ES2797750T3 - Procedimiento para determinar el pronóstico de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas - Google Patents

Procedimiento para determinar el pronóstico de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas Download PDF

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Abstract

Procedimiento in vitro para establecer un pronóstico de supervivencia en un paciente que padece cáncer de páncreas, que comprende las siguientes etapas: a) medir el nivel de expresión de cada gen de una combinación de genes marcadores seleccionados entre el grupo constituido por genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos el 90 % con el gen NME4 o ARL4C, respectivamente, en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída; b) comparar el nivel de expresión medido de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente con un umbral de referencia; c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para determinar el pronóstico de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas La presente invención se refiere al cáncer de páncreas y, más particularmente, al pronóstico de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas.
La invención también tiene por objeto determinar la capacidad de dicho paciente para recibir un tratamiento para el cáncer de páncreas, particularmente un tratamiento con gemcitabina.
Con 43.920 nuevos casos anuales en los Estados Unidos y 37.390 fallecimientos, la mortalidad relacionada con el cáncer de páncreas es más del 85 %, lo que ubica al cáncer de páncreas en el cuarto lugar en términos de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos, tanto en hombres como en mujeres.
La incidencia del cáncer de páncreas ha aumentado significativamente en las últimas décadas. Cada año, alrededor de 60.000 personas en Europa, y más de 230.000 en todo el mundo, son diagnosticadas con esta enfermedad. Los pacientes que padecen cáncer de páncreas a menudo presentan un pronóstico no tan favorable con respecto a otros tumores malignos y tipos de cáncer, en parte porque la detección precoz es difícil.
En el momento del diagnóstico, la mayoría de los pacientes que padecen adenocarcinoma ductal pancreático presentan una enfermedad localmente avanzada o metastásica, y solamente un 10 a 20% de los casos son candidatos para cirugía curativa.
El tiempo medio de supervivencia a partir del diagnóstico es de aproximadamente 3 a 6 meses; la supervivencia durante un periodo de 5 años es muy inferior al 5 % y una remisión completa es extremadamente rara.
Las terapias actuales aprobadas o utilizadas en la práctica clínica en pacientes que padecen cáncer de páncreas son tratamientos a base de gemcitabina, folfirinox o incluso erlotinib.
La gemcitabina es un análogo de nucleósido, administrado por vía intravenosa a una dosis de aproximadamente 1000 mg/m2. Un tratamiento con gemcitabina suele ser uno de los tratamientos de primera línea recomendados para el cáncer de páncreas resecable (fase I-II), el cáncer de páncreas localmente avanzado no resecable (estadio III) y el cáncer de páncreas metastásico avanzado (estadio IV).
Con la gemcitabina, el tiempo medio de supervivencia global varía entre 4,9 meses y 8,3 meses.
El éxito limitado de los tratamientos y la tasa de mortalidad que sigue siendo alta para una parte de los pacientes destaca la necesidad de medios para mejorar la identificación selectiva terapéutica de los pacientes que podrían ser buenos respondedores a la gemcitabina y que tolerarían bien la gemcitabina en esta indicación.
Una correlación entre la supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas y la expresión de ciertos marcadores en sus células tumorales se describe en la técnica anterior (A. Tsiaousidou et al., Pancreatology, 2013, 13, págs. 564-569, H. Fujita et al., Neoplasia, 2010, 12, págs. 807-817 y T. Takadate et al., Clinical Proteomics, 2012, 9:8).
El tratamiento del cáncer de páncreas con diferentes compuestos puede tener diferentes grados de eficacia según el paciente. Sin embargo, hasta hoy, no se dispone de ningún medio para predecir fácilmente el beneficio clínico de los diferentes tratamientos disponibles en un paciente determinado.
Por lo tanto, existe siempre una necesidad de realizar pruebas que permitan seleccionar el tratamiento adecuado para cada paciente, a fin de darles más posibilidades de sobrevivir.
En el caso de los pacientes que padecen cáncer de la sangre, es posible establecer un pronóstico de supervivencia de manera no invasiva gracias a la medición de la expresión de marcadores específicos en una muestra de sangre periférica, en la que están localizadas las células cancerosas (A. Kracmarova et al., Leukemia & Lymphoma, 2008, 49 (7), págs. 1297-1305). No obstante, en el caso de un cáncer de páncreas, las células cancerosas son difícilmente accesibles.
También podría ser deseable que dicha prueba sea una prueba que se pueda realizar de manera regular. Una ventaja adicional sería que dicha prueba sea no invasiva.
El trabajo de los inventores ha permitido identificar un conjunto de genes cuyo estudio del nivel de expresión permite evaluar el tiempo de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas.
Ventajosamente, esta predicción también permite predecir las posibilidades de éxito de un tratamiento con gemcitabina y seleccionar a los pacientes que puedan responder favorablemente a un tratamiento con gemcitabina. De esta forma, el estudio del nivel de expresión de dichos genes permite proporcionar información sobre la oportunidad de administrar un tratamiento con gemcitabina a un paciente que padece cáncer de páncreas.
Una de las ventajas de la invención reside en el hecho de que el nivel de expresión de dichos genes puede ser evaluado directamente a partir de una muestra de sangre, ventajosamente de sangre total del paciente, previamente extraída.
Esto resulta particularmente ventajoso en el caso del cáncer de páncreas ya que es muy difícil acceder a las células tumorales.
Además, se puede estandarizar el muestreo de sangre (extracción, estabilización y transporte).
Finalmente, el uso de sangre total es más seguro que el uso de una fracción de sangre como, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (CMSP), ya que permite evitar los errores de manipulación relacionados con la preparación de dichas fracciones. Por "sangre total", se entiende la sangre con todos sus constituyentes, (plasma, glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, ...) en oposición a "fracción de sangre", que corresponde a un producto obtenido por separación de los componentes particulares de la sangre. Las células mononucleares de sangre periférica constituyen un ejemplo de una fracción de sangre.
La invención tiene por objeto un procedimiento in vitro para establecer un pronóstico de supervivencia en un paciente que padece cáncer de páncreas, que comprende las siguientes etapas:
a) medir el nivel de expresión de cada gen de una combinación de genes marcadores seleccionados entre el grupo constituido por genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos 90 % con el gen NME4 o ARL4C, respectivamente, en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída; b) comparar el nivel de expresión medido de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente con un umbral de referencia;
c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente.
El término "homólogo" se define en el presente texto como una secuencia de polinucleótidos que presenta un grado de identidad de al menos 90 %, y preferentemente 99 % con la secuencia del gen (de longitud completa) salvaje. El grado de identidad hace referencia a una identidad de secuencia entre dos secuencias. La identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que puede ser alineada con fines de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. Se pueden utilizar diversos algoritmos y/o programas de alineamiento para la determinación de la homología de dos secuencias, incluyendo FASTA y BLAST.
El procedimiento de acuerdo con la invención permite establecer un pronóstico de supervivencia en un paciente que padece cáncer de páncreas.
De acuerdo con la invención, las etapas a) a c) del procedimiento anterior pueden ser implementadas en un paciente que padece cáncer de páncreas que ha recibido un tratamiento y, particularmente, un tratamiento a base de gemcitabina, para predecir o evaluar la eficacia y/o el beneficio de un tratamiento para el cáncer de páncreas en un paciente que padece dicha patología, en particular, en términos de esperanza de vida.
De esta forma, la invención también tiene por objeto un procedimiento in vitro para predecir o evaluar la eficacia y/o el beneficio de un tratamiento para el cáncer de páncreas en un paciente que padece dicha patología, que comprende las siguientes etapas:
a) medir el nivel de expresión de cada gen de una combinación de genes marcadores seleccionados entre el grupo constituido por genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos 90 % con el gen NME4 o ARL4C, respectivamente, en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída; b) comparar el nivel de expresión medido de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente con un umbral de referencia;
c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente.
El procedimiento de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para predecir o evaluar la eficacia y/o el beneficio de un tratamiento para el cáncer de páncreas con gemcitabina.
En los procedimientos de acuerdo con la invención, el umbral de referencia utilizado en la etapa c) para llevar a cabo la comparación se determina previamente para cada gen o cada combinación de genes.
El principio de la invención se basa en el hecho de que el solicitante ha podido establecer que el estudio del nivel de expresión de al menos uno de los 5 genes (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1), ventajosamente de una combinación de 2 a 5 de estos genes, aún más ventajosamente de una combinación de los 5 genes, permite establecer un pronóstico de supervivencia del paciente. Más particularmente, el solicitante ha establecido que al comparar los datos del nivel de expresión de al menos uno de los 5 genes (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RpLPI) o su combinación, obtenidos a partir de una muestra de sangre de dicho paciente sometido a ensayo con los datos establecidos para los 5 genes considerados o su combinación sobre una población de referencia de enfermos que padecen cáncer de páncreas, antes o durante el tratamiento, permitiría establecer un pronóstico de supervivencia del paciente y un seguimiento en el tratamiento del mismo.
El procedimiento de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo en una muestra de sangre de un paciente, preferentemente en una muestra de sangre periférica de dicho paciente, siendo dicha muestra de sangre extraída previamente a la implementación del procedimiento de acuerdo con la invención. La sangre periférica es la sangre que circula a través del corazón, arterias, capilares y venas.
De acuerdo con la divulgación, la etapa a) del procedimiento puede llevarse a cabo midiendo el nivel de expresión de 1 de los 5 genes (o genes homólogos) del grupo definido anteriormente, ventajosamente de 2 de los 5 genes, más ventajosamente de 3 de los 5 genes, incluso más ventajosamente de 4 de los 5 genes, y preferentemente de los 5 genes (o genes homólogos) del grupo definido anteriormente.
De acuerdo con la invención, la etapa a) del procedimiento puede llevarse a cabo midiendo el nivel de expresión de los genes NME4 y ARL4C (o genes homólogos), más ventajosamente de 3 de los 5 genes (o genes homólogos) del grupo definido anteriormente que incluye NME4 y ARL4C, incluso más ventajosamente de 4 de los 5 genes (o genes homólogos) del grupo definido anteriormente que incluye NME4 y ARL4C, y preferentemente de los 5 genes (o genes homólogos) del grupo definido anteriormente.
De acuerdo con la divulgación, la etapa a) del procedimiento puede llevarse a cabo midiendo el nivel de expresión de al menos un gen (o gen homólogo) seleccionado entre los genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1, ventajosamente de al menos una de las siguientes combinaciones: NME4 e ITPR3; NME4 y SESN3; NME4 y ARL4C; NME4 y RPLP1; ITPR3 y SESN3; ITPR3 y ARL4C; ITPR3 y RPLP1; SESN3 y ARL4C; SESN3 y RPLP1; ARL4C y RPLP1; más ventajosamente el nivel de expresión de los genes de una de las siguientes combinaciones: NME4 e ITPR3 y SESN3; NME4 e ITPR3 y ARL4C; NME4 e ITPR3 y RPLP1; NME4 y SESN3 y ARL4C; NME4 y SESN3 y RPLP1; NME4 y ARL4C y RPLP1; ITPR3 y ARL4C y RPLP1; ITPR3 y SESN3 y RPLP1; ITPR3 y SESN3 y ARL4C; SESN3 y ARL4C y RPLP1; incluso más ventajosamente el nivel de expresión de los genes de una de las siguientes combinaciones: NME4 e ITPR3 y SESN3 y Ar L4C; NME4 e ITPR3 y ARL4C y RPLP1; NME4 e ITPR3 y SESN3 y RPLP1; ITPR3 y SESN3 y ARL4C y RPLP1, y preferentemente la siguiente combinación: NME4 e ITPR3 y SESN3 y ARL4C y RPLP1.
De esta forma, de acuerdo con la invención, la etapa a) del procedimiento se lleva a cabo ventajosamente midiendo el nivel de expresión de al menos la siguiente combinación: NME4 y ARL4C; más ventajosamente el nivel de expresión de los genes de una de las siguientes combinaciones: n ME4 e ITPR3 y ARL4C; NME4 y SESN3 y ARL4C; NME4 y ARL4C y RPLP1; incluso más ventajosamente el nivel de expresión de los genes de una de las siguientes combinaciones: NME4 e ITPR3 y SESN3 y ARL4C; NME4 e ITPR3 y ARL4C y RPLP1, y preferentemente la siguiente combinación: NME4 e ITPR3 y SESN3 y ARL4C y RPLP1.
De manera preferente, de acuerdo con la invención, la etapa a) del procedimiento se lleva a cabo midiendo el nivel de expresión de los dos genes (o gen homólogo) NME4 y ARL4C o el nivel de expresión de los genes de la siguiente combinación: NME4 e ITPR3 y SESN3 y ARL4C y RPLP1.
En un primer modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, el nivel de expresión de los genes NME4 y ARL4C, y opcionalmente de o de los genes seleccionados entre el grupo que consiste en ITPR3, SESN3 y RPLP1 se mide por la medición de la cantidad de la proteína codificada por dicho gen en la muestra de sangre de dicho paciente a someter a ensayo. En ese caso, el contenido en proteínas se mide preferentemente utilizando métodos de detección a base de anticuerpos tales como inmunoquímica o análisis por inmunoelectrotransferencia. En otro modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, el nivel de expresión de los genes se mide por la medición del contenido de transcripción de dicho gen. Este contenido puede medirse por la medición de la cantidad de ARN o ADNc de dicho gen. En ese caso, el nivel de ARN transcrito o ADNc se puede medir utilizando métodos de detección de ácidos nucleicos como PCR cuantitativa, chips de ADN, hibridación con sondas marcadas o inmunoensayos de flujo lateral, en particular utilizando tiras de flujo lateral.
Preferentemente, en los procedimientos de acuerdo con la invención, el nivel de expresión del gen o de la combinación de genes se mide por PCR cuantitativa en tiempo real (real time quantitative polymerase chain reaction o qPCR) realizada en los transcritos de ARN de dicho gen o sobre su ADN complementario (ADNc). Una qPCR es una PCR en la que el ADN amplificado es detectado en tiempo real a medida que avanza la reacción de polimerización. Esta detección se realiza por la acumulación de una señal fluorescente.
Esta técnica utiliza cebadores (sentido y antisentido) y un marcador, preferentemente, un intercalante fluorescente del ADN formado durante los ciclos de PCR. Ventajosamente, dichos cebadores son específicos de las regiones flanqueantes del gen considerado.
En el caso del gen NME4, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 16 entre los nucleótidos 399665 y 399728 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, fuente UCSC).
En el caso del gen ITPR3, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 6 entre los nucleótidos 33696404 y 33696485 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, diciembre de 2013, fuente UCSC).
En el caso del gen SESN3, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 11 entre los nucleótidos 95166241 y 95166313 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, fuente UCSC).
En el caso del gen ARL4C, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 4 entre los nucleótidos 234493401 y 234493502 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, diciembre de 2013, fuente UCSC).
En el caso del gen RPLP1, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 15 entre los nucleótidos 69455485 y 69455598 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, diciembre de 2013, fuente UCSC).
En un modo de realización ventajoso, los siguientes cebadores pueden ser utilizados para llevar a cabo la qPCR: - ARN procedentes del gen NME4
o cebador sentido: CATGATTGGACACACCGACTC (SEQ ID NO. 1)
O cebador antisentido: GACGCTGAAGTCACCCCTTAT (SEQ ID NO. 2)
- ARN procedentes del gen ITPR3
O cebador sentido: TCCTGGGGAAGAGTTGTACG (SEQ ID NO. 3)
O cebador antisentido: AGGAGAAAAACAAGCGGTCA (SEQ ID NO. 4)
- ARN procedentes del gen SESN3
O cebador sentido: TTGCCTTTGTAGTCCTGTGC (SEQ ID NO. 5)
O cebador antisentido: CATTAGTCCAGTCACGTGCTTC (SEQ ID NO. 6)
- ARN procedentes del gen ARLC4
O cebador sentido: AAAGCCCTGTGGTGTATCAA (SEQ ID NO. 7)
O cebador antisentido: GCTTCCTCTGTTGGGTCAGA (SEQ ID NO. 8)
- ARN procedentes del gen RPLP1
O cebador sentido: TGGGCTTTGGTCTTTTTGAC (SEQ ID NO. 9)
O cebador antisentido: CAGACCATTTTTGCAGAGCA (SEQ ID NO. 10)
La qPCR permite determinar el valor del número de ciclos (Ct) de un gen en el paciente a someter a ensayo. El Ct ("cycle threshold", umbral de ciclo) se define como el número de ciclos de PCR necesarios para que la señal fluorescente cruce el ruido de fondo.
El valor de Ct obtenido se puede normalizar acto seguido con respecto al nivel de expresión de al menos un gen ubicuo expresado en número de ciclos en la misma muestra de sangre del mismo paciente. Dichos genes ubicuos son genes que se expresan en todas las células de un organismo en condiciones normales y fisiopatológicas. Estos genes son expresados generalmente a niveles relativamente constantes.
Preferentemente, en los procedimientos de acuerdo con la invención, en la etapa a), además del nivel de expresión de cada gen (Ctgen) de una combinación de al menos 2 genes marcadores, se mide el nivel de expresión de al menos un gen ubicuo, siendo dichos niveles de expresión medidos en número de ciclos (Ct, "cycle threshold", umbral de ciclo) por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), después se normaliza el nivel de expresión de los genes marcadores con respecto al nivel de expresión de al menos un gen ubicuo de acuerdo con
ACtgen = Ctgen -[(media de los) Ct (gen(es) ubicuo(s))]
a fin de obtener un nivel de expresión normalizado ACtgen para cada gen marcador en el que se ha medido el nivel de expresión.
Preferentemente, en los procedimientos de acuerdo con la invención, la normalización se lleva a cabo con respecto al nivel de expresión de dos genes ubicuos, en particular, con respecto al nivel de expresión de los genes GAPDH y B2M. En ese caso, el nivel de expresión normalizado ACtgen de un gen marcador se calcula por:
ACtgen = Ctgen -(Cte2M + CtGAPDH)/2
En el caso del gen B2M, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 15 entre los nucleótidos 44718721 y 44718792 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, fuente UCSC).
En el caso del gen GAPDH, las regiones flanqueantes se sitúan en el cromosoma 12 entre los nucleótidos 6534833 y los nucleótidos 6536572 (Ensamblaje, diciembre de 2013, GRch38/hg38, fuente UCSC).
Los cebadores particularmente adecuados para los genes B2M y GAPDH pueden ser:
- ARN procedentes del gen B2M
o cebador sentido: GCTCAGTAAAGACACAACCATCC (SEQ ID NO. 11)
O cebador antisentido: CATCTGTGGATTCAGCAAACC (SEQ ID NO. 12)
- ARN procedentes del gen GAPDH
O cebador sentido: ATGGGGAAGGTGAAGGTCG (SEQ ID NO. 13)
O cebador antisentido: GGGGTCATTGATGGCAACAATA (SEQ ID NO. 14)
Ventajosamente, para llevar a cabo la qPCR, los cebadores, su tamaño (preferentemente comprendido entre 80 y 150 nucleótidos), su temperatura de fusión (Tf, preferentemente de 60 °C ± 1 °C), su porcentaje de nucleótidos G y C (% de GC, preferentemente -60 % en 3'), su autocomplementariedad 3' y 5' y su estabilidad (preferentemente inferior a 4 nucleótidos), los intervalos de las dimensiones del producto y los parámetros termodinámicos (evolución de la estructura secundaria de acuerdo con la Tf de los cebadores y la concentración de sal de sodio) se seleccionan para permitir una detección simultánea.
De acuerdo con un primer modo de realización de la divulgación, durante la etapa a), se mide el nivel de expresión de un único gen marcador. En este modo de realización, durante las etapas b) y c), los umbrales de referencia (Uref) de un gen dado se definen en la tabla 1 a continuación:
Tabla 1
Figure imgf000006_0001
- un nivel de expresión normalizado ACt de NME4 superior a 3,1864, y/o
- un nivel de expresión normalizado ACt de ITPR3, SESN3, ARM4C y/o
- RPLP1 inferior respectivamente a 6,4015; 3,6262; 2,6286 y 6,3748, indica un pronóstico de supervivencia a largo plazo, mientras que
- un nivel de expresión normalizado ACt de NME4 inferior a 3,1864, y/o
- un nivel de expresión normalizado ACt de ITPR3, SESN3, ARM4C y/o
- RPLP1 superior respectivamente a 6,4015; 3,6262; 2,6286 y 6,3748, indica un pronóstico de supervivencia a corto plazo.
Por "supervivencia a largo plazo", se entiende la supervivencia de más de 10 meses, preferentemente más de 12 meses, incluso más preferentemente más de 15 meses.
Por "supervivencia a corto plazo", se entiende una supervivencia de menos de 6 meses, menos de 5 meses, o menos de 3 meses.
Por lo demás, cuando se supone que un paciente tiene una supervivencia a largo plazo, esto también significa que puede considerarse elegible para un tratamiento a base de gemcitabina. Por el contrario, una supervivencia a corto plazo del paciente indica que un tratamiento a base de gemcitabina no presentará ningún beneficio o presentará un beneficio escaso al paciente. Se debe considerar otro tratamiento.
El trabajo del solicitante (véase el ejemplo 1) sobre una población de referencia lo ha llevado de hecho a identificar 5 genes que pueden utilizarse como marcadores para un pronóstico de supervivencia de un paciente que padece cáncer de páncreas, pero también a determinar para estos 5 genes, los valores para los umbrales de Umbral de referencia ( U f permitiendo realizar una comparación.
No obstante, se puede proporcionar una mayor precisión en el pronóstico gracias a la medición de una combinación de al menos dos genes. Por consiguiente, de acuerdo con un segundo modo de realización de acuerdo con la invención, durante la etapa a), se mide el nivel de expresión de una combinación de al menos dos genes marcadores y, durante las etapas b), para cada gen marcador en el que se midió la expresión:
i) se determina un valor ÍNDICEgen que depende del nivel de expresión normalizado del gen, definido por:
- ÍNDICEgen = 1*coeficiente p del gen, si ACtgen > umbral de referencia del gen, e
- ÍNDICEgen = -1'coeficiente p del gen, si ACtgen < umbral de referencia del gen,
en el que el coeficiente p y el umbral de referencia de un gen dado son aquellos definidos en la tabla 2 a continuación:
Tabla 2
Figure imgf000007_0002
ii) se determina, para un paciente determinado, un valor INDICEpaciente igual a la suma de los INDICEgen de los genes de combinación, y
iii) se compara el INDICEpaciente con un umbral final de referencia previamente determinado para la combinación de genes.
El solicitante ha desarrollado así un sistema que permite una comparación simplificada de los niveles de expresión de varios genes. Este sistema de comparación requirió el desarrollo de un coeficiente, el Coeficiente beta (véase la tabla 2 anterior), que permite ponderar la importancia de los diferentes genes dentro del sistema.
De lo anterior se deduce que los ÍNDICEgen solo pueden tomar los siguientes valores (véase la tabla 3 a continuación):
Tabla 3
Figure imgf000007_0001
Un INDICEpaciente es entonces calculado, que corresponde a la suma de los INDICEgen de los genes de la combinación de los genes marcadores, cuyo nivel de expresión se midió en la etapa a) de los procedimientos de acuerdo con la invención:
INDICEpaciente = £ INDICEgen
Este INDICEpaciente se compara a continuación con un valor de umbral final de referencia previamente determinado por el solicitante para cada combinación de genes marcadores.
A título de ejemplo, para la combinación de los 5 genes, dicho valor de umbral final de referencia es igual a 1,102. De esta forma, sobre la base del valor de umbral final de referencia definido para cada combinación de genes marcadores, es posible establecer el pronóstico de supervivencia del paciente sometido a ensayo.
De acuerdo con un modo de realización preferido de los procedimientos de la invención, se mide en la etapa a) en una muestra de sangre extraída previamente de un paciente a someter a ensayo, por qPCR, el nivel de expresión en número de ciclos (Ctgen) de los 5 genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 y de los dos genes ubicuos B2M y GAPDH. El nivel de expresión normalizado ACtgen de cada uno de los 5 genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 se calcula a continuación de acuerdo con:
ACtgen = Ctgen -(Cte2M + CtGAPDH)/2
Luego se calcula un ÍNDICEgen para cada uno de los genes de acuerdo con:
- ÍNDICEgen = 1*coeficiente p del gen, si ACtgen > umbral de referencia del gen, e
- ÍNDICEgen = -1*coeficiente p del gen, si ACtgen < umbral de referencia del gen
en el que el coeficiente p y el umbral de referencia de un gen dado son aquellos definidos en la tabla 2 a continuación:
Tabla 2
Figure imgf000008_0001
El INDICEpaciente es entonces calculado como:
ÍND|CEpaciente
ÍNDICEa/me4+ÍNDICE/tpr3+ÍNDICEses«3+ÍNDICEarl4c+ÍNDICErplpi
Este valor de INDICEpaciente se compara a continuación con el valor de umbral final de referencia para la combinación de los 5 genes marcadores, es decir 1,102.
Si un paciente presenta un INDICEpaciente inferior a 1,102, se considera que tiene un pronóstico de supervivencia a largo plazo, y puede considerarse elegible para el tratamiento a base de gemcitabina. Por el contrario, si un paciente presenta un INDICEpaciente superior a 1,102, esto indica que presenta un pronóstico de supervivencia a corto plazo y que un tratamiento a base de gemcitabina no presentará ningún beneficio o presentará un beneficio escaso. Se debe considerar otro tratamiento.
La invención también se refiere a un método de seguimiento de la eficacia de un tratamiento para el cáncer de páncreas por la implementación del procedimiento de acuerdo con la invención descrito anteriormente, ventajosamente a intervalos de tiempo de tratamiento.
Los expertos en la materia podrán determinar sin dificultad los intervalos de tiempo de tratamiento en los que desean implementar el procedimiento de acuerdo con la invención. Por ejemplo, los intervalos de tiempo apropiados son 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses o 6 meses.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, por ejemplo, superior a 10 meses, ventajosamente superior a 12 meses, incluso más ventajosamente superior a 15 meses, siendo el pronóstico determinado de acuerdo con uno de los procedimientos descritos anteriormente.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente con un INDICEpaciente inferior a 1,102 calculado de acuerdo con el modo de realización preferido descrito anteriormente.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por un procedimiento in vitro que comprende las siguientes etapas:
a) medir el nivel de expresión de al menos un gen marcador seleccionado entre el grupo constituido por los genes NME4, /TPR3, sEsN3, ARL4C y RPLP1 o genes homólogos, en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída;
b) comparar el nivel de expresión medido de o de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente con un umbral de referencia;
c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por el procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que se mide en la etapa a), el nivel de expresión de al menos dos genes, ventajosamente 3, más ventajosamente 4, y preferentemente 5 genes. La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por un procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que la muestra de sangre es una muestra de sangre total periférica.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por un procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que se mide el nivel de expresión del o de los genes por la medición de la cantidad de la(s) proteína(s) codificada(s) por dicho gen(es) presente(s) en la muestra de sangre.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por un procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que se mide el nivel de expresión de o de los genes por el nivel de transcripción del ARN o ADNc de dicho(s) gen(es).
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por el procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que la etapa a), además del nivel de expresión de un gen (Ctgen) marcador o de cada gen de una combinación de al menos 2 genes marcadores, se mide el nivel de expresión de al menos un gen ubicuo, siendo dichos niveles de expresión medidos en número de ciclos (Ct, "cycle threshold", umbral de ciclo) por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), después se normaliza el nivel de expresión del o de los genes marcadores con respecto al nivel de expresión de al menos un gen ubicuo de acuerdo con
ACtgen = Ctgen -[(media de los) Ct (gen(es) ubicuo(s))]
a fin de obtener un nivel de expresión normalizado ACtgen para cada gen marcador en el que se ha medido el nivel de expresión.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por el procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que el nivel de expresión normalizado ACt de un gen marcador o de cada gen de una combinación de al menos dos genes marcadores se normaliza con respecto a dos genes ubicuos B2M y GAPDH.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por el procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que durante la etapa a), se mide el nivel de expresión de un único gen marcador y durante las etapas b) y c), los umbrales de referencia (Uref) de un gen dado son:
Figure imgf000009_0001
- un nivel de expresión normalizado ACt de NME4 superior a 3,1864 y/o
- un nivel de expresión normalizado ACt de ITPR3, SESN3, ARL4C y/o
RPLP1 inferior respectivamente a 6,4015; 3,6262; 2,6286 y 6,3748 indica un pronóstico de supervivencia a largo plazo.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por el procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que durante la etapa a), se mide el nivel de expresión de una combinación de al menos dos genes marcadores y, durante las etapas b), para cada gen en el que se midió la expresión
i) se determina un valor ÍNDICEgen que depende del nivel de expresión normalizado del gen, definido por:
- ÍNDICEgen = 1*coeficiente p del gen, si ACtgen > umbral de referencia del gen, e
- ÍNDICEgen = -1*coeficiente p del gen, si ACtgen < umbral de referencia del gen, y
en el que el coeficiente p y el umbral de referencia (Uref) de un gen dado son aquellos definidos anteriormente
Figure imgf000010_0001
ii) se determina, para un paciente determinado, un valor INDICEpaciente igual a la suma de los INDICEgen de los genes de combinación, y
iii) se compara el ÍNDICEpaciente con un umbral final de referencia previamente determinado para la combinación de los genes.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un pronóstico de supervivencia a largo plazo, siendo dicho pronóstico de supervivencia a largo plazo determinado por el procedimiento in vitro descrito anteriormente, en la que se mide el nivel de expresión de los 5 genes marcadores, siendo el umbral final de referencia de 1,102, un ÍNDICEpaciente inferior a 1,102 indica un pronóstico de supervivencia a largo plazo.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un ÍNDICEpaciente inferior a 1,102, siendo el ÍNDICEpaciente determinado por el procedimiento de acuerdo con la invención, en el que se mide el nivel de expresión de los 5 genes marcadores, siendo el umbral final de referencia de 1,102, un ÍNDICEpaciente inferior a 1,102 indica un pronóstico de supervivencia a largo plazo.
La divulgación también se refiere a la gemcitabina para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en un paciente que presenta un ÍNDICEpaciente inferior a 1,102, siendo el ÍNDICEpaciente determinado por un procedimiento in vitro que comprende las siguientes etapas:
a) medir el nivel de expresión de una combinación de cinco genes marcadores NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 y de dos genes ubicuos B2M y GADPH en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída, el nivel de expresión de los genes corresponde al nivel de transcripción del ARN o del ADNc de dichos genes, medido en número de ciclos (Ct, "cycle threshold", umbral de ciclo) por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), siendo el nivel de expresión de los cinco genes marcadores normalizado a continuación con respecto al nivel de expresión de los genes ubicuos de acuerdo con
ACtgen _ Ctgen -[media de los Ctgenes ubicuos]
a fin de obtener un nivel de expresión normalizado ACtgen para cada uno de los cinco genes marcadores, b) comparar el nivel de expresión medido de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente y para cada gen en el que se midió la expresión: i)
se determina un valor ÍNDICEgen que depende del nivel de expresión normalizado del gen, definido por:
- ÍNDICEgen = 1*coeficiente p del gen, si ACtgen > umbral de referencia del gen, e
- ÍNDICEgen = -1*coeficiente p del gen, si ACtgen < umbral de referencia del gen, y
en el que el coeficiente p y el umbral de referencia (Uref) de un gen dado son aquellos definidos anteriormente
Figure imgf000010_0002
ii) se determina, para un paciente determinado, un valor ÍNDICEpaciente igual a la suma de los ÍNDICEgen de los genes de combinación, y
iii) se compara el ÍNDICEpaciente con el umbral final de referencia de 1,102;
c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente, un ÍNDICEpaciente inferior a 1,102 indica un pronóstico de supervivencia a largo plazo.
La presente divulgación se refiere además a un chip de ADN que tiene en sus superficies, ácidos nucleicos capaces de hibridarse con al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consiste en NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1, preferentemente al menos 2, 3 o 4 genes y, más preferentemente, para detectar el nivel de expresión de los 5 genes, opcionalmente con ácidos nucleicos específicos para al menos un gen ubicuo, preferentemente dos genes ubicuos, de manera aún más preferida los ácidos nucleicos específicos de los genes ubicuos B2M y GAPDH.
La presente divulgación también se refiere a un kit para la determinación del pronóstico de cáncer de páncreas en un paciente, que comprende medios para detectar el nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados entre el grupo que consiste en NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLPI, preferentemente al menos 2, 3 o 4 genes y, más preferentemente, para detectar el nivel de expresión de los 5 genes.
Los medios para detectar el nivel de expresión pueden ser, por ejemplo, un chip de ADN de acuerdo con la divulgación, un juego de cebadores y un indicador como los agentes fluorescentes, sondas de hidrólisis marcadas, balizas moleculares, sondas de hibridación y anticuerpos.
Preferentemente, el kit de acuerdo con la divulgación podrá comprender medios para detectar el nivel de expresión de una combinación de genes seleccionada entre el grupo que consiste en NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1. De manera más preferente, el kit de acuerdo con la divulgación podrá comprender medios para detectar todas las combinaciones de genes mencionados anteriormente, preferentemente al menos 2, 3 o 4 genes y, más preferentemente, de medios para detectar la combinación de los 5 genes.
El kit puede comprender además instrucciones de uso en el procedimiento in vitro de acuerdo con la invención. Finalmente, la divulgación también se refiere al uso de al menos un gen seleccionado entre el grupo que consiste en NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1, para el pronóstico del cáncer de páncreas, en particular, durante un tratamiento a base de gemcitabina.
Preferentemente, la divulgación se refiere al uso de al menos una de las combinaciones de 2 a 5 genes seleccionados entre el grupo que consiste en NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 y preferentemente la combinación de 3 genes, más preferentemente de 4 genes, incluso más preferentemente de 5 genes, para el pronóstico del cáncer de páncreas, en particular, durante un tratamiento a base de gemcitabina.
La divulgación también se refiere al uso de al menos un gen seleccionado entre el grupo constituido por los genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 o genes homólogos, preferentemente al menos 2, 3 o 4 genes y, más preferentemente, de los 5 genes para el pronóstico de un cáncer de páncreas en un paciente, así como al uso de al menos un gen seleccionado entre el grupo constituido por los genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 o genes homólogos, preferentemente al menos 2, 3 o 4 genes y, más preferentemente, de los 5 genes para el seguimiento de la eficacia de un tratamiento del cáncer de páncreas, ventajosamente de un tratamiento con gemcitabina, en un paciente.
La invención se refiere al uso in vitro de una combinación de genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, o una combinación de 5 genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo, ARL4C o un gen homólogo del mismo, ITPR3 o un gen homólogo del mismo, SESN3 o un gen homólogo del mismo y RPLP1 o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos 90 % con el gen NME4, ARL4C, ITPR3, SESN3 o RPLpI, respectivamente, para el pronóstico de un cáncer de páncreas, en un paciente.
La invención también se refiere al uso in vitro de una combinación de genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, o una combinación de 5 genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo, ARL4C o un gen homólogo del mismo, ITPR3 o un gen homólogo del mismo, SESN3 o un gen homólogo del mismo y RPLP1 o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos 90 % con el gen NME4, ARL4C, ITPR3, SESN3 o RpLPI, respectivamente, para el seguimiento de la eficacia de un tratamiento del cáncer de páncreas, ventajosamente de un tratamiento con gemcitabina en un paciente.
La presente invención podrá comprenderse mejor y otras ventajas y características pueden resultar evidentes tras la lectura de los siguientes ejemplos y los dibujos anexos en los que:
La figura 1 representa los resultados obtenidos por los inventores en la determinación del umbral de referencia para el gen NME4.
La figura 1A representa la distribución de ciertos valores estadísticos de la prueba de Mantel-Cox en función de su valor de ACt. Para determinar el límite (punto de corte) entre 2 grupos, se determina el valor máximo obtenido por un individuo para la estadística de la prueba de Mantel-Cox y se utiliza una lectura gráfica que permite determinar el valor del umbral de referencia (Uref) de 3,1864.
La figura 1B representa las curvas de supervivencia calculadas por el método de Kaplan-Meier para los 2 grupos de supervivencia después del cálculo del valor de umbral. El grupo representado en negro es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es inferior al valor de umbral (Uref) y el grupo representado en gris es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es superior al valor de umbral (Uref). Aquí, el grupo de larga supervivencia es el grupo en negro. El valor p ("p-value") de la prueba de rango logarítmico se indica en la parte superior del gráfico: P=9,59.10-5
La figura 2 representa los resultados obtenidos por los inventores en la determinación del umbral de referencia para el gen ITPR3.
La figura 2A representa la distribución de ciertos valores estadísticos de la prueba de Mantel-Cox en función de su valor de ACt. Para determinar el límite (punto de corte) entre 2 grupos, se determina el valor máximo obtenido por un individuo para la estadística de la prueba de Mantel-Cox y se utiliza una lectura gráfica que permite determinar el valor del umbral de referencia (Uref) de 6,4015.
La figura 2B representa las curvas de supervivencia calculadas por el método de Kaplan-Meier para los 2 grupos de supervivencia después del cálculo del valor de umbral. El grupo representado en negro es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es inferior al valor de umbral (Uref) y el grupo representado en gris es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es superior al valor de umbral (Uref). Aquí, el grupo de larga supervivencia es el grupo en gris. El valor p de la prueba de rango logarítmico se indica en la parte superior del gráfico: P=0,000219. La figura 3 representa los resultados obtenidos por los inventores en la determinación del umbral de referencia para el gen SESN3.
La figura 3A representa la distribución de ciertos valores estadísticos de la prueba de Mantel-Cox en función de su valor de ACt. Para determinar el límite (punto de corte) entre 2 grupos, se determina el valor máximo obtenido por un individuo para la estadística de la prueba de Mantel-Cox y se utiliza una lectura gráfica que permite determinar el valor del umbral de referencia (Uref) de 3,6262.
La figura 3B representa las curvas de supervivencia calculadas por el método de Kaplan-Meier para los 2 grupos de supervivencia después del cálculo del valor de umbral. El grupo representado en negro es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es inferior al valor de umbral (Uref) y el grupo representado en gris es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es superior al valor de umbral (Uref). Aquí, el grupo de larga supervivencia es el grupo en gris. El valor p de la prueba de rango logarítmico se indica en la parte superior del gráfico: P=0,000331. La figura 4 representa los resultados obtenidos por los inventores en la determinación del umbral de referencia para el gen ARL4C.
La figura 4A representa la distribución de ciertos valores estadísticos de la prueba de Mantel-Cox en función de su valor de ACt. Para determinar el límite (punto de corte) entre 2 grupos, se determina el valor máximo obtenido por un individuo para la estadística de la prueba de Mantel-Cox y se utiliza una lectura gráfica que permite determinar el valor del umbral de referencia (Uref) de 2,6286.
La figura 4B representa las curvas de supervivencia calculadas por el método de Kaplan-Meier para los 2 grupos de supervivencia después del cálculo del valor de umbral. El grupo representado en negro es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es inferior al valor de umbral (Uref) y el grupo representado en gris es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es superior al valor de umbral (Uref). Aquí, el grupo de larga supervivencia es el grupo en gris. El valor p de la prueba de rango logarítmico se indica en la parte superior del gráfico: P=0,000472. La figura 5 representa los resultados obtenidos por los inventores en la determinación del umbral de referencia para el gen RPLP1.
La figura 5A representa la distribución de ciertos valores estadísticos de la prueba de Mantel-Cox en función de su valor de ACt. Para determinar el límite (punto de corte) entre 2 grupos, se determina el valor máximo obtenido por un individuo para la estadística de la prueba de Mantel-Cox y se utiliza una lectura gráfica que permite determinar el valor del umbral de referencia (Uref) de 6,3748.
La figura 5B representa las curvas de supervivencia calculadas por el método de Kaplan-Meier para los 2 grupos de supervivencia después del cálculo del valor de umbral. El grupo representado en negro es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es inferior al valor de umbral (Uref) y el grupo representado en gris es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es superior al valor de umbral (Uref). Aquí, el grupo de larga supervivencia es el grupo en gris. El valor p de la prueba de rango logarítmico se indica en la parte superior del gráfico: P=0,00053. La figura 6 representa los resultados obtenidos por los inventores en la determinación del umbral final de referencia para la combinación de los 5 genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C, RPLP1.
La figura 6A representa la distribución de ciertos valores estadísticos de la prueba de Mantel-Cox en función de su valor de ACt. Para determinar el límite (punto de corte) entre 2 grupos, se determina el valor máximo obtenido por un individuo para la estadística de la prueba de Mantel-Cox y se utiliza una lectura gráfica que permite determinar el valor del umbral de referencia (Uref) de 1,102.
La figura 6B representa las curvas de supervivencia calculadas por el método de Kaplan-Meier para los 2 grupos de supervivencia después del cálculo del valor de umbral. El grupo representado en negro es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es inferior al valor de umbral (Uref) y el grupo representado en gris es el conjunto de individuos cuyo valor de ACt es superior al valor de umbral (Uref). Aquí, el grupo de larga supervivencia es el grupo en gris. El valor p de la prueba de rango logarítmico se indica en la parte superior del gráfico: P=1,01.10-08.
Ejemplo 1: Identificación de un conjunto de genes para el pronóstico del cáncer de páncreas
1.1 Preparación del ARN
Las muestras de sangre total de 61 pacientes extraídas antes del tratamiento, acondicionadas en tubos de PAXgene en hielo seco (expedidor: LabConnect, Estados Unidos) fueron recibidas y almacenadas a -80 °C. Fueron nombradas "semana 0".
El ARN total se extrajo a partir de las 61 muestras de sangre total y se nombró "semana 0". El análisis del transcriptoma (búsqueda de biomarcadores) solo se realizó en estas muestras "semana 0".
Las 61 muestras de ARN fueron analizadas a fin de determinar su calidad. El control de la integridad del ARN se realizó con el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, Estados Unidos) utilizando el nanochip "ARN eucariótica total 6000" (Nano Chip 6000 de ARN eucariótica total de Agilent Technologies). La cantidad de ARN fue controlada utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (THERMO Scientific). Los ARN purificados fueron conservados a -80 °C.
Una muestra fue eliminada del estudio debido a la mala calidad del ARN ("Número de integridad del ARN" <8).
60 muestras de ARN de sangre total, que se corresponden con las muestras de sangre de referencia, se extrajeron a partir de la sangre previamente extraída (tubos de extracción de sangre PAXgene, BD) utilizando el kit de ARN de sangre PAXgene V.2 (PreAnalitix) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Se llevaron a cabo experimentos de expresión génica digital (Digital Gene Expression (EGD)) para seleccionar un conjunto de biomarcadores putativos.
La validación de los biomarcadores se hizo utilizando una plataforma COBAS (LC480, Roche Diagnostics) y los enfoques bioestadísticos apropiados se utilizaron para filtrar los mejores biomarcadores.
Figure imgf000013_0001
continuación
Figure imgf000014_0001
1.2. Construcción de la biblioteca de EGD y cartografía baliza-gen
Las muestras de ARN se dividieron en 2 grupos:
- M4: corresponde a los pacientes que recibieron, después de la toma de muestras de sangre de referencia, gemcitabina y fallecen antes del mes 4;
- M15: corresponde a los pacientes que recibieron, después de la toma de muestras de sangre de referencia, gemcitabina y viven después del mes 15.
Para cada grupo, se mezclaron cantidades equimolares de cada muestra de ARN total de los pacientes a fin de constituir un agrupamiento de ARN total.
6 bibliotecas de tipo EGD (técnica repetida tres veces para cada grupo) fueron construidas a partir de dichos agrupamientos.
Las bibliotecas se construyeron con el kit previsto a tal efecto de la sociedad Illumina (kit de perfilado con etiqueta EGD) de acuerdo con el protocolo del fabricante (versión 2.1B), utilizando 2 |jg de ARN total.
La secuenciación y los análisis posteriores se realizaron utilizaron el dispositivo Pipeline de Illumina.
Se utilizó la plataforma MGX (Montpellier, Francia).
Los datos de cada biblioteca de EGD fueron analizados con el software de BIOTAG (Acobiom, Montpellier, Francia) para la detección y el recuento de las balizas, y la evaluación de la calidad de las bibliotecas de EGD (Piquemal et al., 2002).
1.3. Marcado y selección de balizas
Una base de datos que compila las secuencias de Homo sapiens y las informaciones conexas se generó a partir de secuencias resultantes de la base de datos UniGene (construido n.° 232, marzo de 2012, NCBI).
Para cada secuencia de la base de datos, la baliza EGD esperada (baliza canónica) situada aguas arriba del sitio de restricción Nlalll (CATG) más cercano al extremo 3' de la secuencia (R1), así como las balizas putativas situadas en posiciones interiores (etiquetada R2, R3 y R4 a partir del extremo 3' del transcrito), fueron extraídas (Piquemal et al., 2002).
Las balizas experimentales obtenidas a partir de las bibliotecas de EGD fueron emparejadas y marcadas (coincidencias exactas para 17 pb) utilizando esta colección de balizas virtuales. En primer lugar se buscó una coincidencia para cada baliza experimental con las balizas canónicas virtuales (R1). A continuación, las balizas experimentales no emparejadas con las balizas R2, luego con R3 y R4 fueron marcadas.
Los análisis de los experimentos de EGD se realizaron utilizando el método edgeR (versión 2.6.9, Bioconductor). Los genes analizados fueron seleccionados en función de (1) filtros matemáticos con el mayor factor de variación diferencial, "differential Fold Change", >1,5).
La tasa de falsos positivos (FDR) es un valor p ("pvalue") ajustado (aquí se establece FDR < 10 %) que se calcula basándose en el error de tipo 1 (a=5 %) notificado en las consideraciones generales. (J.R. Statist. Soc. B, 2010, Discovering the false discovery rate, Y Benjamini)
(2) filtros biológicos con la implementación de genes diana en procesos específicos y vías metabólicas conocidas.
1.4. Síntesis de ADNc para la qPCR
Se realizaron transcripciones inversas para cada una de las 60 muestras de ARN en 20 pl de volumen de reacción final con 300 ng de ARN total utilizando 200 unidades de enzima SuperScript II (M-MLV tipo TA, Invitrogen) y 250 ng de cebadores aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante (25 °C, 10 min, 42 °C, 50 min, 70 °C 15 min), el mismo día con la misma pipeta y los mismos manipuladores.
1.5. qPCR
La validación de los genes diana se llevó a cabo por qPCR en una plataforma de Roche Diagnostics.
Los experimentos de qPCR se realizaron utilizando una mezcla de LightCycler® 480 DNA SYBR Green Master (Roche Diagnostics) en un aparato LightCycler480® de Roche Diagnostics de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para las dosificaciones con SYBR Green, la mezcla de reacción se preparó de la siguiente manera en un volumen final de 10 pl: 5 pl de LightCycler 480 DNA SYBR Green Master 2X (Roche), 4 pl de pares de cebadores de 50 pM (Eurogentec), 1 pl de matriz de ADNc (1/15 de dilución final).
El programa de PCR consiste en una primera etapa de preincubación a 95 °C durante 10 minutos seguido de 45 ciclos de PCR (95 °C durante 10 s), 63 °C durante 15 s y 72 °C durante 15 s).
Para discriminar los productos específicos de los productos no específicos y dímeros de cebadores, se obtuvo una fusión por aumento progresivo de la temperatura de 65 a 97 °C.
Tabla 4: cebadores correspondientes a los 5 biomarcadores utilizados para la qPCR, así como los 2 genes de referencia * enes ubicuos.
Figure imgf000015_0001
Los datos de la qPCR se analizaron utilizando el método Delta.Ct (ACt) (Livak y Schmittgen, 2001). Para todos los genes diana, los valores de ACt se determinaron aplicando la fórmula
ACt = y (gen) -[Ct (B2M) Ct (GAPDH)]/2
Los dos genes ubicuos son:
- B2M (NM_009735, beta-2 microglobulina de Mus musculus, ARNm) y
- GAPDH (NM_002046, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, variante de transcripción 1, ARNm NM_001256799 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Homo sapiens, variante de transcripción 2, ARNm).
1.6. Resultados
Identificación de la huella genética
Por medio del método de EGD, se realizaron perfiles transcriptómicos de sangre total de los pacientes y se seleccionaron 169 genes con el método edgeR, como se describe en el punto 1.3.
En un ensayo de qPCR, una reacción positiva es detectada por una acumulación de una señal fluorescente.
El Ct se define como el número de ciclos de PCR necesarios para que la señal fluorescente cruce el ruido de fondo, el valor Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico diana de la muestra. Así, cuanto más bajo es el valor de Ct, más elevada es la cantidad de ácido nucleico diana en la muestra.
También se realizó un estudio farmacogenómico auxiliar. Muestras de ARN de sangre de 61 pacientes fueron extraídas antes de cualquier tratamiento y analizadas por RT-PCR.
Una huella genética pro-metastásica ("genetic pro-metastatic fingerprint") presente en el 65 % de los pacientes, altamente predictiva de la supervivencia global, y, además, en interacción con el tipo de tratamiento, ha sido resaltada. Los pacientes tratados con gemcitabina, que presentan la huella genética pro-metastásica tienen una baja tasa de supervivencia general (OS) (5,0 meses).
Los genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1 fueron seleccionados por los inventores entre los 169 genes, de acuerdo con la naturaleza multifactorial de esta indicación.
Figure imgf000016_0001
continuación
Figure imgf000017_0001
La identificación de la huella genética descrita aquí abre una nueva vía para la terapia personalizada en esta indicación.
La huella genética pro-metastásica, basada en un valor específico de Delta.Ct (ACt) puede ser normalmente determinada por RT-PCT a partir de ARN de muestras de sangre. El valor ACt que ilustra el nivel de expresión de un gen determinado en un paciente determinado se obtiene por amplificación por RT-PCR del gen determinado y tras la normalización con respecto a los genes de referencia (B2M, GAPDH). Cuanto más bajo es el valor de ACt, más elevado es el nivel de expresión del gen.
Los pacientes con un alto pronóstico de supervivencia y/o elegibles para el tratamiento con gemcitabina presentan un valor ÍNDICE específico.
Determinación de ÍNDICE
Más precisamente, cada gen identificado (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1), se evaluó por su valor pronóstico de supervivencia global en una población tipo de pacientes que padecen cáncer de páncreas (población de referencia), antes de que dichos pacientes reciban tratamiento (véase el punto 1.1).
En dicha población de referencia y para los 5 genes identificados (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1), un valor de umbral de ACT ha sido definido por qPCR.
A continuación, para los 5 genes identificados (NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1), un modelo de Mantel-Cox (o prueba de Log-Rank, "prueba de rango logarítmico") analizó la diferencia de supervivencia entre la supervivencia a largo plazo y la supervivencia a corto plazo, y estableció un "umbral de referencia" (Uref) y un "coeficiente beta" para cada gen identificado. Esta prueba de rango logarítmico permite la comparación entre dos grupos cuyas curvas de supervivencia fueron calculadas por el método de Kaplan Meier. Se comprueba la hipótesis nula H0 de igualdad de las funciones de supervivencia en los dos grupos considerados. Con H0, el riesgo de fallecimiento es el mismo en un momento dado Ti entre los dos grupos, por lo tanto, se espera una proporción de fallecimientos idéntica en estos (Bland y Altman, 2004).
La siguiente tabla 2 anterior presenta los valores del umbral de referencia (Uref) y del coeficiente beta obtenidos para los 5 genes NME4, ITPR3, SESN3, ARL4C y RPLP1, en la población de referencia.
T l 2: m r l fi i n fi i n f r l n i nifi s
Figure imgf000018_0001
Un nivel de expresión normalizado ACt de NME4 superior a 3,1864, y/o
- un nivel de expresión normalizado ACt de ITPR3, SESN3, ARM4C y/o RPLP1 inferior respectivamente a 6,4015; 3,6262; 2,6286 y 6,3748, indica un pronóstico de supervivencia a largo plazo, mientras que
- un nivel de expresión normalizado ACt de NME4 inferior a 3,1864, y/o
- un nivel de expresión normalizado ACt de ITPR3, SESN3, ARM4C y/o RPLP1 superior respectivamente a 6,4015; 3,6262; 2,6286 y 6,3748, indica un pronóstico de supervivencia a corto plazo.
El pronóstico puede ser perfeccionado tomando una combinación de los 5 genes de la tabla 2.
El valor ACT obtenido se corrige entonces a una variable que puede tomar dos valores:
- 1 si el valor ACT de las muestras es estrictamente superior al valor de Uref definido para el gen considerado; - -1 si el valor ACT de las muestras es estrictamente inferior al valor de Uref definido para el gen considerado. Esto permite entonces definir para cada gen considerado un valor ÍNDICE que se calcula de acuerdo con: ÍNDICE = (+1 o -1) x (coeficiente ft).
De esta forma, para los genes considerados, el ÍNDICE calculado sobre la población de referencia de pacientes que padecen cáncer de páncreas puede tomar los valores dados en la siguiente tabla 3:
Tabla 3
Figure imgf000018_0002
Es el INDICE de la combinación de genes escogido para evaluar el pronóstico de supervivencia del paciente que permitirá establecer el pronóstico.
El modelo de Mantel-Cox (o prueba de rango logarítmico) que tiene en cuenta los ÍNDICE calculados permitió determinar un "umbral final de referencia" para cada una de las combinaciones, que permitirá establecer el pronóstico de supervivencia del paciente sometido a ensayo.
El valor del umbral final de referencia para la combinación de los 5 genes considerados es igual a 1,102.
Sobre la base del valor de umbral final de referencia definido para cada gen o para combinación, es posible establecer el pronóstico de supervivencia del paciente sometido a ensayo:
- si el ÍNDICEpaciente calculado en el paciente sometido a ensayo es inferior al valor de umbral final de referencia, entonces el pronóstico es una supervivencia a largo plazo y
- si el ÍNDICEpaciente calculado en el paciente sometido a ensayo es superior al valor de umbral final de referencia, entonces el pronóstico es una supervivencia a corto plazo.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro para establecer un pronóstico de supervivencia en un paciente que padece cáncer de páncreas, que comprende las siguientes etapas:
a) medir el nivel de expresión de cada gen de una combinación de genes marcadores seleccionados entre el grupo constituido por genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos el 90 % con el gen NME4 o ARL4C, respectivamente, en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída; b) comparar el nivel de expresión medido de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente con un umbral de referencia;
c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente.
2. Procedimiento in vitro para predecir o evaluar la eficacia y/o el beneficio de un tratamiento para el cáncer de páncreas en un paciente que padece dicha patología, que comprende las siguientes etapas:
a) medir el nivel de expresión de cada gen de una combinación de genes marcadores seleccionados entre el grupo constituido por genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos el 90 % con el gen NME4 o ARL4C, respectivamente, en una muestra de sangre de dicho paciente previamente extraída; b) comparar el nivel de expresión medido de los genes marcadores seleccionados en la etapa a) en dicho paciente con un umbral de referencia;
c) evaluar el tiempo de supervivencia en dicho paciente.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que dicho tratamiento es un tratamiento con gemcitabina.
4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que en la etapa a) se mide el nivel de expresión de cada gen de una combinación de genes marcadores seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo, ARL4C o un gen homólogo del mismo, ITPR3 o un gen homólogo del mismo, SESN3 o un gen homólogo del mismo y RPLP1 o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos el 90 % con el gen NME4, ARL4C, ITPR3, SESN3 o RPLP1, respectivamente.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra de sangre es una muestra de sangre total periférica.
6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se mide el nivel de expresión de los genes por la medición de la cantidad de las proteínas codificadas por dichos genes presentes en la muestra de sangre.
7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se mide el nivel de expresión de los genes por el nivel de transcripción del ARN o del ADNc de dichos genes.
8. Método de seguimiento de la eficacia de un tratamiento para el cáncer de páncreas, ventajosamente de un tratamiento con gemcitabina, por la implementación del procedimiento descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, ventajosamente a intervalos de tiempo de tratamiento.
9. Uso in vitro de una combinación de genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, o una combinación de 5 genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo, ARL4C o un gen homólogo del mismo, ITPR3 o un gen homólogo del mismo, SESN3 o un gen homólogo del mismo y RPLP1 o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos el 90 % con el gen NME4, ARL4C, ITPR3, SESN3 o RPLP1, respectivamente, para el pronóstico de un cáncer de páncreas, en un paciente.
10. Uso in vitro de una combinación de genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo y ARL4C o un gen homólogo del mismo, o una combinación de 5 genes seleccionados entre el grupo constituido por los genes NME4 o un gen homólogo del mismo, ARL4C o un gen homólogo del mismo, ITPR3 o un gen homólogo del mismo, SESN3 o un gen homólogo del mismo y RPLP1 o un gen homólogo del mismo, siendo dichos genes homólogos genes que presentan un grado de identidad de secuencia de al menos el 90 % con el gen NME4, ARL4C, ITPR3, SESN3 o RPLP1, respectivamente, para el seguimiento de la eficacia de un tratamiento para el cáncer de páncreas, ventajosamente de un tratamiento con gemcitabina en un paciente.
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