ES2549642B1 - Método de predicción de respuesta al tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda - Google Patents

Método de predicción de respuesta al tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda Download PDF

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Abstract

Método de predicción de respuesta al tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.#La presente invención divulga el uso de los genes de la familia IMP, para el diagnóstico, el diagnóstico diferencial, y/o predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA, tanto pediátrica como de adulto.

Description

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DESCRIPCION
METODO DE PREDICCION DE RESPUESTA AL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA
linfoblAstica AGUDA
CAMPO DE LA INVENCION
La invention se engloba dentro del campo de la medicina, y concretamente en el campo del diagnostico y el pronostico medico, y en concreto se refiere a un metodo para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento de la Leucemia Linfoblastica Aguda (LLA).
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La familia de genes denominada "Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein” (IGF2BP, IMP, CRD-BP o VICKS) esta compuesta por los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3, localizados respectivamente en los cromosomas 17q21, 3q27 y 7p11. Se expresan durante la embriogenesis, desarrollo fetal y en determinadas neoplasias, no detectandose en tejidos sanos adultos, por lo que son consideradas oncoprotelnas fetales. Los tres realizan funciones de control de la proliferation celular y regulation de la transcription mediante su union al mRNA de genes diana, entre los que se encuentra como eje fundamental de su action el factor de crecimiento 2 parecido a la insulina (Insulin-like growth factor 2 o IGF2).
La expresion de novo o sobreexpresion de IMP-1 ha sido detectada en una gran variedad de tumores solidos y se ha relacionado con una mayor probabilidad de progresion y mortalidad en pacientes con carcinoma pulmonar y cancer de ovario. En un modelo murino transgenico, la expresion inducida de IMP-1 en tejido mamario adulto indujo el desarrollo de tumores. En tejido hematopoyetico, la expresion de IMP-1 ha sido estudiada en mRNA procedente de celulas sanas de medula osea, sangre periferica y de cordon umbilical, detectandose tan solo expresion en la fraction celular CD34+ de celulas de cordon umbilical. No se han publicado estudios que analicen la expresion de IMP-1 en muestras de pacientes con leucemia.
IMP-2 (VICKZ2), tambien es considerada una oncoprotelna fetal cuya expresion esta limitada a la etapa embrionaria del desarrollo, si bien algunos tejidos adultos como placenta, testlculos, hlgado, intestino y utero, pueden expresarla. Una variante de IMP-2 (p62), originada por la perdida de un exon, esta sobreexpresada en distintas neoplasias de origen digestivo y en liposarcomas. En neoplasias hematologicas la expresion de IMP-2 y sus diferentes isoformas, ha sido estudiada principalmente en slndromes linfoproliferativos
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cronicos y en algunas muestras de leucemias linfoblasticas agudas (LLA). Se ha observado sobreexpresion de la protema en el 25% (4 de 13) de las LLA de origen B y en el 29% (4/14) de las de origen T. Su posible correlation con el pronostico de estos pacientes no ha sido valorada.
IMP-3, originalmente denominado KOC1 (KH domain overexpressed in cancer), codifica una oncoprotema implicada en la regulation de la transcription y la estabilidad del mRNA, procesos implicados en el desarrollo, crecimiento, diferenciacion celular y carcinogenesis. Como IMP-1 e IMP-2, presenta la caractehstica de ser expresada tan solo en tejidos neoplasicos y no en los tejidos sanos circundantes, siendo de gran utilidad para el diagnostico diferencial de lesiones malignas. Asi, se ha demostrado en diferentes neoplasias solidas como en cancer de pancreas, adenocarcinoma de endometrio, melanoma, o adenocarcinoma pulmonar, relacionandose tambien con una mayor agresividad clmica. En neoplasias hematologicas los estudios son limitados, con escasos pacientes y centrados en el estudio de la expresion proteica mediante inmunohistoquimica y no a nivel de mRNA.
La Leucemia Linfoblastica Aguda (LLA) representa el 27% de las neoplasias diagnosticadas en menores de 15 anos, presenta una probabilidad global de supervivencia a los 5 anos del 75% aproximadamente. Sin embargo, esta puede oscilar entre el 25% y el 95% dependiendo de los factores de riesgo presentes al diagnostico y del tipo de tratamiento quimioterapico empleado. La incidencia de LLA en adultos se situa en torno a 1,5 casos por 100.000 habitantes/ano, con una probabilidad global de supervivencia libre de enfermedad a los 5 anos entre el 25% y el 52%. Esta supervivencia inferior en la LLA de los adultos respecto a los ninos viene determinada principalmente por la detection en adultos de una proportion superior de anomalias geneticas de alto riesgo, como el reordenamiento BCR- ABL1, y por una mayor morbilidad secundaria al tratamiento quimioterapico.
Junto a los factores de riesgo “clasicos” como la edad de presentation, la cifra de leucocitos, el inmunofenotipo, las anomalias cromosomicas o la respuesta inicial al tratamiento, existen nuevos factores pronostico dependientes del perfil de expresion de genes supresores, oncogenes o de factores epigeneticos que pueden modificar el riesgo establecido por los factores clasicos. Esta nueva estratificacion de grupos de riesgo podha permitir adaptar mejor la estrategia terapeutica en cada paciente y establecer nuevas lmeas de investigation para el desarrollo de dianas terapeuticas mas eficaces y menos agresivas que la quimioterapia convencional.
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En la LLA la detection de celulas residuales leucemicas o de enfermedad minima residual (EMR) tras la remision citologica, condiciona el pronostico y la probabilidad de recalda de los pacientes de forma independiente a otros factores de riesgo conocidos. Los metodos mas utilizados para su estudio estan basados en el analisis mediante citometrla de flujo de marcadores inmunologicos aberrantes (como la expresion de marcadores de estirpe mieloide o de asincronismo madurativo) o en la deteccion de marcadores geneticos especlficos de las celulas leucemicas mediante la reaction en cadena de la polimerasa (PCR). Estos marcadores geneticos deben identificarse en los pacientes con LLA en el momento del diagnostico y se monitorizaran en las distintas fases del tratamiento quimioterapico (induction, consolidation, mantenimiento o trasplante de progenitores hematopoyeticos).
Actualmente en la LLA existen dos estrategias de seguimiento de la EMR mediante PCR, la primera se basa en el estudio de reordenamientos o translocaciones cromosomicas especlficas de la clona leucemica (BCR-ABL, ETV6-RUNX1, E2A/PBX, reordenamientos de MLL, etc.), que si bien presenta una alta sensibilidad en la deteccion de EMR (1 celula leucemica entre 10e5 celulas normales), tiene el inconveniente de que tan solo el 25-30% de los pacientes con LLA van a presentar en el momento de su diagnostico reordenamientos cromosomicos que nos permitan su seguimiento. La segunda estrategia se basa en la deteccion por PCR de los reordenamientos del gen de las cadenas pesadas de las Inmunoglobulinas y del receptor de la celula T. Mas del 90% de los pacientes se puede seguir mediante esta metodologla, aunque para ello es necesario la secuenciacion individualizada de cada reordenamiento, y el diseno posterior de cebadores especlficos para cada paciente. Esto hace que el tiempo, la metodologla y el coste economico necesario no esten al alcance de los laboratorios cllnicos y solo se utilice para fines de investigation y no asistenciales.
En la Leucemia Mieloblastica Aguda (LMA) se ha descrito una nueva estrategia de seguimiento de EMR mucho mas simple y al alcance del laboratorio cllnico, la monitorizacion mediante PCR cuantitativa en tiempo real (PCRctr) de la expresion del gen WT1 (gen del tumor de Wilms). El gen WT1 se encuentra sobreexpresado al diagnostico en aproximadamente el 70-90% de las LMA, sin embargo su expresion en medula osea o sangre periferica de sujetos sanos es muy baja o ausente, por lo que la cuantificacion de sus niveles de expresion en mRNA durante las fases del tratamiento quimioterapico es de gran utilidad cllnica para establecer el pronostico y la probabilidad de recalda de los pacientes.
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Esta estrategia ha sido estandarizada recientemente por el grupo European LeukemiaNet para el seguimiento de los pacientes con LMA. A diferencia de la LMA, en la LLA todavia no se ha encontrado un marcador genetico que se sobreexprese en la mayoha de pacientes y que permita el seguimiento de la EMR.
Un ultimo aspecto a destacar es el descubrimiento de la capacidad inmunogena de la protema IGF2BP3 (IMP-3), esto abre una posible via terapeutica mediante inmunoterapia en aquellos pacientes con neoplasias que la sobreexpresen. En un ensayo clmico reciente, una vacuna anti IGF2BP3 ha mostrado ser segura y bien tolerada.
La identification mediante estudios geneticos y moleculares de subtipos biologicamente diferentes en la LLA, asi como la realization de estudios de EMR y su integration en el laboratorio y la practica clmica, permitiran una mejor estratificacion del riesgo en ninos y adultos con LLA y un mejor planteamiento de la estrategia terapeutica a seguir. Es necesario, por tanto, encontrar un metodo que permita mejor estratificacion del riesgo en ninos y adultos con LLA y un mejor planteamiento de la estrategia terapeutica a seguir.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
Los autores de la presente invention han desarrollado un metodo para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento de la LLA, mediante el empleo de unos biomarcadores espedficos, de manera sencilla.
Por tanto, un primer aspecto de la invencion se refiere al uso de los genes de la familia IMP (“Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein”, IGF2BP, IMP, CRD-BP o VICKS), o cualquiera de sus combinaciones, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA. En una realizacion preferida de este aspecto de la invencion, los genes de la familia IMP se seleccionan de la lista que comprende IMP-1, IMP-2, IMP-3, o cualquiera de sus combinaciones.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso simultaneo de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP- 3, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA. Sin embargo, el uso independiente de cualquiera de ellos o cualquiera de sus combinaciones podhan ser suficientes para evaluar el seguimiento de dicha enfermedad.
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El segundo aspecto de la invention se refiere a un metodo, de ahora en adelante primer metodo de la invencion” de obtencion de datos utiles para el diagnostico, el diagnostico diferencial, o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento de la leucemia linfoblastica aguda que comprende:
a. Obtener una muestra biologica aislada que comprende celulas del individuo, y
b. Detectar la cantidad de producto de expresion de los genes de la familia IMP.
El termino "muestra biologica aislada que comprende celulas del paciente", tal y como se utiliza en la description se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biologicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier metodo conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biologica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia o un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biologico, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, linfa, fluido ascltico u orina. Preferiblemente las muestras son de sangre periferica o de medula osea de pacientes preferiblemente diagnosticados con LLA recolectadas en distintos momentos del tratamiento quimioterapico, por ejemplo, pero sin limitarse, al dla 14 de la induction, tras la induction, tras las consolidaciones, durante el mantenimiento y seguimiento o tras el trasplante de precursores hematopoyeticos. En otra realization preferida, la muestra biologica procede de pacientes que se sospecha que pueden padecer LLA, y la muestra y el metodo de la invencion se utilizan para el diagnostico. La muestra biologica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.
En una realizacion preferida de este segundo aspecto el sujeto padece LLA de linaje linfoide de origen T o B adultos y pediatricos, y cualquiera de los subtipos moleculares BCR-ABL, TEL-AML1, E2A-PBX1, con reordenamientos de MLL y con reordenamientos de c-Myc.
En otra realizacion preferida, el primer metodo de la invencion comprende ademas:
c) Comparar los niveles de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 en la muestra obtenida en (a), con la cantidad de expresion detectada para dichos genes en una poblacion de individuos de referencia de respuesta patologica conocida.
Un tercer aspecto de la invencion se refiere a un metodo para el diagnostico diferencial, y para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA, de ahora en adelante segundo metodo de la invencion, que comprende los pasos (a)-(c) del primer metodo de la invencion, y ademas comprende asignar al individuo que presentan un nivel de
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expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 superior a los niveles de expresion de los mismos genes en una poblacion de referencia, al grupo de individuos con LLA. Actualmente, a pesar de tener pronosticos muy diferentes, la division entre LLA pediatrica o del adulto se determina por la edad. En Espana los individuos con menos de 14 anos se clasifican como una LLA pediatrica, y cuando tienen mas de 14 anos, como una LLA del adulto. En otros palses esta edad puede establecerse en los 18 anos.
Los autores de la presente invention han observado un diferente perfil del expresion de la familia de genes IMP entre pacientes adultos y pediatricos, este nos podrla ayudar a establecer o a caracterizar de una forma mas adecuada una LLA como pediatrica o del adulto, pues anadirlamos un perfil biologico y no solo una simple edad llmite. En una realization preferida de este aspecto de la invencion la muestra biologica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periferica, y/o comprende celulas de sangre periferica (peripheral blood cells PBCs).
Una realizacion preferida de este aspecto se refiere a un metodo de diagnostico que comprende los pasos (a)-(c) del primer metodo de la invencion, y ademas comprende asignar al grupo de individuos que presentan una expresion superior de IMP-3 al 0.01 (Media ± 3 SD).
La detection de la cantidad del producto de expresion de los genes puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la tecnica. La cantidad del producto de expresion de los genes detectada en distintas estadios de la enfermedad podrla establecer un diagnostico diferencial en individuos afectados por LLA, que permite subclasificarlos. Tambien permite el diagnostico diferencia, distinguiendo entre LLA de adultos y LLA infantil.
La medida de la cantidad o la concentration, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentracion del producto de expresion de los genes, basada en una senal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las protelnas a las que se traducen, y que esta correlacionada directamente con el numero de moleculas de RNA o de protelnas producidas por los genes. Dicha senal-a la que tambien podemos referirnos como senal de intensidad-puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad qulmica o flsica de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de
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medida biologica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reaccion enzimatica).
El termino “cantidad”, tal y como se utiliza en la description, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresion de los genes, asl como a cualquier otro valor o parametro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de estos. Dichos valores o parametros comprenden valores de intensidad de la senal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades flsicas o qulmicas de dichos productos de expresion obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parametros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
El termino “comparacion”, tal y como se utiliza en la descripcion, se refiere pero no se limita, a la comparacion de la cantidad de los productos de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 de la muestra biologica a analizar, tambien llamada muestra biologica problema, con una cantidad de los productos de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 de una o varias muestras de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripcion. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultanea o consecutivamente, junto con la muestra biologica problema. La comparacion descrita en el apartado (c) del metodo de la presente invencion puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
Los productos de expresion de los genes van a dar un determinado perfil de expresion genica. Se entiende por “perfil de expresion genica” el perfil genico obtenido tras la cuantificacion del ARNm y/o de protelna producida por los genes de interes o biomarcadores, es decir, por los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3, en una muestra biologica aislada. El perfil de expresion de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripcion, previa extraccion del ARN total presente en la muestra biologica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la tecnica. La determination del nivel de ARNm derivado de la transcription de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplification por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripcion en combination con la reaccion en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripcion en combinacion con la reaccion en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro metodo de amplificacion de acidos nuclelcos; analisis en serie de la expresion genica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleotidos depositados
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por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleotidos sintetizados in situ mediante fotolitografia o por cualquier otro mecanismo; hibridacion in situ utilizando sondas espedficas marcadas con cualquier metodo de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridacion con una sonda espedfica; mediante resonancia magnetica nuclear o cualquier otra tecnica de diagnostico por imagen utilizando nanoparticulas paramagneticas o cualquier otro tipo de nanoparticulas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresion genica tambien podria obtenerse mediante la deteccion y/o cuantificacion de las protemas producto de la traduccion del ARNm derivado de la transcripcion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodeteccion por western blot. La deteccion cuantitativa de la expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 puede realizarse mas preferiblemente mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR o RTqPCR). La deteccion en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilizacion de moleculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridacion con diferentes tipos de sondas, como por ejemplo, pero sin limitarnos, sondas TaqMan, FRET, etc.
Mas preferentemente, la deteccion del producto de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 se realiza mediante RT-qPCR.
El termino "diagnostico”, tal y como se utiliza en la presente invencion, a la capacidad de discriminar entre individuos afectados o no por LLA.
A su vez, atendiendo al metodo de la presente invencion, se podrian establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la eleccion y el establecimiento de regimenes terapeuticos adecuados. Esta discriminacion tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadisticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadisticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadisticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinacion de intervalos de confianza, determinacion del valor significacion P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no parametricas de Mann Whitney, correlacion de Spearman, regresion logistica, regresion lineal, area bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del
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95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invention permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, mas preferiblemente en al menos el 70%, mucho mas preferiblemente en al menos el 80%, o aun mucho mas preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o poblacion analizada.
Una "muestra biologica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, celulas, tejidos y/o fluidos biologicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier metodo conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biologica aislada comprende celulas de sangre periferica (peripheral blood cells PBCs), o celulas de medula osea.
El termino "individuo”, tal y como se utiliza en la description, se refiere a animales, preferiblemente mamlferos, y mas preferiblemente, humanos. El termino "individuo” no pretende ser limitativo en ningun aspecto, pudiendo ser este de cualquier edad, sexo y condition flsica.
La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresion constitutiva de los genes, en un grupo de individuos sanos, o de la expresion de los genes en el grupo de individuos antes de ser sometidos al tratamiento.
La cantidad de referencia sera, por ejemplo, en el caso de la diferenciacion entre los pacientes afectados por LLA de los individuos sanos, la expresion constitutiva del gen en un grupo control de individuos sanos. Sin embargo, en el caso de la subclasificacion de los pacientes afectados por LLA en funcion de sus manifestaciones, el grupo control estara formado por un grupo de enfermos con LLA que no tuvieron esa manifestation cllnica.
As! pues, la muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, obtenidas a partir de las celulas sangulneas de un paciente con LLA, en una determinada fase cllnica. En otra realization preferida de este aspecto de la presente invencion, la cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse tambien, por ejemplo, de los llmites de distribution normal de una cantidad encontrada en muestras obtenidas de una poblacion de individuos con LLA en distintas fases, mediante tecnicas estadlsticas bien conocidas. En otra realizacion preferida, la muestra de referencia se obtiene de los pacientes antes y despues del tratamiento.
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La expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 en ARNm la estudiamos mediante la reaccion de la cadena polimerasa cuantitativa en tiempo real (RTqPCR) en la muestra tumoral diagnostica. Para su cuantificacion empleamos el metodo de cuantificacion relativa 2 delta CT utilizando como gen de referencia ABL1, el cual se ha visto que mantiene niveles estables de expresion a nivel de ARNm tanto en sujetos sanos como en pacientes con LLA. El gen IMP-1 o tambien Homo sapiens insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1 (IGF2BP1; IMP1; ZBP1; CRDBP; IMP-1; CRD-BP; VICKZ1) se encuentra en el cromosoma 17 (17q21.32). En el contexto de la presente invention, IMP-1 se define tambien por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la protelna recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprenderla diversas variantes procedentes de:
a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacldica de la SEQ ID NO: 2,
b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hlbrida con la secuencia polinucleotldica de a),
c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneration del codigo genetico,
d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacldica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterlsticas estructurales de la protelna IMP-1. Entre dichas moleculas de acido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 1.
El gen IMP-2 o tambien Homo sapiens insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 (IGF2BP2; p62; IMP2; IMP-2; VICKZ2) se encuentra en el cromosoma 3 (3q27.2). En el contexto de la presente invencion, IMP-2 se define tambien por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la protelna recogida en la SEQ ID NO: 4, y que comprenderla diversas variantes procedentes de:
a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacldica de la SEQ ID NO: 4,
b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hlbrida con la secuencia polinucleotldica de a),
c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneracion del codigo genetico,
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d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4, y en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterlsticas estructurales de la protelna IMP-2. Entre dichas moleculas de acido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 3.
El gen IMP-3 o tambien Homo sapiens insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 3 (IGF2BP3; CT98; IMP3; KOC1; IMP-3; VICKZ3) se encuentra en el cromosoma 7 (7p11). En el contexto de la presente invencion, IMP-3 se define tambien por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la protelna recogida en la SEQ ID NO: 6, y que comprenderla diversas variantes procedentes de:
a) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacidica de la SEQ ID NO: 6,
b) moleculas de acido nucleico cuya cadena complementaria hlbrida con la secuencia polinucleotldica de a),
c) moleculas de acido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneracion del codigo genetico,
d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido que comprende la secuencia aminoacidica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6, y en las que el polipeptido codificado por dichos acidos nucleicos posee la actividad y las caracterlsticas estructurales de la protelna IMP-2. Entre dichas moleculas de acido nucleico se encuentra la recogida en la SEQ ID NO: 5.
El cuarto aspecto de la invencion se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invencion, que comprende las herramientas moleculares necesarias para detectar la expresion de los genes de la familia de genes IMP.
En una relacion preferida del cuarto aspecto de la invencion, los genes se seleccionan de la lista que consiste en IMP-1, IMP-2, IMP-3, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra relacion preferida, la deteccion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 es simultanea. Mas preferiblemente, el kit comprende las secuencias SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 15.
Tabla 1. SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y SONDAS TAQMAN DE LA FAMILIA
GENES IGF2BP (Insulin-like Growth Factor II mRNA Binding Protein)
Cebador/sonda SECUENCIA
SEQ ID NO: 7
IMP1-F 5’- GGA AAG TAG AAT TAC AAG GAA AAC G -3’
SEQ ID NO: 8
IMP1-R 5’- CGG AGC TGG GGT GGA ATA -3’
SEQ ID NO: 9
IMP1-SONDA 5’-FAM- TGA ACA TTC GGT GCC CAA AA -3’- TAMRA
SEQ ID NO: 10
IMP2-F 5’- GCA GAG AAG CCT GTC ACC AT -3’
SEQ ID NO: 11
IMP2-R 5’- TGG TCC CTG TTT CAT GTT CA -3’
SEQ ID NO: 12
IMP2-SONDA 5’-FAM- CCA CCC CAG AGG GGA CTT CT -3’- TAMRA
SEQ ID NO: 13
IMP3-F AGA ACT GCA CGG GAA ACC CAT AGA
SEQ ID NO: 14
IMP3-R TCC CAC TGT AAA TGA GGC GGG A
SEQ ID NO: 15
IMP3-SONDA 5’-FAM- AGC ACT CGG TCC CAA AAA GGC A -3’- TAMRA
5 Un quinto aspecto de la invencion se refiere al uso del kit o dispositivo de la invencion, para el diagnostico, el diagnostico diferencial, o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento de la LLA.
Un sexto aspecto de la invencion se refiere a un medio de almacenamiento legible por un 10 ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los metodos de la invencion (del primer o del segundo metodo de la invencion).
Un septimo aspecto de la invencion se refiere a una senal transmisible que comprende 15 instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los metodos de la invencion.
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Los terminos “polinucleotido” y “acido nucleico” se usan aqul de manera intercambiable, refiriendose a formas polimericas de nucleotidos de cualquier longitud, tanto ribonucleotidos (ARN o RNA) como desoxiribonucleotidos (ADN o DNA). Los terminos “secuencia aminoacldica”, “peptido”, “oligopeptido”, “polipeptido” y “protelna” se usan aqul de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, qulmica o bioqulmicamente modificados.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caracterlsticas del invento de acuerdo con un ejemplo preferente de realization practica del mismo y para complementar esta descripcion, se acompana como parte integrante de la misma un juego de dibujos, cuyo caracter es ilustrativo y no limitativo.
Fig. 1. Media de edad de los pacientes pediatricos con LLA de precursores B con expresion normal y aumentada de IMP-3.
Fig. 2. Expresion media de IMP-3 en las LLA de origen B entre adultos y pacientes en edad pediatrica.
Fig. 3. Expresion media de IMP-3 en las LLA de origen T frente a las LLA de origen B (serie global, incluyendo adultos y ninos).
EJEMPLOS DE LA INVENCION
Este estudio fue financiado mediante el Premio de Investigation "Carmen Lavigne" concedido por la AECC delegacion provincial de Malaga. Se han analizado 202 pacientes diagnosticados de Leucemia Aguda Linfoblastica (LLA) entre diciembre de 1996 y diciembre de 2011. Considerando pacientes pediatricos todos aquellos con menos de 14 anos de
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edad, se encontraban en esta edad 124(61,4%) y 78(38,6%) en edad adulta. De las 202 LLA, 164(81,2%) fueron de linaje linfoide B y 38(18,8%) de origen T.
Para conocer los valores normales de expresion del gen IMPS tambien se analizaron 14 muestras de sangre periferica y 10 muestras de medula osea de sujetos sanos.
La expresion de IMPS en ARNm se estudio mediante reaction en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR 6 PCRctr) en la muestra tumoral diagnostica. Para su cuantificacion se empleo el metodo de cuantificacion relativa 2 delta CT utilizando como gen de referenda ABL1, el cual se ha visto que mantiene niveles estables de expresion a nivel de ARNm tanto en sujetos sanos como en pacientes con LLA.
RESULTADOS
1. Expresion en sujetos sanos:
Tras analizar 14 muestras de sangre periferica total (sin separacion de poblaciones leucocitarias), la expresion relativa de IMPS respecto al gen de control ABL1 (metodo de cuantificacion delta CT):
Media de expresion: 0,0034 Desviacion tfpica: 0,0023 Error tfpico de la media: 0,00062
Tras analizar 10 muestras de medula osea total, la expresion relativa de IMPS respecto al gen de control ABL1 (metodo delta CT):
Media de expresion: 0,0032 Desviacion tfpica: 0,0027 Error tfpico de la media: 0,00086
Se ha considerado que existe una expresion aumentada de IMPS cuando sus valores fueron iguales o superiores a 0,01 (Media + 3 SD).
2. Datos Globales en pacientes Adultos y Pediatricos:
De las 202 LLA analizadas, se detecto sobreexpresion en 132 (65,3%) de los pacientes. Esta distribucion fue diferente cuando se compararon ninos y adultos. Asf el 79,8% de los ninos (99 de 124 casos) frente al 42,3% de los adultos (33 de 78) sobreexpresaban IMPS (p<0,001) (Chi-cuadrado).
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Dentro de las LLA de origen B, el 75% de los pacientes (123 de 164) sobreexpresan IMP-3, frente al 23,7% (9 de 29) de las LLA de linaje T (p<0,001) (Chi-cuadrado).
3. Expresion en LLA pediatrica
Considerando pacientes pediatricos todos aquellos con 14 anos o menos, los niveles de expresion de IMPS detectados han sido:
3.1. LLA pediatrica de origen B
Se han analizado 102 muestras, en las cuales se ha detectado un aumento de expresion de IMPS en 91 (89,2%) de ellas. La media de expresion de los pacientes con aumento de IMP- 3 fue de 1,037 (rango: 0,01-3,88), con una desviacion tfpica de 0,87. Solo en 11 pacientes (10,8%) pediatricos con LLA de linaje B no se detecto aumento de la expresion de IMPS (valores inferiores a 0,01).
Cuando se analizo la media de edad entre los pacientes con expresion normal y sobreexpresion, los que presentaban valores normales de IMPS tenfan una media de edad significativamente mayor a los que presentaban sobreexpresion, 11,14 anos y 6,03 anos respectivamente (p<0,001) (Figura 1).
3.2. LLA pediatrica de origen T
Se han analizado 22 muestras, en las cuales se ha detectado aumento de expresion de IMPS en 8 casos (36,4%), en los 14 (63,6%) restantes los niveles eran comparables a los encontrados en sujetos sanos.
4. Expresion en LLA del adulto
Se ha analizado la expresion de IMPS en 78 casos de LLA del adulto, de las cuales 62 (79,5%) eran de linaje B y 16 (20,5%%) de linaje T.
4.1. LLA del adulto de origen B
De los 62 casos, 32 (51,6%) presentaban sobreexpresion de IMPS, frente a un 48,4% que tenfan valores comparables a los sujetos sanos. La edad media de ambos grupos fue similar, 37 anos para los que tenfa sobre-expresion frente a 28,8 anos para los que presentaban valores normales de IMPS.
4.2. LLA del adulto de origen T
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De los 16 casos, solo 1 paciente (6,3%) tenia aumento de la expresion de IMPS, el resto (93,8%) presentaban valores equiparables a los sanos.
5. Diferencias de expresion de IMPS entre las LLA de origen B de adultos y pacientes pediatricos
De un total de 164 LLA-B estudiadas, 102 correspondfan a pacientes pediatricos y 62 a adultos. De las 164, un 75% sobreexpresaban IMPS, pero la distribution entre adultos y pacientes pediatricos es diferente. Asf, el 89,2% de las LLA-B pediatricas sobreexpresan IMPS a nivel de ARNm, frente al 51,6% de las LLA-B del adulto (p<0,001) (Chi-cuadrado), los niveles medios de expresion de ambos grupos pueden observarse en la Figura 2.
6. Diferencias de expresion de IMPS en la serie completa, entre las LLA de origen B y T
De un total de 202 LLA estudiadas (incluyendo pacientes pediatricos y adultos) ,164 correspondfan a LLA de origen B y 38 a LLA de origen T. La sobreexpresion de IMPS fue detectada en el 75% de las LLA-B, frente al 23,7% de las LLA-T (p<0,0001) (Chi-cuadrado). Los niveles medios de expresion de ambos grupos pueden observarse en la Figura 3.
CONCLUSIONES
Se ha detectado que el 89,2% de las LLA-B pediatricas sobreexpresan IMP-3. En adultos con LLA-B, existe una mayor variabilidad en los niveles de expresion de IMPS, con expresion aumentada en el 42,3% de los casos. Tan solo el 23,7% (9 de 29 casos) de las LLA de origen T sobreexpresan IMPS, siendo este hallazgo mas frecuente en ninos 36,4%) que en adultos (6,3%) (p=0,031) (Chi-cuadrado).

Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. El uso de los genes de la familia IMP, para el diagnostico, el diagnostico diferencial, y/o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA, tanto pediatrica como de adulto.
  2. 2. El uso simultaneo de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3, para el diagnostico, el diagnostico diferencial, y/o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con terapia neoadyuvante en individuos con LLA.
  3. 3. Un metodo de obtencion de datos utiles para el diagnostico, el diagnostico diferencial, y/o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA:
    a. Obtener una muestra biologica aislada que comprende celulas del individuo, y
    b. Detectar la cantidad de producto de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 en la muestra aislada de (a).
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 3, que ademas comprende:
    c. Comparar los niveles de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 en la muestra obtenida en (a), con la cantidad de expresion detectada para dichos genes en una poblacion de individuos de referencia de respuesta patologica conocida.
  5. 5. Un metodo para el diagnostico, el diagnostico diferencial, y/o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento en individuos con LLA que comprende los pasos (a)-(c) segun cualquiera de las reivindicaciones 3-4, y ademas comprende asignar al individuo que presentan un nivel de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 superior a los niveles de expresion de los mismos genes en una poblacion de referencia, al grupo de individuos con LLA.
  6. 6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde el gen que se encuentra sobre-expresado es IMP-3.
  7. 7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde la muestra biologica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periferica, y/o comprende celulas de sangre periferica, o se obtiene de medula osea.
  8. 8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 3-7, donde la deteccion del producto de expresion de los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3 se realiza mediante RT- PCR.
  9. 9. Un kit o dispositivo que comprende las herramientas moleculares necesarias para
    5 detectar la expresion de los genes de la familia de genes IMP.
  10. 10. El kit o dispositivo segun la reivindicacion anterior, donde los genes de la familia de genes IMP, son los genes IMP-1, IMP-2 e IMP-3.
  11. 11. El kit o dispositivo segun cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende los cebadores y sondas de secuencias SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 15.
    10 12. El uso del kit o dispositivo de la invencion, para el diagnostico, diagnostico
    diferencial, o para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento de la LLA.
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