１）。膀胱鏡検査自体ではＨＲ－ＮＭＩＢＣ及びＬＲ－ＮＭＩＢＣを区別することができず、したがって、腫瘍の病理学的解析の後に経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）を行うことがきわめて重要である。ＨＲ－ＮＭＩＢＣは、筋層浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）（すなわち、ｐＴ２及びそれ以上のステージ）又は転移に進行することもあるので、進行前に早期にＨＲ－ＮＭＩＢＣを検出することが必要である。患者がＨＲ－ＮＭＩＢＣと診断された場合、再発／進行を軽減するために腫瘍を完全に切除するための第２のＴＵＲＢＴを実施することが多い。したがって、ＴＵＲＢＴの前に、がんがＬＲ－ＮＭＩＢＣなどのように低リスクか、又はＨＲ－ＮＭＩＢＣ及びＭＩＢＣなどのように高リスクか分かることは臨床的に有益である。この恩恵には、臨床の結果が良好なだけでなく、第２のＴＵＲＢＴを回避できる可能性も含まれる。

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、対象の尿路上皮がんを検出する方法に関する。この方法は、ａ）この対象から尿サンプルを取得すること、ｂ）この尿サンプルからＲＮＡを単離すること、ｃ）ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現レベルを定量化すること、及びｄ）この１つ又は複数のマーカーの発現レベルが非尿路上皮がん対象から取得された尿サンプル中のこの１つ又は複数のマーカーの発現レベルよりも高い場合、この対象がこの尿路上皮がんを有すると特定することを含むことができる。

本明細書中に記載される他の実施形態は、尿路上皮がんの指標を示すヒト患者を特定し、治療する方法に関し、この方法は、ａ）このヒト患者から取得された尿サンプルを有すること、ｂ）この尿サンプルからＲＮＡを単離すること、ｃ）ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現レベルを定量化すること、ｄ）この１つ又は複数のマーカーの発現レベルが非尿路上皮がん対象から取得された尿サンプル中のこの１つ又は複数のマーカーの発現レベルよりも高い場合、このヒト患者がこの尿路上皮がんを有すると診断すること、及びｅ）有効量の尿路上皮がん薬剤（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）を尿路上皮がんの徴候を呈するこのヒト患者に投与することを含み、この尿路上皮がん薬剤（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）は、化学療法、放射線照射、外科手術、及び免疫療法からなる群から選択される。

本発明のこれらのそして他の特徴、態様及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲を参照してより理解される。

図１Ａは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図１Ａは、βアクチン、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、及びＡＱＰ３の発現データを示す。図１Ａの遺伝子発現プロファイルをＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図１Ｂは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図１Ｂは、ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、及びＧＡＰＤＨのデータを示す。図１Ｂの遺伝子発現プロファイルをＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図１Ｃは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図１Ｃは、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、及びＩＧＦＢＰ５の発現データを示す。図１Ｃの遺伝子発現プロファイルをＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図１Ｄは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図１Ｄは、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、及びＭＤＫの発現データを示す。図１Ｄの遺伝子発現プロファイルをＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図１Ｅは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図１Ｅは、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、及びＮＥＴ１の発現データを示す。図１Ｅの遺伝子発現プロファイルをＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図１Ｆは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図１Ｆは、ＮＯＮＯ及びＳＬＣ２Ａ１の発現データを示す。図１Ｆの遺伝子発現プロファイルをＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図２Ａは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図２Ａは、βアクチン、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、及びＡＱＰ３の発現データを示す。図２Ａの遺伝子発現プロファイルをＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図２Ｂは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図２Ｂは、ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、及びＧＡＰＤＨのデータを示す。図２Ｂの遺伝子発現プロファイルをＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図２Ｃは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図２Ｃは、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、及びＩＧＦＢＰ５の発現データを示す。図２Ｃの遺伝子発現プロファイルをＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図２Ｄは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図２Ｄは、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、及びＭＤＫの発現データを示す。図２Ｄの遺伝子発現プロファイルをＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図２Ｅは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図２Ｅは、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、及びＮＥＴ１の発現データを示す。図２Ｅの遺伝子発現プロファイルをＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図２Ｆは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図２Ｆは、ＮＯＮＯ及びＳＬＣ２Ａ１の発現データを示す。図２Ｆの遺伝子発現プロファイルをＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図３Ａは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図３Ａは、βアクチン、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、及びＡＱＰ３の発現データを示す。図３Ａの遺伝子発現プロファイルをＮＯＮＯ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図３Ｂは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図３Ｂは、３ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、及びＧＡＰＤＨのデータを示す。図３Ｂの遺伝子発現プロファイルをＮＯＮＯ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図３Ｃは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図３Ｃは、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、及びＩＧＦＢＰ５の発現データを示す。図３Ｃの遺伝子発現プロファイルをＮＯＮＯ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図３Ｄは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図３Ｄは、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、及びＭＤＫの発現データを示す。図３Ｄの遺伝子発現プロファイルをＮＯＮＯ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図３Ｅは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図３Ｅは、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、及びＮＥＴ１の発現データを示す。図３Ｅの遺伝子発現プロファイルをＮＯＮＯ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図３Ｆは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図３Ｆは、ＮＯＮＯ及びＳＬＣ２Ａ１の発現データを示す。図３Ｆの遺伝子発現プロファイルをＮＯＮＯ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図４Ａは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図Ａは、βアクチン、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、及びＡＱＰ３の発現データを示す。図４Ａの遺伝子発現プロファイルをＡＣＴＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図４Ｂは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図Ｂは、３ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、及びＧＡＰＤＨのデータを示す。図４Ｂの遺伝子発現プロファイルをＡＣＴＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図４Ｃは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図４Ｃは、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、及びＩＧＦＢＰ５の発現データを示す。図４Ｃの遺伝子発現プロファイルをＡＣＴＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図４Ｄは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図４Ｄは、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、及びＭＤＫの発現データを示す。図４Ｄの遺伝子発現プロファイルをＡＣＴＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図４Ｅは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図４Ｅは、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、及びＮＥＴ１の発現データを示す。図４Ｅの遺伝子発現プロファイルをＡＣＴＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図４Ｆは、各種膀胱がんの尿中ＥＶｍＲＮＡ分析に関するデータを示す。図４Ｆは、ＮＯＮＯ及びＳＬＣ２Ａ１の発現データを示す。図４Ｆの遺伝子発現プロファイルをＡＣＴＢ遺伝子により正規化し、ウェルチのｔ検定により分析した。図５Ａは、重症度が異なる膀胱がんの患者由来の尿サンプルから収集した各種データに関するデータを示す。図５Ａは、尿細胞診の結果を示す。図５Ｂは、重症度が異なる膀胱がんの患者由来の尿サンプルから収集した各種データに関するデータを示す。図５Ｂは、サンプル中にＮＭＰ２２が存在するかについてのＥＬＩＳＡデータを示す。図５Ｃは、重症度が異なる膀胱がんの患者由来の尿サンプルから収集した各種データに関するデータを示す。図５Ｃは、膀胱腫瘍関連抗原（ＢＴＡｓｔａｔ）イムノアッセイ分析の結果を示す。図６Ａは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図６Ａは、低リスク及び高リスクの両方の膀胱がんのマーカー選択率を示す。図６Ｂは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図６Ｂは、高リスクの膀胱がんのマーカー選択率を示す。図６Ｃは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図６Ｃは、低リスクの膀胱がんのマーカー選択率を示す。図６Ｄは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図６Ｄは、マーカー選択率及び関連するリスク層別化を示す。図７Ａは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図７Ａは、低リスク及び高リスクの両方の膀胱がんのマーカー選択率を示す。図７Ｂは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図７Ｂは、高リスクの膀胱がんのマーカー選択率を示す。図７Ｃは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図７Ｃは、低リスクの膀胱がんのマーカー選択率を示す。図７Ｄは、スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）により選択されるマーカーの百分率を示す。図７Ｄは、マーカー選択率及び関連するリスク層別化を示す。図８Ａは、予測公式の決定及びスパースロジスティック回帰分析の診断性能比較に関するデータを示す。図８Ａは、ＥＶｍＲＮＡ分析及び細胞診の組み合わせに基づく曲線下面積を示す。図８Ｂは、予測公式の決定及びスパースロジスティック回帰分析の診断性能比較に関するデータを示す。図８Ｂは、ＥＶｍＲＮＡ単独に基づく曲線下面積を示す。

本開示の特定の態様は概して、尿路上皮がんに関する患者の状態を評価する低侵襲の、又は非侵襲の方法に関する。本明細書中に記載される各特徴及び全ての特徴、並びにこのような特徴の２つ以上の各組み合わせ及び全ての組み合わせは、このような組み合わせに含まれる特徴が相互に矛盾しないという条件で、本開示の範囲内に含まれる。

エキソソーム及び微小胞などの細胞外小胞（ＥＶ）は、ネフロンの全ての領域から尿腔中に放出され、起始細胞の細胞質分子を包む。いくつかの研究から、腫瘍は高濃度の大きなＥＶを産生することが分かった。筋層浸潤膀胱がん細胞由来のＥＶは、尿路上皮細胞に上皮間葉転換を起こさせることが分かっている。尿路上皮がんは尿路上皮上に位置し、尿と直接接触するので、尿路上皮がん由来のＥＶは、尿中に放出されてよく、本明細書中に開示されるいくつかの実施形態によれば、尿中ＥＶは尿路上皮がんバイオマーカーの豊富な供給源となることができることが示唆される。尿中細胞及び他のマーカーが腫瘍から尿中に放出されるのは、腫瘍が著しく増殖し、周囲の領域に浸潤した後のみである。しかしながら、尿中ＥＶは、腫瘍からだけでなく、正常細胞及び傷害を受けた細胞からも放出される。したがって、尿路上皮がんの分子の痕跡は、尿路上皮がんの従来のバイオマーカーよりもずっと早期に尿中に取得することができる。

尿中ＥＶを単離する標準的な方法は、超遠心分離法を用いる分画遠心法である。しかしながら、超遠心分離法は、通常の臨床検査室での日常的な臨床アッセイには応用できないおそれがある。本開示のいくつかの実施形態では、バイオマーカー及び臨床試験用の尿中ＥＶｍＲＮＡアッセイを利用し、これによりアッセイ感度、再現性及び使いやすさの点から標準的な方法と同様の又は優れてさえいる性能が可能になる。いくつかの実施形態では、様々ながんのグレード及びステージの尿路上皮がん患者由来の尿サンプルをスクリー
ニングして尿路上皮がんの新規なバイオマーカーを特定するために、この尿中ＥＶｍＲＮＡアッセイを利用する。

以下に詳述するように、尿中ＥＶは、尿サンプルに小胞捕捉フィルターを通過させ、それにより超遠心分離法を用いることなく尿からＥＶを単離させることにより、尿から単離することができる。いくつかの実施形態においては、小胞捕捉材料は、捕捉される小胞の大きさよりも桁が大きい多孔度（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）を有する。小胞捕捉材料は、ＥＶの大きさよりずっと大きい孔径を有するが、ＥＶの小胞捕捉材料に対する吸着によりＥＶは小胞捕捉材料上に捕捉される。小胞捕捉材料の孔径及び構造は、ＥＶ由来のｍＲＮＡを小胞捕捉材料から回収できるように、ＥＶ捕捉とＥＶ回収のバランスをとるよう目的に合わせられる。いくつかの実施形態においては、小胞捕捉材料は、異なる多孔度を有する少なくとも２個の層を含む多層フィルターである。いくつかの実施形態においては、尿サンプルは、両方ともにガラス繊維で作成された、第１の層を最初に通過し、ついで第２の層を通過する。１つの実施形態において、第１の層は、０．６と２．７μｍの間の、好ましくは１．５と１．８μｍの間の粒子保持率を有し、第２の層は、０．１と１．６μｍの間の、好ましくは０．６と０．８μｍの間の粒子保持率を有する。１つの実施形態において、第１の層の粒子保持率は、第２の層の粒子保持率より大きく、したがって、高い微粒子充填能力及び速い流速を得ることができる。

本開示のいくつかの態様は、ヒト対象の尿由来のＥＶを尿路上皮がんのバイオマーカーのためにスクリーニングする尿中ＥＶｍＲＮＡアッセイを利用する。健康なボランティアの尿中ＥＶｍＲＮＡプロファイルをＲＮＡ－ｓｅｑで分析し、腎臓特異的遺伝子だけでなく、膀胱特異的遺伝子も発現することがわかり、尿中ＥＶは尿路上皮疾患（例えば、尿管及び腎盂がん）及び膀胱がんを検出するのに有用であってよいと示唆される。尿路上皮がんは、尿と直接接触するので、尿路上皮がんの分子の痕跡は、現在の診断下で分析される尿中細胞又はタンパク質バイオマーカーと比較して尿中ＥＶにおいて早期に検出することができる可能性がある。

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、対象の尿路上皮がんの検出方法に関する。この方法は、ａ）この対象から尿サンプルを取得すること、ｂ）この尿サンプルからＲＮＡを単離すること、ｃ）ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現レベルを定量化すること、及びｄ）この１つ又は複数のマーカーの発現レベルが非尿路上皮がん対象から取得された尿サンプル中のこの１つ又は複数のマーカーの発現レベルよりも高い場合、この対象がこの尿路上皮がんを有すると特定することを含むことができる。

いくつかの実施形態において、このＮＥＴ１の発現レベルを定量化する。

他の実施形態はさらに、ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現レベルを用いてスコアを計算することをさらに含む。

さらに他の実施形態は、リファレンス遺伝子を検出することをさらに含み、このリファレンス遺伝子は、このマーカーのこの発現レベルを正規化するために用いられ、このリファレンス遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＮＯＮＯ及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される。

さらに他の実施形態は、ａ）細胞及び大きな残屑を除去することにより尿の上清を調製
すること、ｂ）この尿の上清から尿中細胞外小胞を単離すること、及びｃ）この尿中細胞外小胞からＲＮＡを単離することをさらに含む。

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、尿路上皮がんの指標を示すヒト患者を特定し、治療する方法に関し、この方法は、ａ）このヒト患者から取得された尿サンプルを有すること、ｂ）この尿サンプルからＲＮＡを単離すること、ｃ）ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現レベルを定量化すること、ｄ）この１つ又は複数のマーカーの発現レベルが非尿路上皮がん対象から取得された尿サンプル中のこの１つ又は複数のマーカーの発現レベルよりも高い場合、このヒト患者がこの尿路上皮がんを有すると診断すること、及びｅ）有効量の尿路上皮がん薬剤を尿路上皮がんの指標を示すこのヒト患者に投与することを含み、この尿路上皮がん薬剤は、化学療法、放射線照射、外科手術、及び免疫療法からなる群から選択される。

ヒト患者を特定し、治療する方法のいくつかの実施形態において、この定量化することは、このマーカーのうち少なくとも３つの組み合わされた発現レベルを定量化することを含む。いくつかの実施形態において、このマーカーのうちの、この少なくとも３つは、ＮＥＴ１、ＫＲＴ１７、及びＭＤＫを含む。

いくつかの実施形態において、ヒト患者を特定し、治療する方法は、ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現レベルを用いてスコアを計算することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、ヒト患者を特定し、治療する方法は、リファレンス遺伝子を検出することをさらに含み、このリファレンス遺伝子は、このマーカーのこの発現レベルを正規化するために用いられ、このリファレンス遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＮＯＮＯ及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ヒト患者を特定し、治療する方法は、ａ）細胞及び大きな残屑を除去することにより尿の上清を調製すること、ｂ）この尿の上清から尿中細胞外小胞を単離すること、及びｃ）この尿中細胞外小胞からＲＮＡを単離することをさらに含む。

膀胱がん検出のための尿中ＥＶＲＮＡ試験
彼／彼女のがんの前病歴又は血尿などの臨床症状から患者が膀胱がんと疑われるとき、尿サンプルを取得し、膀胱がん検出のために尿中ＥＶＲＮＡ試験に送ることができる。尿サンプルは、室温で保管することができ、例えば４℃で７日間まで、好ましくは１日間まで、冷蔵により保管することができる。あるいは、尿サンプルを－６０℃以下、好ましくは－８０℃で保管することができる。尿中ＥＶ試験用の尿サンプルの望ましい体積は、５０ｍＬ未満、４０ｍＬ未満、３０ｍＬ未満、２０ｍＬ未満、１０ｍＬ未満、５ｍＬ未満、３ｍＬ未満、２ｍＬ未満、１ｍＬ未満、５００μＬ未満、２００μＬ未満、又は１００μＬ未満である。尿サンプル中の大きな残屑又は尿中細胞を、１００００×Ｇ未満、５０００×Ｇ未満、３５００×Ｇ未満、２５００×Ｇ未満、２０００×Ｇ未満、１５００×Ｇ未満、１０００×Ｇ未満、８００×Ｇ未満、５００×Ｇ未満、４００×Ｇ未満、３００×Ｇ未満、２００×Ｇ、若しくは１００×Ｇ未満の遠心分離、２０μｍ未満の細孔によるろ過、１４μｍ未満の細孔によるろ過、１２μｍ未満の細孔によるろ過、１０μｍ未満の細
孔によるろ過、８μｍ未満の細孔によるろ過、５μｍ未満の細孔によるろ過、２μｍ未満の細孔によるろ過、１．２μｍ未満の細孔によるろ過、１．０μｍ未満の細孔によるろ過、０．８μｍ未満の細孔によるろ過、０．６μｍ未満の細孔によるろ過、０．４５μｍ未満の細孔によるろ過、若しくは０．２２μｍ未満の細孔によるろ過、又は重力沈降により除去することができる。尿中ＥＶは、上述した方法、超遠心分離法、ポリマー共沈、膜ろ過、デプスろ過、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離することができる。尿中ＥＶＲＮＡは、単離した尿中ＥＶからフェノールークロロホルム抽出、シリカ吸着／溶出、及びオリゴ（ｄＴ）固定化担体などの従来のＲＮＡ分離方法により単離することができる。任意選択的に、尿中ＥＶＲＮＡは、尿サンプルから尿中ＥＶを単離せずに従来のＲＮＡ単離により直接単離することができる。尿中ＥＶＲＮＡマーカーの発現レベルは、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、等温核酸増幅、ノーザンブロット、及びＲＮＡハイブリダイゼーションなどの従来のＲＮＡ定量化方法により測定することができる。尿中ＥＶＲＮＡマーカーの発現レベルは、サンプルの量、質、及びアッセイ手順による影響を避けるためにリファレンス遺伝子の発現レベルにより正規化することができる。正規化は、１つのリファレンス遺伝子又は１つより多いリファレンス遺伝子の発現レベルをマーカー遺伝子の発現レベルから減算することにより行うことができる。患者の尿サンプル中の尿中ＥＶＲＮＡマーカーの発現レベルが、特定の閾値又は膀胱がん又はいずれの他のがんも有さない対象のグループの同一のマーカーのレベルより高いとき、試験は陽性とみなす。患者の尿サンプル中の尿中ＥＶＲＮＡマーカーの発現レベルが閾値より低いとき、試験は陰性とみなす。陽性の試験結果は、患者が膀胱がんにかかっていることを示す一方、陰性の試験結果は、試験尿サンプルを収集した時点では患者が膀胱がんにかかっていないことを示す。尿サンプルの収集及び試験を繰り返すと、試験の正確性をより高めることができる。試験の診断性能をさらに改良するために、２つ以上のＥＶＲＮＡマーカーの発現レベルを測定し、血尿、性別、年齢、及びがんの病歴などの追加の臨床パラメータ又は尿細胞診などの試験結果の有り無し両方で診断スコアを生成するために使用することができ、この診断スコアを個別の尿中ＥＶマーカーの発現レベルの代わりに用いることができる。診断スコアは、スパースロジスティック回帰、ランダムフォレスト、及びサポートベクターマシンなどの機械学習手法によって生成された診断公式（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｆｏｒｍｕｌａ）により計算することができる。ロジスティック回帰分析など、患者が膀胱がんにかかっている確率に基づいて計算された診断スコアは、さらに有用である。ロジット関数又は対数オッズは、ｐが確率である場合のオッズの対数であり、したがって、診断スコアが高いことは、膀胱がんにかかっているリスクが高いことを示し、診断スコアが低いことは、膀胱がんにかかっている確率が低いことを示す。診断公式は、膀胱がんスクリーニング、再発モニタリング、及び低リスクの膀胱がん及び高リスクの膀胱がんの層別化などの、臨床的必要性のために膀胱がん集団のうちの特定の集団を検出するよう最適化することができる。この試験結果を用いて、医師の判断で膀胱鏡検査などの膀胱腫瘍の追加の確認検査を行うことができ又は外科手術による膀胱腫瘍の除去を行うこともできる。

尿中ＥＶＲＮＡマーカー
有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＣＴＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＱＰ３、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＤＫ１、ＣＧＮＬ１、ＣＮＴＲＯＢ、ＣＴＸＮ３、ＣＸＣＲ２、ＤＮＡＪＣ２４、ＦＡＭ１１０Ｂ、ＦＡＭ８Ａ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＧＦ１、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＳ５、ＧＥＭＩＮ５、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＸＹＬＴ１、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＢＲ、ＬＥＯ１、ＬＲＲＣ１９、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＭＡＢ２１Ｌ３、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＥＴＴＬ１７、ＭＭＰ１５、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＮＯＮＯ、Ｐ４ＨＡ１、ＰＡＲＳ２、ＰＣＡＴ１、ＲＧＮ、ＲＯＢＯ１、Ｓ１００Ａ１３、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＰＲＹ４－ＩＴ１、ＴＭＥＭ１７６Ａ、ＴＭＥＭ３３、ＴＲＨＤＥ、ＵＧＣＧ、及びＷＮＴ５Ａから選択される１つである。尿中ＥＶＲＮＡマーカーを正規化するために有用なリファレ
ンス遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＯＮＯ、及びＵＰＫ１Ａから選択される１つである。低グレードのｐＴａ、高グレードのｐＴａ、全てのｐＴｉｓ、ｐＴ１、ｐＴ２及びより高いステージを含む膀胱がんを検出するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＸ３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、及びＳＬＣ２Ａ１から選択される１つである（表３）。高グレードのｐＴａ、全てのｐＴｉｓ、ｐＴ１、ｐＴ２及びより高いステージを含む高リスクの膀胱がんを検出するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＣＴＢ、ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＮＥＴ１、及びＳＬＣ２Ａ１から選択される１つである（表４）。低グレードのｐＴａを含む低リスクの膀胱がんを検出するために、より有用な膀胱がん検出用尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＳ５、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、及びＳＬＣ２Ａ１から選択される１つである（表５）。低／高グレードのｐＴａ膀胱がんを検出するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、及びＳＬＣ２Ａ１から選択される１つである（表６）。ｐＴ１以上の膀胱がんを検出するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＸ３、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＮＥＴ１、及びＳＬＣ２Ａ１から選択される１つである（表７）。高グレードのｐＴａ膀胱がんを検出するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＱＰ３、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、及びＳＬＣ２Ａ１から選択される１つである（表８）。ｐＴｉｓ膀胱がんを検出するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＣＸＣＲ２、ＧＰＸ３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、及びＵＰＫ１Ａから選択される１つである（表９）。低リスクの膀胱がんと高リスクの膀胱がんを区別するために、より有用な尿中ＥＶＲＮＡマーカーは、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＱＰ３、ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＳ５、ＧＰＸ３、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、及びＭＤＫから選択される１つである（表１０）。

診断公式は、尿細胞診結果を伴い又は伴わずＥＶＲＮＡマーカーの組み合わせを用いて開発することができる。膀胱がん検出用の有用な診断公式又はマーカーの組み合わせは、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＱＰ３、ＣＸＣＲ２、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＳ５、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＥＭＡ４Ａ、及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを含む（表１１）。高リスクの膀胱がん（すなわち高グレードのｐＴａ、全てのｐＴａ、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上）検出用の有用な診断公式又はマーカーの組み合わせは、ＡＣＴＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＥＭＡ４Ａ、及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを含む（表１２）。低リスクの膀胱がん（すなわち低グレードのｐＴａ）検出用の有用な診断公式又はマーカーの組み合わせは、ＡＣＴＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＱＰ３、ＣＤＫ１、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを含む（表１３）。膀胱がんリスクの層別化又は低リスクの膀胱がん及び高リスクの膀胱がん用の有用な診断公式又はマーカーの組み合わせは、ＡＱＰ３、ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、ＤＨＲＳ２、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを含む（表１４）。
いくつかの非限定的な実施形態を図１～８に記載する。

図１．尿中ＥＶｍＲＮＡ分析（１）。ＡＬＤＯＢ遺伝子により正規化された遺伝子発現プロファイルを、コントロール（ＣＴＲＬ）、低グレードのｐＴａ（ｐＴａＬＧ）、高グレードのｐＴａ（ｐＴａＨＧ）、全てのｐＴｉｓ（同時にｐＴａ及びｐＴ１を伴う又は伴わないｐＴｉｓ）、ｐＴ１（ｐＴ１）、ｐＴ２及びそれ以上の（＞ｐＴ２）群間でウェルチのｔ検定により分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５により決定した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

図２．尿中ＥＶｍＲＮＡ分析（２）。ＵＰＫ１Ａ遺伝子により正規化された遺伝子発現プロファイルを、コントロール（ＣＴＲＬ）、低グレードのｐＴａ（ｐＴａＬＧ）、高グレードのｐＴａ（ｐＴａＨＧ）、全てのｐＴｉｓ（同時にｐＴａ及びｐＴ１を伴う又は伴わないｐＴｉｓ）、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上の（＞ｐＴ２）群間で、ウェルチのｔ検定により分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５により決定した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

図３．尿中ＥＶｍＲＮＡ分析（３）。ＮＯＮＯ遺伝子により正規化された遺伝子発現プロファイルを、コントロール（ＣＴＲＬ）、低グレードのｐＴａ（ｐＴａＬＧ）、高グレードのｐＴａ（ｐＴａＨＧ）、全てのｐＴｉｓ（同時にｐＴａ及びｐＴ１を伴う又は伴わないｐＴｉｓ）、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上の（＞ｐＴ２）群間で、ウェルチのｔ検定により分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５により決定した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

図４．尿中ＥＶｍＲＮＡ分析（４）。ＡＣＴＢ遺伝子により正規化された遺伝子発現プロファイルを、コントロール（ＣＴＲＬ）、低グレードのｐＴａ（ｐＴａＬＧ）、高グレードのｐＴａ（ｐＴａＨＧ）、全てのｐＴｉｓ（同時にｐＴａ及びｐＴ１を伴う又は伴わないｐＴｉｓ）、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上の（＞ｐＴ２）群間で、ウェルチのｔ検定により分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５により決定した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

図５．尿細胞診、ＮＭＰ２２及びＢＴＡｓｔａｔの分析。尿細胞診、ＮＭＰ２２及びＢＴＡアッセイ結果を、コントロール（ＣＴＲＬ）、低グレードのｐＴａ（ｐＴａＬＧ）、高グレードのｐＴａ（ｐＴａＨＧ）、全てのｐＴｉｓ（同時にｐＴａ及びｐＴ１を伴う又は伴わないｐＴｉｓ）、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上の（＞ｐＴ２）群間で比較した。Ａ．Ｙ軸の正の数は、細胞診で陽性及び擬陽性結果のサンプルの数を示し、負の数は、細胞診で陰性の結果のサンプルの数を示す。Ｂ．Ｙ軸の正の数は、ＮＭＰ２２の結果が陽性のサンプルの数を示し、負の数は、ＮＭＰ２２の結果が陰性のサンプルの数を示す。Ｃ．Ｙ軸が正の数は、ＢＴＡｓｔａｔが陽性の結果のサンプルの数を示し、負の数は、ＢＴＡｓｔａｔが陰性の結果のサンプルの数を示す。

図６．スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）で頻繁に選択されるマーカー。ＳＬＲを実施し、マーカーの最良の組み合わせをＥＶＲＮＡマーカー及び細胞診スコアから選択した。Ｙ軸の数は、各マーカーがマーカーの最良の組み合わせに選択される相対頻度を示す。

図７．スパースロジスティック回帰分析（ＳＬＲ）で頻繁に選択されるマーカー。ＳＬＲを実施し、マーカーの最良の組み合わせをＥＶＲＮＡマーカーから選択した。Ｙ軸の数は、各マーカーがマーカーの最良の組み合わせに選択される相対頻度を示す。

図８．スパースロジスティック回帰分析の診断性能比較。Ａ．マーカーの最良の組み合
わせを、ＥＶＲＮＡマーカー及び細胞診スコア、ＮＥＴ１を除外したＥＶＲＮＡマーカー及び細胞診スコア、又はＫＲＴ１７を除外したＥＶＲＮＡマーカー及び細胞診スコアから選択した。Ｂ．マーカーの最良の組み合わせを、ＥＶＲＮＡマーカー、ＮＥＴ１を除外したＥＶＲＮＡマーカー、又はＫＲＴ１７を除外したＥＶＲＮＡマーカーから選択した。最上のマーカーの組み合わせの診断性能（ＡＵＣ）を、ウェルチのｔ検定により分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５により決定した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

定義
本明細書を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、規定された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を含有することを意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解される。

用語及び方法の以下の説明は、本開示をより良く説明し、当業者が本開示を実行するのを案内するために提供される。単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」「１つの（ｔｈｅ）」とは、文脈で明確な別段の規定がない限り、１つ又は１つを超えることを指す。例えば、用語「１つの核酸分子を含む」は、単一の又は複数の核酸分子を含み、語法「少なくとも１つの核酸分子を含む」と等価な意味であるとみなされる。用語「又は（ｏｒ）」とは、文脈で明確な別段の規定がない限り、複数の規定された別の要素のうち単一の要素又は２つ以上の要素の組み合わせを指す。本明細書中で用いる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ又はＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇＡｏｒＢ）」とは、追加の要素を排除することなしに、「Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡ，Ｂ，ｏｒＡａｎｄＢ）」を意味する。別段の指定がない限り、本明細書中に提供される定義は、本発明の定義が他のあり得る定義と異なってよい場合を制御する。

別段の説明がない限り、本明細書中に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。本明細書中に述べる全てのＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ）識別子（ＩＤ）は、その全体を参照により援用される。本明細書中に記載されるものと類似する又は等価な方法及び材料を、本開示の実行及び試験に用いることができるが、適した方法及び材料を以下に記載する。この材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定を意図するものではない。

用語「がん」とは、分化が消失し、増殖速度が上昇し、周囲組織を浸潤する特徴的な退形成を受け、転移することができる悪性腫瘍を意味する。用語「がん」は、対象内部細胞の制御されない増殖によって特徴づけられる疾患を含むとみなされるものとする。いくつかの実施形態において、用語「がん」及び「腫瘍」は、互換的に用いられる。いくつかの実施形態において、用語「腫瘍」とは、良性又は非悪性増殖を指す。

本発明の非限定的な実施例では、患者リクルートメント及び尿サンプルの収集、並びに細胞外小胞ＲＮＡマーカーの発見及び検証を記載する。

患者リクルートメント及び尿サンプルの収集
臨床試験プロトコルは、北海道大学病院、札幌市総合病院、北海道がんセンター、手稲渓仁会病院、及び恵佑会札幌病院の施設内審査委員会で承認された。インフォームドコンセントを得て、ＴＵＲＢＴ前及び最後のＴＵＲＢＴ後３年間のフォローアップにおいて６０４個までの尿サンプル（２３１人の患者）を収集した。腫瘍のステージ分類及びグレー
ド分類を膀胱鏡検査及びその後の病理検査により行った。マーカー性能比較のために製造業者のプロトコルにしたがって、尿細胞診、ＮＭＰ２２（Ａｂｂｏｔｔ，ＩＬ）及びＢＴＡｓｔａｔ（Ｐｏｌｙｍｅｄｃｏ，ＮＹ）試験を実施した。

細胞外小胞ＲＮＡマーカーの発見
低リスク膀胱がん及び高リスク膀胱がんの検出に有用な尿中細胞外小胞（ＥＶ）ＲＮＡバイオマーカー候補を取得するために、ＲＮＡ－ｓｅｑにより尿中ＥＶの様々な遺伝子発現解析を実施し（膀胱がんＮ＝１２対非膀胱がんのコントロールＮ＝７）、以前の臨床試験データ（２）及び膀胱がん患者の腫瘍及び尿沈殿物（細胞）の発現プロファイルと比較した。腫瘍ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（膀胱がんＲＮＡ－ｓｅｑ，腫瘍、Ｎ＝４０５；一致した正常な膀胱組織、Ｎ＝１９）及びＧｅｎｏｔｙｐｅ－ＴｉｓｓｕｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）（正常な膀胱組織ＲＮＡ－ｓｅｑ，Ｎ＝１２）データベースから取得した。尿中細胞データは、ＮＩＨＧＥＯデータベース（ＧＳＥ６８０２０，尿路上皮がん，Ｎ＝３０対非膀胱がんのコントロール，Ｎ＝２０）から取得した。特異的遺伝子発現解析及び文献調査から（３～７）、ＲＴ－ｑＰＣＲにより大きなコホートでのさらなる検証のために、少なくとも５６個のマーカー候補及びリファレンス遺伝子（ＡＣＴＢ，ＡＬＤＯＢ，ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ，ＡＱＰ３，ＣＤＣ４２ＢＰＢ，ＣＤＫ１，ＣＧＮＬ１，ＣＮＴＲＯＢ，ＣＴＸＮ３，ＣＸＣＲ２，ＤＨＲＳ２，ＤＮＡＪＣ２４，ＦＡＭ１１０Ｂ，ＦＡＭ８Ａ１，ＦＡＮＣＤ２，ＦＧＦ１，ＧＡＰＤＨ，ＧＡＳ５，ＧＥＭＩＮ５，ＧＰＲＣ５Ａ，ＧＰＸ３，ＧＸＹＬＴ１，ＨＯＸＡ１３，ＩＧＦＢＰ５，ＫＲＴ１７，Ｌ１ＣＡＭ，ＬＢＲ，ＬＥＯ１，ＬＲＲＣ１９，ＬＲＲＣ８Ｄ，ＭＡＢ２１Ｌ３，ＭＡＬＡＴ１，ＭＤＫ，ＭＥＴＴＬ１７，ＭＭＰ１５，ＭＲＰＬ４８，ＭＴ－ＮＤ５，ＮＥＴ１，ＮＯＮＯ，Ｐ４ＨＡ１，ＰＡＲＳ２，ＰＣＡＴ１，ＲＧＮ，ＲＯＢＯ１，Ｓ１００Ａ１３，ＳＥＭＡ４Ａ，ＳＬＣ１２Ａ３，ＳＬＣ１６Ａ４，ＳＬＣ２Ａ１，ＳＰＲＹ４－ＩＴ１，ＴＭＥＭ１７６Ａ，ＴＭＥＭ３３，ＴＲＨＤＥ，ＵＧＣＧ，ＵＰＫ１Ａ，ＷＮＴ５Ａ）を選定した。

尿中細胞外小胞マーカーの検証
尿中ＥＶｍＲＮＡを、ＥｘｏＣｏｍｐｌｅｔｅ（ＨｉｔａｃｈｉＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＡ）を用いて単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲによりアッセイした。プライマー配列を表２に列挙する。ＲＴ－ｑＰＣＲデータを、デルタＣｔ法、すなわち各マーカーの閾値サイクル値をリファレンス遺伝子の閾値サイクル値により減算する方法を用いて、リファレンス遺伝子としてＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＯＮＯ、又はＵＰＫ１Ａのデータにより正規化した。

参加者の診断分類は、低グレードのｐＴａ（Ｎ＝４４）、高グレードのｐＴａ（Ｎ＝５１）、ｐＴ１（Ｎ＝３９）、全てのｐＴｉｓ（同時にｐＴａ及びｐＴ１を伴う又は伴わない）（Ｎ＝２２）、ｐＴ２又はそれ以上のステージ（Ｎ＝１２）、他の非膀胱がん（Ｎ＝４）及びコントロール（良性腫瘍又は非腫瘍、Ｎ＝１３９）だった（表１）。臨床試験期間中に患者の再発がみられなかった場合、最後のＴＵＲＢＴ後１２ヶ月のフォローアップ中に収集された尿サンプルをコントロールとみなした。

診断性能は、Ｒ及びｐＲＯＣパッケージを用いてコントロールに対するＲＯＣ曲線分析により取得された。尿細胞診については、２つのスコアリングシステムを用いて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。細胞診１：スコア「１」は、細胞診結果陽性に、そして「０」は、細胞診結果が疑い及び陰性に割り当てた。細胞診２：スコア「１」は、細胞診結果陽性及び疑いに、そして「０」は、細胞診結果陰性に割り当てた。ＢＴＡｓｔａｔ及びＮＭＰ２２については、製造業者のプロトコル中に明記された閾値を用いた。尿中ＥＶＲＮＡマーカーの各々については、ＲＯＣ曲線が左上の角に最も近接する点で最適な閾値を取得し、診断性能を特徴づけるために用いた。

尿中ＥＶＮＥＴ１は、ＮＥＴ１の発現レベルをＡＣＴＢ（図４）、ＡＬＤＯＢ（図１）、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＮＯＮＯ（図３）、又はＵＰＫ１Ａ（図２）の発現レベルで正規化すると、コントロール群と比較して低グレードのｐＴａ、高グレードのｐＴａ、ｐＴｉｓ、ｐＴ１及び＞ｐＴ２において有意に上昇した。ＮＥＴ１の膀胱がんに対する診断性能は、表３、表４、表５、表６、表７、表８及び表９に示すように、尿細胞診、ＢＴＡｓｔａｔ及びＮＭＰ２２などの従来のマーカーのいずれよりも優れていた。

尿中ＥＶＫＲＴ１７はコントロール群と比較して、高グレードのｐＴａ、ｐＴｉｓ、ｐＴ１及び＞ｐＴ２を含む高リスクの膀胱がんにおいてより有意に上昇した（図１、図２、図３、図４）。ＫＲＴ１７の膀胱がんに対する診断性能は、表３、表４、表５、表６、表７、表８及び表９に示すように、尿細胞診、ＢＴＡｓｔａｔ及びＮＭＰ２２などの従来のマーカーのいずれよりも優れており、表１０に示すように低リスク膀胱がん及び高リスク膀胱がんを区別するのに有用だった。

尿中ＥＶＭＤＫはコントロール群と比較して、低グレードのｐＴａ、高グレードのｐＴａ、ｐＴｉｓ、ｐＴ１及び＞ｐＴ２においてより有意に上昇した（図１、図２、図３、図４）。ＭＤＫの膀胱がんに対する診断性能は、表３、表４、表５、表６、表７、表８及び表９に示すように、尿細胞診、ＢＴＡｓｔａｔ及びＮＭＰ２２などの従来のマーカーのいずれよりも優れていた。

スパースロジスティック回帰分析をＲ及びｇｌｍｎｅｔパッケージにより実施した。ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＱＰ３、ＣＤＫ１、ＣＸＣＲ２、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＳ５、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＸ３、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＮＯＮＯ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＰＫ１Ａを含む２３個の遺伝子の未加工の閾値サイクル値を、尿細胞診結果を伴い又は伴わずに特徴選択のために用いた。尿細胞診については、２つの異なるスコアリング、細胞診１；陽性（１）、疑い（０）及び陰性（０）並びに細胞診２；陽性／疑い（１）及び陰性（０）を用いた。特徴選択（公式スクリーニング）を１０倍の交差検証及び５０，０００回のブートストラップ再標本化により実施して低リスクの膀胱がん及び高リスクの膀胱がん（すなわち、低グレードのｐＴａ、高グレードのｐＴａ、全てのｐＴｉｓ、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上）、高リスクの膀胱がん（すなわち、高グレードのｐＴａ、全てのｐＴｉｓ、ｐＴ１、ｐＴ２及びそれ以上）、及び低リスクの膀胱がん（すなわち、低グレードのｐＴａ）などの各種膀胱がん集団において膀胱がん陽性（スコア１）又は陰性（スコア０）かどうかを判定した。膀胱がんリスクの層別化については、サンプルが高リスクの膀胱がん（スコア１）又は低リスクの膀胱がん（スコア０）かどうかを判定するほかは、同一の特徴選択法を採用した。さらなる検証及びパラメータ最適化のために、１０回以上選択された公式を適用した。各公式については、パラメータを最適化するために、特徴選択せずに１０倍の交差検証及び５００回のブートストラップ再標本化を行うロジスティック回帰分析を実施した（公式確認）。尿細胞診結果を伴い又は伴わず膀胱がんの最良の公式を表１１に示し、ＫＲＴ１７及びＮＥＴ１を含む最も多く選択されたマーカーを図６Ａ及び図７Ａに示す。高リスクの膀胱がんに対する最良の公式を表１２に示し、ＫＲＴ１７及びＮＥＴ１を含む最も多く選択されたマーカーを図６Ｂ及び図７Ｂに示す。低リスクの膀胱がんに対する最良の公式を表１３に示し、ＮＥＴ１、ＭＤＫ及びＨＯＸＡ１３を含む最も多く選択されたマーカーを図６Ｃ及び図７Ｃに示す。膀胱がん層別化に対する最良の公式又は低リスクの膀胱がん及び高リスクの膀胱がんを区別するための最良の公式を表１４に示し、ＨＯＸＡ１３、ＫＲＴ１７及びＡＱＰ３を含む最も多く選択されたマーカーを図６Ｄ及び図７Ｄに示す。

公式の開発にＮＥＴ１又はＫＲＴ１７を含めることがいかに重要かを理解するために、ＮＥＴ１又はＫＲＴ１７を除いて上に示したように特徴選択を実施し、１０回以上選択した公式の診断性能を比較した（図８Ａ、図８Ｂ）。最上の公式の診断性能は、ＮＥＴ１又はＫＲＴ１７がないと、有意に低下し、これらのマーカーは膀胱がんを検出するための公式を開発するために重要であることを意味した。

表：

参考文献
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Claims

対象の尿路上皮がんを検出する方法であって、前記方法は、
前記対象から尿サンプルを取得すること、
前記尿サンプルからＲＮＡを単離すること、
ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現レベルを定量化すること、並びに
前記１つ又は複数のマーカーの発現レベルが非尿路上皮がん対象から取得された尿サンプル中の前記１つ又は複数のマーカーの発現レベルよりも高い場合、前記対象が前記尿路上皮がんを有すると特定することを含む、
方法。
前記ＮＥＴ１の発現レベルを定量化する、請求項１に記載の方法。
ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現レベルを用いてスコアを計算することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
リファレンス遺伝子を検出することをさらに含み、前記リファレンス遺伝子は、前記マーカーの前記発現レベルを正規化するために用いられ、前記リファレンス遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＮＯＮＯ及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。
細胞及び大きな残屑を除去することにより尿の上清を調製すること、
前記尿の上清から尿中細胞外小胞を単離すること、及び
前記尿中細胞外小胞からＲＮＡを単離することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
尿路上皮がんの指標を示すヒト患者を特定し、治療する方法であって、前記方法は、
前記ヒト患者から取得された尿サンプルを有すること、
前記尿サンプルからＲＮＡを単離すること、
ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現レベルを定量化すること、
前記１つ又は複数のマーカーの発現レベルが非尿路上皮がん対象から取得された尿サンプル中の前記１つ又は複数のマーカーの発現レベルよりも高い場合、前記ヒト患者が前記尿路上皮がんを有すると診断すること、及び
有効量の尿路上皮がん薬剤を尿路上皮がんの指標を示す前記ヒト患者に投与することを含み、前記尿路上皮がん薬剤は、化学療法、放射線照射、外科手術、及び免疫療法からなる群から選択される、方法。
定量化することは、前記マーカーのうち少なくとも３つの組み合わされた発現レベルを定量化することを含む、請求項６に記載の方法。
前記マーカーのうちの、前記少なくとも３つは、ＮＥＴ１、ＫＲＴ１７、及びＭＤＫを含む、請求項７に記載の方法。
ＣＸＣＲ２、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＯＸＡ１３、ＩＧＦＢＰ５、ＫＲＴ１７、ＬＢＲ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＤＫ、ＭＲＰＬ４８、ＭＴ－ＮＤ５、ＮＥＴ１、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＧＣＧからなる群から選択される少なくとも２つのマーカーの発現レベルを用いてスコアを計算することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
リファレンス遺伝子を検出することをさらに含み、前記リファレンス遺伝子は、前記マーカーの前記発現レベルを正規化するために用いられ、前記リファレンス遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＤＨＲＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＰＸ３、ＮＯＮＯ及びＵＰＫ１Ａからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
細胞及び大きな残屑を除去することにより尿の上清を調製すること、
前記尿の上清から尿中細胞外小胞を単離すること、及び
前記尿中細胞外小胞からＲＮＡを単離することをさらに含む、
請求項６に記載の方法。