BR112017025255B1 - Método implementado por computador, método e composição farmacêutica inibidora - Google Patents

Método implementado por computador, método e composição farmacêutica inibidora Download PDF

Info

Publication number
BR112017025255B1
BR112017025255B1 BR112017025255-4A BR112017025255A BR112017025255B1 BR 112017025255 B1 BR112017025255 B1 BR 112017025255B1 BR 112017025255 A BR112017025255 A BR 112017025255A BR 112017025255 B1 BR112017025255 B1 BR 112017025255B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
pde4d
prostate cancer
pde
index
exp
Prior art date
Application number
BR112017025255-4A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112017025255A2 (pt
Inventor
Ralf Hoffmann
Eveline Den Biezen - Timmermans
Dianne Arnoldina Margaretha Wilhelmina Van Strijp
Anne Godefrida Catharina Van Brussel
Márcia Alves De Inda
Janneke Wrobel
Joannes Baptist Adrianus Dionisius Van Zon
Original Assignee
Koninklijke Philips N.V
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Koninklijke Philips N.V filed Critical Koninklijke Philips N.V
Publication of BR112017025255A2 publication Critical patent/BR112017025255A2/pt
Publication of BR112017025255B1 publication Critical patent/BR112017025255B1/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04001—Phosphodiesterase I (3.1.4.1)
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

MÉTODOS, PRODUTO, PRODUTO DE PROGRAMA DE COMPUTADOR, SISTEMA, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ESTIMULANTE E INIBIDORA PARA USO NO TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DO CÂNCER DE PRÓSTATA. A presente invenção refere-se a métodos para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão do câncer de próstata, sendo que o dito método determina o estado do câncer de próstata, com base no nível de expressão de variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D). A invenção refere-se, ainda, a um método para identificar a elegibilidade de um indivíduo para terapia de câncer de próstata. A invenção refere-se, também, a produtos para a análise de variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D), bem como a composições farmacêuticas que modulam a atividade e/ou expressão das variantes de PDE4D.

Description

Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se a métodos para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão do câncer de próstata, sendo que o dito método determina o estado do câncer de próstata, com base no nível de expressão de variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D). A invenção refere-se, ainda, a um método para identificar a elegibilidade de um indivíduo para terapia de câncer de próstata. A invenção refere-se, também, a produtos para a análise de variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D), bem como a composições farmacêuticas que modulam a atividade e/ou expressão das variantes de PDE4D.
Antecedentes da invenção
[002] Câncer é uma classe de doenças em que um grupo de células apresenta um crescimento descontrolado, invasão e, às vezes, metástase. Essas três propriedades malignas dos cânceres os diferenciam dos tumores benignos, os quais são autolimitados, não invadem ou metastizam.
[003] O câncer de próstata (CaP) é a malignidade não cutânea de ocorrência mais comum nos homens, com uma estimativa de 900.000 novos casos diagnosticados mundialmente em 2008. Devido ao envelhecimento da população, a incidência de CaP aumentará dramaticamente nos próximos anos. O diagnóstico de rotina por determinação dos níveis sanguíneos do antígeno específico da próstata (PSA), exame retal digital (DRE) e análise de ultrassom transrectal (TRUS) resulta em diagnóstico excessivo significativo de primeira linha de condições benignas (não cancerosas) da próstata: das aproximadamente 1 milhão de biópsias de próstata realizadas anualmente nos Estados Unidos apenas para descobrir cerca de 250.000 novos casos, cerca de 75% são feitas desnecessariamente, incorrendo em complicações substanciais (urossepsia, hemorragias, retenção urinária) em pacientes e um custo total acima de 2 bilhões de dólares (2.100 dólares por procedimento de biópsia). Ao menos 4 de 100 homens com uma biópsia negativa têm a probabilidade de serem hospitalizados devido a efeitos colaterais e 9 de 10.000 pacientes submetidos a biópsia estão em risco de morte decorrente do procedimento atualmente em uso.
[004] Dos aproximadamente 250.000 casos de CaP recentemente detectados nos Estados Unidos por ano, cerca de 200.000 são inicialmente caracterizados como doença localizada, isto é, como câncer confinado ao órgão da próstata. Esta condição é, em certa medida, curável por abordagens primárias de tratamento, como radioterapia ou, em particular, a remoção parcial ou total da próstata por cirurgia (prostatectomia). No entanto, essas intervenções são tipicamente acompanhadas de efeitos colaterais sérios, particularmente, como consequências muito frequentes da prostatectomia, incontinência urinária e/ou disfunções eréteis. Cerca de 50% dos homens submetidos à prostatectomia radical desenvolvem incontinência urinária. Os estudos mostram que, um ano após a cirurgia, entre 15% e 50% dos homens ainda apresentam esses problemas. Problemas de ereção também são efeitos colaterais sérios da prostatectomia radical (PR). Apenas cerca de metade dos homens submetidos à cirurgia é capaz de recuperar parte de sua capacidade erétil. Além disso, todos os tratamentos rotineiramente aplicados a CaP localizado são caros (tipicamente na ordem de 20 a 30 mil dólares) e geram custos diretos totais de 5 bilhões de dólares nos Estados Unidos a cada ano.
[005] Entre os aproximadamente 200.000 homens nos Estados Unidos diagnosticados com doença clinicamente localizada, até 50% têm muito baixo ou baixo risco de câncer. Consequentemente, em uma revisão recente de suas diretrizes de tratamento de CaP, o NCCN (National Comprehensive Cancer Network) incluiu a vigilância ativa (VA ou AS “active surveillance”) como um tratamento alternativo brando e conveniente para pacientes com baixo risco da doença. A recomendação de vigilância ativa para pacientes adequados melhora significativamente a qualidade de vida de tais pacientes em comparação com os homens que foram submetidos a tratamento primário, além do custo envolvido no tratamento de pacientes em vigilância ativa por 5 anos ser menor que 10.000 dólares por paciente.
[006] Além disso, no caso de cirurgia (em contraste com vigilância ativa) ser o tratamento de escolha selecionado para um determinado paciente, é significativamente vantajoso estratificar a extensão da cirurgia de acordo com a agressividade potencial do tumor do paciente. Por exemplo, técnicas operatórias com preservação dos nervos poderiam ser mais genericamente aplicadas em homens com baixo risco previsto de ocorrência da doença para minimizar os efeitos adversos relacionadas a potência como consequência de prostatectomia radical. Da mesma forma, de acordo com as diretrizes mais recentes das diretrizes “Prostate Cancer Guidelines” da European Association Of Urology (EAU, Associação Européia de Urologia), a dissecção estendida do nódulo linfático é recomendada no caso de ser previsto alto risco de câncer, embora esse procedimento seja complexo, demorado e associado a taxas de complicação mais altas comparado aos procedimentos mais limitados. Consequentemente, embora a dissecção menos limitada do nódulo linfático tenha mostrado falha em detectar em cerca de 50% de metástases linfonodais, o manejo dos homens com câncer de próstata localizado exige predições pré-cirúrgicas altamente acuradas da agressividade potencial de um tumor individual para se fornecer o tratamento mais adequado para cada paciente.
[007] O documento WO 2010/131194 A1 revela um método para diagnosticar ou detectar câncer de próstata maligno, sensível a hormônio, que compreende a etapa de determinar o nível de expressão da variante da fosfodiesterase 4D, PDE4D7. O documento também revela o uso de um índice de PDE para discriminar eficazmente entre doenças benignas e malignas, no qual a expressão de PDE4D7 é normalizada para PDE4D5 como um controle interno.
[008] O documento WO 2010/131195 A1 descreve um método para diagnosticar câncer de próstata sensível a hormônio e câncer de próstata resistente a hormônio, que compreende a etapa de determinar o nível de expressão de PDE4D7. O nível de expressão de PDE4D7 é normalizado para um gene de referência que pode ser PDE4D5.
[009] O artigo “The cAMP phosphodiesterase-4D7 (PDE4D7) is downregulated in androgen-independent prostate cancer cells and mediates proliferation by compartmentalizing cAMP at the plasma membrane of VCaP prostate cancer cells” por Henderson et al. no British Journal of Cancer, volume 110, número 5, páginas 1278 a 1287, (2014), apresenta evidência de o PDE4D7 ser altamente expresso em células de câncer de próstata sensíveis a andrógeno e, ao mesmo tempo, ser significativamente regulado negativamente em células de câncer de próstata insensíveis a andrógeno, e sugere uma aplicação potencial como um biomarcador para câncer de próstata insensível a andrógeno bem como possibilidades terapêuticas.
[010] O documento EP 1471153 A2 é direcionado a um ensaio da atividade transcricional para determinar a atividade biológica de um composto por análise de sua capacidade de modular a expressão gênica. Dentre os possíveis produtos da expressão alvo se encontram as isoenzimas PDE4D. Os compostos identificados nos rastreamentos descritos podem ser anticorpos, que são de valor terapêutico no tratamento de, por exemplo, câncer de mama.
[011] O documento WO 2010/059838 A2 refere-se a inibidores de fosfodiesterase-4 (PDE4) e seu uso no tratamento e prevenção de acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, doenças e distúrbios inflamatórios cardiovasculares, bem como distúrbios do sistema nervoso central.
[012] O documento WO 2004/090157 A1 revela o uso de PDE4D, particularmente de PDE4D5 ou PDE4D7, como um alvo para a identificação de compostos que podem ser usados para o tratamento de aterosclerose ou para o tratamento de restenose.
[013] O documento US 2003/220273 A1 descreve compostos antissenso, composições e métodos para modular a expressão de fosfodiesterases 4D e o uso desses compostos para o tratamento de doenças associadas com a expressão de fosfodiesterase 4D.
[014] O artigo “Roles of cAMP and cAMPdependent protein kinase in the progression of prostate cancer: Cross-talk with the androgen receptor” por Merkle e Hoffmann em Cellular Signalling, Volume 23, número 3, páginas 507-515, (2011) é um estudo sobre os papéis de cAMP e da proteína quinase dependente de cAMP na progressão do câncer de próstata. No contexto deste estudo afirma-se que a expressão de PDE4D é aumentada em tecidos cancerosos.
Sumário da invenção
[015] A presente invenção refere-se à identificação e ao uso de perfis de expressão gênica, assinaturas, padrões de genes biomarcadores de interesse (também chamados de genes marcadores) com relevância clínica para o câncer de próstata. Em particular, a invenção é baseada na análise da expressão gênica de ácidos nucleicos, de preferência, transcritos de genes biomarcadores, obtidos de amostras biológicas. Em particular, a análise de expressão desses genes marcadores é usada para fornecer um índice de PDE de câncer de próstata (índice PDE), indicativo do estado de progressão do câncer de próstata.
[016] Portanto, o índice PDE fornece um parâmetro muito útil para a medicina personalizada em relação ao prognóstico e tratamento de pacientes com câncer de próstata. O índice PDE pode ser usado sozinho ou em combinação com outros meios ou métodos que fornecem informações sobre o pessoal estado de doença ou o estágio da doença dos pacientes.
[017] Os médicos e/ou patologistas podem usar vantajosamente o índice PDE para confirmar os resultados obtidos em outros métodos para diagnosticar, identificar, prognosticar os pacientes. Os métodos e meios fornecidos pela invenção ajudam, portanto, a estabelecer melhor prognóstico, etc., para encontrar o melhor tratamento para um paciente, e para evitar cirurgia ou outros tratamentos desnecessários que são perigosas devido aos efeitos colaterais, às vezes supérfluos e que resultam em custos enormes para o sistema de saúde pública.
[018] Um aspecto da invenção refere-se a um método que compreende a etapa de: determinar um estado de progressão do câncer de próstata com base em um perfil de expressão gênica incluindo o nível de expressão de pelo menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, e sendo que nenhuma das variantes da PDE4D serve como uma referência gênica.
[019] Um outro aspecto da invenção é direcionado a um método que compreende a etapa de: determinar a presença ou ausência da fusão gênica TMPRSS2- ERG ou o nível de expressão do fator de transcrição ERG, com base em um perfil de expressão gênica incluindo o nível de expressão de pelo menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, e sendo que nenhuma das variantes da PDE4D serve como uma referência gênica.
[020] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos acima, o perfil de expressão gênica é convertido em ao menos um índice PDE de câncer de próstata (índice PDE) indicativo do estado de progressão do câncer de próstata. A introdução do índice PDE fornece uma boa predição no prognóstico do câncer de próstata ou um bom desempenho em aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[021] As variantes de PDE4D que não servem como um gene de referência fornecem uma boa predição no prognóstico do câncer de próstata ou um bom desempenho em aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[022] Em algumas modalidades, as variantes de PDE4D são selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9. Os genes selecionados fornecem uma boa asserção no prognóstico de câncer de próstata ou um bom desempenho para aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[023] Em algumas modalidades, o perfil de expressão gênica é um perfil de expressão genética de uma amostra, de preferência uma amostra de um indivíduo.
[024] Em algumas modalidades, o perfil de expressão gênica é um perfil de expressão gênica normalizado que é obtido pela normalização do nível de expressão das variantes da PDE4D para a expressão de ao menos um gene de referência, sendo que o método compreende opcionalmente, antes da normalização, a etapa de determinar o nível de expressão de ao menos um gene de referência em uma amostra.
[025] Em algumas modalidades, os métodos conforme descritos na presente invenção são um método para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão de câncer de próstata.
[026] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos compreendem, ainda, identificar de um indivíduo como elegível para receber terapia para câncer de próstata, em que o índice PDE do indivíduo indica a presença de câncer de próstata ou em que o índice PDE do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata não progressivo ou progressivo.
[027] Em algumas modalidades, os métodos descritos na presente invenção compreendem, ainda, tratar um indivíduo elegível para receber uma terapia para câncer de próstata.
[028] Em algumas modalidades, os métodos conforme aqui descritos compreende, ainda, antes da etapa a), a etapa de determinar o nível de expressão de a menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 em uma amostra para obter um perfil de expressão gênica. Em uma modalidade, a variante da PDE4D é selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9.
[029] Em uma outra modalidade, o estado de progressão de câncer de próstata é não progressivo ou progressivo.
[030] Em uma modalidade, o nível de expressão de PDE4D1 e PDE4D2 é determinado para ambas as variantes em conjunto.
[031] Em uma outra modalidade, as variantes de PDE4D são selecionadas do grupo que compreende PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9, de preferência que compreende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9.
[032] Em uma modalidade, na etapa (a) o nível de expressão de ao menos três variantes de PDE4D é determinado.
[033] Em algumas modalidades, o ao menos um índice PDE é selecionado dentre os seguintes:
[034] Índice-PDE_1:
[035] PDE4D7_exp – PDE4D5_exp
[036] ii) Índice-PDE_ 2:
[037] MEAN(PDE4D7_exp e PDE4D5_exp)
[038] iii) Índice-PDE_3:
[039] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)) / (PDE4D4_exp)
[040] iv) Índice-PDE_4:
[041] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)) / (PDE4D1 e PDE4D2_exp)
[042] v) Índice-PDE_5:
[043] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp))
[044] O cálculo do índice PDE fornece uma boa predição no prognóstico do câncer de próstata ou um bom desempenho em aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[045] Em uma modalidade adicional, o índice PDE_1 é determinado para distinguir próstata sem câncer de próstata com câncer.
[046] Em uma outra modalidade, ao menos um dentre índice PDE_2, índice PDE_3, índice PDE _4 e índice PDE_5 é determinado para distinguir câncer não progressivo de progressivo, e/ou em que um índice PDE_2, índice PDE _3, índice PDE _4 ou índice PDE_5 acima de um valor de corte predeterminado é indicativo do estado progressivo de câncer de próstata não progressivo, e/ou um índice PDE _2, índice PDE _3, índice PDE _4 ou índice PDE_5 abaixo do valor de corte predeterminado é indicativo do estado de progressão do câncer de próstata progressivo.
[047] Em uma outra modalidade, a presença do gene de fusão TMPRSS2-ERG é determinada e/ou o método é executado com amostras positivas do gene de fusão TMPRSS2- ERG.
[048] Em uma modalidade, a determinação do nível de expressão na etapa (a) é realizada, ou é realizada adicionalmente, pela medição dos níveis de ácido nucleico ou proteína ou pela determinação da atividade biológica da variante de PDE4D.
[049] Em uma modalidade, a determinação do nível de expressão do gene de referência é realizada, ou é adicionalmente realizada, mediante a medição dos níveis de ácido nucleico ou proteína ou pela determinação da atividade biológica de ao menos um gene de referência.
[050] Em algumas modalidades, o ao menos um gene de referência é um gene constitutivo de manutenção, de preferência, TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K- ALPHA-1 (=TUBA1B) ou ALAS-1.
[051] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido, uma amostra de urina, uma amostra de sedimento de urina, uma amostra de sangue, uma amostra de saliva, uma amostra de sêmen, uma amostra que compreende células de tumor circulantes, uma amostra contendo exossomos secretados pela próstata, ou linhagens de células ou linhagens de células de câncer.
[052] Em uma outra modalidade, os métodos aqui descritos compreendem a etapa adicional de determinar o escore de pGleason e/ou o estágio PT.
[053] Em uma outra modalidade, o nível de expressão gênica é determinado pela detecção da expressão de mRNA com o uso de uma ou mais sondas e/ou um ou mais conjuntos de sondas.
[054] Em uma modalidade adicional, o nível de expressão gênica é determinado por um método baseado em amplificação e/ou por análise por microarranjo e/ou por sequenciamento de RNA.
[055] Em uma modalidade adicional, o nível de expressão gênica é determinado por sequenciamento de RNA, PCR, qPCR, ou PCR multiplex.
[056] Em uma modalidade específica, um indivíduo é identificado como elegível para receber terapia para câncer de próstata selecionada dentre cirurgia da próstata, remoção da próstata, quimioterapia, radioterapia, ou dissecção limitada ou estendida do nódulo linfático, em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão de câncer de próstata progressivo.
[057] Em uma outra modalidade, na etapa (c), um indivíduo é identificado como elegível para receber terapia de vigilância ativa de câncer de próstata, em que o ativo de índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata não progressivo.
[058] Um outro aspecto da invenção é direcionado a um produto que compreende:
[059] iniciadores e/ou sondas para determinar o nível de expressão de pelo menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9;
[060] que compreende adicionalmente iniciadores e/ou sondas para determinar o nível de expressão gênica de um gene de referência, de preferência, um gene constitutivo, com mais preferência TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 ou ALAS-1.
[061] O produto fornece uma base ou entrada para executar os métodos conforme aqui descritos, que, por sua vez, fornecem uma boa asserção no prognóstico de câncer de próstata ou um bom desempenho em aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[062] Em algumas modalidades, o produto é um kit, que inclui um kit de PCR, um kit de sequenciamento de RNA, ou um kit de microarranjo. Em uma modalidade, o produto é um microarranjo. O produto fornece um modo eficiente para a obtenção dos níveis de expressão necessários.
[063] Em algumas modalidades, o produto é um produto para executar qualquer dos métodos, ou o produto é um produto para monitorar ou prognosticar o câncer de próstata ou o estado de progressão do câncer de próstata ou para identificar um indivíduo elegível para terapia para câncer de próstata.
[064] Em algumas modalidades, o produto é uma composição que compreende um conjunto de moléculas de ácido nucléico que compreende, cada, ao menos duas sequências de sondas de oligonucleotídeo para a análise da expressão gênica das variantes PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, que compreende ao menos uma sequência de sonda de oligonucleotídeo para a análise da expressão gênica de genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS-1.
[065] Em algumas modalidades, o produto é um arranjo de ácidos nucleicos que compreende uma ou mais sondas de oligonucleotídeo complementares ou hibridizáveis a uma sequência de codificação de ao menos duas variantes de PDE4D dentre PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, que compreende uma ou mais sondas de oligonucleotídeo complementares e hibridizáveis a aomenos um dos genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS- 1, para determinar um índice PDE conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
[066] Em algumas modalidades, o produto é um kit para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão do câncer de próstata para identificar um indivíduo elegível para terapia para câncer de próstata, que compreende: a) um arranjo conforme definido acima, b) um kit de controle; e c) opcionalmente, instruções para uso.
[067] Um aspecto adicional da invenção refere- se a um método implementado por computador para diagnosticar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado da progressão do câncer de próstata, que compreende as etapas do método conforme aqui definido.
[068] Um aspecto adicionado da invenção refere-se a um produto de programa de computador, que compreende código legível por computador armazenado em uma mídia legível por computador ou transferível por download de uma rede de comunicação que, quando executado em um computador, implementa uma ou mais etapas ou todas as etapas de qualquer um dos métodos conforme aqui definido.
[069] Um aspecto adicional da invenção refere- se a uma mídia de armazenamento não transitório legível por computador com um programa executável armazenado na mesma, sendo que o programa instrui um microprocessador sobre como executar uma ou mais das etapas de quaisquer dos métodos descritos na presente invenção.
[070] Ainda um outro aspecto da invenção refere-se a um sistema que compreende o produto conforme descrito na presente invenção e o produto de programa de computador ou a mídia de armazenamento não transitório legível por computador conforme descritos na presente invenção.
[071] Um outro aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição farmacêutica estimulatória para uso no tratamento ou prevenção do câncer de próstata, que compreende ao menos um elemento selecionado do grupo que consiste em:
[072] (a) um composto que estimula ou modula diretamente a atividade de uma variante PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9, de preferência, um agonista alostérico da atividade enzimática;
[073] (b) um composto que estimula ou modula indiretamente a atividade da variante da PDE4D de (a);
[074] (c) a proteína da variante da PDE4D de (a) ou um equivalente biologicamente ativo da mesma;
[075] (d) um ácido nucleico que codifica e expressa a variante da PDE4D de (a);
[076] (e) um inibidor de miRNA específico para miRNAs da variante da PDE4D de (a);
[077] (f) um agente de desmetilação; e
[078] (g) um fator de deslocamento da fosfodiesterase, de preferência um peptídeo, um peptidomimético, uma molécula pequena, um anticorpo ou um aptâmero,
[079] sendo que a variante da PDE4D, de preferência, é selecionada do grupo que consiste em PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
[080] Um outro aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição farmacêutica inibitória para uso no tratamento ou prevenção do câncer de próstata, que compreende ao menos um elemento selecionado do grupo que consiste em:
[081] (a) um composto que inibe diretamente a atividade de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9,
[082] (b) um composto que inibe indiretamente a atividade da variante da PDE4D de (a);
[083] (c) uma forma negativa dominante da proteína da variante da PDE4D de (a) ou um equivalente biologicamente ativo da mesma;
[084] (d) um ácido nucleico que codifica e expressa uma forma negativa dominante da variante da PDE4D de (a);
[085] (e) um miRNA específico para a variante da PDE4D de (a);
[086] (f) uma molécula antissenso para a variante da PDE4D de (a);
[087] (g) um siRNA específico para a variante da PDE4D de (a);
[088] (h) um aptâmero específico para o produto de expressão da variante da PDE4D de (a) ou para a proteína da variante da PDE4D de (a);
[089] (i) uma molécula pequena ou peptidomimético capaz de se ligar especificamente à proteína da variante da PDE4D de (a); e
[090] (j) um anticorpo específico para a proteína da variante da PDE4D de (a) e/ou uma variante de anticorpo específica para a proteína da variante da PDE4D de (a),
[091] sendo que a variante da PDE4D, de preferência, é selecionada do grupo que consiste em PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
[092] As composições farmacêuticas, conforme descrito na presente invenção, fornecem uma abordagem eficaz para tratar uma variedade de cânceres de próstata.
[093] Em algumas modalidades, a variante da PDE4D é selecionada do grupo que consiste em PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
[094] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória é para o tratamento de câncer de próstata, sendo que a composição é administrada a um indivíduo na dependência do índice PDE indicativo do estado de progressão do câncer de próstata.
[095] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória é para o tratamento de câncer de próstata, sendo que a composição é administrada a um indivíduo, em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata progressivo.
[096] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória é para o tratamento de câncer de próstata, em que ao menos um dentre o índice PDE_2, o índice PDE_3, o índice PDE_4 ou o índice PDE_5 da amostra do indivíduo está abaixo de um limite ou limiar predeterminado.
[097] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método para tratar um indivíduo que tem câncer de próstata, sendo que o método compreende:
[098] (i) selecionar um indivíduo com câncer de próstata em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata progressivo, e
[099] (ii) administrar a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória conforme aqui descrito ao indivíduo selecionado.
[0100] O método fornece uma abordagem eficaz para tratar uma variedade de cânceres de próstata.
[0101] Em uma outra modalidade, o método compreende:
[0102] (i) selecionar um indivíduo que tem câncer de próstata, em que ao menos um dentre o índice PDE_2, o índice PDE_3, o índice PDE_4, ou o índice PDE_5 da amostra do indivíduo está abaixo de um limite ou limiar pré- determinado, e
[0103] (ii) administrar a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória conforme aqui descrito ao indivíduo selecionado.
[0104] Um outro aspecto da invenção refere-se a variantes de PDE4D selecionadas do grupo que compreende de PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9 para uso como um marcador para o estado de progressão do câncer de próstata.
[0105] Ainda um aspecto adicional da invenção refere-se ao uso de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que compreende de PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9 para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão do câncer de próstata.
Breve descrição dos desenhos
[0106] A Figura 1 mostra os conjuntos de sondas do arranjo Affymetrix Human Exon 1.0 ST com a sequência do gene de referência no NCBI ((National Center for. Biotechnology Information) e o número de acesso da proteína no NCBI da variante da PDE4D correspondente, bem como as sequências de iniciadores e de sondas específicas para a variante da PDE4D.
[0107] A Figura 2 relaciona os genes de referência com seu ID de transcrito e ID de proteína, bem como as sequências dos iniciadores e sondas específicas para os genes de referência.
[0108] A Figura 3 mostra o desempenho de PDE4D1 a PDE4D9 e do índice PDE_1 ao índice PDE_5 para discriminar tecido não canceroso, câncer de próstata não em progressão e em progressão.
[0109] A Figura 4 mostra os resultados do desempenho de PDE4D1 a PDE4D9 e do índice PDE_1 ao índice PDE_5 para discriminar tecido não canceroso e câncer de próstata não em progressão.
[0110] A Figura 5 mostra os resultados de desempenho do índice PDE_1. É fornecida uma visão geral de um total de oito conjuntos de dados de câncer de próstata, que compreendem no total amostras de mais de 900 pacientes dentre as categorias de tecido adjacente normal (NAT), lesões benignas, hiperplasia benigna, bem como tecido tumoral.
[0111] A Figura 6 mostra os resultados de desempenho do índice PDE_2, índice PDE_3, índice PDE_4 e índice PDE_5 para discriminar amostras de tumor da próstata não progressivo e progressivo.
[0112] A Figura 7 mostra os resultados de desempenho de PDE4D1 a PDE4D9 e do índice PDE_1 até o índice PDE_5 para discriminar amostras de tecido não canceroso e amostras de tumor de próstata não progressivo.
[0113] A Figura 8 mostra a correlação da PDE4D1 a PDE4D9 e do índice PDE_1 ao índice PDE_5 e o escore de Gleason da patologia em um conjunto de câncer de próstata.
[0114] A Figura 9 dá uma visão geral do valor adicionado de PDE4D1 a PDE4D9 e do índice PDE_1 ao índice PDE_5 juntamente com dados clínicos sobre a sobrevida livre de progressão (SLP) (progression-free survival (PFS), dependendo do estado da fusão TMPRSS2-ERG do tumor.
[0115] A Figura 10 mostra a expressão normalizada de PDE4D1/2, PDE4D3, PDE4D4 e PDE4D5 em seis diferentes tipos de tecidos de câncer de próstata no conjunto de dados de Taylor et al. Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)).
[0116] A Figura 11 mostra a expressão normalizada de PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 em seis diferentes tipos de tecidos de câncer de próstata no conjunto de dados de Taylor et al. Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)).
[0117] A Figura 12 mostra a expressão normalizada de PDE4D1/2, PDE4D3, PDE4D4 e PDE4D5 em seis diferentes tipos de tecidos de câncer de próstata no conjunto de dados de Boormans et al., a identificação de TDRD1 como um gene de direcionamento direto de ERG em câncer de próstata primário, Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (GSE41410 (NCBI GEO)).
[0118] A Figura 13 mostra a expressão normalizada de PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 em seis diferentes tipos de tecidos de câncer de próstata no conjunto de dados de Boormans et al., a identificação de TDRD1 como um gene de direcionamento direto de ERG em câncer de próstata primário, Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (GSE41410 (NCBI GEO)).
Descrição detalhada das modalidades
[0119] Embora a presente invenção seja descrita em relação a modalidades específicas, essa descrição não deve ser interpretada em sentido limitador.
[0120] Antes de descrever em detalhes as modalidades exemplificadoras da presente invenção, são apresentadas definições importantes para o entendimento da presente invenção.
[0121] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares de “um” e “uma” também incluem seus respectivos plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário.
[0122] No contexto da presente invenção, os termos “cerca de” e “aproximadamente” denotam um intervalo de exatidão que o versado na técnica entenderá como certo de que o efeito técnico da característica em questão está assegurado. O termo tipicamente indica um desvio do valor numérico indicado de ± 20%, de preferência, de ± 15%, com mais preferência, ± 10%, e com mais preferência ainda, de ± 5%.
[0123] Deve ser entendido que o termo “que compreende” não é limitador. Para os propósitos da presente invenção, o termo “que consiste em” é considerado uma modalidade preferencial do termo “que compreende”. Se deste ponto em diante do presente documento for definido que um grupo compreende ao menos um certo número de modalidades, isso significa que o grupo compreende também um grupo que, de preferência, consiste apenas nessas modalidades.
[0124] Além disso, os termos “primeiro”, “segundo”, “terceiro” ou “(a)”, “(b)”, “(c)”, “(d)”, etc., e similares na descrição e nas reivindicações são usados para distinguir entre elementos similares, e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve-se entender que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias adequadas, e que as modalidades da invenção descritas neste documento podem ser praticadas em outras sequências, diferentes das descritas ou ilustradas neste documento.
[0125] Caso os termos “primeiro”, “segundo”, “terceiro” ou “(a)”, “(b)”, “(c)”, “(d)”, etc., se refiram a etapas de um método ou uso, não haverá coerência de tempo ou intervalo de tempo entre as etapas, isto é, as etapas devem ser executadas simultaneamente ou deve haver intervalos de tempo de segundos, minutos, horas, dias, semanas, meses ou mesmo anos entre tais etapas, a menos que indicado de outro modo na aplicação, conforme estabelecido acima ou abaixo, na presente invenção. Deve ser entendido que esta invenção não é limitada por metodologias, protocolos, proteínas, bactérias, vetores, reagentes específicos, etc., aqui descritos, uma vez que os mesmos podem variar. Deve ser entendido também que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de descrever modalidades específicas apenas, e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados, como comumente entendido por um versado na técnica.
[0126] Um aspecto da invenção refere-se a um método que compreende a etapa de:
[0127] (a) determinar um estado de progressão do câncer de próstata com base em um perfil de expressão gênica incluindo o nível de expressão de pelo menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, e sendo que nenhuma das variantes da PDE4D serve como uma referência gênica. Um outro aspecto da invenção é direcionado a um método que compreende a etapa de:
[0128] (a) determinar a presença ou ausência da fusão gênica TMPRSS2-ERG ou o nível de expressão do fator de transcrição ERG, com base em um perfil de expressão gênica incluindo o nível de expressão de pelo menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, e sendo que nenhuma das variantes da PDE4D serve como uma referência gênica.
[0129] O termo “variante do transcrito de PDE4D” ou “isoforma PDE4D” ou “variante de PDE4D” refere-se a qualquer das variantes do splicing de PDE4D do PDE4D humano da fosfodiesterase, isto é, o gene PDE4D humano da fosfodiesterase, por exemplo, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9.
[0130] Os termos “marcador”, “gene marcador”, “GOI” ou “marcador de variantes da PDE4D” podem ser usados de maneira intercambiável e referem-se a um gene, ou unidade ou sequência genética (uma sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos ou de proteína) conforme definido aqui acima, cujo nível de expressão é aumentado ou diminuído em célula ou tecido de câncer de próstata maligna ou benigna, ou em qualquer tipo de amostra compreendendo células ou tecidos ou porções ou fragmentos dos mesmos, quando comparados com um nível de controle, de preferência, quando comparados com a expressão em tecido normal. O termo também refere-se a qualquer produto de expressão da dita unidade ou sequência genética, em particular a uma transcrito de mRNA da variante da PDE4D, um polipeptídeo ou proteína codificada pela transcrição da variante da PDE4D, ou fragmentos dos mesmos, bem como a homólogos derivados dos mesmos conforme descrito na presente invenção acima. Em particular, os termos “marcador” ou “gene marcador” ou “GOI” ou “marcador da variante de PDE4D” referem-se a qualquer das variantes do splicing de PDE4D do PDE4D humano da fosfodiesterase, isto é, o gene PDE4D humano da fosfodiesterase, por exemplo, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9.
[0131] O termo “fosfodiesterase 4D1” ou “PDE4D1” refere-se à variante 1 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D1 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197222.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D1 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 2, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184151.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D1. O termo “fosfodiesterase 4D1” ou “PDE4D1” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D1D2_forward (SEQ ID NO: 20) e o PDE1D1D2_reverse (SEQ ID NO: 21), e pode ser detectado pela sonda SEQ ID NO: 22.
[0132] O termo “fosfodiesterase 4D2” ou “PDE4D2” refere-se à variante 2 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D2 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197221.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 3, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D2 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 4, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184150.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D2. O termo “fosfodiesterase 4D2” ou “PDE4D2” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D1D2_forward (SEQ ID NO: 20) e o PDE1D1D2_reverse (SEQ ID NO: 21), e pode ser detectado pela sonda SEQ ID NO: 22.
[0133] O termo “fosfodiesterase 4D3” ou “PDE4D3” refere-se à variante 3 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D3 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_006203.4, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 5, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D3 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 6, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_006194.2 que codifica o polipetídeo de PDE4D3.
[0134] O termo “fosfodiesterase 4D4” ou “PDE4D4” refere-se à variante 4 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D4 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001104631.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 7, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D4 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 8, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001098101.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D4.
[0135] O termo “fosfodiesterase 4D5” ou “PDE4D5” refere-se à variante 5 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D5 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197218.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 9, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D5 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 10, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184147.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D5. O termo “fosfodiesterase 4D5” ou “PDE4D5” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D5_forward (SEQ ID NO: 23) e o PDE1D5_reverse (SEQ ID NO: 24), e pode ser detectado pela sonda SEQ ID NO: 25.
[0136] O termo “fosfodiesterase 4D6” ou “PDE4D6” refere-se à variante 6 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D6 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197223.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 11, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D6 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 12, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184152.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D6.
[0137] O termo “fosfodiesterase 4D7” ou “PDE4D7” refere-se à variante 7 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D7 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001165899.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 13, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D7 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 14, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001159371.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D7. O termo “fosfodiesterase 4D7” ou “PDE4D7” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D7_forward (SEQ ID NO: 26) e o PDE1D7_reverse (SEQ ID NO: 27), e pode ser detectado pela sonda SEQ ID NO: 28.
[0138] O termo “fosfodiesterase 4D8” ou “PDE4D8” refere-se à variante 8 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D8 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197219.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 15, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D8 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 16, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184148.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D8.
[0139] O termo “fosfodiesterase 4D9” ou “PDE4D9” refere-se à variante 9 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D9 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197220.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 17, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D9 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 18, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184149.1 que codifica o polipetídeo de PDE4D9. O termo “fosfodiesterase 4D9” ou “PDE4D9” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D5_forward (SEQ ID NO: 29) e o PDE1D5_reverse (SEQ ID NO: 30), e pode ser detectado pela sonda SEQ ID NO: 31.
[0140] Os termos “PDE4D1”, “PDE4D2”, “PDE4D3”, “PDE4D4”, “PDE4D5”, “PDE4D6”, “PDE4D7”, “PDE4D8” e “PDE4D9” compreendem também as sequências de nucleotídeos que mostram um alto grau de homologia com PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 respectivamente, por exemplo, sendo as sequências de ácidos nucleicos ao menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17, respectivamente, ou sendo as sequências de aminoácidos ao menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18, respectivamente, ou sendo as sequências de ácido nucleicos que codificam sequências de aminoácidos ao menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18, ou sendo as sequências de aminoácidos codificadas por sequências ao menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17.
[0141] O termo “nível de expressão” como usado na presente invenção, refere-se à quantidade de transcrito da variante de PDE4D e/ou proteína de PDE4D derivável de um número definido de células ou de uma porção definida de tecido, de preferência, à quantidade de transcrito da variante de PDE4D e/ou proteína da variante de PDE4D obtenível em um procedimento padrão de extração de ácido nucleico (por exemplo, RNA) ou de proteína. Métodos de extração adequados são conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[0142] O termo “nível de controle” (ou “estado de controle”), como usado na presente invenção, refere-se a um nível de expressão que pode ser determinado ao mesmo tempo e/ou sob condições similares e/ou comparáveis como a amostra de teste com o uso de (a) amostras anteriormente coletadas e armazenada, de um indivíduo ou indivíduos cuja condição ou estado de doença, por exemplo, tumor de próstata não canceroso, normal ou benigno, câncer da próstata avançado etc., é conhecida. O termo “estado de doença” ou “estado de doença cancerosa” refere-se a qualquer estado ou tipo de condição celular ou molecular entre um estado de célula não cancerosa e (incluindo) um estado de célula cancerosa terminal. De preferência, o termo inclui/ou diferentes estágios de proliferação/desenvolvimento ou níveis de desenvolvimento de tumor no organismo entre (e excluindo) um estado de célula não cancerosa e (incluindo) um estado de célula cancerosa terminal. Tais estágios de desenvolvimento podem incluir todos os estágios do sistema de classificação TNM (tumor, nódulo, metástase) de tumores malignos, conforme definido pela UICC, por exemplo, estágios 0 a I a IV. O termo inclui também etapas antes de estágio 0 de TNM, por exemplo, estágios de desenvolvimento em que biomarcadores conhecidos pela pessoa versada na técnica mostram uma expressão ou padrão de expressão modificado alterado.
[0143] O nível de expressão acima mencionado pode ser, de preferência, o nível de expressão de variantes da PDE4D conforme definido anteriormente neste documento. Alternativamente ou adicionalmente, o nível de expressão pode também ser o nível de expressão de qualquer outro gene ou elemento genético expressado em uma célula, por exemplo, o nível de expressão de um gene de manutenção ou o nível de expressão de uma combinação de genes de manutenção, por exemplo, um controle do gene ou o nível de expressão de uma combinação de genes de controle, por exemplo com TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (=TUBA1B) ou ALAS-1. Em uma modalidade preferencial, o nível de expressão é determinado por uma combinação de genes de referência.
[0144] Em uma outra modalidade preferencial, a combinação de genes de referência compreende TBP, HPRT1 e ao menos um, ao menos dois ou ao menos três genes de referência selecionados do grupo que compreende ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 ou ALAS-1.
[0145] Em uma outra modalidade preferencial, a combinação de genes de referência compreende TBP, HPRT1 e ao menos dois genes de referência adicionais selecionados do grupo que compreende ACTB, RPLP0, PUM1, K-ALPHA-1 ou ALAS-1.
[0146] Uma combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0. Uma outra combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
[0147] O termo “canceroso” no contexto da presente invenção refere-se a um estado de doença cancerosa, como aqui definido.
[0148] O termo não “canceroso” no contexto da presente invenção refere-se a uma condição na qual proliferação benigna ou maligna pode ser detectada. Meios adequados para a dita detecção são conhecidos na técnica.
[0149] Um nível de controle preferencial no contexto da presente invenção é a expressão da variante da PDE4D em tecido saudável ou não canceroso, isto é, normal, ou a expressão da variante da PDE4D em tecido de tumor de próstata benigno. O termo “tumor benigno de próstata” como aqui usado refere-se a um tumor de próstata que não apresentada todas as três as propriedades malignas de um câncer, isto é, não se desenvolve de uma maneira ilimitada e agressiva, não invade tecidos circundantes, e não se metastiza. Tipicamente, um tumor de próstata benigno significa uma doença neoplástica, ou inchaço, moderada e não progressiva que não apresenta as propriedades invasivas de um câncer. Além disso, os tumores benignos de próstata são tipicamente encapsulados, e portanto inibidos em sua capacidade de se comportar de uma maneira maligna. Um tumor benigno ou uma condição saudável pode ser determinado por meio de qualquer método molecular, histológico ou fisiológico independente adequado conhecido pela pessoa versada na técnica.
[0150] Um nível de controle mais preferencial no contexto da presente invenção, é a expressão da variante da PDE4D em tecido saudável ou não canceroso, isto é, normal, ou a expressão da variante da PDE4D em tecido de tumor de próstata não progressivo.
[0151] O nível de controle de expressão pode ser determinado por um método estatístico com base nos resultados obtidos através da análise do(s) nível(is) de expressão anteriormente determinados de gene(s) marcador(es) da presente invenção em amostras de pacientes cujo estado de doença é conhecido. Além disso, o nível de controle pode ser derivado a partir de uma base de dados de padrões de expressão ou níveis de expressão de pacientes, tecidos ou células testados anteriormente. O nível de controle pode ser determinado a partir de uma amostra de referência derivada de um paciente que foi diagnosticado com câncer de próstata, por exemplo, de câncer de próstata independente de hormônio ou resistente a hormônio. Além disso, o nível de expressão dos genes marcadores da presente invenção em uma amostra biológica a ser testada pode ser comparado com múltiplos níveis de controle, cujos níveis de controle são determinados a partir de múltiplas amostras de referência. É contemplado o uso de um nível de controle determinado a partir de uma amostra de referência derivada de um tipo de tecido similar àquele da amostra biológica derivada de paciente. É particularmente preferido o uso de amostras derivadas de um paciente cujo estado de doença é canceroso conforme definido aqui acima.
[0152] Alternativamente, as amostras de referência podem compreender materiais derivados de linhagens de células, por exemplo, linhagens celulares imortalizadas de câncer, ou ser derivadas de xenoenxertos de tecido. De preferência, o material derivado de linhagens de células de câncer de próstata ou material derivado de xenoenxertos de tecido como tecido de próstata humano, em particular com tecido de próstata humano benigno ou derivado de tumor, pode ser compreendido em uma amostra de referência de acordo com a presente invenção. Exemplos de linhagens celulares de câncer preferenciais compreendem as linhagens celulares PC346P, PC346B, LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flu1, PC346Flu2. Exemplos de xenoenxertos preferenciais compreendem PC295, PC310, PC-SD, PC82, PC133, PC135, PC324 e PC374. De preferência, um painel inteiro de linhagens de célula e xenoenxertos pode ser usado, por exemplo, o painel humano PC346.
[0153] Em uma outra alternativa preferencial, as amostras de referência podem ser derivadas de tecidos de pacientes, ou painéis tecidos ou coleções de tecidos obtidos em ambientes clínicos. As amostras podem, por exemplo, ser obtidas de pacientes masculinos sendo submetidos a cirurgia. As amostras podem ser derivadas de qualquer tipo de tecido, por exemplo de tecido ou linfonodos da próstata. Os exemplos preferenciais de coletas de tecidos de pacientes são derivados de procedimentos cirúrgicos (por exemplo, prostatectomia).
[0154] Além disso, é preferível usar o valor padrão dos níveis de expressão do marcador da variante da PDE4D da presente invenção em uma população com um estado de doença conhecido, por exemplo, uma população tendo tumor de próstata não progressivo ou uma população saudável. O valor padrão pode ser obtido por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, uma faixa de média ± 2 DP (desvio padrão) ou média ± 3 DP ou pode ser usada como um valor padrão.
[0155] Além disso, o nível de controle pode também ser determinado ao mesmo tempo e/ou sob condições similares ou comparáveis como a amostra de teste com o uso de (a) amostras anteriormente coletadas e armazenadas de um indivíduo ou indivíduos cujos estados de doença são conhecidos como sendo cancerosos, isto é, que foram independentemente diagnosticados como tendo câncer de próstata, em particular, câncer de próstata maligno, sensível a hormônio.
[0156] No contexto da presente invenção, um nível de controle determinado a partir de uma amostra biológica que é conhecida como não cancerosa, por exemplo, uma amostra de tecido saudável ou uma amostra de tumor de próstata não progressivo, é chamado de “nível de controle normal”.
[0157] Se o nível de controle é determinado a partir de uma amostra biológica cancerosa, particularmente uma amostra de um indivíduo para o qual câncer hormônio-resistente foi independentemente diagnosticado, pode ser designado como “nível de controle canceroso”.
[0158] O termo “câncer da próstata” refere-se a um câncer da glândula da próstata no sistema reprodutor masculino, que ocorre quando células da próstata sofrem mutação e começam a se multiplicar sem controle. Tipicamente, o câncer de próstata é ligado a um nível elevado de antígeno específico da próstata (PSA). Em uma modalidade da presente invenção, o termo “câncer da próstata” refere-se a um câncer que mostra níveis de PSA acima de 4,0. Em uma outra modalidade, o termo refere-se a câncer que mostra os níveis de PSA acima de 2,0. O termo “nível de PSA” refere-se à concentração de PSA no sangue em ng/ml.
[0159] O termo “estado de câncer de próstata não progressivo” significa que uma amostra de um indivíduo não mostra valores de parâmetro que indicam “recorrência bioquímica” e/ou “recorrência clínica”.
[0160] O termo “estado de câncer de próstata progressivo” significa que uma amostra de um indivíduo não mostra valores de parâmetro que indicam “recorrência bioquímica” e/ou “recorrência clínica”.
[0161] No contexto do presente pedido, a expressão “a recorrência bioquímica” refere-se, por exemplo, a valores biológicos recorrentes de PSA aumentado que indicam a presença de células de câncer da próstata em uma amostra. Entretanto, também é possível usar outros marcadores que podem ser usados na detecção da presença ou que elevam a suspeita de tal presença.
[0162] No contexto do presente pedido, o termo “recorrência clínica” refere-se à presença de sinais clínicos que indicam a presença de células tumorais, conforme medido, por exemplo, com o uso de formação de imagem in vivo.
[0163] Os termos “aumentado” ou “nível de expressão aumentado” ou “nível de expressão regulada positivamente” ou “aumento do nível de expressão” (os quais podem ser usados como sinônimo) no contexto da presente invenção denotam, portanto, uma elevação no nível de expressão entre uma situação a ser analisada, por exemplo, uma situação derivável de uma amostra do paciente, e um ponto de referência, que pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso, derivável de qualquer estágio tumor de próstata ou câncer de próstata adequado conhecido da pessoa versada na técnica. Os níveis de expressão são considerados “aumentados” quando a expressão do gene da variante da PDE4D, por exemplo, em uma amostra a ser analisada, difere em, isto é, é elevada em, por exemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, ou mais de 50% em comparação com um nível de controle, ou em ao menos 0,1 vezes, ao menos 0,2 vezes, ao menos 1 vez, ao menos 2 vezes, ao menos 5 vezes, ou ao menos 10 vezes ou mais em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Se a comparação com um nível de controle canceroso deve ser feita, uma comparação adicional com um nível de controle normal é preferida. Tal comparação adicional permite a determinação de uma tendência da modificação, por exemplo, a magnitude de um aumento do nível de expressão pode ser observada e/ou conclusões correspondentes podem ser tiradas. É preferencial uma comparação com um tumor da próstata benigno, ou um tecido saudável ou uma amostra derivada de um indivíduo saudável.
[0164] Em uma outra modalidade, uma similaridade adicional no padrão da expressão gênica global entre uma amostra obtida de um indivíduo e uma referência conforme definido acima que é cancerosa, indica que o indivíduo está sofrendo de câncer de próstata. Em uma outra modalidade da presente invenção, o diagnóstico pode ser combinado com a elucidação de níveis de expressão do biomarcador de câncer adicionais, particularmente de biomarcadores de câncer de próstata. Os biomarcadores adequados, particularmente os biomarcadores de câncer de próstata, serão de conhecimento do versado na técnica. Por exemplo, a expressão de biomarcadores como ASP pode ser testada.
[0165] Um câncer de próstata maligno, sensível a hormônio pode ser considerado como sendo diagnosticado quando o nível de expressão do marcador da variante da PDE4D da presente invenção é aumentado, em comparação com o nível de controle normal, conforme anteriormente definido neste documento.
[0166] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D1, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D1, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0167] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D2, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser considerado como sendo diagnosticado se o nível de expressão de PDE4D2, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0168] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D3, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D3, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0169] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D4, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D4, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0170] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D5, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D5, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0171] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D6, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D6, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0172] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D7, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D7, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0173] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D8, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D8, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0174] Um câncer progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D9, conforme definido anteriormente neste documento, for diminuído por um valor de entre 20% e 80% de, de preferência, em um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata progressivo pode ser indicado se o nível de expressão de PDE4D9, conforme definido aqui acima, for reduzido por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo.
[0175] O estágio de progressão de câncer de próstata não progressivo pode ser detectado quando o nível de expressão do marcador de PDE4D7 é aumentado em comparação ao nível de controle normal como definido aqui acima. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, um câncer de próstata não progressivo pode ser detectado se o nível de expressão do marcador de PDE4D7 for similar a um nível de expressão de uma célula de câncer de próstata estabelecido, por exemplo, independentemente estabelecido, ou linhagem celular por exemplo, uma linhagem celular de câncer não progressivo.
[0176] Um estágio de progressão de câncer de próstata pode ser detectado quando o nível de expressão do marcador de PDE4D7 é reduzido em comparação com o nível de controle normal, particularmente um tecido saudável ou um tumor de próstata não progressivo. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, um câncer de próstata progressivo pode ser detectado se o nível de expressão do marcador de PDE4D7 for similar a um nível de expressão de uma célula de câncer de próstata progressivo estabelecido, por exemplo, independentemente estabelecido, ou uma linhagem celular, por exemplo, uma linhagem celular de câncer de próstata progressivo.
[0177] Um câncer de próstata não progressivo ou progressivo pode ser detectado quando o nível de expressão de ao menos um marcador dentre o marcador de PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9 for reduzido em comparação com o nível de controle normal como definido aqui acima. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, um câncer de próstata não progressivo ou progressivo pode ser detectado se o nível de expressão de ao menos um marcador de dentre o marcador de PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 PDE4D9 for similar a um nível de expressão de uma célula ou linhagem celular estabelecida, por exemplo, independentemente estabelecida.
[0178] O termo “que monitora câncer de próstata”, como usado na presente invenção, refere-se ao acompanhamento de uma doença ou distúrbio de câncer de próstata diagnosticado ou detectado, por exemplo, durante um procedimento de tratamento ou durante um certo período de tempo, tipicamente durante 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 5 anos, 10 anos, ou qualquer outro período de tempo. O termo “acompanhamento” significa que estados da doença, conforme definido aqui acima e, em particular, alterações desses estados de doença podem ser detectados comparando-se o nível de expressão do marcador da variante de PDE4D da presente invenção em uma amostra a um nível de controle normal como aqui definido acima, de preferência, um nível de expressão de controle derivado de um controle de tumor progressivo, um controle de tumor não progressivo ou um controle saudável ou ao nível de expressão de uma célula ou linhagem celular de câncer de próstata estabelecido, por exemplo, independentemente estabelecido, ou uma linhagem de célula em qualquer tipo de segmento de tempo periódico, por exemplo, cada semana, cada 2 semanas, cada mês, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 mês, cada 1,5 ano, cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos, durante qualquer período de tempo, por exemplo, durante 2 semanas, 3 semanas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, 1,5 ano, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 anos, respectivamente. A célula ou linhagem celular de câncer de próstata estabelecido, por exemplo, independentemente estabelecido, que dá origem a um nível de controle adicional pode ser derivada de amostras que correspondem a diferentes estágios de desenvolvimento de câncer, por exemplo, estágios 0 e I a IV do sistema de classificação de TNM. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o termo refere-se ao acompanhamento de um câncer de próstata diagnosticado, com mais preferência de um câncer de próstata progressivo ou não progressivo. O monitoramento pode também incluir a detecção da expressão de genes ou elementos genéticos adicionais, por exemplo genes de manutenção.
[0179] O termo “que prognostica câncer de próstata” como usado na presente invenção, refere-se à previsão do curso ou resultado (prognóstico) de um câncer de próstata, por exemplo, durante um certo período de tempo, durante um tratamento ou após um tratamento. O termo refere- se, também, a uma determinação de uma probabilidade de sobrevida ou recuperação da doença, bem como a uma previsão da expectativa de tempo de vida útil de um indivíduo. Um prognóstico pode, especificamente, envolver estabelecer a probabilidade de sobrevida de um indivíduo durante um período de tempo no futuro, como 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 5 anos, 10 anos ou qualquer outro período de tempo.
[0180] O termo “fator de transcrição ERG” como aqui usado refere-se a uma proteína nuclear que liga sequências de DNA ricas em purina, que é codificada pelo gene ERG (gene relacionado ao ETS), um oncogene. O ERG é um membro da família ETS (eritroblasto de transformação específica) de fatores de transcrição. O regulador transcricional ERG é necessário para a adesão plaquetária no subendotélio e regulação da hematopoese. Ele tem um domínio de ligação ao DNA e um domínio “pointed” (PNT).
[0181] Em algumas modalidades, a expressão regulada positivamente de PDE4D indica um nível de expressão regulada positivamente do fator de transcrição ERG ou a presença de fusão gênica TMPRSS2-ERG.
[0182] O termo “gene de referência” ou “gene de controle”, como aqui usado, refere-se a qualquer gene adequado, por exemplo, a qualquer gene, produto de gene, produto de expressão, proteína ou variante de proteína, que é regularmente expresso e continuamente detectável no organismo de escolha. O termo inclui também produtos de gene como proteínas, peptídeos, polipeptídeos expressos, bem como variantes modificadas dos mesmos. A invenção, portanto, também inclui proteínas de referência derivadas de um de gene de referência. Também abrangidas são todos os tipos de transcritos deriváveis do gene de referência, bem como modificações dos mesmos ou parâmetros secundários relacionados aos mesmos. Alternativamente ou adicionalmente, outros parâmetros de referência podem também ser usados para propósitos de referência, por exemplo concentrações metabólicas, tamanhos de célula, etc.
[0183] A expressão pode ser realizada, de preferência, dentro da mesma amostra, isto é, o nível de uma variante da PDE4D e do gene de referência é determinado na mesma amostra. Se o teste é executado na mesma amostra, uma abordagem de detecção única ou de detecção multiplex, conforme descrito aqui, pode ser realizada. Para o desempenho de detecção multiplex, a concentração de oligonucleotídeos iniciadores e/ou sonda pode ser modificada. Além disso, a concentração e presença de outros ingredientes como tampões, íons etc. pode ser modificada, por exemplo, aumentada ou diminuída em comparação com as indicações dos fabricantes.
[0184] Em uma modalidade específica da presente invenção, a expressão de mais de um gene de referência ou gene expresso de forma constante pode ser determinada. Por exemplo, a expressão de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30 ou mais genes de referência pode ser determinada. Os resultados de tais medições podem ser calculados separadamente, ou podem ser combinados para a obtenção de um índice médio de expressão. Além disso, o padrão de expressão do gene de referência pode ser determinado e/ou usado como base para as etapas subsequentes. Tal padrão pode ser baseado em comportamentos de expressão conhecidos de genes em certos estágios ou estados de câncer, particularmente de câncer de próstata.
[0185] Além disso, os resultados de expressão podem ser comparados aos resultados já conhecidos de casos ou bases de dados de referência. A comparação pode incluir, adicionalmente, um procedimento de normalização a fim de melhorar a relevância estatística dos resultados.
[0186] Em uma modalidade alternativa da presente invenção, em vez de determinação do nível de expressão de um gene de referência em uma amostra, a expressão de um outro marcador de câncer ou gene expressão de maneira não constante pode ser ter determinada. Por exemplo, a expressão de um gene, que é conhecida por ser reduzida durante o câncer de próstata resistente a hormônio ou que é conhecida por ser aumentada durante o câncer de próstata sensível a hormônio, pode ser determinada.
[0187] Em uma outra modalidade, também, ambas as determinações de expressão podem ser realizadas, isto é, a determinação de expressão de um gene de referência e de um gene de câncer ou biomarcador adicional.
[0188] Genes de controle exemplificadores incluem, entre outros, proteína de ligação à caixa TATA (TBP) de Homo sapiens, hipoxantina fosforribosiltransferase 1 de Homo sapiens (HPRT1), mRNA de beta-actina (ACTB) de Homo sapiens, mRNA de fosfoproteína ribossomal P0 ácida 60S (RPLP0) de Homo sapiens, membro da família pumílio de ligação a RNA (PUM1) de Homo sapiens, polipeptídeo A da polimerase (RNA) II (DNA-direcionada) polipeptídeo A, 220 kDa (POLR2A), beta-2- microglobulina (B2M), tubulina-alfa-1b (K-ALPHA-1), aminolevulinato-Delta-sintase (ALAS-1).
[0189] Em uma modalidade específica nos métodos conforme descrito na presente invenção, são realizadas as seguintes etapas (a2) determinação do nível de expressão de um gene de referência em uma amostra; (a3) normalização do nível de expressão medido das variantes de PDE4D da etapa (a) à expressão do gene de referência para obter um perfil de expressão gênica normalizada;
[0190] em que o estado progressivo do câncer de próstata e/ou o índice de progressão do câncer de próstata são com base no perfil de expressão gênica normalizada das variantes de PDE4D da etapa (a3).
[0191] O termo “em que nenhuma das variantes de PDE4D é usada como um gene de referência” significa que a variante de PDE4D não é usada como gene de para a normalização do nível de expressão medido.
[0192] Em particular, PDE4D5 não é usado como um gene de referência.
[0193] Mais particular, nenhuma das variantes de PDE4D é usada como gene de referência para normalizar o nível de expressão de PDE4D7.
[0194] Em ainda uma modalidade mais particular PDE4D5 é não é usada como gene de referência para normalizar o nível de expressão de PDE4D7.
[0195] Os resultados da expressão podem ser normalizados de acordo com qualquer método adequado conhecido do versado na técnica. Tipicamente, tais testes ou fórmula correspondente, que seriam do conhecimento do versado na técnica, poderiam ser usados para padronizar os dados de expressão para permitir a diferenciação entre variações reais nos níveis e varações de expressão dos genes devido aos processos de medição. Para microarranjos, o algoritmo RMA (Robust Multi-array Average) pode ser usado como uma abordagem de normalização.
[0196] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[0197] N(Cqgene de interesse) = Média(Cqgene de ref) - (Cqgene de interesse)
[0198] Em que N(Cqgene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; em que Média (Cqgene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR da combinação selecionada dos genes de referência; em que (Cqgene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[0199] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[0200] N(Cqgene de interesse) = Média(Cqgene de ref) - (Cqgene de interesse)
[0201] Em que N(Cqgene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; em que Média (Cqgene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR dos ao menos dois genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, POLR2A, B2M, PUM1, K-ALPHA-1 e ALAS-1; em que (Cqgene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[0202] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[0203] N(Cqgene de interesse) = Média(Cqgene de ref) - (Cqgene de interesse)
[0204] Em que N(Cqgene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; em que Média (Cqgene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR dos genes de referência T TBP, HPRT1, ACTB e RPLP0; em que (Cqgene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[0205] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[0206] N(Cqgene de interesse) = Média(Cqgene de ref) - (Cqgene de interesse)
[0207] Em que N(Cqgene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; em que Média(Cqgene de interesse) é média aritmética dos valores de Cq da PCR dos genes de referência TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1 e ALAS-1 em que (Cqgene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[0208] Genes de referência exemplificadores incluem, entre outros, proteína de ligação à caixa TATA (TBP), hipoxantina fosforribosiltransferase 1 de Homo sapiens (HPRT1), mRNA de beta-actina (ACTB) de Homo sapiens, mRNA de fosfoproteína ribossomal P0 ácida 60S (RPLP0) de Homo sapiens, membro da família pumílio de ligação a RNA (PUM1) de Homo sapiens, polipeptídeo A da polimerase (RNA) II (DNA-direcionada), 220 kDa (POLR2A), beta-2- microglobulina (B2M), tubulina-alfa-1b (K-ALPHA-1), aminolevulinato-Delta-sintase (ALAS-1). Uma combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0. Uma outra combinação particularmente preferencial é TBP, HPT1, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
[0209] Uma outra modalidade preferencial, a combinação de genes de referência compreende TBP, HPRT1 e ao menos um, ao menos dois ou ao menos três genes de referência selecionados do grupo que compreende ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B)ou ALAS-1.
[0210] Uma outra modalidade preferencial, a combinação de genes de referência compreende TBP, HPRT1 e ao menos dois genes de referência adicionais selecionados do grupo que compreende ACTB, RPLP0, PUM1, K-ALPHA-1 (TUBA1B)ou ALAS-1.
[0211] Uma combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0. Uma outra combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
[0212] Uma descrição detalhada dos genes de referência incluindo sua identificação de transcrição (NCBI RefSeq) e a SEQ ID NO da sequência de nucleotídeos correspondente, a identificação de proteínas (acesso de proteína de adesão) e a SEQ ID NO da sequência do aminoácido correspondente é revelada na Figura 2. Adicionalmente, a Figura 2 revela para cada gene de referência um iniciador foward, um iniciador reverse para a geração de um amplicon que é específico para o gene de referência uma sequência de sonda que se liga especificamente ao amplicon.
[0213] Em particular, o gene de referência não é uma variante de PDE4D.
[0214] Em uma modalidade específica, as variantes de PDE4D são selecionadas a partir do grupo que compreende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9.
[0215] Em uma outra modalidade específica, as variantes de PDE4D são selecionadas do grupo que compreende PDE4D1, PDE4D2, PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9.
[0216] Em uma modalidade adicional, as variantes de PDE4D são selecionadas a partir do grupo que compreende PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9.
[0217] Em uma modalidade específica, as variantes de PDE4D são selecionadas a partir do grupo que compreende PDE4D5 e PDE4D7.
[0218] Em uma outra modalidade específica, as variantes de PDE4D são selecionadas do grupo que compreende PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9.
[0219] Em uma outra modalidade específica, as variantes de PDE4D são selecionadas do grupo que consiste em PDE4D5 e PDE4D7.
[0220] Em uma modalidade preferencial, o nível de expressão de ao menos três variantes de PDE4D, de ao menos quatro variantes de PDE4D, de ao menos 5 variantes de PDE4D é selecionado na etapa (a).
[0221] Em uma modalidade mais preferencial, o nível de expressão de ao menos três variantes de PDE4D é selecionado na etapa (a).
[0222] Em uma modalidade adicional, o nível de expressão de diferentes variantes de PDE4D é determinado em conjunto, por exemplo, por uma sonda que detecta várias variantes de PDE4D juntas.
[0223] Em uma modalidade preferencial, o nível de expressão de PDE4D1 e PDE4D2 é determinado para ambas as variantes em conjunto. Isto significa que apenas uma única sonda é usada para relatar a expressão dessas variantes de PDE4D intimamente relacionadas, PDE4D1 e PDE4D2 juntas.
[0224] No contexto da presente invenção, os termos “diagnosticar” e “prognosticar” são também destinados a incluir análises de predições e probabilidade. As variantes de PDE4D como marcadores podem, consequentemente, também ser usadas clinicamente para fazer decisões concernentes a modalidades de tratamento, incluindo intervenção terapêutica ou critérios diagnósticos, como uma vigilância da doença. De acordo com a presente invenção, um resultado intermediário para o exame da condição de um paciente pode ser fornecido. Esses resultados intermediários podem ser combinados com informações adicionais para ajudar o médico, enfermeira, ou outro profissional a diagnosticar um indivíduo que sofre da doença. Alternativamente, a presente invenção pode ser usada para detectar células cancerosas em um tecido derivado de um indivíduo, e fornecer ao médico informações úteis para diagnosticar que o indivíduo sofre de uma doença.
[0225] Um indivíduo ou paciente a ser diagnosticado, monitorado ou prognosticado com câncer de próstata ou o estado progressivo de câncer de próstata de acordo com a presente invenção é um animal, de preferência, um mamífero, mais preferencialmente um ser humano.
[0226] Particularmente, prefere-se o uso de ferramentas de formação de imagem molecular, como é conhecido pela pessoa versada na técnica, por exemplo, tecnologia de formação de imagem por ressonância magnética (MRI) e/ou de formação de imagem por ressonância magnética protônica (MPI) no contexto de uso de variantes de PDE4D como um marcador para diagnosticar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata maligno sensível a hormônio do câncer de próstata sensível a hormônio-sensitivo com progressão para maligno. Por exemplo, as variantes da PDE4D podem ser usadas como um marcador que diagnostica, monitora ou prognostica câncer de próstata ou o estado de progresso do câncer de próstata em abordagens como MRI ou MPI que permite uma detecção online do marcador diagnóstico de um indivíduo humano.
[0227] Em algumas modalidades, é fornecido com um método para diagnosticar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão de câncer de próstata, que compreende as etapas de:
[0228] (a) determinar o nível de expressão de ao menos duas variantes da PDE4D selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 em uma amostra para obter um perfil de expressão gênica;
[0229] (b) determinar ao menos um índice PDE indicativo o estado de progressão de câncer de próstata com base no perfil da expressão gênica obtido na etapa (a).
[0230] Em algumas modalidades, é fornecido com um método para identificar a elegibilidade de um indivíduo para terapia para câncer de próstata, que compreende:
[0231] (a) determinar, em uma amostra obtida de um indivíduo o nível de expressão de ao menos duas variantes da PDE4D selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 para obter um perfil de expressão gênica;
[0232] (b) determinar ao menos um índice de progressão de câncer de próstata, com base no perfil de expressão genética de variantes de PDE4D indicativo do estado de progressão do câncer de próstata da etapa (a);
[0233] (c) identificar o indivíduo como elegível para receber uma terapia para câncer de próstata, em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica a presença de câncer de próstata ou em que o índice PDE do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata não progressivo ou progressivo.
[0234] O termo “índice PDE” refere-se à combinação dos valores de expressão de ao menos duas isoformas de PDE4D em um único modelo de dados. O índice PDE fornece, portanto, poder de classificação significativamente melhorado para prever o estado de progressão de câncer de próstata.
[0235] Em uma modalidade específica, o estado de progressão do câncer de próstata é não progressivo ou progressivo.
[0236] O índice PDE pode ser, por exemplo:
[0237] i) Índice-PDE_1:
[0238] PDE4D7_exp - PDE4D5_exp,
[0239] ii) Índice-PDE_ 2:
[0240] MEAN(PDE4D7_exp & PDE4D5_exp),
[0241] iii) Índice-PDE_3:
[0242] (MEAN(PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) / (PDE4D4_exp), ou
[0243] iv) Índice-PDE_4:
[0244] (MEAN(PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) / (PDE4D1&PDE4D2_exp).
[0245] v) Índice-PDE_5:
[0246] (MEAN(PDE4D5_exp & PDE4D7_exp&PDE4D9_exp))
[0247] O termo “PDE4D4_exp” denota o nível de expressão normalizado (a genes de referência) de PDE4D4, o termo “PDE4D5_exp” denota o nível de expressão normalizado (a genes de referência) de PDE4D5, o termo “PDE4D7_exp” denota o nível de expressão normalizado (a genes de referência) de PDE4D7 e o termo “PDE4D9_exp” denota o nível de expressão normalizado (a genes de referência) de PDE4D9. O termo “PDE4D1&PDE4D2_exp” denota os níveis de expressão normalizados (a genes de referência) de PDE4D1 e PDE4D2, detectados juntos por um único ensaio.
[0248] O índice PDE_1 de progressão de câncer de próstata é determinado por PDE4D7_exp - PDE4D5_exp. O índice PDE_1, em particular, distingue próstata não cancerosa de câncer de próstata. De preferência, o índice PDE_1 distingue próstata não cancerosa de próstata cancerosa.
[0249] Por exemplo, um índice PDE_1 abaixo de um valor de corte predeterminado é indicativo de próstata não cancerosa e um índice PDE_1 acima do valor de corte predeterminado é indicativo de câncer de próstata.
[0250] O índice PDE_2 é determinado por MEAN(PDE4D7_exp & PDE4D5_exp). O índice PDE_2 discrimina entre estado de progressão de câncer não progressivo e progressivo.
[0251] Por exemplo, um índice PDE_2 abaixo de um valor de corte predeterminado é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_2 acima do valor de corte predeterminado é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0252] Em uma outra modalidade, um índice PDE_2 abaixo dos níveis de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_2 acima do nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0253] O índice PDE_3 é determinado por
[0254] (MEAN(PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) / (PDE4D4_exp).
[0255] O índice PDE_3 discrimina entre estado de progressão de câncer não progressivo e progressivo.
[0256] Por exemplo, um índice PDE_3 abaixo de um valor de corte predeterminado é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_3 acima do valor de corte predeterminado é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0257] O índice PDE_4 é determinado por
[0258] (MEAN(PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) / (PDE4D1&PDE4D2_exp).
[0259] O índice PDE_4 discrimina entre estado de progressão de câncer não progressivo e progressivo.
[0260] O índice PDE_5 é determinado por
[0261] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)).
[0262] O índice PDE_5 discrimina entre estado de progressão de câncer não progressivo e progressivo.
[0263] Por exemplo, um índice PDE_4 abaixo de um valor de corte predeterminado é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_4 acima do valor de corte predeterminado é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0264] O termo “corte predeterminado” pode ser definido com base em um nível de controle, isto é um índice PDE que é determinado para tecido não canceroso ou tecido de próstata não progressivo. Em uma modalidade específica, o corte pode ser ajustado para o nível de controle. Em uma outra modalidade específica, o corte pode diferir do nível de controle.
[0265] Um índice PDE_1 abaixo de um nível de controle é indicativo de próstata não cancerosa e um índice PDE_1 acima de um nível de controle é o valor de corte predeterminado indicativo de câncer de próstata.
[0266] Um índice PDE_1 abaixo de um nível de controle é indicativo de próstata não cancerosa e um índice PDE_1 acima de um nível de controle é o valor de corte predeterminado indicativo de câncer de próstata, sendo que o nível de controle é o índice PDE_1 do tecido não canceroso.
[0267] Em uma outra modalidade, um índice PDE_2 abaixo de um nível de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_2 acima de um nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0268] Em uma modalidade preferencial, um índice PDE_2 abaixo dos níveis de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_2 acima do nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo, sendo que o nível de controle é o índice PDE_2 do tecido de tumor não progressivo.
[0269] Em uma outra modalidade, um índice PDE_3 abaixo de um nível de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_3 acima de um nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0270] Em uma modalidade preferencial, um índice PDE_3 abaixo dos níveis de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_3 acima do nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo, sendo que o nível de controle é o índice PDE_3 do tecido de tumor não progressivo.
[0271] Em uma outra modalidade, um índice PDE_4 abaixo de um nível de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_4 acima de um nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0272] Em uma modalidade preferencial, um índice PDE_4 abaixo dos níveis de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_4 acima do nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo, sendo que o nível de controle é o índice PDE_4 do tecido de tumor não progressivo.
[0273] Em uma outra modalidade, um índice PDE_5 abaixo de um nível de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_5 acima de um nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0274] Em uma modalidade preferencial, um índice PDE_5 abaixo dos níveis de controle é indicativo do estado de tumor de próstata progressivo e um índice PDE_5 acima do nível de controle é indicativo do estado de progressão de câncer de próstata não progressivo, sendo que o nível de controle é o índice PDE_5 do tecido de tumor não progressivo.
[0275] Em uma modalidade específica da invenção, a presença do gene TMPRSS2-ERG é determinada, isto é, é determinada se a amostra é positiva ou negativa para TMPRSS2-ERG. Em particular, é determinado se TMPRSS2-ERG conforme descrito em Tomlins, S. A. et al. “Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer”, Science 310, 644-648 (2005) é expresso. TMPRSS2-ERG é um rearranjo genômico entre a serino-protease regulada por andrógeno TMPRSS2 e o fator de transcrição ERG2 que é membro da família de transcrição ETS. Os métodos como aqui descritos fornecem, em particular, poder de classificação significativamente melhorado para predizer a progressão de câncer de próstata em amostras nas quais o gene TMPRSS2-ERG ou a expressão do TMPRSS2-ERG pode ser detectado(a).
[0276] Em uma modalidade preferencial, os métodos da invenção são aplicados às amostras em que TMPRSS2-ERG está presente.
[0277] O nível da variante de PDE4D pode ser determinado no nível de ácido nucleico, nível de proteína ou nível de atividade, conforme descrito na presente invenção. É preferencial a determinação da quantidade de transcrito(s) e/ou proteína das variantes de PDE4D. Além disso, o nível de um gene de referência na amostra pode ser determinado.
[0278] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o monitoramento ou prognóstico como mencionado acima é para ser executado em uma amostra obtida de um indivíduo. O termo “amostra obtida de um indivíduo”, como usado na presente invenção, refere-se a qualquer material biológico obtido de um indivíduo através de métodos adequados conhecidos pela pessoa versada na técnica. A amostra usada no contexto da presente invenção deve, de preferência, ser coletada de maneira clinicamente aceitável, com mais preferência, de uma maneira que os ácidos nucleicos (RNA em particular) ou as proteínas sejam conservados(as).
[0279] As amostras biológicas podem incluir tecidos e fluidos corpóreos, como sangue, suor e urina. Além disso, a amostra biológica pode conter um extrato celular derivado de uma célula ou população de células, incluindo uma célula epitelial, de preferência, uma célula epitelial cancerosa ou célula epitelial derivada do tecido suspeita de ser canceroso. Ainda mais preferencialmente, a amostra biológica pode conter uma população de células derivada de um tecido glandular, por exemplo, a amostra pode ser derivada da próstata de um indivíduo do sexo masculino. Adicionalmente, as células podem ser purificadas a partir de tecidos e fluidos corpóreos obtidos, se necessário, e, então, usadas como a amostra biológica.
[0280] As amostras, particularmente após o processamento inicial, podem ser agrupadas. Entretanto, também amostras não agrupadas podem ser usadas.
[0281] Em uma modalidade específica da presente invenção, o conteúdo de uma amostra biológica pode também ser submetido a uma etapa de enriquecimento. Por exemplo, uma amostra pode ser colocada em contato com ligantes específicos para a membrana celular ou organelas de determinados tipos de células, por exemplo, células da próstata, funcionalizadas, por exemplo, com partículas magnéticas. O material concentrado pelas partículas magnéticas pode ser posteriormente usado nas etapas de detecção e análise, conforme descrito na presente invenção acima ou abaixo.
[0282] Em uma modalidade específica da invenção, amostras de biópsia ou de ressecções podem ser obtidas e/ou usadas. Tais amostras podem compreender células ou lisados celulares.
[0283] Além disso, as células, por exemplo células de tumor, podem ser enriquecidas através de processos de filtração de fluido ou de amostras líquidas, por exemplo, sangue, urina, etc. Tais processos de filtração podem também ser combinados com as etapas de enriquecimento, com base em interações ligante-específicas, conforme descrito aqui acima.
[0284] Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, uma amostra pode ser uma amostra de tecido, uma amostra de biópsia, uma amostra de urina, uma amostra de sedimento de urina, uma amostra de sangue, uma amostra de saliva, uma amostra de sêmen, uma amostra que compreende células de tumor circulantes, ou uma amostra contendo exossomas secretados pela próstata. Uma amostra de sangue, pode, por exemplo, uma amostra de soro ou uma amostra de plasma.
[0285] Em modalidades da invenção, o padrão de expressão do gene marcador (ou o índice PDE) pode estar correlacionado com níveis de PSA pré ou pós-cirurgia, escore de Gleason e estágio de pT.
[0286] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o método conforme aqui descrito compreende a etapa adicional de determinar o escore de pGleason e/ou o estágio de pT.
[0287] Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, o método conforme descrito na presente invenção compreende a etapa adicional de determinar o escore de gGleason e o estágio de pT.
[0288] “Escore de Gleason” ou “pGleason” refere-se à classificação de uma amostra de câncer de próstata por um patologista treinado de acordo com o sistema de Gleason, que atribui um escore de Gleason usando-se números de 1 a 5, com base em similaridades nas células de uma amostra de tecido de próstata canceroso com o tecido canceroso ou o tecido da próstata normal. Ao tecido que se parece mais com o tecido da próstata normal é dado uma pontuação ou grau de 1, enquanto um tecido que não apresenta características normais e as células parecem ser espalhadas aleatoriamente através da próstata é dado uma pontuação ou grau de 5. Pontuações ou graus de 2 a 4, inclusive, têm características entre essas possibilidades. Devido aos cânceres de próstata poderem ter áreas com diferentes pontuações ou grau, pontuações ou graus separados são dadas para as duas áreas que formam a maior parte do tecido. As duas pontuações ou graus são adicionadas para produzir um escore de Gleason (ou soma de Gleason) entre 2 e 10.
[0289] Em um aspecto adicional, a análise de níveis de expressão pode ser realizada em combinação com, ou no lugar de, outras avaliações ou indicadores de câncer de próstata. Em algumas modalidades, a análise é feita em combinação com um método para determinar o grau do câncer de próstata em uma amostra que compreende células de câncer de próstata um indivíduo. Em outras modalidades, a combinação é com um método de determinação do estágio de câncer de próstata na amostra. Uma terceira possibilidade é combinação com a detecção ou a determinação dos níveis de PSA do indivíduo, opcionalmente antes de um procedimento usado para isolar as células de câncer de próstata. É claro que uma combinação com um, dois, ou todos os três destes exemplos representativos é possível. Quando mais de um tipo de avaliação é usado, o resultado é uma análise multivariada. A invenção inclui expressamente todas as possíveis combinações de avaliações descritas na presente invenção como modalidades multivariadas.
[0290] Em geral, qualquer método aceito para avaliação do grau e/ou estágio de câncer de próstata, conforme conhecido pelo versado na técnica, pode ser usado. Em alguns casos, o método de determinação do grau de câncer de próstata compreende a determinação de um escore de Gleason (ou grau de Gleason). Em outros casos, o método de determinação do estágio de câncer de próstata compreende uma determinação de acordo com o sistema de estagiamento de tumor do American Joint Committee on Cancer (AJCC) para avaliar o estágio de câncer de próstata. E, conforme descrito na presente invenção, a análise dos níveis de expressão gênica (sequência) pode ser realizada em vez do Escore de Gleason ou da determinação do estágio do tumor do AJCC. Nos casos dos níveis de PSA, sua avaliação pode ser conduzida antes de uma prostatectomia, que é utilizada para fornecer uma amostra que compreende células de câncer de próstata para uso em qualquer método descrito na presente invenção.
[0291] Em uma outra modalidade da presente invenção, o método conforme descrito acima pode ser ainda combinado com um ou mais métodos de identificação similares, com base na expressão de um ou mais biomarcadores diferentes. É preferencial a determinação do nível do antígeno específico da próstata (PSA) no sangue. Portanto, se o nível de PSA no sangue encontrado está em uma faixa de cerca de 2 a 5 ng/ml ou mais, de preferência de cerca de 2,2 a 4,8 ng/ml ou mais, 2,4 a 4,4 ng/ml ou mais, 2,6 a 4,2 ng/ml ou mais ou 2,8 a 4,0 ng/ml ou mais, com mais preferência de cerca de 2,5 a 4 ng/ml ou mais, um indivíduo pode ser considerado como estando sofrendo de câncer de próstata, maligno, sensível a hormônio dependente, ou probabilidade de desenvolver câncer de próstata, maligno, sensível a hormônio em um futuro próximo, ou seja, nos próximos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14, 48 meses. O teste para expressão de variantes de PDE4D pode ser realizado de acordo com as etapas conforme definido na presente invenção. Como controles ou amostras de controle, controles, como definido aqui acima, podem ser usados. Em uma modalidade particularmente preferencial, as das etapas de teste podem ser com base no uso de um anticorpo que se liga especificamente a uma variante de PDE4D específica ou várias variantes de PDE4D, por exemplo, o anticorpo anti-PDE4D7 disponível para comercialização como NB300-652 ou GTX14629.
[0292] Em uma modalidade, o nível de expressão gênica é determinado através de detecção de expressão de mRNA com o uso de uma ou mais sondas e/ou um ou mais conjuntos de sondas.
[0293] Em algumas modalidades, é fornecido com métodos para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão de câncer de próstata, por exemplo, em um indivíduo, que compreende ao menos a etapa de determinar o nível de gene(s) marcador(es) ou de GOI em uma amostra. Os termos “determinar o nível de gene(s) marcador(es) ou de GOI” ou “determinar o nível de expressão gênica” ou “determinar o nível de expressão de variantes de PDE4D” refere-se à determinação da presença ou quantidade de gene(s) marcador(es) ou GOI ou de produtos de expressão de variantes de PDE4D. O termo “nível de gene(s) marcador(es) ou de GOI” significa, portanto, a presença ou a quantidade de produtos de expressão de gene(s) marcador(es) ou de GOI, por exemplo, transcrito(s), e/ou a determinação da presença ou quantidade de gene(s) ou marcador(es) ou de GOI. A determinação da presença ou quantidade de produtos de expressão de gene(s) marcadores ou de GOI, pode ser realizada por quaisquer meios conhecidos na técnica.
[0294] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a determinação da presença ou quantidade de produtos de expressão de gene(s) marcador(es) ou de GOI é realizada através da medição de ácido nucleico. Dessa forma, os níveis de expressão podem ser determinados por um método que envolve a detecção de um mRNA codificado pelo gene.
[0295] Por exemplo, a medição do nível de ácido nucleico de expressão de gene(s) marcador ou de GOI pode ser avaliada pela purificação de moléculas de ácido nucleico (por exemplo RNA ou cDNA) obtidas da amostra, seguida por hibridização com sondas de oligonucleotídeos específicos conforme definido anteriormente neste documento. A comparação dos níveis de expressão pode ser realizada visualmente ou por meio de um dispositivo adequado. Métodos para a detecção de mRNA ou de produtos de expressão são conhecidos da pessoa versada na técnica.
[0296] Alternativamente, o nível de ácido nucleico de expressão de gene(s) marcador(es) ou GOI pode ser detectado em uma abordagem de arranjos ou microarranjos de DNA. Tipicamente, amostras de ácidos nucleicos derivadas de pacientes a serem testados são processadas e marcadas, de preferência com um marcador fluorescente. Posteriormente, essas moléculas de ácido nucleico podem ser usadas em uma abordagem de hibridização com sondas de captura imobilizadas que correspondem aos genes marcadores da presente invenção. Meios adequados para a execução de análises de microarranjo são conhecidos do versado na técnica.
[0297] Em uma configuração padrão, um arranjo ou microarranjo de DNA compreende sondas de alta densidade imobilizadas para detectar um número de genes. As sondas no arranjo são complementares a uma ou mais partes da sequência dos genes marcadores. Tipicamente, cDNAs, produtos de PCR, e oligonucleotídeos são úteis como sondas.
[0298] Um método de detecção baseado em arranjo ou microarranjos de DNA tipicamente compreende as seguintes etapas: (1) Isolamento de mRNA a partir de uma amostra e a conversão opcionalmente do mRNA em cDNA, e subsequentemente marcação desse RNA ou cDNA. Métodos de isolamento de RNA, convertendo-o em cDNA e para marcação de ácidos nucleicos são descritos em manuais de tecnologia de microarranjo. (2) Hibridização dos ácidos nucleicos da etapa 1 com sondas para os genes marcadores. Os ácidos nucleicos de uma amostra podem ser marcados com um corante, como os corantes fluorescentes Cy3 (vermelho) ou Cy5 (azul). Geralmente uma amostra de controle é marcada com um corante diferente. (3) Detecção da hibridização dos ácidos nucleicos da amostra com as sondas e determinação de ao menos qualitativamente, e mais particularmente quantitativamente, as quantidades de mRNA na amostra de genes marcadores investigados. A diferença no nível de expressão entre a amostra e o controle pode ser estimada com base em uma diferença na intensidade de sinal. Estes podem ser medidos e analisados por software adequado como, mas não limitado a, o software fornecido, por exemplo, por Affymetrix.
[0299] Não há limitação quanto ao número de sondas que correspondem aos genes marcadores usados, os quais são depositados em um arranjo de DNA. Também, um gene marcador pode ser representado por duas ou mais sondas, as sondas que hibridizam diferentes partes de um gene. As sondas são projetadas para cada gene marcador selecionado. Tal sonda é tipicamente um oligonucleotídeo que compreende, tipicamente, 5 a 50 resíduos de nucleotídeos. DNAs mais longos podem ser sintetizados por PCR ou quimicamente. Métodos para sintetizar tais oligonucleotídeos e aplicá-los sobre um substrato são bem conhecidos no campo de microarranjos. Genes diferentes dos genes marcadores podem também ser depositados no arranjo de DNA. Por exemplo, uma sonda para um gene cujo nível de expressão não é significativamente alterado pode ser depositada no arranjo de DNA para normalizar os resultados do ensaio ou para comparar os resultados do ensaio de múltiplos arranjos ou diferentes ensaios.
[0300] Alternativamente, o nível de ácido nucleico de expressão dos gene marcadores ou GOI pode ser detectado em uma abordagem de RT-PCR quantitativa, de preferência em uma abordagem de PCR em tempo real seguindo a transcrição reversa de transcritos de interesse. Tipicamente, a primeira etapa, um transcrito é transcrito de forma reversa em cDNA de uma molécula de acordo com qualquer método adequado conhecido do versado na técnica. Uma abordagem de PCR em tempo real ou quantitativa pode ser executada posteriormente com base em uma primeira fita de DNA obtida como descrito acima.
[0301] De preferência, sondas taqman ou molecular Beacon com sondas Fret de base deste tipo pode ser usado para a detecção de PCR quantitativa. Em ambos os casos, as sondas servem como sondas internas que são usadas em conjunto com um par de iniciadores que flanqueiam região alvo de interesse, de preferência, um conjunto de oligonucleotídeos específicos de genes marcadores conforme definido anteriormente neste documento. Mediante a amplificação de um segmento alvo, a sonda pode se ligar seletivamente aos produtos em uma sequência de identificação entre os locais de iniciadores, causando assim o aumento da sinalização FRET em relação a aumentos na frequência alvo.
[0302] De preferência, uma sonda Taqman a ser usada para uma abordagem de PCR quantitativa de acordo com a presente invenção pode compreender um oligonucleotídeo específico conforme definido acima de cerca de 22 a 30 bases que é marcado em ambas as extremidades como um par FRET. Tipicamente, a extremidade 5’ terá um fluoróforo de comprimento de onda mais curto, como fluoresceína (por exemplo, FAM) e a extremidade 3’ é comumente marcada com um supressor de comprimento de onda mais longo (por exemplo, TAMRA) ou um composto supressor (“quencher”) não fluorescente (por exemplo. Black Hole Quencher). Prefere-se que as sondas a serem usadas para PCR quantitativa, em particular as sondas conforme definido anteriormente neste documento, não tenham guanina (G) na extremidade 5’ adjacente ao corante repórter para evitar diminuição ou supressão da intensidade da fluorescência do repórter após a sonda ser degradada.
[0303] Uma sonda molecular Beacon a ser usada para uma abordagem de PCR quantitativa de acordo com a presente invenção usa, de preferência, interações de FRET para detectar e quantificar um produto de PCR, sendo que cada sonda tem uma extremidade 5’ marcada com fluorescência e uma extremidade 3’ marcada com supressor. Esta configuração em forma de grampo (hairpin ou haste-alça da estrutura da sonda compreende, de preferência, uma haste com duas extremidades curtas autoligantes e uma alça com uma região específica de alvo interna, longa de cerca de 20 a 30 bases.
[0304] Mecanismos de detecção alternativos que podem também ser de usados no contexto da presente invenção são direcionados a uma sonda fabricada com somente uma estrutura de alça e sem uma região de haste complementar curta. Uma abordagem alternativa com base em FRET para PCR quantitativa que também pode ser usada no contexto da presente invenção se baseia no uso de duas sondas de hibridização que se ligam a sítios em posição adjacente no alvo, sendo que a primeira sonda tem uma marcação doadora fluorescente na extremidade 3' e a segunda sonda tem uma marcação receptora fluorescente em sua extremidade 5'.
[0305] Em uma modalidade específica, o nível de expressão gênica é determinado por um método com base em amplificação e/ou análise de microarranjo e/ou de sequenciamento de RNA.
[0306] Em uma modalidade específica, na etapa (c) do método de identificação da elegibilidade de um indivíduo para receber terapia para câncer de próstata, um indivíduo é identificado como elegível para receber uma terapia para câncer de próstata selecionada dentre cirurgia da próstata, remoção da próstata, quimioterapia, radioterapia, ou dissecção limitada ou estendida do nódulo linfático, em que o índice de progressão de câncer de próstata da amostra do indivíduo indica um estado de progressão de câncer de próstata progressivo.
[0307] Em algumas modalidades, é fornecido com um método para identificar a elegibilidade de um indivíduo para terapia para câncer de próstata, que compreende: determinar, em uma amostra obtida de um indivíduo o nível de expressão de ao menos duas variantes da PDE4D selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9 para obter um perfil de expressão gênica; determinar ao menos um índice de progressão de câncer de próstata, com base no perfil de expressão genética de variantes de PDE4D indicativo do estado de progressão do câncer de próstata da etapa (a); identificar o indivíduo como elegível para receber uma terapia para câncer de próstata, em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica a presença de câncer de próstata ou em que o índice PDE do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata não progressivo ou progressivo.
[0308] Em uma modalidade preferencial, na etapa (c) do método de identificação da elegibilidade de um indivíduo para receber terapia para câncer de próstata, um indivíduo é identificado como elegível para receber uma terapia para câncer de próstata selecionada dentre cirurgia da próstata, remoção da próstata, quimioterapia, radioterapia, ou dissecção limitada ou estendida do nódulo linfático, em que o índice de progressão de câncer de próstata da amostra do indivíduo indica um estado de progressão de câncer de próstata progressivo e um indivíduo é identificável como elegível para receber como terapia para câncer de próstata vigilância ativa, em que o índice de progressão do câncer de próstata da amostra do indivíduo indica um estado de progressão de câncer de próstata não progressivo.
[0309] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um produto que compreende:
[0310] iniciadores e/ou sondas para determinar o nível de expressão de pelo menos duas variantes da fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9;
[0311] que compreende adicionalmente iniciadores e/ou sondas para determinar o nível de expressão gênica de um gene de referência, de preferência, um gene constitutivo, com mais preferência TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 ou ALAS-1.
[0312] Em algumas modalidades, é fornecido com uma composição que compreende um conjunto de moléculas de ácido nucleico que compreende, cada, ao menos uma sequência de sonda de oligonucleotídeo para a análise da expressão gênica das variantes PDE4D PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, que compreende ao menos uma sequência de sonda de oligonucleotídeo para a análise da expressão gênica de genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS-1.
[0313] Em algumas modalidades, é fornecido com um arranjo de ácidos nucleicos que compreende uma ou mais sondas de oligonucleotídeo complementares ou hibridizáveis a uma sequência de codificação de ao menos duas variantes de PDE4D dentre PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, que compreende uma ou mais sondas de oligonucleotídeo complementares e hibridizáveis a ao menos um dos genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS-1, para determinar um índice PDE conforme definido acima na presente invenção.
[0314] Um “microarranjo” é um arranjo linear ou bi-dimensional de regiões distintas, cada uma tendo uma área definida, formada sobre a superfície de um suporte genericamente sólido, como, mas não limitado a, vidro, plástico, ou membrana sintética. A densidade das regiões distintas em um microarranjo é determinada pelos números totais de oligonucleotídeos imobilizados para serem detectados sobre a superfície de um único suporte de fase sólida, como ao menos cerca de 50/cm2, ao menos cerca de 100/cm2, ao menos cerca de 500/cm2, porém abaixo de cerca de 1.000/cm2 em algumas modalidades. Os arranjos podem conter menos que cerca de 500, cerca de 1.000, cerca de 1.500, cerca de 2.000, cerca de 2.500, cerca de 3.000, ou oligonucleotídeos imobilizados no total. Como usado aqui, um microarranjo de DNA é um arranjo de oligonucleotídeos ou oligonucleotídeos colocados em um chip ou outras superfícies usadas para hibridizar oligonucleotídeos amplificados ou clonados de uma amostra. Uma vez que a posição de cada grupo particular de oligonucleotídeos no arranjo é conhecida, as identidades de uma amostra de oligonucleotídeos pode ser determinada com base em sua ligação a uma posição particular no microarranjo.
[0315] Um “oligonucleotídeo” é uma forma polimérica de nucleotídeos ribonucleotídeos ou nucleotídeos desoxirribonucleotídeos. Este termo se refere apenas à estrutura primária da molécula. Dessa forma, este termo inclui DNA e RNA de fita dupla e de fita simples. Ele também inclui tipos conhecidos de modificações, incluindo marcadores conhecidos na técnica, metilação, “terminações”, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, e modificações de internucleotídeo como ligações sem carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), bem como formas não modificadas do oligonucleotídeo.
[0316] O termo “amplificar” é usado no sentido amplo para significar que a criação de um produto de amplificação pode ser feita enzimaticamente com DNA ou RNA polimerases. “Amplificação,” como usado na presente invenção, refere-se geralmente ao processo de produzir cópias múltiplas de uma sequência desejada, particularmente as de uma amostra. “Múltiplas cópias” significa ao menos 2 cópias. Uma “cópia” não necessariamente significa sequência perfeita de complementaridade ou identidade para a sequência de modelo. É possível usar, ainda, qualquer método de sequenciamento adicional conhecido na técnica para identificar as sequências de GOI.
[0317] O termo “correspondente” pode referir-se a, quando adequado, uma molécula de ácido nucleico que tem uma quantidade substancial de identidade de sequência com uma outra molécula de ácido nucleico. Quantidade substancial significa ao menos 95%, geralmente ao menos 98% e, mais geralmente, de ao menos 99%, e a identidade de sequência é determinada com o uso do algoritmo BLAST, como descrito em Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403 - 410 (usando a configuração padrão, isto é os parâmetros w=4, t=17). Métodos de amplificação de mRNA são de conhecimento geral na técnica, e incluem PCR por transcrição reversa (RT-PCR) e aqueles descritos no pedido de patente US n° de série 10/062.857 (depositado em 25 de outubro de 2001), bem como os pedidos de patente provisórios US 60/298.847 (depositado em 15 de junho de 2001) e 60/257.801 (depositado 22 de dezembro de 2000), todos os quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade como se integralmente apresentados. Um outro método que pode ser usado é a PCR quantitativa (ou Q-PCR). Alternativamente, o RNA pode ser diretamente marcado como o cDNA correspondente por métodos conhecidos na técnica.
[0318] Como a invenção se baseia na identificação de genes (ou sequências expressas) que são superexpressas ou subexpressas, uma modalidade da invenção envolve determinar a expressão por hibridização de mRNA, ou uma versão amplificada ou clonada do mesmo (como cDNA ou DNA), de uma célula de amostra com um oligonucleotídeo que é único para uma sequência gênica particular. Os oligonucleotídeos deste tipo podem conter ao menos cerca de 20, ao menos cerca de 22, ao menos cerca de 24, ao menos cerca de 26, ao menos cerca de 28, ao menos cerca de 30, ou ao menos cerca de 32 pares de base consecutivos de uma sequência gênica que não é encontrada em outras sequências de genes. O termo “cerca de”, como usado na sentença anterior refere-se a um aumento ou diminuição de 1 do valor numérico declarado. Outras modalidades podem usar oligonucleotídeos de ao menos ou cerca de 50, ao menos ou cerca de 100, ao menos ou cerca de 150, ao menos ou cerca de 200, ao menos ou cerca de 250, ao menos ou cerca de 300, ao menos ou cerca de 350, ao menos ou cerca de 400 de pares de bases de uma sequência de genes que não pé encontrada em outras sequências de genes. O termo “cerca de”, como usado na sentença precedente refere- se a um aumento ou diminuição de 10% do valor numérico declarado. Tais oligonucleotídeos podem também ser chamados de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de hibridizar às sequências dos genes, ou porções únicas dos mesmos, descritas aqui. Em muitos casos, as condições de hibridização são condições estringentes de cerca de 30% em volume a cerca de 50% de formamida e de cerca de 0,01 M a cerca de 0,15 M de sal para hibridização e de cerca de 0,01 M a cerca de 0,15 M de sal para condições de lavagem a cerca de 55 a cerca de 65 °C ou mais, ou condições equivalentes às mesmas.
[0319] Em outras modalidades, as sondas de oligonucleotídeos para uso na invenção podem ter cerca de ou 95%, cerca de ou 96%, cerca de ou 97%, cerca de ou 98% ou, cerca de ou 99% de identidade com as sequências do gene marcador cuja expressão será determinada. A identidade é determinada usando o algoritmo BLAST, como descrito acima. Tais sondas podem também ser descritas com base na capacidade de hibridizar a genes marcadores expressos usados em métodos da invenção sob condições estringentes, conforme descrito acima, ou condições equivalentes às mesmas.
[0320] Em muitos casos, as sequências são aquelas de mRNA codificado pelos genes marcadores, o cDNA correspondente a estes mRNAs, e/ou versões amplificadas destas sequências. Em algumas modalidades da invenção, as sondas de oligonucleotídeo são imobilizadas em um arranjo, outros dispositivos, ou em pontos individuais que localizam as sondas.
[0321] Os marcadores adequados que podem ser usados de acordo com a invenção, incluem radioisótopos, cromóforos de nucleotídeos, enzimas, substratos, moléculas fluorescentes, porções quimioluminescentes, partículas magnéticas, porções bioluminescentes, e similares. Como tal, uma marcação é qualquer composição detectável por meios espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, óptico ou químico. O termo “suporte” refere-se a suportes convencionais, como microesferas, partículas, varetas, fibras, filtros, membranas e suportes de silano ou silicato como lâminas de vidro.
[0322] Em algumas modalidades, é fornecido com um kit para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão de câncer de próstata para identificar a elegibilidade de um indivíduo para a terapia de câncer de próstata, que compreende: a) um arranjo que compreende uma ou mais sondas de oligonucleotídeo complementares e hibridizáveis a uma sequência de codificação de ao menos duas variantes de PDE4D dentre PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 de PDE4D9, que compreende uma ou mais sondas de oligonucleotídeo complementares e hibridizáveis a ao menos um dos genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS- 1, para a determinação de um índice PDE conforme definido em quaisquer dos itens anteriores, b) um kit controle; e c) opcionalmente, instruções para uso.
[0323] Tipicamente, o kit da presente invenção contém um ou mais agentes que permitem a detecção específica de genes marcadores ou GOI conforme definido anteriormente neste documento. Os agentes ou ingredientes de um kit podem de acordo com a presente invenção, ser compreendidos de um ou mais recipientes ou entidades separadas. A natureza dos agentes é determinada pelo método de detecção para a qual o kit é destinado.
[0324] Além disso, o kit pode compreender uma quantidade de uma molécula de ácido nucleico conhecida, que pode ser usada para uma calibração do kit ou como um controle interno. Tipicamente, um kit para a detecção de produtos de expressão de genes marcadores ou GOI pode compreender ingredientes acessórios como tampões PCR, dNTPs, uma polimerase, íons como cátion bivalentes ou cátions monovalentes, soluções de hibridização, etc. Tais ingredientes são conhecidos das pessoas versadas na técnica e podem variar dependendo do método de detecção realizado. Adicionalmente, o kit pode compreender um folheto de instrução e/ou pode fornecer informações quanto à relevância dos resultados obtidos.
[0325] Um aspecto adicional da invenção refere- se a um dispositivo para realizar um método conforme descrito na presente invenção, que compreende: a) uma base de dados que inclui registros compreendendo valores de expressão de câncer de próstata associados com os estados de progressão de câncer de próstata, sendo que cada perfil de referência compreende os níveis de expressão de ao menos duas variantes de PDE4D selecionadas do grupo consistindo em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, e/ou b) uma interface de usuário capaz de receber e/ou inserir uma seleção de valores de expressão de gene de um conjunto de genes, sendo que o conjunto compreende os níveis de expressão de ao menos duas variantes de PDE4D selecionadas do grupo consistindo em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 e PDE4D9, para uso comparando os perfis de expressão do gene de referência na base de dados; c) uma saída que apresenta uma predição do status do câncer, de acordo com os níveis de expressão do conjunto de genes.
[0326] Um aspecto adicional refere-se a um método implementado por computador para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estão de progressão do câncer de próstata, que compreende as etapas de método conforme aqui descrito.
[0327] No contexto do presente pedido de patente, a expressão “método implementado por computador para monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou o estado de progressão de câncer de próstata” refere-se a um método em que os algoritmos do software calculam um índice PDE e com base nos mesmos fornecem um prognóstico para o paciente que é analisado, sendo que este método utiliza dados brutos obtidos no medição do nível de expressão gênica dos genes referenciados na presente invenção, e a conversão dos mesmos em um índice PDE usando a equação acima descrita.
[0328] Um aspecto adicional da invenção refere- se a uma composição farmacêutica estimulatória para uso no tratamento ou prevenção do câncer de próstata, que compreende ao menos um elemento selecionado do grupo que consiste em:
[0329] (a) um composto que estimula ou modula diretamente a atividade de uma variante PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9, de preferência, um agonista alostérico da atividade enzimática;
[0330] (b) um composto que estimula ou modula indiretamente a atividade da variante da PDE4D de (a);
[0331] (c) a proteína da variante da PDE4D de (a) ou um equivalente biologicamente ativo da mesma;
[0332] (d) um ácido nucleico que codifica e expressa a variante da PDE4D de (a);
[0333] (e) um inibidor de miRNA específico para miRNAs da variante da PDE4D de (a);
[0334] (f) um agente de desmetilação; e
[0335] (g) um fator de deslocamento da fosfodiesterase, de preferência um peptídeo, um peptidomimético, uma molécula pequena, um anticorpo ou um aptâmero,
[0336] Em algumas modalidades, é fornecido com uma composição farmacêutica estimulatória para uso no tratamento ou prevenção do câncer de próstata, que compreende ao menos um elemento selecionado do grupo que consiste em:
[0337] (a) um composto que estimula ou modula diretamente a atividade da variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D5, PDE4D8 e PDE4D9, de preferência, um agonista alostérico da atividade enzimática;
[0338] (b) um composto que estimula ou modula indiretamente a atividade da variante da PDE4D de (a);
[0339] (c) a proteína da variante da PDE4D de (a) ou um equivalente biologicamente ativo da mesma;
[0340] (d) um ácido nucleico que codifica e expressa a variante da PDE4D de (a);
[0341] (e) um inibidor de miRNA específico para miRNAs da variante da PDE4D de (a);
[0342] (f) um agente de desmetilação; e
[0343] (g) um fator de deslocamento da fosfodiesterase, de preferência um peptídeo, um peptidomimético, uma molécula pequena, um anticorpo ou um aptâmero,
[0344] Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição farmacêutica inibitória para uso no tratamento ou prevenção do câncer de próstata, que compreende ao menos um elemento selecionado do grupo que consiste em:
[0345] (a) um composto que inibe diretamente a atividade de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9;
[0346] (b) um composto que inibe indiretamente a atividade da variante da PDE4D de (a);
[0347] (c) uma forma negativa dominante da proteína da variante da PDE4D de (a) ou um equivalente biologicamente ativo da mesma;
[0348] (d) um ácido nucleico que codifica e expressa uma forma negativa dominante da variante da PDE4D de (a);
[0349] (e) um miRNA específico para a variante da PDE4D de (a);
[0350] (f) uma molécula antissenso para a variante da PDE4D de (a);
[0351] (g) um siRNA específico para a variante da PDE4D de (a);
[0352] (h) um aptâmero específico para o produto de expressão da variante da PDE4D de (a) ou para a proteína da variante da PDE4D de (a);
[0353] (i) uma molécula pequena ou peptidomimético capaz de se ligar especificamente à proteína da variante da PDE4D de (a); e
[0354] (j) um anticorpo específico para a proteína da variante da PDE4D de (a) e/ou uma variante de anticorpo específica para a proteína da variante da PDE4D de (a).
[0355] sendo que a variante da PDE4D, de preferência, é selecionada do grupo que consiste em PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
[0356] Em algumas modalidades, é fornecido com uma composição farmacêutica estimulatória ou inibitória é para o tratamento de câncer de próstata, sendo que a composição é administrada a um indivíduo na dependência do índice PDE indicativo do estado de progressão do câncer de próstata.
[0357] Em algumas modalidades, é fornecido com uma composição farmacêutica estimulatória ou inibitória para o tratamento de câncer de próstata, sendo que a composição é administrada a um indivíduo em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata progressivo.
[0358] Em uma modalidade preferencial, o ao menos um dentre o índice PDE_2, o índice PDE_3, o índice PDE_4, ou o índice PDE_5 da amostra do indivíduo está abaixo de um corte pré-determinado.
[0359] Em outra modalidade preferencial, o ao menos um dentre o índice PDE_2, o índice PDE_3, o índice PDE_ 4, ou o índice PDE_5 da amostra do indivíduo está abaixo de um nível de controle.
[0360] Em outra modalidade preferencial, o ao menos um dentre o índice PDE_2, o índice PDE_3, o índice PDE_ 4, ou o índice PDE_5 da amostra do indivíduo está abaixo de um nível de controle, sendo que o nível de controle é o índice PDE_2, o índice PDE_3, o índice PDE_ 4, ou o índice PDE_5 respectivamente da amostra do indivíduo.
[0361] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método para tratar um indivíduo que tem câncer de próstata, sendo que o método compreende:
[0362] (i) selecionar um indivíduo com câncer de próstata em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata progressivo, e
[0363] (ii) administrar a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória conforme aqui descrito.
[0364] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método para tratar um indivíduo que tem câncer de próstata, sendo que o método compreende:
[0365] (i) selecionar um indivíduo com câncer de próstata em que o índice PDE da amostra do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata progressivo, e
[0366] (ii) administrar a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória conforme aqui descrito.
[0367] Um método para tratar um indivíduo que tem câncer de próstata, sendo que o método compreende:
[0368] (i) selecionar um indivíduo que tem câncer de próstata, em que ao menos um dentre o índice PDE 2, o índice PDE 3, o índice PDE 4, ou o índice PDE 5 da amostra do indivíduo está abaixo de um limite ou limiar pré- determinado, e
[0369] (ii) administrar a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória conforme aqui descrito.
[0370] Um método para tratar um indivíduo que tem câncer de próstata, sendo que o método compreende:
[0371] (i) selecionar um indivíduo que tem câncer de próstata, em que ao menos um dentre o índice PDE 2, o índice PDE 3, o índice PDE 4, ou o índice PDE 5 da amostra do indivíduo está abaixo de um limite ou limiar pré- determinado, e
[0372] (ii) administrar a composição farmacêutica estimulatória ou inibitória conforme aqui descrito.
[0373] O termo “um composto que diretamente estimula ou modula a atividade de uma variante de PDE4D” como usado aqui refere-se a um composto que é capaz de aumentar a atividade de uma variante de PDE4D para degradar cAMP por uma interação direta com a variante de PDE4D. Tal composto pode ser qualquer interagente direto da variante de PDE4D, que tem influência positiva sobre a atividade catalítica da variante de PDE4D. Tal composto pode, de preferência, ser um agonista alostérico da atividade catalítica da variante de PDE4D, por exemplo um modulador alostérico homotrópico. Agonistas alostéricos preferenciais da variante de PDE4D são cAMP ou análogos de cAMP. Outros compostos que diretamente estimulam contemplados pela presente invenção são íons, de preferência, cátions mono e bivalentes biologicamente ativos como Ca2+, Mg2+.
[0374] O termo “um composto que diretamente estimula ou modula a atividade de PDE4D” como usado aqui refere-se a um composto que é capaz de aumentar a atividade de PDE4D sem ser seletivo a uma variante específica para degradar cAMP por uma interação direta com PDE4D. Tal composto pode ser de qualquer interagente direto de PDE4D, que tem influência positiva sobre a atividade catalítica de PDE4D. Tal composto pode, de preferência, ser um agonista alostérico da atividade catalítica de PDE4D, por exemplo um modulador alostérico homotrópico. Agonistas alostéricos preferenciais de PDE4D são cAMP ou análogos de cAMP. Outros compostos que diretamente estimulam contemplados pela presente invenção são íons, de preferência, cátions mono e bivalentes biologicamente ativos como Ca2+, Mg2+.
[0375] O termo “um composto que indiretamente estimula ou modula a atividade de PDE4D” como usado aqui refere-se a um composto que é capaz de aumentar a atividade de PDE4D sem ser seletivo a uma variante específica para degradar cAMP por uma interação direta com um interagente direto de PDE4D (“interagente indireto”), ou através de uma trajetória de trabalho indireta que não envolve uma interação com PDE4D. Tal composto pode ser qualquer interagente direto de um interagente de PDE4D. O efeito conferido pelo interagente direto de um interagente de PDE4D pode ser positivo, se o próprio interagente de PDE4D tiver um efeito positivo sobre a atividade de PDE4D, ou negativo, se o interagente de PDE4D tiver um efeito negativo sobre a atividade de PDE4D. Tipicamente, interagentes indiretos de trabalho positivo podem estimular o efeito agonista dos interagentes diretos, por exemplo, provocar o aumento da concentração de compostos de trabalho alostéricos como cAMP ou seus análogos por inibição dos processos de degradação de cAMP não conferidos por PDE4D7, por aumento da produção de cAMP, etc.
[0376] Alternativamente, tais interagentes indiretos de trabalho positivo podem provocar uma modificação do comportamento de ligação de proteínas de ligação direta, levando a um aumento da atividade de PDE4D sem serem seletivos a uma variante específica. Tipicamente, interagentes indiretos de trabalho negativo podem ter um efeito inibitório interagentes sobre inibidores de PDE4D. Exemplos de tais interagentes são atividades enzimáticas que degradam inibidores de PDE4D, ou proteínas capazes de ligar e suprimir os inibidores de PDE4D. Alternativamente, esses interagentes podem inibir atividades que levam a uma degradação de PDE4D, por exemplo, inibidores de proteinase. Exemplos adicionais e sua implementação é de conhecimento do versado na técnica.
[0377] O termo “um composto que indiretamente estimula ou modula a atividade de uma variante de PDE4D” como usado aqui refere-se a um composto que é capaz de aumentar a atividade de uma variante de PDE4D para degradar cAMP por uma interação direta com um interagente direto de PDE7D (“interagente indireto”), ou através de uma trajetória indireta de trabalho que não envolve uma interação com a variante de PDE4D. Tal composto pode ser qualquer interagente direto de um interagente da variante de PDE4D. O efeito conferido pelo interagente direto de um interagente da variante de PDE4D pode ser positivo, se o próprio interagente da variante de PDE4D tiver um efeito positivo sobre a atividade de PDE4D, ou negativo, se o interagente da variante de PDE4D tiver um efeito negativo sobre a atividade da variante de PDE4D. Tipicamente, interagentes indiretos de trabalho positivo podem estimular o efeito agonista dos interagentes diretos, por exemplo, provocar o aumento da concentração de compostos de trabalho alostéricos como cAMP ou seus análogos por inibição dos processos de degradação de cAMP não conferidos por PDE4D7, por aumento da produção de cAMP, etc.
[0378] Alternativamente, tais interagentes indiretos de trabalho positivo podem provocar uma modificação do comportamento de ligação de proteínas de ligação direta, levando a um aumento da atividade da variante de PDE4D. Tipicamente, interagentes indiretos de trabalho negativo podem ter um efeito inibitório interagentes sobre inibidores da variante de PDE4D. Exemplos de tais interagentes são atividades enzimáticas que degradam inibidores de PDE4D, ou proteínas capazes de ligar e suprimir os inibidores da variante de PDE4D. Alternativamente, esses interagentes podem inibir atividades que levam a uma degradação da variante de PDE4D, por exemplo, inibidores de proteinase. Exemplos adicionais e sua implementação é de conhecimento do versado na técnica.
[0379] Alternativamente, a estimulação indireta da atividade de PDE4D pode ser conferida por compostos que ativam, protegem ou sustentam a expressão do gene PDE4D endógeno. Exemplos de tais compostos são fatores de transcrição de PDE4D específicos, fatores de splice de PDE4D/fatores de splice específicos de PDE4D ou atividades que estabilizam mRNA específicos de PDE4D ou específicos da variante de PDE4D. Exemplos adicionais e sua implementação é de conhecimento do versado na técnica.
[0380] A “proteína da variante de PDE4D” compreendida na composição farmacêutica estimulatória pode ser uma proteína de variante de PDE4D como definido aqui acima. Em particular, pode ser uma proteína que é codificada pela variante de splice 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9 da fosfodiesterase PDE4D humana conforme definido aqui. A “proteína da variante de PDE4D”, conforme usado neste contexto, também compreende sequências de aminoácidos que são ao menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 ou 18, e sendo as sequências de aminoácidos codificadas por sequências de nucloetídeo ao menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9, 7, 9, 11, 15 ou 17.
[0381] A “proteína de PDE4D” compreendida na composição farmacêutica estimulatória pode ser uma proteína da variante de PDE4D como definido aqui acima, uma mistura de várias variantes de PDE4D ou uma versão truncada da variante de PDE4D que é comum a ao menos duas variantes de PDE4D.
[0382] O termo “equivalente biologicamente ativo de PDE4D” ou como aqui usado refere-se a uma proteína de PDE4D que é capaz de realizar todas ou a maioria das funções de PDE4D que são comuns a várias variantes de PDE4D. De preferência, a invenção refere-se a proteínas que são capazes de degradar cAMP.
[0383] O termo “equivalente biologicamente ativo da variante de PDE4D” ou como aqui usado refere-se a uma proteína da variante de PDE4D que é capaz de realizar todas ou a maioria das funções da variante de PDE4D. De preferência, a invenção refere-se a proteínas que são capazes de degradar cAMP.
[0384] PDE4D, variantes de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou de variantes de PDE4D ou de acordo com a presente invenção podem ser produzidos de modo recombinante por meio de qualquer método adequado conhecido do versado na técnica. A presente invenção, portanto, também abrange métodos para a produção de PDE4D, variantes de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou de variantes de PDE4D.
[0385] Consequentemente, a presente invenção contempla vetores contendo os oligonucleotídeos que codificam PDE4D, variantes de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou de variantes de PDE4D conforme definido anteriormente neste documento, células hospedeiras, e a produção de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D por meio de técnicas recombinantes.
[0386] Um vetor adequado pode ser, por exemplo, um fago, plasmídeo, partícula viral, ou vetor retroviral. Vetores retrovirais podem ser replicação competente ou replicação defeituosa. No último caso, a propagação viral geralmente ocorrerá apenas em células hospedeiras complementares. Polinucleotídeos que codificam PDE4D, variantes de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou de variantes de PDE4D podem ser unidos a um vetor ou transportador contendo um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro. Um inserto de polinucleotídeo correspondente pode ser operacionalmente ligado a um promotor adequado, como o promotor PL lambda de fago, os promotores lac, trp, phoA e tac de E. coli, os promotores SV40 precoce e tardio e os promotores de LTRs retrovirais, ou o promotor PSA. Outros promotores adequados são conhecidos da pessoa versada na técnica. O construtos de expressão pode conter adicionalmente sítios para iniciação de transcrição, terminação, e, na região transcrita, um sítio de ligação ribossomal para tradução. A porção de codificação dos transcritos expressos pelos construtos incluirá, de preferência, um códon de iniciação de tradução no começo e um códon de terminação (UAA, UGA ou UAG) posicionado adequadamente no final do polipeptídeo a ser traduzido.
[0387] Os polipeptídeos ou proteínas podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados ou podem de outro modo ser modificados. Além disso, os polipeptídeos ou proteínas podem também incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos como um resultado de processos mediados pelo hospedeiro. Além disso, o polipeptídeo, proteína ou peptídeo pode ser modificado por acetilação, peguilação, hesilação, formilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem química específica, clivagem proteolítica, uma ligação a um ligante celular ou outra proteína, ou hapilação, isto é, uma fusão com uma glicina rica em polímero-aminoácido (HAP), etc, tais modificações podem ser executadas por técnicas adequadas conhecidas pelo versado na técnica. Adicionalmente, o polipeptídeo, ou peptídeo variante pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[0388] Em adição, PDE4D, variantes de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou de variantes de PDE4D da invenção podem ser quimicamente sintetizados usando-se técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de peptídeo.
[0389] Um “polinucleotídeo” é uma forma polimérica de nucleotídeos ribonucleotídeos ou nucleotídeos desoxirribonucleotídeos. Este termo se refere apenas à estrutura primária da molécula. Dessa forma, este termo inclui DNA e RNA de fita dupla e de fita simples. Ele também inclui tipos conhecidos de modificações, incluindo marcadores conhecidos na técnica, metilação, “terminações”, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, e modificações de internucleotídeo como ligações sem carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), bem como formas não modificadas do oligonucleotídeo.
[0390] O “ácido nucleico que codifica e expressa PDE4D” compreendido na composição farmacêutica estimulatória, conforme definido acima no presente documento, refere-se a qualquer transportador adequado, por exemplo, conforme descrito acima na presente invenção, que compreende um gene PDE4D expressável.
[0391] O “ácido nucleico que codifica e expressa uma variante de PDE4D” compreendido na composição farmacêutica estimulatória, conforme definido acima no presente documento, refere-se a qualquer transportador adequado, por exemplo, conforme descrito acima na presente invenção, que compreende um gene PDE4D expressável. De preferência, esse transportador pode compreender a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 e 17. Tal transportador pode também compreender sequências de nucleotídeos que mostram um alto grau de homologia com a variante de PDE4D, por exemplo, sendo as sequências de ácidos nucleicos ao menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 e 17 ou sequências de ácido nucleico que codificam sequências de aminoácidos sendo ao menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência como apresentada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 e 18. Alternativamente, o transportador pode compreender a sequência genômica de PDE4D, de preferência a sequência conforme definido na base de dados ENSEMBL número de dados ENSG00000113448 (versão ENSG00000113448.8, Ensembl release 53 - março 2009), que corresponde à SEQ ID NO: 19, ou derivável do n° de acesso GenBank AC008934 (versão AC008934.5, GI: 17386235 de 24 de março de 2009) em combinação com n° de acesso GenBank AC034234 (versão AC034234.4, GI: 18390182 de 24 de março de 2009) ou como derivável de Wang et al., 2003, Cell Signal., 15(9): 883-91. Mais preferivelmente, o transportador pode compreender a sequência genômica de PDE4D, conforme definido na SEQ ID NO: 19.
[0392] Além disso, equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou de variantes de PDE4D, conforme definido anteriormente neste documento, podem ser compreendidos em um transportador da presente invenção.
[0393] O polinucleotídeo que codifica PDE4D ou variantes de PDE4D pode, de preferência, ser unido a um vetor contendo um marcador selecionável para a propagação em uma célula humana. Em uma modalidade preferencial, o inserto de polinucleotídeo pode ser operacionalmente ligado ao promotor de PSA.
[0394] Em uma modalidade da presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam e expressam PDE4D ou variantes de PDE4D, conforme definido aqui acima, podem ser fornecidos por agentes terapêuticos vivos. O termo “agente terapêutico ativo” significa que PDE4D ou uma variante de PDE4D ou equivalentes biologicamente ativos de PDE4D ou da variante de PDE4D, conforme definido anteriormente neste documento, são expressos em qualquer transportador vivo. Consequentemente, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos correspondentes que são adequados para expressão em uma célula viva. A presente invenção também se refere a vetores contendo esses polinucleotídeos, células hospedeiras adequadas, e a produção de polipeptídeos por técnicas recombinantes nas ditas células hospedeiras.
[0395] O termo “transportador vivo” refere-se a qualquer célula hospedeira viva adequada, ou vírus, conhecida da pessoa versada na técnica. Exemplos representativos de hospedeiros adequados incluem, mas não se limitam a, células bacterianas como Escherichia coli, ou Lactobacillus, células fúngicas, como células de levedura, protozoários, células de inseto, ou células de animais. De preferência, o termo refere-se a bactéria atenuada, células fúngicas atenuadas ou protozoários atenuados. Exemplos representativos de vírus adequados incluem vírus do grupo de adenovírus, retrovírus ou lentivírus, de preferência, vírus atenuados do grupo de adenovírus, retrovírus ou lentivírus. Em uma modalidade preferencial, células bacterianas probióticas, em particular células probióticas de Escherichia coli ou de Lactobacillus, podem ser usadas. Mais preferivelmente, células de Escherichia coli Nissle 1973 e mesmo com mais preferência, células de Lactobacillus casei ou Lactobacillus zeae 393 podem ser usadas.
[0396] O “inibidor de miRNA específico para miRNAs de PDE4D” compreendido na composição farmacêutica estimulatória, conforme anteriormente definido neste documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de ácido nucleico complementar a uma molécula de miRNA ou microTNA de PDE4D sem seletividade específica com uma variante de PDE4D.
[0397] O “inibidor de miRNA específico para miRNAs da variante de PDE4D” compreendido na composição farmacêutica estimulatória, conforme anteriormente definido neste documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de ácido nucleico complementar a uma molécula de miRNA ou microTNA de variante de PDE4D.
[0398] O termo “complementar” como aqui usado refere-se a um complementar perfeito entre o ácido nucleico inibidor de miRNA (molécula senso) e o miRNA (molécula antissenso) sem qualquer malpareamento, bem como a situações nas quais o ácido nucleico contém malpareamentos e/ou nucleotídeos adicionais ou faltando em comparação com a molécula de miRNA. Em outras modalidades, as duas moléculas compreendem um ou mais malpareamentos de base ou diferem em seus números totais de nucleotídeos (devido a adições ou deleções). Em modalidades adicionais, a molécula de ácido nucleico do inibidor de miRNA “complementar” compreende ao menos dez nucleotídeos contíguos que mostram complementaridade perfeita com uma sequência compreendida na molécula de miRNA.
[0399] Tipicamente, as moléculas de ácido nucleico do inibidor de miRNA são moléculas de DNA ou RNA de ocorrência natural ou moléculas de ácido nucleico sintéticas que compreendem em sua sequência um ou mais nucleotídeos modificados que podem ser do mesmo tipo ou de diferentes tipos.
[0400] É contemplado, por exemplo, pela presente invenção que tal molécula de ácido nucleico de inibidor de miRNA compreenda ao menos uma unidade de cadeia principal de ribonucleotídeo e ao menos uma unidade de cadeia principal de desoxirribonucleotídeo. Além disso, a molécula de ácido nucleico do inibidor de miRNA pode conter uma ou mais modificações da cadeia principal de RNA no grupo 2'-O-metil ou no grupo 2'-O-metoxietil (também chamado de 2'-O-metilação), que impediu a degradação por nuclease no meio de cultura e, de forma importante, também impediu a clivagem endonucleolítica pela nuclease presente no complexo de silenciamento induzido por RNA, levando a inibição irreversível do miRNA. Uma outra modificação possível, que é funcionalmente equivalente a 2'-O- metilação, envolve ácidos nucleicos travados (LNAs) que representam análogos de ácido nucleico contendo um ou mais monômeros de nucleotídeos LNA, como definido aqui acima.
[0401] Uma outra classe de silenciadores da expressão de miRNA para ser usada no contexto da presente invenção compreende oligonucleotídeos modificados quimicamente chamados “antagomirs”, que representam moléculas de RNA de fita única conjugadas a colesterol. As moléculas podem compreender entre 19 e 25 nucleotídeos. De preferência, a molécula compreende 20, 21, 22, 23, ou 24 nucleotídeos. Com mais preferência, a molécula compreende 23 nucleotídeos (mais detalhes podem ser derivados de Krutzfeldt et al., 2005, Nature, 438: 685-689).
[0402] Em uma outra modalidade da presente invenção, os inibidores de miRNA, conforme definido aqui acima, podem ser fornecidos sob a forma de vetores de expressão a serem introduzidos no tecido ou células. Alternativamente, tais vetores podem também ser introduzidos em agentes terapêuticos vivos conforme anteriormente definido neste documento.
[0403] Tipicamente, RNAs podem ser produzidos a partir de transgenes fornecidos sob a forma de vetores de expressão transientes ou de transfecção, ou transportadores. Por exemplo, inibidores competitivos de miRNA podem ser fornecidos como transcritos expressados a partir de fortes promotores, contendo mais de um, de preferência, múltiplos sítios de ligação tandem a um microRNA de interesse. Uma “esponja de microRNA” conforme descrito em Ebert et al., 2007, Nat. Methods, 4: 721-726 é um exemplo ilustrativo, não limitador desta técnica.
[0404] O “agente de desmetilação” compreendido na composição farmacêutica estimulatória, conforme anteriormente definido neste documento, refere-se a um agente capaz de desmetilar estruturas de cromatina, de preferência, regiões de promotor, com mais preferência, o promotores de PDE4D ou da variante de PDE4D. Exemplos de agentes de desmetilação a serem usados no contexto da presente invenção são 5-aza-2'- desoxicitidina e 5-azacitidina, os quais reativam genes inadequadamente silenciados por alterações estruturais da cromatina que envolvem metilação de DNA, e que podem reverter estas alterações e, portanto, restaurar rotas celulares principais. Isto tipicamente resulta na re-expressão de gene e reversão de alguns aspectos do estado transformado. A 5- azacitidina e a 5-aza-2'-desoxicitidina tipicamente inativam DNA-(citosina-C5)-metiltransferases através da formação de complexos estáveis entre os resíduos de 5-aza-2'- desoxicitidina em DNA e na enzima, assim imitando um estado de transição estável intermediário quando ligado à enzima metiltransferase.
[0405] Um outro agente, que pode estar compreendido em uma composição farmacêutica estimulatória de acordo com a presente invenção, seja por si só ou em combinação com 5-aza-2'-desoxicitidina e/ou 5-azacitidina, é tricostatina A (TSA).
[0406] O “fator de deslocamento de fosfodiesterase” compreendido na composição farmacêutica estimulatória, conforme anteriormente definido neste documento, refere-se a um composto que é capaz de perturbar ou romper a interação de fosfodiesterases, em particular PDE4D com ou sem seletividade com uma variante específica de PDE4D, com parceiro ou interagentes de interação. Tal processo pode, por fim, levar a uma associação de PDEs, em particular PDE4D com ou sem seletividade com uma variante específica de PDE4D, com diferentes parceiros de interação dos anteriores e, em consequência, com uma redistribuição de PDEs. Tais novos parceiros de interação podem sequestrar PDE, em particular PDE4D com ou sem seletividade com uma variante específica de PDE4D, e correspondentemente modificar comportamentos celulares, por exemplo, provocar influências na ligação a receptor ou outras atividades a jusante. Exemplos de parceiros de proteína que podem estar envolvidos em tal reação de deslocamento e/ou são capazes de sequestrar PDE, em particular PDE4D7, são proteínas de ancoramento como AKAPs, proteínas de arcabouço como DISC1, beta-arrestina ou RACK1, proteínas reguladoras como XAP2/AIP/ARA9, proteínas de ligação de cAMP como subunidades de PKA-R ou EPACs ou receptores como o beta1-adrenoceptor, assim como enzimas como ERK.
[0407] Fatores de deslocamento de fosfodiesterase preferidos são peptídeos, peptidomiméticos, moléculas pequenas, anticorpos, e aptâmeros.
[0408] Um “peptídeo” no contexto de um fator de deslocamento de fosfodiesterase refere-se a uma extensão (“stretch”) de aminoácidos presentes que representam molécula de fosfodiesterase, comum a várias variantes de PDE4D ou específicas para uma determinada variante de PDE4D, ou uma proteína de interação ou sequestro como definido aqui acima. A extensão de aminoácidos compreendida no peptídeo pode ter um comprimento de 5 a 100 aminoácidos, preferivelmente de 10 a 50 aminoácidos, mais de preferência de 20 a 30 aminoácidos. As extensões podem ser inteiramente idênticas à PDE ou proteína interagente ou a uma porção da mesma ou podem compreender variações de sequência. Por exemplo, a sequência de peptídeo pode compreender resíduos de aminoácido modificados em até 25%, de todas as posições, de preferência, modificações que não alteram as propriedades estruturais ou as propriedades de ligação da molécula. A sequência de aminoácidos presente no peptídeo pode alternativamente representar domínios espaciais da PDE ou proteína interagente e, correspondentemente, compreender uma justaposição de extensões de aminoácidos que são unidos na sequência primária das moléculas.
[0409] Um “peptidomimético” no contexto de um fator de deslocamento de fosfodiesterase refere-se a uma cadeia semelhante a uma proteína pequena projetada para imitar um peptídeo. Tal peptidomimético pode resultar de uma modificação de um peptídeo existente, por exemplo um peptídeo, conforme definido anteriormente neste documento, com a finalidade de alterar as propriedades da molécula. Um peptidomimético pode resultar de uma modificação que altera a estabilidade da molécula ou a capacidade de ligação. Essas modificações tipicamente envolvem alterações no peptídeo que não ocorrem naturalmente. Por exemplo, um peptidomimético de acordo com a presente invenção pode ter cadeias principais de peptídeo alteradas ou pode compreender aminoácidos não naturais. De preferência, um peptidomimético de acordo com a presente invenção pode representar uma molécula de fosfodiesterase, comum a várias variantes de PDE4D ou específicas para uma determinada variante de PDE4D, ou uma proteína de interação ou sequestro como definido aqui acima.
[0410] Em uma modalidade da presente invenção, um peptidomimético pode bloquear a interação entre PDE, de várias variantes de PDE4D ou, seletivamente, de uma variante específica de PDE4D, e seu interagente. Em uma outra modalidade da presente invenção, um peptidomimético pode acentuar a interação entre PDE, de várias variantes de PDE4D ou, seletivamente, de uma variante específica de PDE4D, e seu interagente.
[0411] Métodos e técnicas para a preparação de peptidomiméticos, bem como testes para o teste de peptidomiméticos são conhecidos do versado na técnica.
[0412] Uma “moléculas pequenas” no contexto de um fator de deslocamento de fosfodiesterase refere-se a um composto orgânico pequeno que é, de preferência, biologicamente ativo, isto é, uma biomolécula, mas não é, de preferência, um polímero. Esse composto orgânico pode ter qualquer forma ou uma propriedade química adequada. O composto pode ser um composto natural, por exemplo, um metabólito secundário, ou um composto artificial, que foi projetado e criado um novo. Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula pequena é capaz de bloquear a interação entre PDE, seja de várias variantes de PDE4D ou, seletivamente, de uma variante específica de PDE4D, e seu interagente. Em uma outra modalidade da presente invenção uma molécula pequena pode melhorar a interação entre PDE, em particular PDE4D7, e seu interagente. Métodos e técnicas para a identificação e a preparação de moléculas pequenas, bem como testes para o teste de moléculas pequenas são conhecidos do versado na técnica.
[0413] Um “anticorpo” ou um “aptâmero” no contexto de um fator de deslocamento de fosfodiesterase refere-se a um anticorpo específico de PDE4D, específico a várias variantes de PDE4D ou seletivamente para uma variante específica de PDE4D, ou variante ou fragmento de anticorpo, conforme definido aqui acima, ou a um aptâmero específico de PDE4D7, específico a várias variantes de PDE4D ou seletivamente para uma variante específica de PDE4D, conforme definido aqui acima, que tem a capacidade de perturbar ou romper a interação entre PDE, de várias variantes de PDE4D ou seletivamente de uma variante específica de PDE4D, e um ou mais de seus interagentes. Alternativamente, o termo pode também se referir à ligação de anticorpos ou aptâmeros com qualquer um ou mais dos interagentes da PDE4D/variante da PDE4D, conforme descrito na presente invenção acima, tendo também a capacidade de perturbar ou romper a interação entre PDE, de várias variantes de PDE4D ou seletivamente de uma variante específica da PDE4D, e um ou mais de seus interagentes. Métodos para a produção ou teste de anticorpos ou aptâmeros foram anteriormente descritos neste documento, e/ou são conhecidos da pessoa versada na técnica.
[0414] Um aspecto adicionado da invenção refere-se a um produto de programa de computador, que compreende código legível por computador armazenado em uma mídia legível por computador ou transferível por download de uma rede de comunicação que, quando executado em um computador, implementa uma ou mais etapas ou todas as etapas de qualquer um dos métodos conforme aqui definido.
[0415] Pode ser usada qualquer combinação de uma ou mais mídias legíveis por computador. A mídia legível por computador pode ser uma mídia de sinal legível por computador ou uma mídia de armazenamento legível por computador. Uma mídia de armazenamento legível por computador pode, por exemplo, ser mas não se limitar a, um sistema, aparelho ou dispositivo eletrônico, magnético, óptico, eletromagnético, infravermelho ou semicondutor, ou qualquer combinação adequada dos anteriormente mencionados. Exemplos mais específicos (uma lista não exaustiva) da mídia de armazenamento legível por computar incluiria o seguinte: uma conexão elétrica tendo um ou mais fios, um disquete de computador portátil, um disco rígido, uma memória de acesso aleatório (RAM, random access memory), uma memória só de leitura (ROM, read-only memory), uma memória só de leitura programável e apagável (EPROM, erasable programmable read-only memory, ou memória Flash), uma fibra óptica, uma memória só de leitura de disco compacto portátil (CD-ROM), um dispositivo de armazenamento óptico, um dispositivo de armazenamento magnético ou qualquer combinação adequada dos anteriormente mencionados. No contexto deste documento, uma mídia de armazenamento legível por computador pode ser qualquer mídia tangível que possa conter ou armazenar um programa para uso por meio de, ou em conjunto com, um sistema, aparelho ou dispositivo de execução de instruções.
[0416] Uma mídia de sinal legível por computador pode incluir um sinal de dados propagado com código de programa legível por computador incorporado ao mesmo, por exemplo, em banda base ou como parte de uma onda portadora. Tal sinal propagado pode assumir qualquer uma dentre uma variedade de formas, incluindo, mas não se limitando a, uma forma eletromagnética, óptica ou qualquer combinação adequada das mesmas. Uma mídia de sinal legível por computador pode ser qualquer mídia legível por computador que não seja uma mídia de armazenamento legível por computador, e que possa comunicar, propagar ou transportar um programa para uso por ou em conexão com um dispositivo, aparelho ou sistema de execução de instruções.
[0417] O código de programa incorporado em uma mídia legível por computador pode ser transmitido com o uso de qualquer meio adequado incluindo, mas não se limitando a, rede sem fio, rede com fio, cabo de fibra óptica, RF, etc. ou qualquer combinação adequada dos meios anteriormente mencionados.
[0418] O código do programa de computador que executa operações relacionadas aspectos da presente invenção pode ser escrito em qualquer combinação de uma ou mais linguagens de programação, incluindo uma linguagem de programação orientada para objetos, como Java, Smalltalk, C++ ou similares, e linguagens de programação procedural convencionais, como a linguagem de programação “C” ou linguagens de programação similares. O código do programa de computador pode ser executado integralmente no computador do usuário, parcialmente no computador do usuário, como um pacote de software autônomo, parcialmente no computador do usuário e parcialmente em um computador remoto, ou integralmente no computador remoto ou servidor. Finalmente, o computador remoto pode ser conectado ao computador do usuário através de qualquer tipo de rede, incluindo uma rede de área local (LAN) ou uma rede de área ampla (WAN), ou a conexão pode ser feita até um computador externo (por exemplo, através da Internet com o uso de um Provedor de Serviço de Internet).
[0419] Essas instruções de programa de computador podem também ser armazenadas em uma mídia legível por computador que pode guiar um computador, outro aparelho de processamento de dados programável, ou outros dispositivos a funcionar de uma forma específica, de modo que as instruções armazenadas na mídia legível por computador produzem um artigo de fabricação que inclui instruções que implementam a função/ação especificada no presente documento.
[0420] As instruções de programa de computador também podem ser carregadas em um computador, outro aparelho de processamento de dados programável, ou outros dispositivos para conduzir à execução de uma série de etapas operacionais no computador, outro aparelho programável, ou outros dispositivos para produzir um processo implementado por computador, de modo que as instruções executadas no computador ou outro aparelho programável fornecem processos para implementar as funções/ações especificadas no presente documento.
Exemplos Seleção de genes para construção do índice de PDE de câncer de próstata (índice PDE):
[0421] Para selecionar genes candidatos para a construção do índice PDE, vários transcritos da PDE4D (das nove isoformas de PDE atualmente anotadas, PDE4D1 a PDE4D9) foram investigados para correlação do marcador prognóstico de gene putativo PDE4D7 conforme descrito em WO2010131194 e WO2010131195. Para construir o índice PDE de câncer de próstata, os seguintes conjuntos de dados foram usados: 1) Taylor BS et al. Integrative Genomic Profiling of Human Prostate Cancer. Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (cojj unto de dados GEO ID: GSE21032) 2) Boormans JL et al. Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer. Int J Cancer, 15 de julho de 2013; 133(2) :335-45 (co junto de dados do GEO ID: GSE41408) 3) Brase JC et al; TMPRSS2-ERG -specific transcriptional modulation is associated with prostate cancer biomarkers and TGF-b signaling. BMC Cancer 2011, 11, 507-515 (cojjunto de dados do GEO ID: GSE29079) Para adicionalmente testar e validar o índice PDE de câncer de próstata construído, o seguinte conjunto de dados foi usado: 1) Erho N et al. Discovery and Validation of a Prostate Cancer Genomic Classifier that Predicts Early Metastasis Following Radical Prostatectomy. PLoS One 8(6), e66855 (2013) (conjunto de dados do GEO ID: GSE46691)
Processamento de dados de expressão gênica de GSE
[0422] Os respectivos arquivos CEL foram baixados do GEO (Gene Expression Omnibus) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Os dados do arquivo CEL dados foram carregados no Expression Console (Affymetrix Inc; Build 1.3.1.187) e foram pré-processados usando-se os arquivos de conjunto de sondas adequados fornecidos pela Affymetrix Inc, quando adequado, isto é, conjuntos de dados executados em uma plataforma Affymetrix Inc: GSE21032, GSE41408, GSE25136.
[0423] Os valores de expressão das isoformas de PDE4D individuais, PDE4D1 a PDE4D9, foram estimados usando-se os valores de sinal do arranjo de éxons dos conjuntos de sondas do arranjo Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array conforme mostrado na Figura 1. NOTA: durante a interrogação da expressão das isoformas muito semelhantes, PDE4D1 e PDE4D2, apenas um único conjunto de sonda foi usado e a atividade correspondente foi reportada para ambos as isoformas juntos (PDE4D1&2). Para todos os outros transcritos de PDE4D, vários conjuntos de sondas foram usados para calcular a expressão da respectiva isoforma que é relatada como a média dos diferentes conjuntos de sondas medidos para uma única variante de PDE4D.
Procedimento de normalização de dados de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
[0424] Supõe-se que genes de referência tenham uma expressão estável independentemente da amostra sendo processada e podem, portanto, ser usados como um padrão interno para normalizar os valores de saída Cq de uma análise de PCR de modo que os resultados sejam comparáveis, independentemente da quantidade da amostra de entrada usada. Embora esses genes sejam supostamente estáveis, sempre há certa variabilidade em sua expressão, e essa estabilidade pode também depender do tecido que está sendo analisado. Por essa razão, é recomendado o uso de mais de um gene de referência na normalização de valores de Cq de PCR e o uso de um conjunto de genes que apresenta baixa variabilidade no tipo específico de tecido/amostra sendo analisada (C. L. Andersen, J. L. Jensen, and T. F. 0rntoft, “Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets,” Cancer Res., volume 64, no. 15, pp. 5245-5250, agosto de 2004, J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, and F. Speleman, “Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes,” Genome Biol., vol. 3, no. 7, p. RESEARCH0034, junho de 2002).
[0425] Foi feita uma seleção inicial de 9 genes de referência para ser usada neste estudo. A seleção final do conjunto de genes de referência usado para a normalização foi feita operando-se a ferramenta do software Biogazelle (qBase+ with GeNorm analysis J. Hellemans, G. Mortier, A. D. Paepe, F. Speleman, and J. Vandesompele, “qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data,” Genome Biol., vol. 8, no. 2, p. R19, fevereiro de 2007) em todas as amostras clínicas analisadas.
[0426] Os valores Cq de saída de um ensaio de PCR são intrinsecamente logarítmicos (base 2), e inversamente proporcionais à quantidade de mRNA presente na amostra. Usa-se a seguinte fórmula para normalizar os valores de Cq brutos: N(Cqgene de interesse) = Média(Cqgene de ref) - (Cqgene de interesse)
[0427] Em que N(Cqgene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para um gene de interesse; em que Média(Cqgene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR da combinação selecionada dos genes de referência; em que (Cqgene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[0428] No caso de outras tecnologias além de qRT-PCR serem usadas para medir a expressão dos genes de referência ou dos genes de interesse, o valor de Cq de PCR será substituído por uma medição normalizada do valor de expressão gênica normalizada da respectiva tecnologia (por exemplo, uma RMA (Robust Multi-array Average) para microarranjos de DNA ou um valor de expressão gênica normalizada de FPKM (Fragements Per Kilobase of Exon Per Million Fragments Mapped, fragmentos por quilobase de éxon por milhão fragmentos mapeados) para sequenciamento de RNA).
[0429] Os níveis de expressão normalizados dos transcritos de PDE4D nos diferentes tecidos de câncer de próstata dos dois conjuntos de dados Taylor et al., Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)) e Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer, Int J Cancer, 15 de julho de 2013; 133(2):335-45 (GSE41410 (NCBI GEO)) são mostrados nas Figuras 10 a 13. A expressão dos transcritos foi normalizada para os seguintes genes de referência: HPRT1, PUM1, TBP e TUBA1B. Os dados usados são com base nos dados de expressão do arranjo de éxons publicamente disponíveis, isto é, para cada gene uma faixa de conjuntos de sondas para éxons direcionados a vários éxons do respectivo gene mede a expressão dos diferentes éxons conforme descrito acima. Na primeira etapa, a expressão de log2 de todos os conjuntos de sondas para os genes de referência é usada para calcular uma média de expressão dos genes de referência. O mesmo é feito para os diferentes conjuntos de sondas individuais que direcionam os transcritos de 4D individuais. Em seguida, a média dos genes de referência é subtraída da média da expressão de transcritos de 4D. O resultado é a expressão normalizada de transcritos de PDE4D. Como pode ser visto, os diferentes transcritos de 4D são regulados de uma maneira específica ao isoforma através dos diferentes tecidos (variando de próstata normal, de câncer de próstata primária com diferentes potenciais para progredir após o tratamento primário (BCR = recorrência bioquímica; CR=recorrência clínica a metástases) até tecido metastático (hormônio-naive, isto é, antes de qualquer terapia antiandrogênica; e hormônio-resistente, isto é, após terapia antiandrogênica). Por exemplo, PDE4D3 e PDE4D6 não são altamente expressos em comparação com outros transcritos de 4D; PDE4D4 não é de fato alterado nos tecidos; PDE4D5 e PDE4D9 são regulados negativamente de tecidos normais a tecidos resistentes a hormônio, enquanto PDE4D7 é super- expresso em câncer de próstata primário e se torna então novamente mais regulado negativamente em outros tecidos.
Computação de índice PDE (com base nos dados de PCR quantitativa em tempo real)
[0430] i) Índice-PDE_1: PDE4D7_exp — PDE4D5_exp,
[0431] em que
[0432] PDE4D7_exp é (N(CqPDE4D7)), e PDE4D5_exp é (N(CqPDE4D5))
[0433] ii) Índice-PDE_ 2: MEAN(PDE4D7_exp & PDE4D5_exp),
[0434] em que
[0435] PDE4D7_exp é (N(CqPDE4D7)), e PDE4D5_exp é (N(CqPDE4D5))
[0436] iii) Índice-PDE_3: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)) / (PDE4D4_exp)
[0437] em que
[0438] PDE4D5_exp é (N(CqPDE4D5)), PDE4D7_exp é (N(CqPDE4D7)), PDE4D9_exp é (N(CqPDE4D9)), e PDE4D4_exp é (N(CqPDE4D4)
[0439] e onde
[0440] (Média (PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) é a média aritmética de PDE4D5_exp, PDE4D7_exp, e PDE4D9_exp
[0441] iv) Índice-PDE_4: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)) / (PDE4D1 e PDE4D2_exp)
[0442] em que
[0443] PDE4D5_exp é (N(CqPDE4D5)), PDE4D7_exp é (N(CqPDE4D7)), PDE4D9_exp é (N(CqPDE4D9)), e PDE4D1&PDE4D2_exp é (N(CqPDE4D1_2))
[0444] e onde
[0445] (Média (PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) é a média aritmética de PDE4D5_exp, PDE4D7_exp, e PDE4D9_exp
[0446] v) Índice-PDE_5: (MEAN(PDE5_exp & PDE7_exp&PDE4D9_exp))
[0447] em que
[0448] PDE4D5_exp é (N(CqPDE4D5)), PDE4D7_exp é (N(CqPDE4D7)), e PDE4D9_exp é (N(CqPDE4D9))
[0449] e onde
[0450] (Média (PDE4D5_exp & PDE4D7_exp & PDE4D9_exp)) é a média aritmética de PDE4D5_exp, PDE4D7_exp, e PDE4D9_exp
[0451] Os índices PDE calculados foram usados para análise adicional de dados estatísticos.
Análise de correlação do índice PDE em relação aos parâmetros clínicos com os resultados de paciente
[0452] Todas as análises estatísticas (por exemplo, análise de regressão logística, análise ROC, análise de regressão de COX, etc.) do índice PDE e sua correlação com o resultado do paciente em comparação com os parâmetros clínicos como PSA, pGleason, estágio de pT foram realizadas com XLSTAT versão 2014.1.03
Resultados
[0453] A Figura 3 mostra uma visão geral da expressão diferencial normalizada das isoformas individuais de PDE4D, bem como as quatro variantes dos índices PDE para comparações de diferentes grupos de pacientes em dois conjuntos de dados de expressão gênica. As comparações em pares dos pacientes foram analisadas da seguinte forma: i) NAT vs CaP primário, NP ii) CaP primário, NP vs. CaP primário, BCR&CR iii) CaP primário, NP&BCR vs. CaP primário, CR iv) CaP primário (todos) vs. Metástases v) CaP primário (todos) vs. CRPC
[0454] Sendo que,
[0455] - NAT é o tecido normal adjacente, isto é, o tecido coletado próximo de uma lesão de tumor de material de paciente mas sem câncer na histologia
[0456] - CaP primário, NP é o tecido de tumor primário coletado de paciente que não apresentou progressão de tumor durante acompanhamento clínico
[0457] - CaP primária, BCR&CR é tecido de tumor primário coletado de paciente que não apresentou progressão de tumor durante acompanhamento clínico a primeiro recorrência bioquímica e subsequentemente clínica
[0458] - CaP primário, NP&BCR é o tecido de tumor primário coletado de paciente que não apresentou progressão de tumor durante acompanhamento clínico ou demonstrou primeiro recorrência bioquímica
[0459] - CaP primário, CR é o tecido de tumor primário coletado de paciente que não apresentou progressão de tumor durante acompanhamento clínico a recorrência clínica
[0460] - Metástases É Tecido De Tumor Metastático Coletado De Um Paciente Virgem (“naive”) Ao Hormônio
[0461] - CRPC é tecido coletado de um paciente com doença resistente à castração
[0462] Como pode ser visto a partir dos dados, os vários índices PDE podem ser usados para diferentes aplicações no diagnóstico de câncer de próstata e/ou no prognóstico de progressão de câncer de próstata. A variante
[0463] Variante_1 do índice PDE: PDE4D7_Expression - PDE4D5_Expression
[0464] é mais útil para discriminar entre tecido normal adjacente (NAT) e tecido canceroso primário da próstata com poder muito alto de discriminação (consulte a Figura 3). O cálculo desse índice em vários outros conjuntos de dados para discriminação entre NAT e câncer de próstata primário comparado às outras variantes do índice PDE (consulte a Figura 4) confirma que a Variante_1 do índice PDE fornece um forte poder de discriminação. A abreviação “BL” indica lesões benignas e “H” indica hiperplasia benigna da próstata.
[0465] A Figura 5 fornece uma visão geral de um total de oito conjuntos de dados de câncer de próstata, que compreendem, no total, amostras de mais de 900 pacientes dentre as categorias de tecido adjacente normal (NAT), lesões benignas, hiperplasia benigna, bem como tecido tumoral. Todas as comparações de pares entre diferentes categorias de tecido demonstram um pode muito alto de discriminação entre os grupos de tecido como uso da Variante_1 do índice PDE.
[0466] Conforme pode ser adicionalmente visto a partir da Figura 3, as variantes do índice PDE, índice PDE_2, índice PDE_3 e índice PDE_4, são correlacionadas a doença mais agressiva.
[0467] Índice PDE_2 (Variante_2 do índice PDE):
[0468] MEAN(PDE4D7_exp e PDE4D5_exp)
[0469] Índice PDE_3 (Variante_3 do índice PDE):
[0470] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)) / (PDE4D4_exp)
[0471] Índice PDE_4 (Variante_4 do índice PDE):
[0472] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)) / (PDE4D1 e PDE4D2_exp)
[0473] Índice PDE_5 (Variante_5 do índice PDE):
[0474] (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp))
[0475] Sendo que o termo “PDE4D4_exp” denota o nível de expressão de PDE4D4, o termo “PDE4D5_exp” denota o nível de expressão de PDE4D5, o termo “PDE4D7_exp” denota o nível de expressão de PDE4D7 e o termo “PDE4D9_exp” denota o nível de expressão de PDE4D9. O termo “PDE4D1&PDE4D2_exp” denota os níveis de expressão de PDE4D1 e PDE4D2, detectados juntos por um único ensaio.
[0476] As comparações em pares dos seguintes grupos de pacientes fornecem, em geral, significativa diferença de expressão (consulte a Figura 3) diferença: vi) CaP primário, NP vs. CaP primário, BCR&CR vii) CaP primário, NP&BCR vs. CaP primário, CR viii) CaP primário (todos) vs. Metástases ix) CaP primário (todos) vs. CRPC
[0477] Isto é adicionalmente suportado por uma análise ROC conforme descrito para os índices PDE 2 a 4 na Figura 6. A AUC (área sob a curva) da análise ROC análise para as comparações em pares acima demonstram um poder de discriminação positivo. Este dado ilustra o poder prognóstico das combinações de vários transcritos de PDE4D para predizer câncer de próstata progressivo.
[0478] Nós também testamos os vários índices PDE para a expressão diferencial entre tumores negativos para TMPRSS2-ERG e positivos para TMRSS2-ERG em comparação com o tecido normal adjacente tumores (NAT, negativo a TMRPSS2-ERG). Os resultados são mostrados na Tabela 7. É interessante notar que observamos uma forte correlação entre a presença da fusão gênica TMPRSS2-ERG positiva e a expressão da isoforma PDE4D7, enquanto a expressão de outros transcritos de PDE4D (em particular PDE4D1&2, PDE4D5, e PDE4D9) é mais correlacionada à ausência da fusão gênica TMPRSS2-ERG. Este efeito é muito forte para PDE4D5. Esta observação, isto é, a correlação da expressão positiva da presença de PDE4D7 da fusão gênica TMPRSS2-ERG e correlação positiva da expressão de de PDE4D5 com a ausência da fusão gênica TMPRSS2-ERG, com a qual é confirmada em quatro conjuntos de dados de câncer de próstata independentes (Figura 7) fornece uma fundamentação sólida para a combinação de PDE4D5 e PDE4D7 na Variante_1 do índice PDE para representar um forte discriminador entre tecido de próstata com câncer e sem câncer (consulte também a Figura 5).
[0479] Analisamos adicionalmente a correlação das variantes do índice PDE ao escore de Gleason da patologia em um conjunto de dados de câncer de próstata. A análise foi realizada de acordo com o estado da fusão gênica TMPRSS2-ERG específica a câncer de próstata (Tomlins S. et al, Nature, 2005). Esse é um rearranjo genômico entre a serino-protease regulada por andrógeno TMPRSS2 e o fator de transcrição ERG2 que é membro da família de fatores de transcrição ETS. Conforme esquematizado na Figura 8, há uma associação positiva significativa com os índices PDE 2 a 4 e a presença da fusão TMPRSS2-ERG.
[0480] A Figura 9 representa uma visão geral do valor adicionado dos índices PDE juntamente com os dados clínicos na sobrevida livre de progressão (bioquímica e clínica) dependendo do estado da fusão TMPRSS2-ERG do tumor. O valor adicionado é visto no aumento de AUC na análise ROC a partir do modelo clínico sozinho (pGleason & estágio de pT) em comparação com um modelo de combinação de índice PDE, pGleason e estágio pT. É de se observar que um aumento significativo em AUC pode apenas ser detectado para as variantes do índice PDR investigadas em caso da presença da fusão TMPRSS2-ERG para ambos os “endpoints” (pontos de medição) testados, isto é, sobrevida livre de progressão bioquímica bem como sobrevida livre de progressão clínica.

Claims (5)

1. MÉTODO IMPLEMENTADO POR COMPUTADOR, caracterizado por compreender a etapa de: i) determinar um estado de progressão do câncer de próstata com base em um perfil de expressão gênica incluindo o nível de expressão de pelo menos duas variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9, em que nenhuma das variantes de PDE4D serve como uma referência gênica, e em que o perfil de expressão gênica é convertido em pelo menos um índice PDE de câncer de próstata (Índice-PDE) indicativo do estado de progressão do câncer de próstata, e em que pelo menos um índice PDE é selecionado a partir do seguinte: ii) Índice-PDE_1: PDE4D7_exp-PDE4D5_exp iii) Índice-PDE_ 2: MEAN(PDE4D7_exp e PDE4D5_exp) iv) ) Índice-PDE_3: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp) v) ) Índice-PDE_ 4: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp))/(PDE4D1&PDE4D2_exp) vi) Índice-PDE_5: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)).
2. MÉTODO, caracterizado por compreender a etapa de: a) determinar um estado de progressão do câncer de próstata com base em um perfil de expressão gênica incluindo o nível de expressão de pelo menos duas variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 e PDE4D9, em que nenhuma das variantes de PDE4D serve como uma referência gênica, e em que o perfil de expressão gênica é convertido em pelo menos um índice PDE de câncer de próstata (Índice-PDE) indicativo do estado de progressão do câncer de próstata, e em que pelo menos um Índice PDE é selecionado a partir do seguinte: i) Índice-PDE_1: PDE4D7_exp-PDE4D5_exp ii) Índice-PDE_ 2: MEAN(PDE4D7_exp e PDE4D5_exp) iii) Índice-PDE_3: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp) iv) Índice-PDE_ 4: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp))/(PDE4D1 e PDE4D2_exp) v) Índice-PDE_5: (MEAN(PDE4D5_exp e PDE4D7_exp e PDE4D9_exp)), em que antes da etapa (a) o nível de expressão de pelo menos duas variantes de fosfodiesterase 4D (PDE4D) selecionadas do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7, PDE4D9 em uma amostra é determinado para obter um perfil de expressão gênica, o método compreendendo opcionalmente a etapa de determinar o nível de expressão de pelo menos uma referência gênica em uma amostra.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo perfil de expressão gênica ser um perfil de expressão gênica normalizado que é obtido pela normalização do nível de expressão das variantes da PDE4D para a expressão de pelo menos um gene de referência.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por: ser um método para monitorar ou prognosticar o câncer de próstata ou o estado de progressão do câncer de próstata; ou ser um método para identificar um indivíduo para elegibilidade para uma terapia de câncer de próstata, compreendendo ainda a identificação de um indivíduo como elegível para receber uma terapia de câncer de próstata, onde o Índice-PDE do indivíduo indica a presença de câncer de próstata ou em que o Índice-PDE do indivíduo indica um estado de progressão do câncer de próstata não progressivo ou progressivo.
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA INIBIDORA, caracterizada por compreender pelo menos um elemento selecionado do grupo que consiste em:e) um miRNA específico para uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9; f) uma molécula antissenso para uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9; g) um siRNA específico para uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9; h) um aptâmero específico para o produto de expressão de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9 ou para a proteína de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9; i) uma molécula pequena ou peptidomimético capaz de se ligar especificamente à proteína de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9; e j) um anticorpo específico para a proteína de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9 e/ou uma variante de anticorpo específica para a proteína de uma variante da PDE4D selecionada do grupo que consiste em PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 e PDE4D9, sendo que a variante da PDE4D, de preferência, é selecionada do grupo que consiste em PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
BR112017025255-4A 2015-05-29 2016-05-26 Método implementado por computador, método e composição farmacêutica inibidora BR112017025255B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15169788 2015-05-29
EP15169788.5 2015-05-29
PCT/EP2016/061886 WO2016193110A1 (en) 2015-05-29 2016-05-26 Methods of prostate cancer prognosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112017025255A2 BR112017025255A2 (pt) 2018-08-07
BR112017025255B1 true BR112017025255B1 (pt) 2024-02-27

Family

ID=53298161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112017025255-4A BR112017025255B1 (pt) 2015-05-29 2016-05-26 Método implementado por computador, método e composição farmacêutica inibidora

Country Status (10)

Country Link
US (2) US11827938B2 (pt)
EP (1) EP3303616B1 (pt)
JP (1) JP6745820B2 (pt)
KR (1) KR20180082328A (pt)
CN (1) CN108738329A (pt)
BR (1) BR112017025255B1 (pt)
DK (1) DK3303616T3 (pt)
ES (1) ES2861316T3 (pt)
RU (1) RU2760577C2 (pt)
WO (1) WO2016193110A1 (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3502280A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 Koninklijke Philips N.V. Pre-surgical risk stratification based on pde4d7 expression and pre-surgical clinical variables
EP3546598A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-02 Koninklijke Philips N.V. Post-surgical risk stratification based on pde4d variant expression, selected according to tmprss2-erg fusion status, and post-surgical clinical variables
EP3880256A4 (en) * 2018-11-14 2022-08-03 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University TARGETING MAKAPP-PDE4D3 COMPLEXES IN NEURODEGENERATIVE DISEASES
GB202406403D0 (en) * 2019-05-08 2024-06-19 Oxford BioDynamics PLC Chromosome Conformation Markers of Prostate Cancer and Lymphoma
EP3885453A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-29 Koninklijke Philips N.V. Prediction of radiotherapy response for prostate cancer subject based on dna repair genes
TR202007444A1 (tr) * 2020-05-13 2021-11-22 Aselsan Elektronik Sanayi Ve Tic A S Hem manyeti̇k parçacik görüntüleme hem de manyeti̇k rezonans görüntüleme gerçekleşti̇ri̇lmesi̇ne i̇mkan sunan bi̇r terti̇bat ve bu terti̇bati i̇çeren bi̇r ci̇haz
US20220148169A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Verily Life Sciences Llc Artificial intelligence prediction of prostate cancer outcomes
WO2023129947A2 (en) * 2021-12-29 2023-07-06 Salk Institute For Biological Studies Methods of lowering blood glucose and treating type 2 diabetes by activation of pde4d3

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6794141B2 (en) 2000-12-22 2004-09-21 Arcturus Bioscience, Inc. Nucleic acid amplification
US20050164220A1 (en) 2001-03-19 2005-07-28 Decode Genetics Ehf. Susceptibility gene for human stroke: method of treatment
WO2004028341A2 (en) * 2001-03-19 2004-04-08 Decode Genetics Ehf. Susceptibility gene for human stroke; methods of treatment
US20030220273A1 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phosphodiesterase 4D expression
EP1471153A3 (en) 2003-03-21 2005-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay
CN100372944C (zh) 2003-04-10 2008-03-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Pde4d在筛选治疗动脉粥样硬化的药物中的用途
DE602006018513D1 (de) 2005-10-25 2011-01-05 Roche Diagnostics Gmbh Assoziation von pde4d-allelvarianten mit schlaganfall
GB0625321D0 (en) * 2006-12-19 2007-01-24 Univ Surrey Cancer biomarker
WO2010059838A2 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Decode Genetics Ehf Pde4 inhibitors selective for the long form of pde4 for treating inflammation and avoiding side effects
JP6148007B2 (ja) 2009-05-12 2017-06-14 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 前立腺癌マーカーとしてのホスホジエステラーゼ４ｄ７
CN102439176B (zh) * 2009-05-12 2018-11-23 皇家飞利浦电子股份有限公司 用作恶性的、激素-敏感的前列腺癌的标志物的磷酸二酯酶4d7
BRPI1007620A2 (pt) 2009-05-12 2016-02-23 Koninkl Philips Electronics Nv fosfodoestera 9a,composição metodo,metodo de aquisição de dados e imunoesnsaio para diagnostico, detecção, monitoramento ou prognostico do cancer de proposta, ou para diagnostico,detecção monitoramento ou prognostico da progressao do cancer de prostata.
WO2012030840A2 (en) * 2010-08-30 2012-03-08 Myriad Genetics, Inc. Gene signatures for cancer diagnosis and prognosis
MX351626B (es) * 2012-01-31 2017-10-23 Genomic Health Inc Algoritmo de perfil de expresion genica y prueba para determinar la prognosis de cancer de prostata.
CN102603676B (zh) 2012-02-20 2014-02-12 徐江平 一种能避免呕吐反应的磷酸二酯酶4抑制剂

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017025255A2 (pt) 2018-08-07
CN108738329A (zh) 2018-11-02
EP3303616B1 (en) 2021-01-06
KR20180082328A (ko) 2018-07-18
US11827938B2 (en) 2023-11-28
JP6745820B2 (ja) 2020-08-26
DK3303616T3 (da) 2021-03-01
RU2017146409A3 (pt) 2020-03-27
US20180148795A1 (en) 2018-05-31
ES2861316T3 (es) 2021-10-06
WO2016193110A1 (en) 2016-12-08
US20170073778A1 (en) 2017-03-16
RU2017146409A (ru) 2019-07-02
EP3303616A1 (en) 2018-04-11
RU2760577C2 (ru) 2021-11-29
JP2018521637A (ja) 2018-08-09
US11198909B2 (en) 2021-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11827938B2 (en) Methods of prostate cancer prognosis
ES2754434T3 (es) Métodos de pronóstico de cáncer de próstata
JP6430560B2 (ja) 前立腺癌マーカーとしてのホスホジエステラーゼ４ｄ７
US9926603B2 (en) Micro-RNA biomarkers and methods of using same
KR20120065959A (ko) 위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법
KR102029775B1 (ko) 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
US20140005058A1 (en) Methods and materials for the diagnosis of prostate cancers
CN116113712A (zh) 用于癌症的预后生物标志物
EP3548631B1 (en) Risk scores based on human phosphodiesterase 4d variant 7 expression
JP6638128B2 (ja) 腎がんの悪性度の検査マーカー及び検査方法
US8741575B2 (en) Methods of predicting high grade gliomas using senescence associated genes
US20210355543A1 (en) Pre-surgical risk stratification based on pde4d7 and dhx9 expression
CA3221494A1 (en) Cancer detection method, kit, and system
WO2020174478A1 (en) Diagnosis and treatment of medulloblastoma
US20120245044A1 (en) Methods of determining chemotherapy response in cancer

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 26/05/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS