ES2403781B1

ES2403781B1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas, y para evaluar la respuesta al tratamiento.

Info

Publication number: ES2403781B1
Application number: ES201031629A
Authority: ES
Inventors: Trinidad VILLEGAS; Carmen OLMEDO; Karim MUFFAK-GRANERO; Ana COMINO; Antonio BECERRA; Daniel GARROTE; Pablo BUENO; José Antonio FERRÓN; Carlos CANO; Armando BLANCO
Original assignee: Universidad de Granada; Servicio Andaluz de Salud
Current assignee: Universidad de Granada; Servicio Andaluz de Salud
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2014-06-06
Anticipated expiration: 2030-11-05
Also published as: ES2403781A1; WO2012059617A1

Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas, y para evaluar la respuesta al tratamiento.#Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz. Kit que comprende los medios necesarios para llevar a cabo el método de la invención.

Description

MÉTODO DE OBTENCiÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE PÁNCREAS. Y PARA EVALUAR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali-y

cuantitativo): especifico, que es diferente dependiendo del estado de la

enfermedad: y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el

establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El cáncer de páncreas se encuentra entre las cinco primeras causas de muerte por cáncer en el mundo desarrollado con una tasa de supervivencia del 19% a 1 año. Un 95% de tumores malignos del páncreas son adenocarcinoma ductal infiltrante. En la mayoría de los casos se diagnostica en un estado muy avanzado e incluso pacientes con tumores resecables localizados, presentan metástasis. Los tumores que rodean o comprimen estructuras arteriales grandes como las ramas del tronco celíaco o la arteria mesentérica superior son considerados irresecables. La intervención quirúrgica permanece como el tratamiento central, si bien hay que complementarla con otras opciones para aumentar el tiempo de supervivencia. En este sentido, el tratamiento quimioterápico y de radiación se utilizan bien en combinación con la intervención quirúrgica, o bien como tratamiento definitivo en los casos de tumores avanzados, no resecables (Yeo et al. Cancer of the Pancreas. Cancer : principies and practice of oncology. Vincent T. DeVita, Jr., Samuel Heliman, Steven A. Rosenberg;7th Edition 2005). Así, en enfermedad avanzada, la administración de gemcitabina es el agente estándar, combinándola con citostáticos para mejorar la respuesta.

El conocimiento a nivel molecular, de las rutas de señalización que intervienen

en la transformación celular ha permitido el desarrollo de tratamientos nuevos

contra el cáncer. La desregulación de la señalización a través del receptor del

factor de crecimiento epidérmico EGFR está implicada en el proceso de

carcinogénesis. Diversos tipos de cáncer tienden a expresar altos niveles de EGFR y su activación inicia una cascada de señalización cuyos componentes son nuevas dianas potenciales para el tratamiento del cáncer. Moléculas como

erlotinib, inhibidor de tirosin-quinasa a nivel intracelular, actúa impidiendo la autofosforilación del receptor de EGFR y posterior transducción de la señal.

Los inhibidores de EGFR parecen mostrar máxima actividad en pacientes de cáncer de pulmón con mutaciones activado ras en el dominio citoplásmico. Esto sugiere que los pacientes en los cuales los tumores presenten determinadas

mutaciones de este receptor, se beneficiarían de un resultado clínico mejor. Este hecho indicaría que el estudio de la presencia de estas mutaciones en los

pacientes se podría utilizar como pauta de aplicación de la terapia para aquellos que respondieran mejor a inhibidores de EGFR (3-5). Sin embargo, esto no es totalmente cierto, ya que no todos los pacientes con mutaciones detectadas responden al tratamiento, mientras que pacientes sin dichas mutaciones son respondedores. Además de EG FR, otras moléculas parecen

tener un papel en la aparición y progresión del cáncer. Así la activación del oncogen K-ras junto con la inactivación de genes supresores tumorales (p53,

DPC4, p16, Y BRCA2) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de páncreas (Orchekowski el al. , 2005. Cancer Res 65:11193-202).

Por otra parte, ciertos genes se encuentran sobre-expresados en adenocarcinoma de páncreas, entre ellos claudin 4, fascin, Hsp47, mesotelin, Muc4, PSCA, S100A4. Estos datos indican que un estudio del perfil de expresión génica proporciona una oportunidad única para mejorar el conocimiento del diagnóstico y evolución de este letal tumor y proporcionar

una mejora en las pautas del tratamiento del paciente, tanto a nivel de búsqueda de biomarcadores apropiados que reflejen una respuesta eficaz como a nivel de aplicación del mejor tratamiento a nivel individual a cada paciente según los biomarcadores que manifiesten.

Por otro lado, las alteraciones genéticas dan lugar a que las células tumorales produzcan diferentes moléculas que están involucradas en la transformación neoplásica y la progresión tumoral. Estas moléculas a menudo hacen emerger señales autocrinas y paracrinas estimuladoras del crecimiento, factores de crecimiento peptídicos secretados, citoquinas y hormonas. Los niveles

aumentados de estas moléculas solubles pueden ser utilizados para el diagnóstico del cáncer y el manejo terapéutico. Se ha detectado expresión de

proteínas asociadas al cáncer, como HER2, por las células tumorales circulantes en sangre. Estas células tienen valor pronóstico en la enfermedad metastásica, y su presencia aumenta, tras un ciclo de tratamiento, en pacientes con probabilidad de que la terapia fuese inefectiva. Estos resultados indican el

valor de utilizar analíticas que permitan la detección en la sangre de los pacientes con cáncer o bien células cancerosas circulantes o las moléculas que puedan producir, y que estén involucradas en el proceso cancerígeno. Este

procedimiento es menos invasivo para monitorizar tanto la evolución de la

enfermedad como la respuesta a la terapia o intervención quirúrgica. De esta manera, estas moléculas-diana pueden ayudar a caracterizar la biología de la

tumorigénesis, la progresión de la enfermedad y además pueden identificar

biomarcadores para monitorizar el tratamiento de los pacientes con cáncer.

Una manera de detectar estas moléculas es utilizando anticuerpos específicos, para detectar su presencia en el suero de los pacientes con cáncer, así en

pacientes con cáncer de vejiga, la presencia de p331NG1 y ciclina D2, se ha asociado con pérdida de la regulación del ciclo celular; angiostatina y factor de

crecimiento epidérmico con repuesta antiangiogénica; osteopontina y CXCR4

con riesgo metastásico. El perfil de proteínas en suero que se pueden detectar utilizando anticuerpos puede ser característico de la enfermedad (Orchekowski el al., 2005. Cancer Res 65:11193-202).

Estas moléculas alcanzan el torrente sanguíneo tanto por secreción o excreción como por mecanismos de degradación incluyendo apoptosis o necrosis tisular. La neovascularización, vías celulares tumorales autocrinas y las paracrinas, son factores colaboradores de que estas dianas antigénicas

alcancen la circulación y se puedan detectar en sangre (Burczynski el al., 2006. J Mol Diagn. 8:51-61; Golub el al., 1999. Science 286:531-537; Smirnov el al., 2005. Cancer Researc. 65:4993-4997).

En el caso del cáncer de páncreas, en un estudio realizado sobre la expresión del antigeno de células madre prostático (PSCA) mRNA se detectó mediante RT-PCR en la sangre de 7 de 11 pacientes con cáncer de páncreas (63,6%), y

no se observó en la sangre de individuos sanos. Otras alteraciones genéticas características del cáncer de páncreas, como mutación K-ras que está presente en el 80-90% de los casos, pueden detectarse en el plasma de dichos

pacientes por la misma técnica, con potencial aplicación en la monitorización

de la enfermedad. En esta linea, la viabilidad de medir en sangre periférica

moléculas que permitan conocer la evolución de cáncer de páncreas fue la demostración de que los niveles de transcritos de RNAm del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) en sangre periférica estaban elevados en los 10 pacientes

con cáncer de páncreas estudiados comparados con 9 controles sanos (p <

0.05) medidos por Q-RT-PCR y los transcritos de RNAm del TNF-Q se

redujeron a un nivel similar a los controles tras la extirpación del tumor.

La tecnología actual permite determinar el perfil molecular de la enfermedad,

mediante micromatrices (microarrays) capaces de medir simultáneamente los niveles de expresión de miles de genes. Se puede medir la expresión a nivel de ARNm, para ello están los microarrays que utilizan sondas con ADNc u oligonucleótidos sintéticos o medir las proteínas utilizando como "sondas" anticuerpos específicos. En el caso de medir los niveles de expresión de los genes a nivel de ARNm, se puede partir de ARN total o ARNm aislado de la muestra de tejido o de células. Tanto en el caso de partir de ARN total como de ARNm se realiza un paso previo de obtención de ADN complemetario (ADNc), y posteriormente se realiza una transcripción in vitro para la obtención de ARNc

marcado con biotina de manera proporcional al mARN original expresado en el

tejido. Este ARNc biotinilado se fragmenta y se hibrida específicamente con el

panel de sondas de ADNc u oligonucleótuidos sintéticos presentes en el microarray en condiciones específicas, se elimina el que no ha hibridado y la

cantidad de ARNc-biotinilado para cada gen se pone de manifiesto al añadir un fluorófora que suele ser Cy5 unido a estreptavidina. La fluorescencia se detecta

con un escaner, que la convierte en datos numéricos y se crea una base de

datos en la que podemos tener unos valores de intensidad de fluorescencia

directamente relacionados con el nivel de expresión de cada gen particular. Esto permite visualizar las interacciones de miles de genes simultáneamente.

En los últimos años, se han usado los perfiles de expresión génica basados en

microarrays, para el diagnóstico de diversas enfermedades entre ellas el

cáncer, si bien los estudios se han limitado a ciertos tipos de esta enfermedad,

lo cual ha permitido clasificar los distintos tipos de cáncer en subgrupos

clínicamente relevantes, de una manera más precisa y antes de que aparezcan manifestaciones clínicas severas, con lo que aumenta la posibilidad de un

mejor diagnóstico precoz, un mejor seguimiento de la evolución clínica y de la

respuesta a los diferentes tratamientos con respecto a los métodos convencionales o en conjunto con ellos. De esta manera mediante el análisis

del perfil de expresión génica es posible predecir la respuesta a quimioterapia o a agentes dirigidos frente a dianas moleculares del cáncer (Burczynski el al., 2006. J Mol Diagn. 8:51-61; Golub el al., 1999. Science 286:531-537; Smirnov el al., 2005. Cancer Researc. 65:4993-4997; Burczynski el al., 2005. Clin Cancer Res 11 :1181-9). El perfil molecular se puede utilizar como una

herramienta adicional dentro de los exámenes clínicos para determinar la sensibilidad a un tratamiento determinado, y de esta manera reducir tratamientos innecesarios.

La sangre periférica es un tipo de tejido esencial para la investigación clínica debido a su papel crítico en la respuesta inmune y metabólica, y a su fácil

recolección, lo cual es esencial para el descubrimiento de marcadores biológicos de enfermedad. Así, la aplicación de la tecnología de microarrays en sangre periférica puede proporcionar nuevos conocimientos de las variaciones en la expresión genética global específicamente asociadas a la enfermedad

(Burczynski el al., 2005. Clin Caneer Res 11 :1181-9; Feezor el al., 2004. Physiol. Genomics 19:247-254; Samuel el al., 2003. ASCO Molecular Therapeutics Symposium Nov 2002 San Oiego.BMC Cancer 3:3; Jazaeri el al., 2005. Clin cancer Res. 11: 6300-10; McPhail el al., 2005. 10:1485-1487). Es posible el aislamiento de ARN total de sangre sin riesgo de su degradación, y

aunque inicialmente se comprobó que había diferencias en la expresión debido

a sobreabundancia de mRNA de hemoglobina, una vez que se dispone de

técnicas que eliminan ARN de la fracción eritrocitaria los sistemas de recolección de ARN de sangre son idóneos para estudios que requieran

muchas muestras, seguimiento a lo largo del tiempo o multicéntricos. Se ha demostrado que el método de reducción de RNAm de globina consigue aumentar la calidad de los datos de las muestras de RNA estabilizado con

menor variación intragrupos y una tasa de detección de genes expresados similar a la de células mononucleares en sangre. La utilización de sangre periférica, permite un aumento en la identificación de biomarcadores basados en el perfil de expresión de ARN y puede ayudar en lo que ya se conoce como farmacogenómica. El uso de células mononucleares de sangre periférica para análisis de transcriptoma ha probado su valor para valorar la firma genética asociada a la enfermedad y relacionada a respuesta a fármacos. La

disponibilidad de microarrays de AON está acelerando el descubrimiento de dianas del cáncer (Andrea el al., 2006. Nature 439: 353-357). Se ha empleado RT-PCR para detectar tránscritos m RNA de cáncer de mama o asociados a epitelio como citoqueratinas, EGFR, mamoglobulina, MUC-1, beta-HCG, c-Met, GaINac-T, MAGE-3.

En el caso del cáncer de páncreas se han estudiado microarrays de proteinas para detección de marcadores en suero (Orchekowski el al., 2005. 65:11193202), así como se han identificado, mediante microarrays de cONA, 158 genes expresados en el epitelio neoplásico con mayor expresión (mayor del doble, p<0,01) en 10 cánceres de páncreas comparados con 10 muestras de páncreas no tumoral (Logsdon el al., 2003. Cancer Res 63:2649-57). Investigadores de la Universidad de Ulm, aprovechando el conocimiento de estudios previos de perfil de expresión genéti ca de cáncer de páncreas, diseñaron un array diagnóstico de cONA especialmente diseñado para diagnóstico diferencial de tumores pancreáticos basado en el perfil de expresión de biopsias obtenidas con aspiración mediante aguja fina, puesto que más del 90% de tumores pancreáticos representan adenocarcinomas duetales; según estos autores los resultados permitían diferenciar adenocarcinomas duetales de tumores no malignos de páncreas con un 95% de especificidad (Buchloz el al., 2005. Clin Cancer Res. Nov 15;11 (22):804854). Así mismo se han realizado estudios comparativos de los análisis de microarrays utilizados en cáncer de páncreas a fin de encontrar genes y biomarcadores que pudiesen ser utilizados en nuevas estrategias diagnósticas y terapeuticas (Brandt el al. , 2004. Pancreatology 4: 587-597).

Es importante, por tanto, encontrar biomarcadores que puedan emplearse para el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico precoz del cáncer de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GF001, GPI, GPR56, MUC20, MAP4Kl, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPl B, O cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico, o seguimiento

•

del cáncer de páncreas. En una realización preferida de este aspecto de la invención, los genes se usan de manera simultánea.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de páncreas, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar la cantidad de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI , GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI , HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPI B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a).

En una realización preferida, el primer método de la invención comprende

además: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de

referencia.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) se obtiene de sangre periférica, y/o comprende células de sangre periférica (peripheral blood cells PBCs).

En otra realización preferida, el primer método de la invención además

comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos a los que se ha tomado muestra de sangre periférica a los siete días de efectuada una intervención quirúrgica por cáncer de páncreas, cuando presenta una cantidad de producto de expresión de los genes HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPI B, o cualquiera de sus combinaciones, detectado en el paso (b) mayor

y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia

(que se obtiene del grupo control individuos con cáncer de páncreas antes de

una intervención quirúrgica).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del

producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBP1B, o

cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI , GZMB, GFOOI,

GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico

o seguimiento del cáncer de páncreas, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar la cantidad de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GF001 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI , HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPI B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a),

c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de

referencia, y

d) asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con cáncer de páncreas cuando presentan un nivel de expresión dos veces superior al de los individuos sanos.

La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión

constitutiva del gen, en un grupo de individuos sanos, o de la expresión del gen en el grupo de individuos antes de ser sometidos a una intervención quirúrgica.

En particular, en la presente invención, las muestras de sangre periférica se obtuvieron antes de la intervención quirúrgica (TO) y a los siete días después de realizada ésta (T7d)

Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótica sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención , la detección del producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que

comprende: HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI , GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPIB, o

cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.

producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPIB, o

cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.

El término "diagnóstico", tal y como se utiliza en la presente invención, a la

capacidad de discriminar entre individuos afectados o no por adenocarcinoma

de páncreas.

A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer

otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la

elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no

pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras

analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es

estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlacion de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la

curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite

detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los

sujetos de un determinado grupo o población analizada.

Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos

y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método

conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica

aislada comprende células de sangre periférica (peripheral blood cel/s PBCs).

El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a

animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El

término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

La detección de la cantidad del producto de expresión de los genes seleccionados de la li sta que comprende: HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4Kl, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBPl B, o cualquiera de sus combinaciones, puede

realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores

de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la

concentración de estos productos de expresión de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre los diferentes estadios del cáncer de

páncreas. De esta manera, se puede establecer un diagnóstico diferencial en

individuos afectados por cáncer de páncreas, que permite subclasificarlos.

La medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi-

S: cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o

indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la

concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal

que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las

proteínas a las que se traducen, y que está correlacionada directamente con el

10: número de moléculas de RNA o de proteinas producidas por los genes. Dicha

señal-a la que también podemos referirnos como señal de intensidad puede

obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad

química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida

obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por

15: ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de

reacción enzimática).

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no

se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los

20: genes, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos

o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden

valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las

propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos

mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen

25: todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de

los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero

no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de

30: los genes HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFODI,

GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBPIB de

la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema,

con una cantidad de los productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 ylo FKBPIB de una o varias

muestras de referencia deseable descrita en otra parte de la presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (e) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

Los productos de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1 B, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPIB, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin

limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la

polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de

amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica

(SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucfeótidos sintetizados in situ mediante fotofitografía o por cuafquier otro

mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante

transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nano partículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nano partículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podria obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GF001 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4Kl , HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPl B, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos,

inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de

los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GF001, GPI, GPR56, MUC20, MAP4Kl, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBP1B

puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede

llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se

intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.

El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la cantidad absoluta o relativa (al gen de referencia) de productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GF001, GPI, GPR56, MUC20, MAP4Kl, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y/o FKBPl B que permite discriminar un determinado estadio de cáncer de

páncreas de otros estadios, o de otras enfermedades. Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden

ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen cáncer de páncreas.

La cantidad de referencia será, por ejemplo, en el caso de la diferenciación

entre los pacientes afectados por cáncer de páncreas de los individuos sanos,

la expresión constitutiva del gen en un grupo control de individuos sanos. Sin embargo, en el caso de la subclasificación de los pacientes afectados por cáncer de páncreas en función de su s manifestaciones, el grupo control estará formado por un grupo de enfermos con cáncer de páncreas que no tuvieron esa manifestación clínica.

Asi pues, la muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo,

obtenidas a partir de las células sanguíneas de un paciente con cáncer de páncreas, en una determinada fase clínica. En otra realización preferida de este aspecto de la presente invención, la cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse

también , por ejemplo, de los límites de distribución normal de una cantidad

encontrada en muestras obtenidas de una población de individuos con cáncer de páncreas en distintas fases, mediante técnicas estadísticas bien conocidas.

El gen HLAG, antígeno mayor de histocompatibilidad clase 1, implicado en la presentación de antígenos al sistema inmune. Su secuencia aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI ) NP_002118 ; y/o en la SEO ID NO: 1).

En el contexto de la presente invención, el gen HLAG se define también por

una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante de la proteína recogida en la SEO ID NO: 1, Y que comprendería

diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 1,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) ylo b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 1, Y en las que el

polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KMP11. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 002721.

El gen ARFGAP1 ó ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 1 (RP11261 N11.1, ARF1 GAP, HRIHFB2281 , MGC39924), codifica para una proteína activadora de GTPasa que interacciona con el factor de ribosilación ARF1 (Weimer et al., 2008. J Cell BioL Nov 17;183(4):725-35). Su secuencia

aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI)

NP_060679; y/o la SEO ID NO: 2.

En el contexto de la presente invención, ARFGAP1 se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleátido, que constituye la secuencia

codificante de la proteína recogida en la SEO ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotídica de a) , c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ARFGAP1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 018209.2.

El gen S100A2, o "SIDO calcium binding protein A2' (RP11-49N14.8, CAN19, MGC111539, S100L), es un gen que codifica para una proteina de la familia

S100, implicado en la regulación de procesos como ciclo celular y diferenciación. Una expresión alterada de este gen se ha detectado en cáncer de mama. La subexpresión de este gen se asocia a una pobre diferenciación tumoral y menor supervivencia en carcinoma de laringe (Almadori et al., 2009. J Otolaryngol Head Neck Surg. Feb;38(1 ):16-22).

En el contexto de la presente invención , 5100A2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína que se encuentra con número de acceso en el

GenBank (NCBI) NP_005969 ylo en la SEO ID NO: 3, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 3, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 3, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína S 1 00A2. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 005978.3.

El gen SLC25A23 o "salute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 23', (APC2, MCSC2, MGC2615, SCaMC-3). Es un transportador mitocondrial de solutas dependiente de Ca. Puede actuar como un ATP-Mg/Pi intercambiador que media el transporte de Mg-ATP en intercambio por fosfato, catalizando el nivel neto o eflujo de nucleótidos de

,.

adenina dentro o fuera de la mitocondria (Bassi et al., 2005. Gene. Jan 31 ;345(2):173-82. Epub 2005 Jan 7.) .

.En el contexto de la presente invención, SLC25A23 se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_077008 y/o en la SEO ID NO: 4, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 4,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido

a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99°/0 con la SEO ID NO: 4, y en las que el

polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SLC25A23. Entre dichas moléculas

de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank

(NCBI) NM 024103.2.

El gen KLRG1 o "killer ce" lectin-like receptor subfamily G, member 1", (2F1 , CLEC15A, MAFA, MAFA-2F1, MAFA-L, MAFA-LlKE, MGC13600), desempeña un papel inhibidor de las células "natural killer" (NK) (Schwartzkopff et al. , 2007. J Immunol. Jul 15;179(2):1022-9)

En el contexto de la presente invención, KLRG 1 se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_077008 y/o en la SEO ID NO: 5, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codilican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacidica de la SEO ID NO: 5,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotídíca de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 5, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína KLRG1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 005810.3.

El gen GZMB o "granzyme B (granzyme 2, cytotoxic T-Iymphocyte-associated serine esterase 1", (CCPI, CGL-1, CGL1 , CSP-B, CSPB, CTLA1, CTSGL1, HLP, SECT) está implicado en inducción de apoptosis. Este gen codifica para la enzima Granzima B, necesaria para dirigir la lisis celular en respuestas

inmunes mediadas por células. Parece estar ligada a una activación de

caspasas responsables de la apop1osis (Rotonda et al., 2001 . Chem Biol. Apr;8(4):357-68) .

.En el contexto de la presente invención , GZMB se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI ) NP_004122 y/o en la SEO ID NO: 6, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 6, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido

a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99°/0 con la SEO ID NO: 6, y en las que el

5: polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las

características estructurales de la proteína GZMB. Entre díchas moléculas de

ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI)

NM 004131.3.

lO: El gen GFOD1 o "glucose-fruclose oxidoreduclase domain conlaining 1", está

implicado en inducción de apoptosis. Este gen codifica para la enzima

Granzima B, necesaria para dirigir la lisis celular en respuestas inmunes

mediadas por células. Parece estar ligada a una activación de caspasas

responsables de la apoptosis (Rotonda el al., 2001 . Chem Biol. Apr;8(4):357

15: 68).

En el contexto de la presente invención, GFOD1 se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI )

20: NP_061861 y/o en la SEO ID NO: 7, y que comprendería diversas variantes

procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 7,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

25: la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido

a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

30: un 90%, un 95%, un 98% O un 99% con la SEO ID NO: 7, y en las que el

polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las

características estructurales de la proteína GFOD1 . Entre dichas moléculas de

ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 018988.2.

El gen GPI o "glucose-6-phosphate isomerase", codifica para una enzima

dimérica que cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato y

fructosa-6-fosfato, además puede actuar como una citoquina segregada por tumores y como factor angiogénico (AMF) que estimula la motilidad de la célula endotelial (25).

En el contexto de la presente invención, GPI (AMF, DKFZp686C13233, GNPI, NLK, PGI, PHI, SA-36, SA36) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_000166, NP_001171651.1 y/o en la SEO ID NO: 8, y que comprenderia diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 8, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotidica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 8, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GPI. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 000175.3 ó NM 001184722.1.

El gen GPR56 o "G protein-coupled receptor 56', (UN0540/PR01083, BFPP, DKFZp781L 1398, TM7LN4, TM7XN1) receptor ligado a proteína G cuya sobreexpresión puede suprimir crecimiento tumoral y metástasis (Huang et al., 2008.

Mol Cell Biochem. Jan;308(1-2):133-9. Epub 2007 Oct 12).

En el contexto de la presente invención, GPR56 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEO ID NO: 9, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 9, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GPR56. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 201524.1.

El gen MUC20 o "mucin 20, cefl surface associaled', (UN02782/PR07170, FLJ14408, FLJ53153, KIAA1359, MUC-20) codifica para una mucina, glicoproteína que forma una barrera mucosa insoluble (Higuchi el al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):7456-68). Este gen parece reducir la activación transitoria de MAPK inducida por hepatocyte growth factor (HGF). Así mismo inhibe la proliferación de la expresión de MMP1 y MMP9 inducida por HGF (Higuchi el al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):7456-68).

En el contexto de la presente invención, MUC20 se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEO ID NO: 10, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencía aminoacidíca de la SEO ID NO: 10, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotidica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 10, Y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las caracteristicas estructurales de la proteina MUC20. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 152673.

El gen MAP4Kl o "milogen-activaled prolein kinase kinase kinase kinase 1", (HPK1) codifica para una mucina, glicoproteína que forma una barrera mucosa insoluble (Higuchi el al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):7456-68). Esle gen parece reducir la activación transitoria de MA PK inducida por hepatocyte growth factor (HGF). Así mismo inhibe la proliferación de la expresión de MMPl y MMP9 inducida por HGF (Higuchi el al., 2004. Mol Cell Biol. Sep;24(17):745668).

En el contexto de la presente invención, MAP4Kl se define también por una

secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEO ID NO: 11, Y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 11,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 11, Y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MAP4K1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 007181.3.

El gen HBD o "hemog/obin, delta", está implicado en el transporte de oxígeno desde el pulmón a otros tejidos periféricos.

En el contexto de la presente invención, HBD se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleátido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEO ID NO: 12, y que comprendería diversas variantes proceden les de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 12,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99°/0 con la SEQ ID NO: 12, y en las que el

polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína HBD. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 000519.3.

El gen RPS5 o "ribosomal protein SS', codifica para una proteína ribosomal cuya expresión variable se ha detectado, además de en cáncer de páncreas,

en cáncer colorrectal, si bien no se ha relacionado con la severidad de la

enfermedad (Campagna et al., 2008. Int J Clin Exp Pathol 1: 32-43, Frigerio et al., 1995. Biochim Biophys Acta 1262: 64-68).

En el contexto de la presente invención, RPS5 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_002057 y/o en la SEO ID NO: 13, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 13,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 13, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína RPS5. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 031902.3.

El gen BNIP3L o "BCL2/adenovirus E/B /9kDa interacting protein 3-fike", (BNIP3a, NIX) puede funcionar como supresor de tumores. Inhibe la apoptosis inducida por BNIP3 (Fei et al., 2004. Cancer Cell. Dec;6(6):597-609; Mellar et al., 2007. Cancer Metastasis Rev. Dec;26(3-4):553-66).

En el contexto de la presente invención, BNIP3L se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_004322 y/o en la SEO ID NO: 14, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 14,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 14, yen las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína BNIP3L. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 004331 .2.

El gen PCDH9 o "protocadherin g', (BNIP3a, NIX) es un gen que codifica para una proteína de adhesión celular dependiente de calcio (protocadherina) y alterada en cáncer de páncreas (Hidalgo, 2010. Pancreatic Cancer. N Engl J Med 362:1605-17).

En el contexto de la presente invención, PCDH9 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia

codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI ) NP_065136 y/o en la SEO ID NO: 15, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 15, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido

a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 15, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína PCDH9. Entre díchas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 020403.4 o NM 203487.2.

El gen FKBP1B o "FK506 binding protein lB, 12.6 kDa", (FKBP12.6, FKBP1L, OTK4, PKBP1L, PPlase) este gen codifica para una proteína miembro de la familia de las inmunofilinas, implicadas en inmunoregulación y en procesos celulares básicos como plegamiento de proteínas y su paso a través de

membranas. Esta proteína es una cis-trans prolil-isomerasa que se une al inmunosupresor FK506 y a rapamicina

En el contexto de la presente invención, FKBP1 B se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI ) NP_004107 y/o en la SEO ID NO: 16, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 16,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con

comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%,

un 90%, un 95%, un 98% O un 99% con la SEO ID NO: 16, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína FKBP1 B. Entre dichas moléculas de

2.

ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 004116.2

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteina sustancialmente homóloga a cualquiera de las proteinas HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación metilación o acilación.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homóloga" a cualquiera de las proteínas HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9, SEO ID NO: 10, SEO ID NO: 11 , SEO ID NO: 12, SEO ID NO: 13, SEO ID NO: 14, SEO ID NO: 15, y SEO ID NO: 16,

respectivamente a como se ha descrito anteriormente; es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia

de aminoácidos SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9, SEO ID NO: 10, SEO ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEO ID NO: 13, SEO ID NO: 14, SEO ID NO: 15, y SEO ID NO: 16, de al menos, un 50%, típicamente de, al

menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias homologas a

cualquiera de las proteínas HLAG, ARFGAP1 , S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para

comparar secuencias.

La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa

que las proteinas o el/los fragmento/s de la/s proteina/s en cuestión mantiene/n

esencialmente las propiedades biológicas o inmunológicas descritas en este

documento. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos

convencionales.

En otra realización preferida, la detección de la cantidad de cualquiera de las proteínas HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1, GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1 , HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y/o FKBP1 B se realiza mediante un inmunoensayo. El término "inmunoensayo", tal y como se

utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno.

Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por

ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a

enzimas (ELlSA), inmunoensayo lineal (L1A), radioinmunoensayo (RIA),

inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente

ligado a enzimas o ELlSA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELlSA

se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que

puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELlSA: ELlSA directo, ELlSA indirecto o ELlSA sándwich.

El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal

cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1 , GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4Kl, HBD, RPS5, BNI P3L, PCDH9 y/o FKBPl B. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radio isótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra

molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto

marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32 p o 35S , fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.

En otra realización preferida, el segundo método de la invención además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos intervenidos quirúrgicamente y a los que siete días después de realizada ésta

se les toma muestra de sangre periférica cuando presenta una cantidad de producto de expresión de los genes HaO, RPS5, aN/P3L, PCDH9 y FKapla,

o cualquiera de sus combinaciones, detectado en el paso (b) mayor y

estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia

(que se obtiene del grupo control individuos con cáncer de páncreas antes de

una intervención quirúrgica).

A su vez, atendiendo a los métodos de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando , por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras

analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la

materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher.

Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos

del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%.

Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

La quimioterapia actual es muy eficaz en los primeros estadios. El método de la presente invención permite el diagnóstico precoz, y por tanto, adelantar significativamente el inicio del tratamiento.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de seguimiento de la evolución del cáncer de páncreas, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende:

a) tomar una muestra biológica aislada de un individuo,

b) detectar la cantidad de producto de expresión de, al menos, uno de los genes que se seleccionan de la lista que comprende HLAG, ARFGAP1, S100A2, SLC25A23, KLRG1, GZMB, GFOD1 , GPI, GPR56, MUC20, MAP4K1, HBD, RPS5, BNIP3L, PCDH9 y FKBP1 B, o cualquiera de sus combinaciones, en la muestra biológica aislada de (a).

c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de

referencia, y

d) repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) -(c) en

muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de manera no

simultánea.

5 cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante RT-PCR.

producto de expresión de al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI , GZMB, GFOOI, 10 GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBP1B, o

cualquiera de sus combinaciones, se realiza mediante un microarray.

El término "seguimiento de la evolución", tal y como se utiliza en la presente

descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como

15 por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento del cáncer de páncreas, o a una intervención quirúrgica. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el seguimiento se

realiza post-tratamiento.

20 En una realización preferida, la detección de los productos de expresión se realiza de al menos dos, preferiblemente tres, cuatro, cinco, seís, siete, ocho, nueve, diez, once, doce trece, catorce, quince, y aún más preferiblemente los dieciséis genes HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNlP3L, PCOH9 y

25 FKBPIB. En otra realización más preferida, la detección de los productos de expresión de los genes HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPIB se realiza simultáneamente.

30 Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit °dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad del producto de expresión de los genes de

la lista que comprende: HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9

y FKBP1B, o cualquiera de sus combinaciones.

Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar la

cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.

Aún más preferiblemente, el kit de la presente invención comprende los

elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la presente invención.

Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar la

cantidad cantidad del producto de expresión de los genes HLAG, ARFGAPI, S100A2, SLC25A23, KLRGI, GZMB, GFOOI, GPI, GPR56, MUC20, MAP4KI, HBO, RPS5, BNIP3L, PCOH9 y FKBPIB, o cualquiera de sus combinaciones,

por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación , inhibidores de la degradación de las proteinas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los

soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera

intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN Ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).

Los términos "secuencia aminoacidica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codifican tes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

A lo largo de la descripción y las reivi ndicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Visualización de los 3 tubos con estabilizador de RNA para cada paciente y tiempo.

Fig. 2. Expresión génica. Sobre-expresión superior a dos veces respecto a los voluntarios sanos (>2-fold, p<O,05) y de la sub-expresión. (A) Antes de la intervención. (B) A los 7 días de la intervención quirúrgica.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los métodos de la invención para obtener datos útiles en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, y para el diagnóstico y el seguimiento de dicha enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes y Métodos

Estudio aprobado por el Comité Ético de Investigación Clinica del Hospital

Universitario Virgen de las Nieves de Granada, en el cual se han estudiado cuatro pacientes con adenocarcinoma de páncreas comparando con un grupo de cinco voluntarios sanos. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron

antes de la intervención quirúrgica (TO) y a los siete dias de realizada ésta (T7d) utilizando para cada paciente y tiempo de toma de muestra, tres tubos

que contienen un estabilizador de RNA. Una vez extraído, se procede a la

purificación de este RNA comprobándose su calidad en un bioanalizador, de modo que las muestras de RNA cuya razón 288/188 no sea del orden de 1,5

son desechadas. A continuación se procede a realizar la reacción de transcripción inversa, así como a marcar los cRNA obtenidos con Cy5

streptavidina, procediéndose a hibridar éstos en los microarrays de genoma completo humano del sistema CodeLink. Cada microarray se realiza por duplicado cargando 2 ~g de cRNA de cada paciente, para compararlo con 2 ~g de cRNA de los voluntarios sanos. Una vez finalizada la hibridación durante un periodo de 12h y a 37' C, se realizó la lectura de los microarrays en un láser

escáner, procediéndose a la cuantificación y normalización de los valores

obtenidos mediante el software CodeLink 5.0.

De cada paciente participante en el estudio se obtuvieron antes de la

intervención quirúrgica (TO) y 7 dias después de ésta (T7d) 18 mi de sangre periférica distribuidos del siguiente modo: 12 mi para la obtención de ARN, 6 mi para un estudio de bioquímica sérica de los parámetros lipasa, amilasa, y

glutamil transferasa (GGT) y alanin-L-transferasa (ALT ~GPT) como indicadores de funcionalidad pancreática, y 6 mi para realización de un hemograma completo así como fórmula leucocitaria. El perfil de expresión génica se estudió mediante bioarrays del sistema CodeLink (Applied Microarrays, Tempe, AZ, U8A) a partir de RNA total de sangre periférica obtenido con paxgene Blood

RNA Tubes (PreAnalytix, Qiagen, The Netherlands) y purificado con Paxgene Blood RNA kit (Qiagen, The Netherlands). La calidad del RNA obtenido se

midió mediante microfluídica en un bioanalizador (Experion, Bio-Rad,

Richmond, VI, USA). La fluorescencia de los bioarrays se determinó en un escáner GenePix-4000B (Axon Instruments). Los datos se procesaron con el software de la plataforma CodeLink 5.0 (GE Healthcare).

Resultados

Antes de la intervención quirúrgica (TO), y comparando con los voluntarios

sanos, se han detectado 176 genes con un nivel de sobre-expresión superior a

2 veces (p<0,05), entre los cuales se encuentran: HLAG, implicado en la presentación de antígenos al sistema inmune; ARFGAP1 , proteína actívadora de GTPasa que interacciona con el factor de ribosilación ARF1; S100A2,

implicado en la regulación de procesos como ciclo celular y diferenciación;

SLC25A23, transportador mitocondrial de sol utas dependiente de Ca; KLRG1, que desempeña un papel inhibidor de las células "natural killer" (NK); GZMB, implicado en inducción de apoptosis; GFOD1, una glucosa-fructosa oxidoreductasa; GPI, glucosa fosfato isomerasa que además de función

glicolítica puede actuar como una citoquina segregada por tumores y como

factor angiogénico; GPR56, receptor ligado a proteína G cuya sobre-expresión

puede suprimir crecimiento tumoral y metástasis; MUC20, que codifica para una mucina, glicoproteína que forma una barrera mucosa insoluble. Después de la intervención, T7d, comparando con TO, se han detectado 11 genes con una sobre-expresión superior a 2 veces (p<O,05), entre los que se encuentran: HBD, hemoglobina delta, implicada en el transporte de oxígeno desde el pulmón a otros tejidos periféricos; RPS5, que codifica para una proteína

ribosomal cuya expresión variable se ha detectado en cáncer colorrectal, si

bien no se ha relacionado con la severidad de la enfermedad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico, o seguimiento del cáncer de páncreas, que comprende:

a.

obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b.

detectar la cantidad de producto de expresión de:

i. el gen S100A2 y el gen KLRG, en la muestra biológica aislada de (a), cuando la muestra se obtiene de un

individuo antes de la intervención quirúrgica,

ii. el gen RPS5 y el gen BNIP3L, en la muestra biológica aislada de (a), cuando la muestra se obtiene de un

individuo, post-intervención quirúrgica.
2. El método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o

seguimiento del cáncer de páncreas según la reivindicación anterior, que además comprende

c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
3. Un método de diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas, que comprende los pasos (a) -(e) del método según la reivindicación 2, y además comprende:

d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con cáncer

de páncreas cuando presenta un nivel de expresión dos veces superior al de los individuos sanos.
4. Un método de seguimiento de la evolución del cáncer de páncreas, que comprende los pasos (a) -(e) del método según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además:

d. repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) -(e) en muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de

manera no simultánea.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la muestra se obtiene de sangre periférica.
6.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la detección del producto de expresión de se realiza mediante RT-PCR.
7.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la detección

del producto de expresión se realiza mediante un microarray.
8. Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a

cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Un kit o dispositivo comprende los elementos necesarios para detectar el

producto de expresión de:

a. el gen S100A2 y el gen KLRG , en muestras de individuos antes de la intervención quirúrgica,

b. el gen RPS5 y el gen BNIP3L, en muestras de individuos post

intervención quirúrgica.
10.EI uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, para la

obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas.