WO2014076342A1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento de adenocarcinoma de páncreas - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento de adenocarcinoma de páncreas Download PDF

Info

Publication number
WO2014076342A1
WO2014076342A1 PCT/ES2013/070786 ES2013070786W WO2014076342A1 WO 2014076342 A1 WO2014076342 A1 WO 2014076342A1 ES 2013070786 W ES2013070786 W ES 2013070786W WO 2014076342 A1 WO2014076342 A1 WO 2014076342A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
genes
vnn1
ankrd22
clec4d
Prior art date
Application number
PCT/ES2013/070786
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Juan Ramón DELGADO PÉREZ
Antonia ARÁNEGA JIMÉNEZ
José Carlos PRADOS SALAZAR
Octavio CABA PÉREZ
Consolación MELGUIZO ALONSO
Fernando RODRÍGUEZ SERRANO
Raul Ortiz Quesada
María Celia VÉLEZ FERNÁNDEZ
Ignacio ROJAS RUIZ
Alberto Prieto Espinosa
Javier PÉREZ FLORIDO
Original Assignee
Universidad De Granada
Servicio Andaluz De Salud
Universidad De Jaén
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Granada, Servicio Andaluz De Salud, Universidad De Jaén filed Critical Universidad De Granada
Publication of WO2014076342A1 publication Critical patent/WO2014076342A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention is within medicine and molecular biology, and refers to a method of obtaining useful data for the early diagnosis of pancreatic adenocarcinoma, as well as to evaluate the response to the treatment of said disease, which allows the establishment of an individual pattern of recognition (quantitative) specific, which is modified post-treatment, allowing the establishment of groups of patients.
  • Pancreatic adenocarcinoma ⁇ Pancreatic Ductal Adenocarcinoma PDAC is an epithelial neoplasm of pancreatic ducts (Kloppel et al., 1996) and the fourth leading cause of cancer death in the world (Sharma et al., 201 1, JOP 12 (4): 343-6).
  • PDAC has the worst prognosis of all gastrointestinal tumors, with a mortality rate very close to the incidence (Karanjawala et al., 2008, Am J Surg Pathol; 32: 188-96).
  • the current survival rate of patients affected by PDAC is less than 5% (Sharma et al., 201 1, JOP 12 (4): 343-6; Huang et al., 2010, Am J Gastroenterol 105 (7): 1661-9).
  • pancreatic tumor cannot be resected when there are distant metastases, (eg liver, extra-abdominal, peritoneum, lymph nodes) (Li et al., 2004) or there is a locally advanced tumor.
  • distant metastases eg liver, extra-abdominal, peritoneum, lymph nodes
  • a locally advanced tumor e.g., a tumor of the superior mesenteric artery, the inferior vena cava, the aorta, the celiac trunk or the superior mesenteric vein and the portal venous system.
  • CA19-9 or Lewis sialylated antigen (Buxbaum et al., 2010; JOP 1 1 (6): 536-44.), With an average sensitivity of 80% and specificity of 90% (Steinberg et al. ., 1990; Am J Gastroenterol; 85: 350-5).
  • CA19-9 may be useful for monitoring treatment and determining whether the disease may be recurrent (Locker et al., 2006, J. Clin. Oncol ;.
  • CA19-9 levels are not sufficient to identify primary stages of PDACs, and only 65% of patients with resectable pancreatic cancer have elevated levels of this antigen (Goggins et al., 2005; J Clin Oncol; 23: 4524-31).
  • microarrays The global gene expression profile of microarrays provides important information about the molecular characteristics of cancer, and is widely used for the development of biomarkers.
  • PDAC the first tissue RNA gene expression profile that was based on microarrays was published in 2002 (Lacobuzio-Donahue et al., 2002; Am J Pathol 160 (4): 1239-49). Since then, many types of genes have been identified whose expression is deregulated in primary pancreatic cancer compared to normal pancreatic tissue, which can be very useful for the detection of pancreatic cancer, from its stages, or to predict its prognosis (Karanjawala et al., 2008, J Surg Pathol 32: 188-96).
  • Peripheral blood is an accessible source of cells with which to investigate important issues.
  • circulating cells can be viewed as scouts, continuously maintaining a thorough surveillance of signs of infection or other threats in the body (Whitney et ai, 2003. Proc Nati Acad Sci U S A 100 (4): 1896-901).
  • genetic expression in PBMCs ⁇ Peripheral Blood Mononuclear Cells is altered as if it were a disease-associated signature (Whitney et al., 2003; Proc. Nati. Acad. Sci.
  • peripheral blood circulating mononuclear cells can serve as a controller of the physiological state of the organism.
  • these cells pass through several tissues, their reaction with the medium is captured in a complex transcriptional response that is measured through a profile.
  • blood cells communicate with extracellular cells and matrices in almost all body tissues and organs (Liotta et ai., 2003; Nature; 425 (6961): 905).
  • the differential genetic expression profile of PBMCs is potentially a very useful tool for early diagnosis. This is especially important considering that two of the most likely mechanisms on which this differential expression is based would be the recognition and at the same time the evasion of cancer by the immune system. While other biomarkers such as CA19-9 are released from cancer cells and increase with the increase in tumor burden, differential expression in PBMCs could begin, at least partially, as soon as immune evasion or cancer's immunogenicity is established. It has been shown that evasion of the immune system begins before the disease is considered malignant in PDAC. Therefore, the analysis of differential genetic expression In immune cells it could offer the ability to detect neoplastic lesions even before it becomes invasive (Baine et al., 201 1. PLoS One. 201 1; 6 (2): e17014).
  • pancreatic cancer protein microarrays have been performed to detect serum markers (Orchekowski et al., 2005; Cancer f ⁇ es, 65: 1 1 193-202), as well as cDNA microarrays, to detect overexpressed genes in the neoplastic epithelium in 10 pancreatic cancers compared with 10 samples of non-tumor pancreas (Logsdon et al., 2003. Physe cancer 63: 2649-57).
  • pancreatic cancer Likewise, comparative studies of the microarray analyzes used in pancreatic cancer have been carried out in order to find genes and biomarkers that could be used in new diagnostic and therapeutic strategies (Brandt et al., 2004. Pancreatology A: 587-597).
  • the authors of the present invention have selected a group of genes whose expression correlates with early diagnosis, prognosis and response to the treatment of pancreatic adenocarcinoma.
  • the present invention provides a method of obtaining useful data for the early diagnosis of adenocarcinoma of the pancreas, as well as for evaluating the response to the treatment of said disease, allowing the establishment of groups of patients.
  • a first aspect of the invention relates to the use of any of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3, FAIM3 or any combination thereof, for diagnosis, for prognosis, or for the prediction of the response to the chemotherapy treatment of adenocarcinoma of the pancreas.
  • Another aspect of the invention relates to the simultaneous use of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3, FAIM3 genes for obtaining useful data in the diagnosis, prognosis or prediction of the response to chemotherapy treatment of pancreatic adenocarcinoma.
  • the independent use of any of them or any of their combinations could be sufficient for the diagnosis, prognosis or prediction of the response to the treatment of said disease.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis, prognosis or prediction of the response to chemotherapy treatment of adenocarcinoma of the pancreas, comprising:
  • step (c) compare the expression of the gene or the genes of step (b) with a reference amount.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis, prognosis or prediction of the response to chemotherapy treatment of adenocarcinoma of the pancreas, hereinafter the first method of the invention, comprising:
  • step (b) simultaneously detect the level of expression of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 genes in the isolated sample of (a), and (c) compare the expression of the genes of step (b) with a reference amount.
  • steps (b) and / or (c) of the methods described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the quantity in step (b) or the computerized comparison in step (c).
  • Another aspect of the invention relates to a method for the diagnosis, prognosis or prediction of the response to the treatment of adenocarcinoma of the pancreas in an individual, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) - (c ) according to the first method of the invention, and further comprises:
  • step (d) diagnose the individual of step (a) as an individual with adenocarcinoma of the pancreas, when he has an increased expression of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 genes, in the sample obtained in (a), in relation to the amount of expression detected for said genes in a population of reference patients. More preferably, the expression of said genes is twice the basal expression in the reference population.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is obtained from peripheral blood, and / or comprises peripheral blood cells ⁇ peripheral blood mononuclear cells PBMCs).
  • the studies of the authors of the present invention have allowed us to obtain information on gene expression patterns in patients with unresectable adenocarcinoma of the pancreas versus control subjects.
  • the study using computer techniques of the results obtained has allowed us to obtain a model of the modifications that are significant in this type of pathology.
  • pancreatic adenocarcinoma is unresectable.
  • the detection of gene expression can be performed by any means known in the state of the art.
  • the authors of the present invention have demonstrated that the detection of the expression in a quantitative way allows to differentiate between the patient with adenocarcinoma of the pancreas and the healthy individual.
  • the concentration measurement can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of gene expression, based on a signal that is obtained directly from the transcripts of said genes, or from the proteins to which they are translated, and that is directly correlated with the number of molecules of RNA or proteins produced by genes.
  • Said signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tags" or enzymatic reaction products).
  • the term "comparison”, as used in the description, refers to, but is not limited to, the comparison of expression levels of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 genes in the biological sample to be analyzed, also called the biological problem sample, with the expression levels of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3, FAIM3 genes of one or more desirable reference samples described elsewhere of this description.
  • the reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the comparison described in section (c) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
  • Gene expression profile means the gene profile obtained after quantification of mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1 , F5, ⁇ RAK3 and FAIM3, in an isolated biological sample.
  • the gene expression profile is preferably performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA present in the isolated biological sample, which can be performed using protocols known in the state of the art.
  • the level of mRNA derived from the transcription of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 and FAIM3 genes can be determined, for example, but not limited to, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), retrotranscription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative RT-PCR, retrotranscription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), or any other amplification method of nucleic acids; serial analysis of gene expression (SAGE, SuperSAGE); DNA chips made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with
  • the gene expression profile could also be obtained by the detection and / or quantification of the proteins resulting from the translation of the mRNA derived from the transcription of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3 and FAIM3 genes. for example, but not limited to, western blot immunodetection.
  • Quantitative detection of the expression of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 and FAIM3 genes can be more preferably performed by real-time PCR (RT-PCR or RTqPCR).
  • the real-time detection of the amplified products can be carried out by means of the use of fluorescent molecules that are intercalated in the double-stranded DNA or by hybridization with different types of probes.
  • the detection of the expression levels of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3, FAIM3 genes is performed by Q-RT-PCR.
  • Quantitative real-time PCR is a technique for quantifying sensitive and reproducible gene expression that can be used in particular for the expression of the gene profile in cells and tissues. Any procedure may be used for the evaluation of the results of the RT-PCR and the AACt procedure may be preferred.
  • the AACt procedure will involve a "control sample” and a "subject sample”.
  • the "subject sample” is a sample from the subject to be analyzed.
  • a target gene here: the gene of interest
  • an endogenous control gene as described below
  • the efficiency of PCR amplification can be defined as the percentage of amplification (from 0 to 1).
  • software normally measures the number of cycles of each sample in which the fluorescence crosses an arbitrary line (PCR amplification indicator), the threshold. This crossing point is the Ct value. More diluted samples will cross to subsequent Ct values.
  • the Ct of a nucleic acid from the gene of interest is divided by the Ct of the nucleic acid from the endogenous control in the same sample to normalize the variation in the quantity and quality of RNA between different samples and obtain the relative expression (with respect to the endogenous control) of each of the "sample of the subject" and of the "control sample”.
  • this is carried out in duplicate, triplicate, quadruplicate and similarly, respectively.
  • An ACt value of the control can be adequately obtained by calculating the average of the ACt values obtained from samples of a control group of several individuals with which the values of the "subject sample" are to be compared.
  • the control group (from which the average value is calculated) consists of individuals suitable for the respective purposes (for comparison).
  • the skilled person will learn from this disclosure that a suitable control group is for a specific purpose.
  • the present invention can be practiced by omitting the determination of the ACt value of the control group, that is, determining (only) the ACt value of the "subject sample” and then comparing this with the respective one. average ACt value of the control indicated in the examples.
  • the detection of the expression product of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 genes is performed by Northern Blot Transfer.
  • the detection of the gene expression product ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 is performed using microarrays.
  • the ANKRD22 or nkyr ⁇ n repeat domain-containing protein 22 gene is found on chromosome 10.
  • ANKRD22 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the ANKRD22 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the ARG1 or arginase gene, liver, (arginase-1; liver-type arginase; type I arginase) is found on chromosome 6 (6q23).
  • ARG1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 3, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, a 98% or 99% with SEQ ID NO: 3, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the ARG1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the S100A8 or S100 calcium binding protein A8 gene (60B8AG, CAGA, CFAG, CGLA, CP-10, L1 Ag, MA387, MIF, MRP8, NIF, P8, RP-8; S100 calcium-binding protein A8 (calgranulin A) ; calgranulin A; calgranulin-A; calprotectin L1 L subunit; cystic fibrosis antigen; leukocyte L1 complex light chain; migration inhibitory factor-related protein 8; protein S100-A8; urinary stone protein band A) is found on chromosome 1 (1 q21).
  • S100A8 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 5, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 5, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the S100A8 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the LRRN3 or leucine rich repeat neuronal 3 gene (Nbla10363, FIGLER5, NLRR-3, NLRR3, fibronectin type III, immunoglobulin and leucine rich repeat domains 5; leucine-rich repeat neuronal protein 3; leucine-rich repeat protein, neuronal 3; Neuronal leucine-rich repeat protein 3) is found on chromosome 7 (7q31 .1).
  • LRRN3 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 7, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 7, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the LRRN3 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 8.
  • CLEC4D or C-type lectin domain family 4, member D, (MCL; MPCL; CLEC6; CLEC-6; CLECSF8) gene is found on chromosome 12 (12p13.31).
  • CLEC4D is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 9, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 9, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the CLEC4D protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 10.
  • VNN1 or vanin 1 gene (HDLCQ8, Tiff66; CLECSF8, pantetheinase; pantetheine hydrolase; vanin-1; vannin 1; vascular non-inflammatory molecule 1) is found on chromosome 6 (6q23-q24).
  • VNN1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1 1, and which would comprise various variants from: a) molecules of nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 1,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1 1, and wherein the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the VNN1 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 12.
  • the F5 gene or coagulation factor V (proaccelerin, labile factor), (FVL, PCCF, RPRGL1, THPH2, activated protein c cofactor; coagulation factor V; coagulation factor V jinjiang A2 domain; factor V Leiden; proaccelerin, labile factor) is found on chromosome 1 (1 q23).
  • F5 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 13, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 13, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the F5 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 14.
  • the IRAK3 or interleukin-1 receptor-associated kinase 3 gene, (ASRT5, IRAKM. IL-1 receptor-associated kinase M) is found on chromosome 12 (12q14.3).
  • IRAK3 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 15, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 15, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the IRAK3 protein.
  • nucleic acid molecules is the collection in SEQ ID NO: 16.
  • the FAIM3 or Fas apoptotic inhibitory molecule 3 gene (FCMR, TOSO, Fe mu receptor; IgM Fe receptor; fas apoptotic inhibitory molecule 3; immunoglobulin mu Fe receptor; regulator of Fas-induced apoptosis Toso) is found on chromosome 1 (1 q32.1).
  • FAIM3 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 17, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 17, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the protein FAIM3.
  • nucleic acid molecules is the collection in the sequence SEQ ID NO: 18.
  • diagnosis refers to the ability to discriminate between individuals affected or not by pancreatic adenacarcinoma.
  • prognosis is understood as the expected evolution of a disease and refers to the assessment of the probability according to which a subject suffers from a disease as well as the assessment of its onset, developmental status, evolution, or its regression, and / or the prognosis of the course of the disease in the future. As those skilled in the art will understand, such assessment, although preferred, may not be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having the disease or having a predisposition to it.
  • a part is statistically significant, it can be determined by the person skilled in the art using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p-values, Student's t-test, Mann-Whitney test , etc.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%.
  • P values are preferably 0.2, 0.1, 0.05.
  • Prediction of the response means, in the context of the present invention, the determination of the probability that the patient responds favorably or unfavorably to a particular therapy or treatment, including surgical treatment.
  • prediction refers to an individual evaluation of any parameter that may be useful in determining the evolution of a patient.
  • the prediction of the clinical response to treatment although it is preferred, does not need to be correct for 100% of the subjects to be diagnosed or evaluated. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having an increased probability of having a positive response.
  • Intervals Preferred confidence are at least 50%>, at least 60%>, at least 70%>, at least 80%>, at least 90%), at least 95%>.
  • P values are preferably 0.2, 0.1 or 0.05.
  • the prediction of the clinical response can be made using any assessment criteria used in oncology and known to the person skilled in the art.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially by at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 80%, or even much more preferably at least 90%. of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample comprises peripheral blood mononuclear cells PBMCs.
  • peripheral blood mononuclear cell is understood as a blood cell characterized by having a single round nucleus, such as lymphocytes, monocytes or macrophages. These blood cells are a critical component in the immune system, specifically to combat infections
  • the lymphocyte population consists of T cells (CD4 and CD8 positive ⁇ 75%).
  • These cells are often obtained from the blood using fi lcol, a hydrophilic polysaccharide that separates layers of blood, with monocytes and lymphocytes forming a buffy coat under the plasma layer.
  • This buffy contains the PBMCs.
  • extraction methods known in the state of the art, such as, for example, extracting them from whole blood with a hypotonic lysis solution that preferably smooths red blood cells. This method gives rise to neutrophils and other polymorphonuclear cells (PMN) important in innate immune defense.
  • PMN polymorphonuclear cells
  • the term “individual” is not intended to be limiting in any aspect, and may be of any age, sex and physical condition.
  • the reference amount is obtained from the constitutive expression values of the genes, in a group of healthy individuals, or from the expression of the genes in the group of individuals before being subjected to treatment.
  • the reference amount will be, for example, in the case of differentiation between patients affected by pancreatic adenocarcinoma of healthy individuals, the constitutive expression of the gene in a control group of healthy individuals.
  • the control group will consist of a group of patients with adenocarcinoma of the pancreas that did not have that clinical manifestation.
  • reference samples can be obtained from individuals at different stages of treatment.
  • the sample or reference samples can be, for example, obtained from the blood cells of a patient with adenocarcinoma of the pancreas, in a certain clinical phase.
  • the reference amount is obtained from a reference sample.
  • the reference amount can also be obtained, for example, from the limits of normal distribution of an amount found in samples obtained from a population of individuals with adenocarcinoma of the pancreas in different phases, by statistical techniques well known.
  • the reference sample is obtained from patients before and after treatment.
  • Expression levels of one or more of these genes may be indicative of a subject's response or lack of response to treatment.
  • the answer is a reduction in tumor burden.
  • the response is a clinical result, which implies an improvement in the patient's condition or absence of deterioration.
  • the response is progression-free survival or an increase in overall survival.
  • CR Full Response
  • Partial Response At least a 30% decrease in the sum of diameters of the target lesions, taking as reference the initial value of the sum of diameters.
  • Progressive Disease At least a 20% increase in the sum of diameters of the target lesions, taking as a reference the smallest sum in the study (this includes the initial value of the sum if this is the smallest of the study). In addition to the relative increase of 20%, the sum must also demonstrate an absolute increase of at least 5 mm. (Note: the appearance of one or more new lesions is also considered progression).
  • Stable Disease Neither a sufficient decrease to qualify as PR nor a sufficient increase to qualify as PD, taking as reference the smallest sum of diameters during the study.
  • the terms CR, PR, PD and SD are defined in accordance with the above definitions 1 to 4 taken from the revised RECIST Guidelines of Eisenhauer et al., Eur. J. Cancer, 45 (2009) 228-247.
  • the treatment comprises the administration of Gemcitabine associated with Erlotinib. More preferably, the treatment comprises the administration of intravenous Gemcitabine 1, 000 mg / m2, days 1, 8, and 15 4-week cycles associated with continuous daily oral Erlotinib 100 mg. The treatment will be administered until documented progression of the disease or unacceptable toxicity.
  • Another aspect of the invention relates to a method for monitoring the evolution of pancreatic adenocarcinoma in an individual, hereinafter third method of the invention, comprising performing at least twice the sequence of steps (a) - ( b) according to the first or second method of the invention, in biological samples from the same individual, and isolated at different times.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a modulating agent of at least one of the genes that are selected from ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3, and / or FAIM3, for Treat an individual diagnosed with pancreatic adenocarcinoma according to the methods of the invention.
  • the modulating agent is an inhibitor of the expression of said genes.
  • Another aspect of the invention relates to an antibody for treating an individual diagnosed with pancreatic adenocarcinoma, identifiable by a method of the invention, wherein the antibody is selected from among anti-ANKRD22, anti-ARG1, anti-S100A8, anti-LRRN3 , anti-CLEC4D, anti-VNN1, anti-F5, anti-IRAK3, and / or anti-FAIM3.
  • kit or device of the invention comprising the elements necessary to analyze the level of expression of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1 genes , F5, IRAK3, and / or FAIM3.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequence of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, and / or FAIM3 genes, for subsequent amplification by PCR.
  • the sequence of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3 and / or FAIM3 genes is the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 18, respectively.
  • the kit or device of the invention comprises TaqMan probes specific to Applied Biosystems ANKRD22: Ref. Hs00944018_m1; ARG1: Ref. Hs00968979_m1; S100A8: Ref. Hs00374264_g1; LRRN3: Ref. Hs00539582_s1; CLEC4D: Ref. Hs00431023_m1; VNN1: Ref. Hs01546812_m1; F5: Ref. Hs00914120_m1
  • IRAK3 Ref. Hs00936103_m1
  • FAIM3 Ref. Hs00193770_m1.
  • step (b) More preferably it comprises the means necessary to compare the amount detected in step (b) with a reference amount.
  • Said kit may contain all those reagents necessary to analyze the level of expression of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, and / or FAIM3 genes by any of the methods described hereinbefore.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • kits suitable for RQ-PCR a technique for quantifying sensitive and reproducible gene expression
  • the kit additionally comprises a polyT oligonucleotide primer in addition to the kit oligonucleotide (s).
  • oligonucleotide oligonucleotide (s) (hybridization probe) complementary to (part of) the target sequence of the RNA of interest.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • the number of spots is not limited in any way, there is a preferred embodiment in which the microarray is customized for the methods of the invention.
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequence of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3 genes, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, and / or FAIM3 More preferably, the sequence of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ⁇ RAK3 and / or FAIM3 genes is the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 18, respectively.
  • microarray of the invention comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or an mRNA of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D genes. , VNN1, F5, ⁇ RAK3, and / or FAIM3.
  • the sequence of the ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 and / or FAIM3 genes is the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 18, respectively.
  • oligonucleotide sequences are constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • oligonucleotides are anchored by the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • the oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • oligonucleotides per gene preferably about 40 oligonucleotides per gene are used.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • kits or devices for obtaining data useful in the diagnosis, prognosis or response to the treatment of pancreatic adenocarcinoma.
  • Another aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention (of the first or second method of the invention ).
  • Another aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • peripheral blood samples 12 ml of peripheral blood were collected from patients and control subjects in PAXgene tubes (PreAnakytix GmbH, Switzerland). Blood samples were collected at the Virgen de las Nieves Hospital (Granada) between January 2009, July 2012. Peripheral blood samples were left 24 hours at room temperature for stabilization.
  • pancreatic cancer ⁇ Pancreatic Ductal Adenocarcinoma PDAC
  • pancreatic cancer ⁇ Pancreatic Ductal Adenocarcinoma PDAC
  • RNA from PBMCs Isolation of total RNA from PBMCs
  • PAXgene ® Blood RNA system PreAnalytix GmbH, Switzerland
  • the protocol followed to extract the RNA from the collected blood cells was the protocol recommended by the manufacturer, without modifications.
  • RNA concentration and integrity was measured using a NanoDrop 2000c spectrophotometer (Thermo Scientific Wilmington, USA).
  • Hybridizations were carried out in whole human genome microarrays to identify potential PDAC markers.
  • Microarray hybridization, scanning and analysis were carried out in the Genomics Unit of the Andalusian Center for Molecular Biology and Regenerative Medicine (CABIMER, Sevilla).
  • Gene expression profiles of PBMC samples of patients with PDAC and healthy controls were carried out in Affymetrix microarrays. Briefly, 1 g of high quality total RNA was used to synthesize double stranded cDNA and then biotin-labeled cRNA was produced. The resulting biotin-labeled cRNA is recovered and purified and then the chips are hybridized. After being washed and dyed, the matrices (arrays) were scanned using a Gene-Chip Scanner 3000 7G (Affymetrix Inc).
  • the Log2 transformation was applied to all proportions, with data normalization. After normalization, the 40 subjects (20 with PDAC and 20 healthy controls) closest to normal values were selected.
  • RNA sample obtained from each RNA sample obtained.
  • the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) was used for reverse transcriptase PCR. Briefly, 1 g of total RNA was reverse transcribed using the MultiScribe TM reverse transcriptase according to the manufacturer's instructions, in a final volume of 20 ml. The program was as follows: 25 ° C 10 min, 37 ° C 120 min, 85 ° C 5nin.
  • the Q-RT-PCR was carried out from each cDNA sample. Each sample was run in quadruplicate and the GAPDH gene was used to normalize the results.
  • the cDNA was mixed with TaqMan Fast PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems) and with Taqman ® (Applied Biosystems) probes and primers corresponding to the previously selected genes in a reaction volume of 20 ⁇ .
  • VNN1 was the second that presented the greatest increase
  • RQ is the number of times the gene expression is increased compared to the control sample (healthy controls). Each sample is compared with the same control.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, kit y usos del mismo basado en la expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3.

Description

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO. PRONÓSTICO Y PREDICCIÓN DE RESPUESTA AL TRATAMIENTO DE ADENOCARCINOMA DE
PÁNCREAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuantitativo) específico, que se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El adenocarcinoma de páncreas {Pancreatic Ductal Adenocarcinoma PDAC por sus siglas en inglés) es una neoplasia epitelial de los ductos pancreáticos (Kloppel et al., 1996) y la cuarta primera cause de muerte por cáncer en el mundo (Sharma et al., 201 1 , JOP 12(4):343-6). PDAC tiene el peor pronóstico de todos los tumores gastrointestinales, con una tasa de mortalidad muy cercana al de la incidencia (Karanjawala et al., 2008, Am J Surg Pathol; 32:188-96). La actual tasa de supervivencia de pacientes afectados por PDAC es menor que un 5% (Sharma et al., 201 1 , JOP 12(4):343-6; Huang et al., 2010, Am J Gastroenterol 105(7):1661 -9).
La mayoría de casos de PDAC se detectan en estadios avanzados. El único tratamiento efectivo de PDAC continúa siendo la intervención quirúrgica. Pero en el momento del diagnóstico, no más del 20% de los pacientes son candidatos aptos para la cirugía y la supervivencia sigue siendo baja ya que las terapias adyuvante son poco efectivas (Sharma et al., 201 1 , JOP 12(4):343-6). Además, dentro del grupo de pacientes que pasaron por la cirugía solamente el 20% sobreviven más de 5 años post diagnóstico (Baine et al., 201 1 ; PLoS One, 6(2):e17014).
Es ampliamente aceptado que un tumor pancreático no se puede reseccionar cuando existen metástasis a distancia, (p.ej. hepático, extra-abdominal, peritoneo, nodulos linfáticos) (Li et al., 2004) o existe un tumor localmente avanzado. El último caso se define cuando hay un tumor invasivo de la arteria mesentérica superior, de la vena cava inferior, de la aorta, del tronco celiaco o de la vena mesentérica superior y el sistema venoso portal. Pero la realidad en el momento de realizar la cirugía puede ser más compleja y tumores sin invasión vascular pueden resultar no resecable debido a la desmoplasia (Kim et al., 2007) (Chang et al., 201 1 ; J Páncreas 201 1 ; 12(2):101 -105).
Por esto, aparte de la necesidad de nuevos avances en el tratamiento incluyendo tratamiento combinado, la detección temprana de PDAC será la estrategia más importante y efectiva para mejorar la supervivencia a largo plazo en el futuro. (Huang et al., 2010, Am J Gastroenterol 105(7):1661 -9).
Varios marcadores tumorales están asociados con PDAC, sin embargo, actualmente no existe un marcador apropiado para su detección (Sharma et al., 201 1 , JOP 12(4):343-6). El desafío es encontrar marcadores tempranos que puedan predecir el desarrollo de PDAC, descubrir la enfermedad en el estado resecable y guiar en la terapia. El marcador más conocido es CA19-9, o antígeno sialilado Lewis (Buxbaum et al., 2010; JOP 1 1 (6):536-44.), con una sensibilidad promedio del 80% y especificidad del 90% (Steinberg et al., 1990; Am J Gastroenterol; 85:350-5). CA19-9 puede ser útil para monitorizar el tratamiento y determinar si la enfermedad puede ser recurrente (Locker et al., 2006, J. Clin. Oncol;. 24 (33): 5313-27). Sin embargo, los niveles de CA19-9 no son suficientes para identificar estadios primarios de PDACs, y solo el 65% de pacientes con cáncer pancreático resecable presentan niveles elevados de este antígeno (Goggins et al., 2005; J Clin Oncol; 23:4524-31 ).
Distintas técnicas se han utilizado para encontrar marcadores, incluyendo el desarrollo de microarrays de cDNA para analizar el perfil de expresión génica en pacientes con respecto a individuos sanos. Esta técnica es frecuentemente uno de los primeros pasos en la búsqueda de marcadores para diagnóstico. La reciente secuenciación de genoma humano y los avances en tecnologías de microarrays de DNA permiten un análisis genético rápido y han revolucionado la forma de estudiar el cáncer hoy en día. Esta aproximación innovadora para estudiar el cáncer permitirá un mejor entendimiento de la tumorogénesis, un diagnóstico y un pronóstico más preciso, e intervenciones terapéuticas más efectivas
El perfil de expresión génica global de microarrays proporciona información importante acerca de las características moleculares del cáncer, y es ampliamente utilizado para el desarrollo de biomarcadores. Para PDAC, el primer perfil de expresión génica de RNA de tejido que estaba basado en microarrays se publicó en 2002 (Lacobuzio-Donahue et al., 2002; Am J Pathol 160(4):1239-49). Desde entonces, se han identificado muchos tipos de genes cuya expresión se desregula en el cáncer primario de páncreas en comparación con el tejido pancreático normal, lo cual puede ser muy útil para la detección del cáncer pancreático, de sus estadios, o para predecir su pronóstico (Karanjawala et al., 2008, J Surg Pathol 32:188-96). Sin embargo, la dificultad de esos estudios es la obtención de especímenes de pacientes ya que la biopsia es un método invasivo, muchas veces no se puede realizar y algunas veces da lugar a complicaciones. Por esto, esta técnica no es válida para la detección temprana de cáncer pancreático. Por otro lado, el estudio de biomarcadores en sangre periférica es un método no invasivo que puede ser utilizado reiteradamente (Huang et al., 2010, Am J Gastroenterol 105(7):1661 -9).
La sangre periférica es una fuente accesible de células con las cuales investigar importantes cuestiones. Además, las células circulantes pueden ser vistas como exploradores, continuamente manteniendo una vigilancia exhaustiva de señales de infección u otras amenazas en el cuerpo (Whitney et ai, 2003. Proc Nati Acad Sci U S A 100(4):1896-901 ). En los últimos años se ha demostrado que la expresión genética en PBMCs {Peripheral Blood Mononuclear Cells) se altera como si fuera una firma asociada a la enfermedad (Whitney et al., 2003; Proc. Nati. Acad. Sci. U S A; 100(4): 1896-901 ) (Huang et al., 2010, Am J Gastroenterol 105(7):1661 -9) Estas células mononucleares han surgido en los últimos años como marcadores de varias enfermedades inflamatorias (por ejemplo, pancreatitis crónica) (Bluth et al., 2008. Arch Surg 143: 227-234.) y tumorales (por ejemplo, leucemia linfática crónica) (Baine et ai, 201 1 ; PLoS One, 6(2):e17014).
Por lo tanto, las células mononucleares circulantes de sangre periférica pueden servir como un controlador del estado fisiológico del organismo. Cuando estas células pasan a través de varios tejidos, su reacción con el medio se capta en una respuesta transcripcional compleja que se mide a través de un perfil. Existen evidencias de que las células sanguíneas comunican con las células y matrices extracelulares en casi todos los tejidos y órganos del cuerpo (Liotta et ai., 2003; Nature; 425(6961 ):905).
El perfil de expresión genético diferencial de PBMCs, o de unos genes predeterminados establecidos a partir de dicho perfil, es potencialmente una herramienta muy útil para el diagnóstico temprano. Esto es de especial importancia considerando que dos de los mecanismos más probables en los que se basa esta expresión diferencial serían el reconocimiento y al mismo tiempo la evasión del cáncer por el sistema inmune. Mientras que otros biomarcadores como CA19-9 se liberan de células cancerosas y aumentan con el aumento de la carga tumoral, la expresión diferencial en PBMCs podría comenzar, al menos parcialmente, tan pronto como la evasión inmune o la inmugenicidad del cáncer se establece. Se ha demostrado que la evasión del sistema inmune se inicia antes de que la enfermedad se considere maligna en PDAC. Por lo tanto, el análisis de la expresión genética diferencial en células inmunes podría ofrecer la capacidad de detectar lesiones neoplásicas incluso antes de que adquiera carácter invasivo (Baine et al., 201 1 . PLoS One. 201 1 ; 6(2): e17014).
En el caso del cáncer de páncreas se han realizado microarrays de proteínas para detección de marcadores en suero (Orchekowski et al., 2005; Cáncer fíes, 65:1 1 193-202), así como microarrays de cDNA, para detectar genes sobrexpresados en el epitelio neoplásico en 10 cánceres de páncreas comparados con 10 muestras de páncreas no tumoral (Logsdon et al., 2003. Cáncer fíes 63:2649-57). Investigadores de la Universidad de Ulm, aprovechando el conocimiento de estudios previos de perfil de expresión genética de cáncer de páncreas, diseñaron un array diagnóstico de cDNA para el diagnóstico diferencial de tumores pancreáticos basado en el perfil de expresión de biopsias obtenidas con aspiración mediante aguja fina, puesto que más del 90% de tumores pancreáticos representan adenocarcinomas ductales; según estos autores los resultados permitían diferenciar adenocarcinomas ductales de tumores no malignos de páncreas con un 95% de especificidad (Buchloz et al., 2005. Clin Cáncer fíes, 1 1 (22):8048- 54). Así mismo se han realizado estudios comparativos de los análisis de microarrays utilizados en cáncer de páncreas a fin de encontrar genes y biomarcadores que pudiesen ser utilizados en nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas (Brandt et al., 2004. Pancreatology A: 587-597).
Puesto que el diagnóstico precoz es esencial en PDAC con el fin de obtener una resección curable y para mejorar el pronóstico, sólo el 15-20% de los pacientes son diagnosticados de PDAC con enfermedad resecable, la tenaz resistencia de los tumores malignos a la quimioterapia y a la radioterapia, y el biomarcador CA19-9, considerado actualmente como el mejor, no es útil en sujetos asintomáticos, es importante, por tanto, encontrar biomarcadores que puedan emplearse para el diagnóstico precoz del adenocarcinoma de páncreas, y para predecir la respuesta al tratamiento.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han seleccionado un grupo de genes cuya expresión está correlacionada con el diagnóstico precoz, el pronóstico y la respuesta al tratamiento del adenocarcinoma de páncreas. La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico precoz de adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes. Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de cualquiera de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3 o cualquiera de sus combinaciones, para el diagnóstico, para el pronóstico, o para la predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso simultáneo de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3 para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas. Sin embargo, el uso independiente de cualquiera de ellos o de cualquiera de sus combinaciones podrían ser suficientes para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad.
MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO, PRONÓSTICO Y PREDICCIÓN DE LA RESPUESTA CON QUIMIOTERAPIA
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas, que comprende:
(a) obtener una muestra biológica aislada que comprende células de un individuo, y
(b) detectar el nivel de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra aislada de (a), y
(c) comparar la expresión del gen o los genes del paso (b) con una cantidad de referencia.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
(a) obtener una muestra biológica aislada que comprende células de un individuo, y
(b) detectar simultáneamente el nivel de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 en la muestra aislada de (a), y (c) comparar la expresión de los genes del paso (b) con una cantidad de referencia.
Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento del adenocarcinoma de páncreas en un individuo, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) - (c) según el primer método de la invención, y además comprende:
(d) diagnosticar al individuo del paso (a) como un individuo con adenocarcinoma de páncreas, cuando presente una expresión aumentada de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3, en la muestra obtenida en (a), en relación a la cantidad de expresión detectada para dichos genes en una población de pacientes de referencia. Más preferentemente, la expresión de dichos genes es dos veces la expresión basal en la población de referencia.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periférica, y/o comprende células de sangre periférica {perípheral blood mononuclear cells PBMCs).
Los estudios de los autores de la presente invención han permitido obtener información sobre los patrones de expresión de genes en pacientes afectos de adenocarcinoma irresecable de páncreas frente a sujetos control. El estudio mediante técnicas informáticas de los resultados obtenidos, ha permitido obtener un modelo de las modificaciones que son significativas en este tipo de patología.
Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, el adenocarcinoma de páncreas es irresecable.
La detección de la expresión de los genes puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la expresión de manera cuantitativa permite diferenciar entre el paciente con adenocarcinoma de páncreas y el individuo sano.
La medida de la concentración, preferiblemente de manera cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas a las que se traducen, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de RNA o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de los niveles de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 en la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con los niveles de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3 de una o varias muestras de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de la proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3 y FAIM3, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 y FAIM3, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleotidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleotidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3 y FAIM3, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 y FAIM3 puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.
Más preferentemente, la detección de los niveles de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3 se realiza mediante Q-RT-PCR.
La PCR cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR) es una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible que se puede usar de manera particular para la expresión del perfil génico en células y tejidos. Se puede usar cualquier procedimiento para la evaluación de los resultados de la RT-PCR y se puede preferir el procedimiento AACt. El procedimiento AAC\ se describe en detalle en Livak y col. (Methods 2001 , 25:402-408). (Ct = Valores umbral del ciclo). Cuando se lleva la presente invención a la práctica, se deberá usar preferiblemente el procedimiento AACt tal como describen Livak y col. (Methods 2001 , 25:402-408). El procedimiento AACt implicará una "muestra del control" y una "muestra del sujeto". La "muestra del sujeto" es una muestra procedente del sujeto que se va a analizar. Por cada muestra, se incluyen un gen diana (aquí: el gen de interés) y un gen endógeno del control (tal como se describe a continuación) para la amplificación de la PCR a partir de alícuotas (normalmente diluciones en serie). Normalmente se usan varias réplicas de cada concentración diluida para derivar la eficacia de la amplificación. La eficacia de la amplificación de la PCR se puede definir como el porcentaje de amplificación (de 0 a 1 ). Durante la reacción de la qPCR, un software mide normalmente el número de ciclos de cada muestra en el cual la fluorescencia cruza una línea arbitraria (indicadora de la amplificación de la PCR), el umbral. Este punto de cruce es el valor Ct. Muestras más diluidas cruzarán a valores Ct posteriores. Para cuantificar la expresión génica de un gen particular, se divide el Ct de un ácido nucleico procedente del gen de interés por el Ct del ácido nucleico procedente del control endógeno en la misma muestra para normalizar la variación en la cantidad y calidad del ARN entre diferentes muestras y obtener la expresión relativa (con respecto al control endógeno) de cada una de la "muestra del sujeto" y de la "muestra del control". Opcionalmente, esto se lleva a cabo por duplicado, triplicado, cuadriplicado y de manera similar, respectivamente. Se puede obtener de manera adecuada un valor ACt del control calculando el promedio de los valores ACt obtenidos a partir de muestras de un grupo del control de varios individuos con los cuales se van a comparar los valores de la "muestra del sujeto". El grupo del control (del cual se calcula el valor promedio) consiste en los individuos adecuados a los respectivos fines (de comparación). La persona experta aprenderá de esta divulgación que un grupo de control adecuado es para un fin concreto. En una realización particular, la presente invención se puede llevar a la práctica omitiendo la determinación del valor ACt del grupo del control, es decir, determinar (solo) el valor ACt de la "muestra del sujeto" y a continuación comparando posteriormente este con el respectivo valor ACt promedio del control indicado en los ejemplos.
Como se ha dicho, otros métodos están también disponibles en el estado de la técnica, como por ejemplo la Transferencia Northern Blot, o los microarrays.
Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención la detección del producto de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 se realiza mediante Transferencia Northern Blot. En otro aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 se realiza mediante microarrays.
El gen ANKRD22 ó nkyrín repeat domain-containing protein 22, se encuentra en el cromosoma 10.
En el contexto de la presente invención, ANKRD22 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ANKRD22. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 2.
El gen ARG1 ó arginase, liver, (arginase-1 ; liver-type arginase; type I arginase) se encuentra en el cromosoma 6 (6q23).
En el contexto de la presente invención, ARG1 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 3, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 3,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 3, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ARG1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 4.
El gen S100A8 ó S100 calcium binding protein A8, (60B8AG, CAGA, CFAG, CGLA, CP-10, L1 Ag, MA387, MIF, MRP8, NIF, P8, RP-8; S100 calcium-binding protein A8 (calgranulin A); calgranulin A; calgranulin-A; calprotectin L1 L subunit; cystic fibrosis antigen; leukocyte L1 complex light chain; migration inhibitory factor-related protein 8; protein S100-A8; urinary stone protein band A) se encuentra en el cromosoma 1 (1 q21 ).
En el contexto de la presente invención, S100A8 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 5, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 5,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 5, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína S100A8. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 6.
El gen LRRN3 ó leucine rich repeat neuronal 3, (Nbla10363, FIGLER5, NLRR-3, NLRR3, fibronectin type III, immunoglobulin and leucine rich repeat domains 5; leucine- rich repeat neuronal protein 3; leucine-rich repeat protein, neuronal 3; neuronal leucine-rich repeat protein 3) se encuentra en el cromosoma 7 (7q31 .1 ).
En el contexto de la presente invención, LRRN3 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 7, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 7,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 7, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína LRRN3. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 8.
El gen CLEC4D ó C-type lectin domain family 4, member D, (MCL; MPCL; CLEC6; CLEC-6; CLECSF8) se encuentra en el cromosoma 12 (12p13.31 ).
En el contexto de la presente invención, CLEC4D se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 9, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 9,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CLEC4D. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 10.
El gen VNN1 ó vanin 1, (HDLCQ8, Tiff66; CLECSF8, pantetheinase; pantetheine hydrolase; vanin-1 ; vannin 1 ; vascular non-inflammatory molecule 1 ) se encuentra en el cromosoma 6 (6q23-q24). En el contexto de la presente invención, VNN1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína VNN1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 12.
El gen F5 ó coagulation factor V (proaccelerin, labile factor), (FVL, PCCF, RPRGL1 , THPH2, activated protein c cofactor; coagulation factor V; coagulation factor V jinjiang A2 domain; factor V Leiden; proaccelerin, labile factor) se encuentra en el cromosoma 1 (1 q23).
En el contexto de la presente invención, F5 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 13, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 13,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 13, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína F5. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 14. El gen ÍRAK3 ó interleukin-1 receptor-associated kinase 3, (ASRT5, IRAKM. IL-1 receptor-associated kinase M) se encuentra en el cromosoma 12 (12q14.3).
En el contexto de la presente invención, IRAK3 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 15, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 15,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 15, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IRAK3. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 16.
El gen FAIM3 ó Fas apoptotic inhibitory molecule 3, (FCMR, TOSO, Fe mu receptor; IgM Fe receptor; fas apoptotic inhibitory molecule 3; immunoglobulin mu Fe receptor; regulator of Fas-induced apoptosis Toso) se encuentra en el cromosoma 1 (1 q32.1 ).
En el contexto de la presente invención, FAIM3 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 17, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 17,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 17, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína FAIM3. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 18.
El término "diagnóstico", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a la capacidad de discriminar entre individuos afectados o no por adenacarcinoma de páncreas.
En la presente invención "pronóstico" se entiende como la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1 , 0,05.
Por "predicción de la respuesta" se entiende, en el contexto de la presente invención, la determinación de la probabilidad de que el paciente responda de forma favorable o desfavorable a una terapia o a un tratamiento determinado, incluyendo el tratamiento quirúrgico. Especialmente, el término "predicción", como se usa aquí, se refiere a una evaluación individual de cualquier parámetro que pueda ser útil en determinar la evolución de un paciente. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta clínica al tratamiento, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados o evaluados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que tienen una probabilidad aumentada de tener una respuesta positiva. El experto en la materia puede determinar fácilmente si un sujeto es estadísticamente significativo usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de los valores de p, prueba t de Student, prueba de Mann Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%), al menos del 95%>. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1 ó 0,05. La predicción de la respuesta clínica se puede hacer utilizando cualquier criterio de valoración usado en oncología y conocido por el experto en la materia.
A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos o tratamiento adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001 . Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada comprende células mononucleares de sangre periférica {peripheral blood mononuclear cells PBMCs).
En esta memoria se entiende por célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) una célula sanguínea caracterizada por poseer un único núcleo redondo, como los linfocitos, los monocitos o los macrófagos. Estas células sanguíneas son un componente crítico en el sistema inmune, concretamente para combatir las infecciones. La población de linfocitos está formada por células T (CD4 y CD8 positivas~75%).
Estas células se obtienen a menudo de la sangre usando fícol, un polisacárido hidrofílico que separa capas de la sangre, con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la capa del plasma. Este buffy contiene las PBMCs. Existen otros métodos de extracción conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, extraerlas a partir de la sangre total con una solución de lisis hipotonica que preferiblemente lisa las células rojas sanguíneas. Este método da lugar a neutrófilos y otras células polimorfonucleares (PMN) importantes en la defensa inmune innata.
El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión constitutiva de los genes, en un grupo de individuos sanos, o de la expresión de los genes en el grupo de individuos antes de ser sometidos al tratamiento.
La cantidad de referencia será, por ejemplo, en el caso de la diferenciación entre los pacientes afectados por adenocarcinoma de páncreas de los individuos sanos, la expresión constitutiva del gen en un grupo control de individuos sanos. Sin embargo, en el caso de la subclasificación de los pacientes afectados por adenocarcinoma de páncreas en función de sus manifestaciones, el grupo control estará formado por un grupo de enfermos con adenocarcinoma de páncreas que no tuvieron esa manifestación clínica. También, en el caso de la predicción de la respuesta al tratamiento, las muestras de referencia pueden ser obtenidas de los individuos en distintas fases del tratamiento. Así pues, la muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, obtenidas a partir de las células sanguíneas de un paciente con adenocarcinoma de páncreas, en una determinada fase clínica. En otra realización preferida de este aspecto de la presente invención, la cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse también, por ejemplo, de los límites de distribución normal de una cantidad encontrada en muestras obtenidas de una población de individuos con adenocarcinoma de páncreas en distintas fases, mediante técnicas estadísticas bien conocidas. En otra realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de los pacientes antes y después del tratamiento.
Los niveles de expresión de uno o más de estos genes pueden ser indicativos de la respuesta o la falta de respuesta de un sujeto al tratamiento. En una realización, la respuesta es una reducción de la carga tumoral. En una realización alternativa, la respuesta es un resultado clínico, que implica una mejora del estado del paciente o ausencia de deterioro. En otra realización, la respuesta es una supervivencia exenta de progresión o un aumento de la supervivencia global.
La evaluación de la respuesta completa y/o la respuesta parcial es un factor importante para determinar el estado de un paciente individual. De esta manera, es necesario estimar la carga total del tumor en el valor inicial y usar ésta como elemento comparador para las posteriores medidas que se llevan a cabo normalmente de acuerdo con las directrices RECIST revisadas, Eisenhauer y col., Eur. J. Cáncer, 45 (2009) 228-247 (versión 1 .1 .), en particular las definiciones de los criterios utilizados para determinar la respuesta, las proporciona Eisenhauer y col. de acuerdo con las siguientes definiciones:
1 . Respuesta Completa (CR): Desaparición de todas las lesiones diana. Cualquier nodulo linfático patológico (tanto diana como no diana) debe tener reducción en el eje hasta <10 mm.
2. Respuesta Parcial (PR): Al menos una disminución del 30% en la suma de diámetros de las lesiones diana, tomando como referencia el valor inicial de la suma de diámetros.
3. Enfermedad Progresiva (PD): Al menos un aumento del 20% en la suma de diámetros de las lesiones diana, tomando como referencia la suma más pequeña en el estudio (esto incluye el valor inicial de la suma si este es el más pequeño del estudio). Además del aumento relativo del 20%, la suma debe también demostrar un aumento absoluto de al menos 5 mm. (Nota: la aparición de una o más nuevas lesiones se considera también progresión).
4. Enfermedad Estable (SD): Ni una disminución suficiente para calificarla como PR ni un aumento suficiente para calificarla como PD, tomando como referencia la suma de diámetros más pequeña durante el estudio.
A lo largo de la presente invención, los términos CR, PR, PD y SD se definen de acuerdos con las definiciones 1 a 4 anteriores tomadas de las Directrices RECIST revisadas de Eisenhauer y col., Eur. J. Cáncer, 45 (2009) 228-247. En una realización preferida de este aspecto, el método de predicción de la respuesta al tratamiento comprende analizar dos muestras, una muestra obtenida a tiempo 0 (T1 =0), antes del tratamiento, y otra muestra después del tratamiento (T2=X), siendo X un intervalo de días cualesquiera. Más preferentemente, el tratamiento comprende la administración de Gemcitabina asociado a Erlotinib. Más preferiblemente, el tratamiento comprende la administración de Gemcitabina 1 .000 mg/m2 intravenosa, días 1 , 8, y 15 de ciclos de 4 semanas asociado a Erlotinib oral 100 mg diario continuo. El tratamiento se administrará hasta progresión documentada de la enfermedad o toxicidad inaceptable. En otra realización preferida, las muestras se toman con un intervalo de 15 días (T2=15).
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el seguimiento de la evolución del adenocarcinoma de páncreas en un individuo, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (b) según el primer o el segundo método de la invención, en muestras biológicas procedentes de un mismo individuo, y aisladas en momentos diferentes.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, y/o FAIM3, para tratar un individuo diagnosticado de adenocarcinoma de páncreas según los métodos de la invención. Preferiblemente, el agente modulador es un inhibidor de la expresión de dichos genes.
Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo para tratar un individuo diagnosticado de adenocarcinoma de páncreas, identificable por un método de la invención, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-ANKRD22, anti-ARG1 , anti- S100A8, anti-LRRN3, anti-CLEC4D, anti-VNN1 , anti-F5, anti-IRAK3, y/o anti-FAIM3.
KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO, MICROARRAY Y USOS
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de aquí en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar el nivel de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3. En otra realización preferida el kit puede contener oligonucleótido diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3, para la posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente, la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3 y/o FAIM3 es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y/o SEQ ID NO: 18, respectivamente.
En otra realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende las sondas TaqMan específicas de Applied Biosystems ANKRD22: Ref. Hs00944018_m1 ; ARG1 : Ref. Hs00968979_m1 ; S100A8: Ref. Hs00374264_g1 ; LRRN3: Ref. Hs00539582_s1 ; CLEC4D: Ref. Hs00431023_m1 ; VNN1 : Ref. Hs01546812_m1 ; F5: Ref. Hs00914120_m1
IRAK3: Ref. Hs00936103_m1 ; FAIM3: Ref. Hs00193770_m1 .
Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar el nivel de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3 por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
En el caso de un kit adecuado para la RQ-PCR, una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible, se desea que el kit comprenda adicionalmente un cebador del oligonucleótido poliT además del(de los) oligonucleótido(s) del kit. Estos reactivos pueden estar comprendidos opcionalmente en el kit. Una Transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño y la posterior detección con un(os) oligonucleótido(s) (sonda de hibridación) complementaria con (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3Más preferiblemente, la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3 y/o FAIM3 es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y/o SEQ ID NO: 18, respectivamente.
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonuleotidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, y/o FAIM3. Más preferiblemente, la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 y/o FAIM3 es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y/o SEQ ID NO: 18, respectivamente.
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonuleotidos son construidas en la superficie de un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleoitidos. Para la cuantificacion de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo, la micromatriz, o el microarray de la invención, de la para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o la respuesta al tratamiento del adenocarcinoma de páncreas.
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención (del primer o del segundo método de la invención).
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los métodos de la invención para obtener datos útiles en el diagnóstico y pronóstico de adenocarcinoma de páncreas, así como para el seguimiento de dicha enfermedad.
Materiales y métodos
Población del estudio
Estudio aprobado por el comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Universitario Virgen de las Nieves de Granada, en el cual se han estudiado 24 pacientes con adenocarcinoma de páncreas comparando con un grupo de 24 sujetos sanos. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron antes de someterles al tratamiento quimioterapéutico (T0) y después de quince días de dicho tratamiento (T15d) utilizando para cada paciente y tiempo de toma de muestra, 4 tubos que contienen un estabilizador de RNA.
Se recogieron 12 mi de sangre periférica de pacientes y sujetos control en tubos PAXgene (PreAnakytix GmbH, Suiza). Las muestras de sangre fueron recolectadas en el Hospital Virgen de las Nieves (Granada) entre enero de 2009 julio de 2012. Las muestras de sangre periférica se dejaron 24 horas a temperatura ambiente para la estabilización.
El diagnóstico de cáncer de páncreas {Pancreatic Ductal Adenocarcinoma PDAC) se basó en una biopsia positiva de una masa pancreática o una lesión metastásica. Todas las muestras se recogieron antes de la quimioterapia para el PDAC.
Aislamiento del RNA total a partir de las PBMCs Para obtener el ARN total a partir de PBMCs se utilizó el sistema PAXgene ® Blood RNA (PreAnalytix GmbH, Suiza), que consta de los Tubos para la recogida del ARN de la sangre PAXgene y del PAXgene Blood RNA Kit para el aislamiento y la purificación de ARN basado en membrana de sílice, en formato de spin-column. El protocolo seguido para extraer el ARN a partir de las células de sangre recogidas fue el protocolo recomendado por el fabricante, sin modificaciones.
Para todas las muestras, se cuantificó el ARN obtenido. La concentración y la integridad del ARN se midió utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific Wilmington, EE.UU.).
Hibridación de microarrays de cDNA de PBMCs
Se llevaron a cabo hibridaciones en microarrays de genoma humano completo para identificar potenciales marcadores de PDAC. La hibridación del microarray, el escaneado y el análisis se llevaron a cabo en la Unidad de Genómica del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER, Sevilla). Se llevaron a cabo perfiles de expresión génica de muestras de PBMC de pacientes con PDAC y controles saludable en microarrays de Affymetrix. Brevemente, 1 g de ARN total de alta calidad se usó para sintetizar ADNc de doble cadena y, a continuación se produjo cRNA marcado con biotina. El resultante cRNA marcado con biotina se recupera y se purifica y luego se hibridan los chips. Después de ser lavados y teñidos, las matrices (los arrays) fueron escaneados utilizando un Gene-Chip Scanner 3000 7G (Affymetrix Inc).
Análisis del perfil de expresión génica global de PBMCs
Se aplicó a todas las proporciones la transformación Log2, con normalización de los datos. Después de la normalización, se seleccionaron los 40 sujetos (20 con PDAC y 20 controles sanos) más cercana a los valores normales.
A partir de los datos normalizados obtenidos, se seleccionaron los genes que se consideraban más probable que se expresaran de forma diferente en pacientes versus controles, aplicando el paquete de software para el análisis de la expresión génica de datos de microarrays LIMMA (linear models for microarray data - modelos lineales para datos de microarrays ) (Smyth et al., 2005) Q-RT-PCR para validar los datos de microarrays
Con el fin de obtener cDNA para estudios de expresión, se realizaron PCRs con la transcriptasa inversa y cebadores aleatorios para cada muestra de RNA obtenida. Para la PCR de transcriptasa inversa se empleó el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Brevemente, 1 g de ARN total se transcribió de forma inversa usando la transcriptasa inversa MultiScribe ™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en un volumen final de 20 mi. El programa fue el siguiente: 25 ° C 10 min, 37 ° C 120 min, 85 ° C 5nin.
A continuación, los resultados de la hibridación de los microarrays fueron validados por Q-RT-PCR utilizando el StepOne Plus the Real-Time PCR System (Applied BioSystems). Se seleccionó un conjunto de 20 muestras de PBMC de los pacientes con PDAC y una mezcla de cDNA obtenida a partir de 20 sujetos sanos se utilizó como control.
Se llevó a cabo la Q-RT-PCR a partir de cada muestra de ADNc. Cada muestra se corrió en cuadriplicado y el gen GAPDH se utilizó para normalizar los resultados. El cDNA fue mezclado con TaqMan Fast PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems) y con sondas y cebadores Taqman ® (Applied Biosystems) correspondientes a los genes previamente seleccionados en un volumen de reacción de 20 μΙ.
RESULTADOS
Análisis cDNA microarray del perfil de expresión génica global de PBMCs
Un total de 9 genes fueron identificados como significativamente aumentados entre el grupo PDAC y el grupo de control (Tabla 1 ).
Tabla 1 . Genes significativamente aumentados en pacientes PDAC.
Genes FC AveExpr T P -Valor Adj. P -Val B
ANKRD22 3.26 6.32 7.70 6.84E-10 9.96E-06 12.09
ARG1 2.83 5.89 4.44 5.29E-05 0.00922339 1 .83
S100A8 2.79 10.82 5.06 6.66E-06 0.00314132 3.73
LRRN3 2.57 5.88 4.72 2.09E-05 0.00481845 2.68 CLEC4D 2.36 7.04 5.28 3.22E-06 0.00293166 4.39
VNN1 2.34 7.87 5.05 6.94E-06 0.00314132 3.69
F5 2.11 8.02 5.79 5.45E-07 0.00084033 6.01
IRAK3 2.10 8.91 5.98 2.85E-07 0.00084033 6.61
FAIM3 2.02 9.09 4.85 1.38E-05 0.00392863 3.06
Verificación por Q-RT-PCR
A partir de los 9 genes identificados como upregulated (significativamente aumentados) en sangre en pacientes con PDAC mediante el análisis de microarrays, varios de ellos fueron inicialmente seleccionados para la validación por RT-PCR, incluido VNN1. VNN1 fue el segundo que presentó mayor aumento
Los resultados fueron analizados con el StepOne Software 2.0
Después de analizar las muestras de 18 pacientes en varias ocasiones mediante RT- PCR, se eliminaron aquellos valores que se desviaban de la media.
Tabla 2. Valores del incremento en número de veces, obtenidos de la Q-RT-PCR realizada.
PACIENTE ANKRD22 CLEC4D VNN1 IRAK3
1 - 1.202 - 1.893
2 - 1.248 1.276 1.400
3 4.032 1.064 1.532 2.134
5 1.444 0.981 1.926 2.08
6 1.636 0.879 1.480 1.846
9 4.557 2.006 0.836 1.900
10 2.310 1.889 1.150 1.877
11 4.298 1.602 3.860 1.595
12 1.736 1.311 1.440 1.409
13 4.404 0.960 1.260 1.694
14 0.519 1.076 2.840 2.258
15 0.785 1.636 7.785 2.951
18 1.486 5.350 1.650 2.869
19 6.076 2.281 2.491 1.891
20 0.659 1.654 1.506 1.941
21 2.338 2.252 1.122 3.378
22 0.370 1.797 3.606 1.340 24 2.592 1 .593 1 .199 2.876
TOTAL 3.06 (3.26) (2.36) 2.174 (2.34) 2.074 (2.10)
Tabla 3. Comparación de los valores obtenidos con Q-RT-PCR y con microarrays.
Figure imgf000028_0001
Los resultados muestran que la media del nivel de expresión de dichos genes es mayor de dos veces la expresión basal en la población de referencia.
La RQ, cuantificación relativa, es el exponencial de AAC\ (RQ = 2-AACt). En resumen, la RQ es el número de veces que se encuentra aumentada la expresión del gen en comparación con la muestra de control (controles sanos). Cada muestra se compara con el mismo control.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - El uso de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas.
2. - Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas que comprende:
(a) obtener una muestra biológica aislada que comprende células de un individuo, y
(b) detectar simultáneamente el nivel de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3 en la muestra aislada de (a).
(c) comparar la expresión de los genes del paso (b) con una cantidad de referencia.
3. - Un método para el diagnóstico, pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas en un individuo, que comprende los pasos (a) - (c) según el primer método de la invención, y además comprende
(d) diagnosticar al individuo del paso (a) como un individuo con adenocarcinoma de páncreas, cuando presente una expresión aumentada de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3, en la muestra obtenida en (a), en relación a la cantidad de expresión detectada para dichos genes en una población de pacientes de referencia.
4. - El método según la reivindicación anterior, donde el nivel de expresión de dichos genes es dos veces la expresión basal en la población de referencia.
5. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la muestra se obtiene de sangre periférica y/o comprende células de sangre periférica {peripheral blood mononuclear cells PBMCs).
6. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde el adenocarcinoma de páncreas es irresecable.
7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la detección de los niveles de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 se realiza mediante Q-RT-PCR.
8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-6 donde la detección de los niveles de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 se realiza mediante Transferencia Northern Blot.
9. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-6 donde la detección de los niveles de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, FAIM3 se realiza mediante microarrays.
10. - Un método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas en un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, que comprende analizar dos muestras, una muestra obtenida a tiempo 0 (T1 =0), antes del tratamiento, y otra muestra después del tratamiento (T2=X).
1 1 . - El método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia del adenocarcinoma de páncreas en un individuo según la reivindicación anterior, donde T2 es igual a 15 días.
12. - El método para predecir la respuesta al tratamiento del adenocarcinoma de páncreas en un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 10-1 1 , donde el tratamiento con quimioterapia comprende la administración de Gemcitabina y Erlotinib.
13. - El método para predecir la respuesta al tratamiento del adenocarcinoma de páncreas en un individuo según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde el tratamiento con quimioterapia comprende la administración de Gemcitabina 1 .000 mg/m2 intravenosa, días 1 , 8, y 15 en ciclos de 4 semanas asociada a Erlotinib oral 100 mg diario continuo.
14. - Un método para el seguimiento de la evolución del adenocarcinoma de páncreas en un individuo que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (b) según cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en muestras biológicas procedentes de un mismo individuo, y aisladas en momentos diferentes.
15. - Una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3, para tratar un individuo diagnosticado de adenocarcinoma de páncreas según el método de cualquiera de las reivindicaciones 2- 9.
16. - Un anticuerpo para tratar un individuo diagnosticado de adenocarcinoma de páncreas, identificable por un método según cualquiera de las reivindicaciones 2-9, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-ANKRD22, anti-ARG1 , anti-S100A8, anti-LRRN3, anti-CLEC4D, anti-VNN1 , anti-F5, anti-IRAK3, y/o anti-FAIM3.
17. - Un kit o dispositivo que comprende las herramientas moleculares necesarias para detectar el nivel de expresión de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, FAIM3.
18. - El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3 y/o FAIM3.
19. - El kit o dispositivo según la reivindicación 18, donde la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3 y/o FAIM3 es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y/o SEQ ID NO: 18, respectivamente.
20. - El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 17-18, que comprende las sondas TaqMan específicas de Applied Biosystems ANKRD22: Ref. Hs00944018_m1 ; ARG1 : Ref. Hs00968979_m1 ; S100A8: Ref. Hs00374264_g1 ; LRRN3: Ref. Hs00539582_s1 ; CLEC4D: Ref. Hs00431023_m1 ; VNN1 : Ref. Hs01546812_m1 ; F5: Ref. Hs00914120_m1 ; IRAK3: Ref. Hs00936103_m1 ; y/o FAIM3: Ref. Hs00193770_m1 .
21 . - Una micromatriz que comprende oligonucleótidos capaces de hibridar con la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, y/o FAIM3.
22. Una micromatriz según la reivindicación anterior donde los oligonucleótidos están diseñados a partir de una secuencia conocida o de un ARNm de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, y/o FAIM3.
23. - Un microarray que comprende oligonuleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, ÍRAK3, y/o FAIM3.
24. - La micromatriz según cualquiera de las reivindicaciones 21 -22 o el microarray según la reivindicación 23, donde la secuencia de los genes ANKRD22, ARG1, S100A8, LRRN3, CLEC4D, VNN1, F5, IRAK3, y/o FAIM3 es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y/o SEQ ID NO: 18, respectivamente.
25. - El uso del kit, la micromatriz o el microarray según cualquiera de las reivindicaciones 17-24, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o para predecir la respuesta al tratamiento del adenocarcinoma de páncreas
26. - Un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 2-14.
27. - Una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 2-14.
PCT/ES2013/070786 2012-11-14 2013-11-12 Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento de adenocarcinoma de páncreas WO2014076342A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP201231761 2012-11-14
ES201231761 2012-11-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014076342A1 true WO2014076342A1 (es) 2014-05-22

Family

ID=50730631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2013/070786 WO2014076342A1 (es) 2012-11-14 2013-11-12 Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento de adenocarcinoma de páncreas

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2014076342A1 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020254667A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Universidad De Granada Series of metabolites as biomarkers for the diagnosis of pancreatic cancer
WO2021052049A1 (zh) * 2019-09-17 2021-03-25 浙江大学 以ankrd22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAINE MICHAEL J ET AL.: "Transcriptional profiling of peripheral blood mononuclear cells in pancreatic cancer patients identifies novel genes with potential diagnostic utility..", PLOS ONE UNITED STATES, vol. 6, no. 2, 30 November 2010 (2010-11-30), pages e17014, ISSN: 1932-6203 *
HUANG HAI ET AL.: "Novel blood biomarkers of pancreatic cancer-associated diabetes mellitus identified by peripheral blood-based gene expression profiles..", THE AMERICAN JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY UNITED STATES, vol. 105, no. 7, 30 June 2010 (2010-06-30), pages 1661 - 1669, ISSN: 1572-0241 *
SABBAGHIAN M SHIRIN ET AL.: "Levels of Elevated Circulating Endothelial Cell Decline after Tumor Resection in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.", ANTICANCER RESEARCH, vol. 30, no. 7, 30 June 2010 (2010-06-30), pages 2911 - 2917, ISSN: 0250-7005 *
ZHOU JIAHUA ET AL.: "Marker expression in circulating cancer cells of pancreatic cancer patients..", THE JOURNAL OF SURGICAL RESEARCH UNITED STATES, vol. 171, no. 2, 30 November 2011 (2011-11-30), pages 631 - 636, ISSN: 1095-8673 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020254667A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Universidad De Granada Series of metabolites as biomarkers for the diagnosis of pancreatic cancer
WO2021052049A1 (zh) * 2019-09-17 2021-03-25 浙江大学 以ankrd22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2538504T3 (es) Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga
JP6039656B2 (ja) 癌再発の予後予測のための方法および装置
ES2492498T3 (es) Panel de biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de rechazo de injerto
ES2316932T3 (es) Pronostico de cancer colorectal.
ES2647154T3 (es) Combinaciones de biomarcadores para tumores colorrectales
JP2010535782A5 (ja) メチルトランスフェラーゼを標的にすることによるメチル化を元に戻す方法
ES2714582T3 (es) Procedimiento de predicción de la respuesta a la quimioterapia en un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar un cáncer de mama recurrente
Lee et al. Macrophage migration inhibitory factor may be used as an early diagnostic marker in colorectal carcinomas
ES2965535T3 (es) Métodos de diagnóstico y tratamiento de pacientes con carcinoma cutáneo de células epidermoides
TWI682034B (zh) 用於評估子宮內膜癌的發展風險或診斷子宮內膜癌的方法
US20190285518A1 (en) Methods for personalized detection of the recurrence of cancer or metastasis and/or evaluation of treatment response
US20110183859A1 (en) Inflammatory genes and microrna-21 as biomarkers for colon cancer prognosis
WO2014076342A1 (es) Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento de adenocarcinoma de páncreas
ES2797750T3 (es) Procedimiento para determinar el pronóstico de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas
JP6827067B2 (ja) ループス腎炎の検出またはそのリスクを予測する方法およびその応用
JP2015107091A (ja) 膵臓がんの検出キット及び検出方法
WO2014080060A1 (es) Método para predecir la respuesta al tratamiento con quimioterapia en pacientes con cáncer
JP2012085555A (ja) 乳がん診断用マーカー
US20160304961A1 (en) Method for predicting the response to chemotherapy treatment in patients suffering from colorectal cancer
ES2403781B1 (es) Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas, y para evaluar la respuesta al tratamiento.
JP2012085556A (ja) 乳がんの診断方法
JP6977965B2 (ja) 卵巣癌組織型鑑別方法
KR20100045703A (ko) 침윤성 또는 비침윤성 방광암의 예후 예측용 진단 키트, 방광암의 예후 측정방법 및 방광암 치료제의 스크리닝 방법
JP6623548B2 (ja) 膵管内乳頭粘液性腫瘍検出用マーカーとキット
US20100297014A1 (en) Method of detecting the risk of cancer using genetic markers

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13856020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13856020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1