ES2897004T3

ES2897004T3 - Métodos para diagnosticar el riesgo de fibrosis y rechazo de aloinjerto renal

Info

Publication number: ES2897004T3
Application number: ES15811195T
Authority: ES
Inventors: Barbara Murphy; Weijia Zhang
Original assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Current assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2022-02-28
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN106661634B; US20190345556A1; AU2015279621B2; EP3161158A4; US20170152560A1; EP3161158B1; CN106661634A; CA2953368A1; US10787709B2; WO2015200873A1; CA2953368C; AU2015279621A1; EP3161158A1; US10308985B2

Abstract

Un método para diagnosticar el riesgo de que el receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, método que comprende: (a) determinar los niveles de expresión de cuatro microARN en una muestra de sangre obtenida a partir del receptor, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p; (b) comparar los niveles de expresión de los cuatro microARN con un nivel de control para cada microARN; y (c) diagnosticar al receptor como de alto o de bajo riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto (i) en donde el receptor se diagnostica como de alto riesgo si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR- 302b-3p están aumentados con respecto a un nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir de un conjunto de entrenamiento; o (ii) en donde el receptor se diagnostica como de bajo riesgo si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR- 302b-3p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN, tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para diagnosticar el riesgo de fibrosis y rechazo de aloinjerto renal

Campo técnico

Esta invención se refiere al campo de la biología molecular, y más particularmente a la detección de firmas moleculares de microARN. Más particularmente, esta invención se refiere a métodos para diagnosticar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Los métodos comprenden analizar la sangre de los receptores de un aloinjerto renal determinando el nivel de expresión de un conjunto de firmas de miARN que contiene al menos 4 miARN preseleccionados para identificar y tratar a dichos pacientes. Se puede aplicar un modelo de ajuste por regresión logística a los valores de un recuento normalizado de la lectura de la expresión (por ejemplo, recuentos de lecturas de genes mediante tecnología de secuenciación de última generación) para derivar un modelo estadístico a partir del cual se puede calcular una puntuación de probabilidad del riesgo de fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto para cada paciente.

Antecedentes

La fibrosis renal progresiva que conduce a la disminución de la función renal sigue siendo la causa predominante de pérdida de un aloinjerto renal. Las metodologías actuales basadas en parámetros clínicos y patológicos no logran identificar los injertos con riesgo de pérdida antes de que se produzca una lesión irreversible. Dichos ensayos requieren normalmente obtener una muestra de una biopsia del paciente. A menudo, el momento en que se reconoce el rechazo es demasiado tarde para hacer nada. Un aumento en la creatinina sérica o un aumento de la proteína en la orina pueden ser advertencias de rechazo, pero no son completamente predictivas. Adicionalmente, la recogida y la evaluación de muestras de biopsias del paciente es laboriosa y cara.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de métodos de diagnóstico mejorados para predecir el riesgo de que el receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto.

Sumario

En el presente documento se divulga un método para diagnosticar el riesgo de que el receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. El método generalmente incluye la medición del nivel de una firma de miARN en una muestra de prueba (por ejemplo, una muestra de sangre) del receptor. La firma comprende la determinación de una alteración en los niveles de la firma de miARN en una muestra de prueba de un receptor de un aloinjerto. En algunas realizaciones, la firma de miARN consiste en productos génicos del miARN: hsa-mir-128, hsamir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p. Una alteración en los niveles del miARN, con respecto al nivel de los correspondientes niveles del miARN en una muestra de control, es indicativo del riesgo de que el receptor del aloinjerto desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos para determinar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal (por ejemplo, un "receptor", un "paciente con un aloinjerto renal" o "un paciente") desarrolle fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto, que comprende comparar los niveles de expresión de los cuatro microARN con un nivel de control para cada microARN, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p; e (i) diagnosticar al receptor como de alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están aumentados con respecto a un nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento; o ii) diagnosticar al receptor como de bajo riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsamiR-192-5p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento.

En algunos aspectos, los métodos divulgados pueden incluir la obtención de una muestra de sangre del receptor; determinar los niveles de expresión de cuatro microARN en la muestra, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsamir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p; comparar los niveles de expresión de los cuatro microARN con un nivel de control para cada microARN y diagnosticar al receptor como de riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de las muestras de miARN están alterados con respecto a un nivel de control para cada microARN. La determinación de los niveles de expresión puede incluir, por ejemplo, aislar el ARNm total de la muestra de sangre, sintetizar el ADNc a partir del ARNm y medir los niveles de expresión de los microARN hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p de la muestra.

En algunos aspectos, los métodos divulgados pueden incluir: obtener una muestra de sangre del receptor del aloinjerto renal; aislar (es decir, extraer) el ARNm total de la muestra de sangre; sintetizar el ADNc a partir del ARNm; determinar los niveles de expresión de cuatro microARN, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b3p y hsa-mir-192-5p; comparar los niveles de expresión de cada uno de los microARN con un nivel de control predeterminado, y diagnosticar al receptor del aloinjerto como: (i) con alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento; o (ii) con un riesgo bajo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento.

En algunos aspectos del método, un riesgo alto de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto corresponde a un índice de daño crónico del aloinjerto en 12 meses, CADI-12, con una puntuación de 1 o mayor. La puntuación del CADI se basa en las puntuaciones de los componentes individuales para a) inflamación difusa o focal, b) fibrosis en el intersticio, c) aumento de la matriz mesangial, d) esclerosis en los glomérulos, e) proliferación de la íntima y f) atrofia tubular. Cada parámetro individual se puntúa de 0 a 3 como se describe en la bibliografía (Yilmaz et al., 2003, Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 14:773-779). En algunos aspectos del método, un riesgo bajo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto corresponde a una puntuación del CADI-12 menor de 1.

En algunos aspectos del método, el método comprende además realizar una comparación entre los niveles de expresión del miARN medidos en la muestra del receptor con una o más muestras de referencia (es decir, de control), siendo dichas referencias representativas de sujetos humanos sanos.

En algunos aspectos, el diagnóstico del riesgo del receptor comprende el cálculo del riesgo del receptor mediante la aplicación de los niveles de expresión determinados en la muestra del receptor a un modelo de ajuste por regresión logística penalizado. En una realización, el modelo de ajuste por regresión logística penalizado a partir del cual se calculará el riesgo utiliza la fórmula:

i°gT ^ =PVP*1g1+P*¡g¡+- P*4g4

donde (p(x) es la probabilidad de desarrollar fibrosis, p* es el coeficiente penalizado y gi es el valor de la expresión del miARN i.

En algunos aspectos, el diagnóstico del riesgo del receptor comprende el cálculo de la puntuación de probabilidad del riesgo de fibrosis para dicho receptor mediante la ecuación:

donde (p(x) es la probabilidad de desarrollar fibrosis, p* es el coeficiente penalizado y gi es el valor de la expresión del miARN i. En ciertas realizaciones, el método comprende además el diseño de un plan de tratamiento basado en el diagnóstico.

En ciertas realizaciones, el método comprende además la administración de un tratamiento basado en el diagnóstico.

En algunos aspectos del método, el método incluye además el tratamiento del receptor del aloinjerto para inhibir la fibrosis del aloinjerto y la pérdida del aloinjerto si se ha diagnosticado que el receptor del aloinjerto está en riesgo de sufrir fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Por lo tanto, en algunos aspectos, el método comprende la administración de un fármaco antifibrótico al receptor del aloinjerto.

Por lo tanto, en el presente documento también se divulga un método para tratar a un receptor de un aloinjerto renal para inhibir la fibrosis del aloinjerto y la pérdida del aloinjerto. El método puede incluir obtener una muestra de sangre del receptor del aloinjerto renal; aislar el miARN a partir de la muestra de sangre; sintetizar el ADNc a partir del miARN; determinar los niveles de expresión de cuatro microARN, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p;comparar el nivel de expresión de cada uno de los microARN con un nivel de control para cada microARN; diagnosticar al receptor del aloinjerto como: (i) con alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento; o (ii) con un riesgo bajo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento, y administrar un fármaco contra el rechazo y/o antifibrótico al receptor del aloinjerto y/o modificar su régimen de inmunosupresión si el receptor tiene unos niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p que están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN, y unos niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p que están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN.

En algunos aspectos de los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento, el tratamiento incluye la administración al receptor del aloinjerto de un fármaco contra el rechazo al receptor del aloinjerto. En algunos aspectos, el fármaco contra el rechazo es belatacept (una proteína de fusión compuesta por el fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG1 humana unido al dominio extracelular de la CTLA-4). En algunos aspectos, el fármaco contra el rechazo es un agente inmunosupresor o un agente antiproliferativo, micofenolato de mofetilo (MMF), sirólimus, prednisona, micofenolato de mofetilo, micofenolato sódico y azatioprina.

En algunos aspectos de los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento, el tratamiento incluye la administración de un fármaco antifibrótico (por ejemplo, un antifibrótico) al receptor del aloinjerto. En algunos aspectos, el fármaco antifibrótico se selecciona entre el grupo que consiste en pirfenidona, relaxina, proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y factor de crecimiento hepático (HGF) 6. En algunos aspectos de los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento, el método de tratamiento incluye la modificación del régimen de inmunosupresión del receptor del aloinjerto mediante, por ejemplo, el cambio de un inhibidor de la calcineurina a un fármaco que no esté asociado con el desarrollo de fibrosis, tales como los fármacos contra el rechazo belatacept, rapamicina o micofenolato de mofetilo.

En algunos aspectos del método, la determinación de los niveles de expresión de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsamir-302b-3p y hsa-mir-192-5p incluye la realización de un ensayo tal como una qPCR, un análisis de micromatriz o un análisis Nanostring. Para el análisis Nanostring, el análisis incluye hibridar el ARN total que comprende los miARN con sondas de código de barras específicas para los microARN, inmovilizar el miARN y cuantificar las sondas unidas al miARN con un analizador digital.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un chip de ADN para diagnosticar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, en el que se ha inmovilizado una sonda para ensayar los niveles de expresión de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos para seleccionar un paciente con un aloinjerto renal para que reciba un tratamiento para reducir la fibrosis del aloinjerto y un tratamiento para reducir el riesgo de pérdida del aloinjerto, métodos que comprenden la comparación de los niveles de expresión de los cuatro microARN con un nivel de control para cada microARN, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p, y (f) seleccionar al paciente para que reciba el tratamiento si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsamiR-302b-3p están aumentados con respecto a un nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN. De acuerdo con algunos aspectos, los métodos pueden incluir obtener una muestra de sangre del receptor, determinar los niveles de expresión de cuatro microARN en la muestra, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p, comparar los niveles de expresión de los cuatro microARN con un nivel de control para cada microARN, y seleccionar al paciente para que reciba el tratamiento si los niveles de expresión de las muestras de miARN están alterados con respecto a un nivel de control para cada microARN. En algunas realizaciones, el paciente es seleccionado para que reciba el tratamiento si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están aumentados con respecto a un nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN.

La presente divulgación también proporciona un kit para determinar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Los kits incluyen reactivos adecuados para determinar los niveles de expresión de un miARN en una muestra de sangre (por ejemplo, reactivos adecuados para determinar los niveles de expresión de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p); opcionalmente una o más muestras de control que comprenden unos niveles predeterminados del mismo miARN, en donde la comparación de los niveles de los miARN en una muestra de prueba con los niveles en las muestras de control identifica el riesgo de que el receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto; e instrucciones de uso del kit en el método descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el kit comprende una o más sondas de código de barras que hibridan específicamente con uno o más de (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, o los cuatro de) hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p. En algunos aspectos, el kit incluye además uno o más reactivos de extracción de microARN. En algunos aspectos, el kit incluye además un reactivo de hibridación. En algunos aspectos, el kit incluye además instrucciones de uso.

Como se utiliza en el presente documento, "obtener" u "obtención" puede ser cualquier medio por el que se llega a la posesión de la muestra por medios "directos" o "indirectos". Obtener directamente una muestra significa realizar un proceso (por ejemplo, realizar un método físico tal como una extracción) para obtener la muestra. La obtención indirecta de una muestra se refiere a la recepción de la muestra de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio externo que adquirió directamente la muestra). La obtención directa de una muestra incluye la realización de un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física, por ejemplo, un material de partida, tal como sangre, por ejemplo, sangre que fue aislada previamente de un paciente. Por lo tanto, obtener se usa para referirse a la recogida y/o la extracción de la muestra a partir del sujeto. Adicionalmente, "obtener" también se usa para referirse a cuando uno recibe la muestra de otro que estaba en posesión de la muestra previamente.

En algunas realizaciones, la muestra de referencia se obtiene a partir de al menos un individuo que no es el receptor de un aloinjerto renal. En algunas otras realizaciones, la muestra de referencia se obtiene a partir de al menos un receptor de un aloinjerto renal al que previamente se le ha diagnosticado riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. En algunas realizaciones, la muestra de referencia comprende un nivel de analito de referencia predeterminado y estadísticamente significativo (por ejemplo, niveles de expresión del miARN de referencia predeterminados y estadísticamente significativos).

En otra realización más, los métodos comprenden además modificar la historia clínica del receptor del aloinjerto para identificar si el receptor está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Preferentemente, la historia clínica se almacena en un medio legible por ordenador.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y en la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones. La invención se define en las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La figura 1 representa un flujo de trabajo de análisis de datos.

La figura 2 contiene una matriz cromática (heat map) de los miARN expresados diferencialmente en los pacientes con un CADI alto (CADI > 1) en comparación con un CADi bajo (CADI <= 1). El color rojo indica un aumento de la expresión, y el verde una disminución de la expresión.

Figura 3: la figura 3a contiene un gráfico de barras de enriquecimiento de ontología génica de los objetivos predichos que se correlacionaron negativamente con mirl28; la figura 3b contiene un gráfico de barras de enriquecimiento de ontología génica de los objetivos predichos que se correlacionaron negativamente con mir29b-3p.

Figura 4: la figura 4a contiene una curva ROC de predicción de un conjunto predictivo de 4 miARN en el conjunto de entrenamiento; la figura 4b representa la distribución de las AUC en el conjunto de entrenamiento derivado de 4 miARN seleccionados aleatoriamente. La línea roja vertical representaba la posición del AUC original; la figura 4c contiene una curva ROC de predicción de un conjunto predictivo de 4 miARN en el conjunto de ensayo; y la figura 4d representa la distribución de las AUC en el conjunto de ensayo derivadas de 4 miARN seleccionados aleatoriamente. La línea roja vertical representaba la posición del AUC original.

La figura 5 es una matriz cromática que muestra la agrupación de muestras tras la calibración del lote y la eliminación del efecto de lote para los miARN indicados.

La figura 6 muestra la corrección de datos de la muestra duplicada R281.1 en diferentes lotes.

La figura 7 muestra la corrección de datos de la muestra duplicada R2941.7A en diferentes lotes.

La figura 8 muestra dos cuantificadores de la relación F, y muestra las fuentes clínicas o demográficas que contribuyen a la variación de los datos antes (figura 8a) y después (figura 8b) de la corrección del SVA.

La figura 9 es un diagrama esquemático que ilustra las etapas de validación cruzada triples en el conjunto de entrenamiento con 100 iteraciones.

La figura 10 contiene gráficos con la curva ROC antes (grupo izquierdo) y después (grupo derecho) de la corrección del SVA. Se representa gráficamente la tasa de verdaderos positivos en el eje Y frente a la tasa de falsos positivos en el eje X.

Descripción detallada

Visión general

La presente divulgación se refiere a métodos para diagnosticar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. La fibrosis puede dar como resultado la pérdida del aloinjerto. Los métodos descritos en el presente documento son útiles para identificar si un receptor de un aloinjerto renal está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Dicho de otro modo, los métodos descritos en el presente documento son útiles para determinar la probabilidad de que el receptor de un aloinjerto renal esté en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, métodos que se basan en las diferencias en las cantidades relativas (por ejemplo, el nivel de expresión) del miARN obtenido a partir del receptor, en donde la probabilidad se determina utilizando un modelo de regresión lineal como se describe en el presente documento.

La técnica de ensayo divulgada en el presente documento es un ensayo basado en la sangre que evita la necesidad de muestras de biopsia. Los receptores de aloinjertos pueden ser controlados usando los ensayos divulgados en el presente documento en el momento del trasplante, poco después del trasplante y periódicamente después. Si se determina que el receptor de un aloinjerto tiene un alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y de perder el aloinjerto, el receptor del aloinjerto puede ser tratado, por ejemplo, mediante la modificación del régimen de inmunosupresión del receptor del aloinjerto, tal como, por ejemplo, administrando, interrumpiendo la administración o ajustando la dosis de un medicamento inmunosupresor (por ejemplo, medicamentos contra el rechazo) o administrando uno o más agentes antifibróticos.

Como se describe en los ejemplos, a continuación, se descubrió una firma molecular para predecir el desarrollo/progresión de la fibrosis en el aloinjerto renal. Los datos mostraron el uso de la identificación genética del miARN periférico para vigilar y estratificar los pacientes que están en riesgo de fibrosis y pérdida del injerto, obviando la necesidad de una biopsia del aloinjerto, y para identificar aquellos que puedan beneficiarse de intervenciones tempranas para prevenir pérdidas crónicas del aloinjerto.

La técnica de ensayo divulgada en el presente documento aborda la necesidad métodos de diagnóstico mejorados para predecir el riesgo de que el receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del injerto, y proporciona un ensayo basado en la sangre que se administra fácilmente de forma repetitiva a los pacientes trasplantados. Los pacientes de trasplante renal son explorados por su médico muy frecuentemente después del trasplante, en la mayoría de los casos, dos veces por semana durante el primer mes, pasando a semanalmente y a continuación cada dos semanas, hasta llegar a ser mensualmente después de 4 a 5 meses, aumentando posteriormente los intervalos de tiempo entre visitas de forma gradual. Durante este tiempo, se vigilan la función renal del paciente y los niveles de inmunosupresión. Los esteroides normalmente se reducen progresivamente hasta 5 mg a los 3 meses tras la cirugía, y los niveles de tacrólimus (un fármaco que suprime el sistema inmunitario y que se usa para evitar el rechazo de los órganos trasplantados) se reducen gradualmente hasta un nivel estacionario a los 6-12 meses si en el curso posterior al trasplante no hay complicaciones y el paciente no presenta un riesgo inmunitario alto. Los perfiles de expresión del miARN descritos a continuación se pueden emplear como un ensayo patrón a realizar en el momento de una visita clínica. Un resultado positivo de la prueba (es decir, si los niveles de expresión de las muestras de miARN están alterados con respecto a un nivel de control para cada microARN) indica que el para desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, y se trataría modificando cada vez más el régimen posológico inmunosupresor del paciente y administrando fármacos antifibróticos. La repetición de los ensayos (que es económicamente viable, ya que el ensayo es preferentemente un ensayo basado en sangre) guiará las continuas modificaciones, si las hubiera, en el régimen posológico inmunosupresor del paciente.

En los ejemplos, se realizó una identificación genética del miARN usando la tecnología Nanostring en sangre periférica a los 3 meses del trasplante a partir de una cohorte de 102 pacientes de trasplante renal del estudio Genomics of Chronic Allograft Rejection (GoCAR). El análisis LIMMA de los perfiles de expresión de los miARN identificó un conjunto de 24 miARN significativamente asociados con una puntuación elevada del CADI a los 12 meses (por ejemplo, una puntuación del CADI-12 de >1). La correlación de los perfiles de expresión del miARN con los perfiles de expresión génica del ARNsec en los mismos pacientes (N = 96) identificó los objetivos predichos de miARN correlacionados negativamente, y el enriquecimiento de ontología génica predijo además los procesos biológicos en los que podrían participar los miARN. El mir-128, que se sabe que desempeña un papel en la oncogénesis, era el más significativamente regulado por aumento en los pacientes con un CADI alto, y estaba asociado con genes de respuesta inmunitaria y de proliferación y apoptosis celular. El mir-29b-3p era el más regulado por disminución en los pacientes con un CADI alto (por ejemplo, puntuación del CADI-12 de >1) y estaba asociado a los genes en la regulación de la transcripción, las vías de reparación del ADN a través de la vía ATM.

La identificación genética del miARN identificó un conjunto de miARN para la predicción del desarrollo de fibrosis del aloinjerto renal y pérdida del aloinjerto. Se descubrió, en particular, que los cuatro microARN, hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p, pueden usarse conjuntamente para diagnosticar el riesgo de que el receptor de un aloinjerto desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto con un alto valor predictivo. En los receptores de aloinjertos que tenían un alto CADI (por ejemplo, una puntuación del CADI-12 de >1), los hsa-miR-128, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-378e, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-361-5p y hsamiR-22-3p estaban regulados por aumento; y los miARN, hsa-miR-7b-5p, hsa-miR-1991-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-7b-5p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-7g-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-1226-3p y hsa-miR-29b-3p estaban regulados por disminución. Por lo tanto, tomando como base estos datos se pueden desarrollar firmas de miARN, que identifica a un paciente como de alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Alternativamente, pueden determinarse los niveles de expresión de cualquier miARN individual para evaluar el riesgo de fibrosis y de pérdida del aloinjerto del receptor del aloinjerto. Los miARN individuales particularmente preferidos para usar en los presentes métodos de diagnóstico y/o tratamiento incluyen, por ejemplo, miR-128, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p.

En ciertas realizaciones, un subconjunto particular de 4 de los miARN descritos anteriormente es muy predictivo de que un receptor de un aloinjerto tenga un alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. En particular, el receptor de un aloinjerto puede ser diagnosticado como de alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y/o hsa-miR-302b-3p están aumentados con respecto a un nivel de control para cada microARN, y/o los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y/o hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto a un nivel de control para cada microARN.

En otras realizaciones, los niveles de expresión en el receptor de un aloinjerto de miR-128, hsa-miR-302b-3p, hsamiR-29b-3p y hsa-miR-192-5p se comparan con un valor de referencia o conjunto de referencia (control) para los miARN, y se evalúa el riesgo relativo del receptor del aloinjerto tomando como base un análisis estadístico.

En otras realizaciones, el receptor de un aloinjerto puede ser diagnosticado como de bajo riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y/o hsa-miR-302b-3p están disminuidos con respecto a un nivel de control o perfil de referencia para cada microARN, y/o si los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y/o hsa-miR-192-5p están aumentados con respecto a un nivel de control o perfil de referencia para cada microARN.

En otras realizaciones, los miARN se analizan en conjunto, y el riesgo relativo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto se evalúa tomando como base la comparación del perfil de miARN del receptor del aloinjerto con un perfil de referencia (por ejemplo, derivado de, o tomando como base, los niveles de una cohorte de receptores de aloinjertos que se sabe que no tienen riesgo de desarrollar fibrosis de un aloinjerto y pérdida del aloinjerto), en donde la comparación incluye la consideración del perfil de expresión de miR-128, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-29b-3p y hsamiR-192-5p o un subconjunto de los mismos.

En algunas realizaciones, el perfil de expresión del miARN puede determinarse usando un sistema de análisis nCounter® (NanoString Technologies®, Seattle, WA). El sistema de análisis nCounter® de NanoString Technologies realiza la identificación genética de cientos de ARNm, microARN o ADN objetivo simultáneamente con alta sensibilidad y precisión. Las moléculas objetivo se detectan digitalmente. El sistema de análisis NanoString usa "códigos de barras" moleculares e imágenes monomoleculares para detectar y contar cientos de transcritos únicos en una sola reacción. El protocolo no incluye ninguna etapa de amplificación. Aunque este es un método preferido para la detección rápida de la expresión del miARN, de acuerdo con los presentes métodos, puede usarse cualquier método de detección adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, y sin limitación, el miARN puede detectarse usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una (q)PCR cuantitativa o una micromatriz.

Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, el receptor de un aloinjerto que tiene un "riesgo alto" de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto tiene una probabilidad significativamente mayor de desarrollar fibrosis y fracaso del aloinjerto, sin intervención, que un sujeto que tiene un "riesgo bajo".

Como se utiliza en el presente documento, el "nivel de expresión" de un miARN divulgado en el presente documento significa el nivel de expresión del ARNm del marcador o el nivel mensurable del marcador en una muestra, que puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como, pero no se limita a, la técnica Northern, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, cuantitativa en tiempo real, "QPCR", una micromatriz y un análisis Nanostring, etc.

En algunos métodos del presente documento, es deseable detectar y cuantificar los miARN presentes en una muestra. La detección y la cuantificación de la expresión del ARN se puede conseguir mediante uno cualquiera de numerosos métodos bien conocidos en la técnica. Usando las secuencias conocidas para los miembros de la familia de ARN, se pueden diseñar sondas y cebadores específicos para usar en los métodos de detección descritos a continuación, según sea apropiado.

En algunos casos, la detección y la cuantificación de la expresión del ARN requiere el aislamiento del ácido nucleico a partir de una muestra, tal como una muestra de células o de tejido. Los ácidos nucleicos, incluyendo el ARN y específicamente el miARN, se pueden aislar usando cualquier técnica adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, la extracción basada en fenol es un método frecuente para el aislamiento del ARN. Los reactivos basados en fenol contienen una combinación de desnaturalizantes e inhibidores de la ARNasa para romper células y tejidos y la posterior separación del ARN de los contaminantes. Los procedimientos de aislamiento basados en fenol pueden recuperar especies de ARN en el intervalo de 10-200 nucleótidos (por ejemplo, miARN precursores y maduros, ARN ribosómico de 5S y 5,8S (ARNr), y ARN nuclear pequeño U1 (ARNnp). Además, procedimientos de extracción tales como los que usan TRIZOL™ o TRI REAGENT™, purificarán todos los ARN, grandes y pequeños, y son métodos eficaces para aislar el ARN total de muestras biológicas que contienen miARN y ARN interferentes pequeños (ARNip). También se contemplan procedimientos de extracción tales como los que usan el kit QIAGEN-ALLprep.

En algunas realizaciones, es deseable el uso de una micromatriz. Un micromatriz es una matriz microscópica y ordenada de ácidos nucleicos, proteínas, moléculas pequeñas, células u otras sustancias, que permite el análisis paralelo de muestras bioquímicas complejas. Una micromatriz de ADN tiene diferentes sondas de ácidos nucleicos, conocidas como sondas de captura, que están unidas químicamente a un sustrato sólido, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla del tamaño de una microesfera. Las micromatrices se pueden usar, por ejemplo, para medir simultáneamente los niveles de expresión de un gran número de ARN mensajeros (ARNm) y/o de miARN.

Los análisis de micromatrices de miARN, por ejemplo, (aunque estos procedimientos pueden usarse de forma modificada para cualquier análisis de ARN), pueden realizarse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. En un ejemplo, se extrae el ARN de una muestra de células o tejidos, los ARN pequeños (ARN de 18-26 nucleótidos) se seleccionan por tamaño a partir del ARN total usando una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Los enlazadores oligonucleotídicos (por ejemplo, códigos de barras) se unen a los extremos 5' y 3' de los ARN pequeños, y los productos de ligación resultantes se usan como moldes para una reacción de RT-PCR con 10 ciclos de amplificación. El cebador de la PCR de la cadena sentido tiene un fluoróforo unido a su extremo 5', etiquetando así de forma fluorescente la cadena sentido del producto de la PCR. El producto de la PCR se desnaturaliza y luego se hibrida en la micromatriz. Un producto de la PCR, denominado ácido nucleico objetivo, que es complementario de la correspondiente secuencia de la sonda de captura del miARN de la matriz, hibridará, a través del apareamiento de bases, con el punto en el que están fijadas las sondas de captura. El punto será entonces fluorescente cuando se excite con un escáner por láser de micromatrices. La intensidad de la fluorescencia de cada punto se evalúa entonces en términos del número de copias de un miARN en particular, usando varios controles positivos y negativos y métodos de normalización de los datos de la matriz, lo que dará como resultado la evaluación del nivel de expresión de un miARN en particular.

En un método alternativo, el ARN total que contiene la fracción de ARN pequeño (incluyendo el miARN) extraído a partir de una muestra de células o tejidos, se usa directamente sin selección por tamaño de los ARN pequeños, y se etiqueta el extremo 3' usando la ARN ligasa T4 y cualquier conector de ARN corto marcado con fluorescencia. Las muestras de ARN se etiquetan mediante incubación a 30 °C durante 2 horas, seguida de una inactivación por calor de la ARN ligasa T4 a 80 °C durante 5 minutos. Los miARN etiquetados con fluoróforos complementarios de las correspondientes secuencias de la sonda de captura de miARN de la matriz hibridarán, a través del apareamiento de bases, con el punto en el que están fijadas las sondas de captura. El escaneo de la micromatriz y el procesamiento de los datos se llevan a cabo como se ha descrito anteriormente.

Hay varios tipos de micromatrices que pueden emplearse, incluyendo micromatrices de oligonucleótidos punteados, micromatrices de oligonucleótidos prefabricados y matrices de oligonucleótidos largos punteados. En las micromatrices de oligonucleótidos punteados, las sondas de captura son oligonucleótidos complementarios de las secuencias del miARN. Este tipo de matriz hibrida normalmente con los productos amplificados con la PCR de ARN pequeño seleccionados por tamaño a partir de dos muestras que se van a comparar (tales como tejido no canceroso y tejido canceroso o de muestra) que se etiquetan con dos fluoróforos diferentes. Alternativamente, el ARN total que contiene la fracción de los ARN pequeños (incluyendo los miARN) se extrae a partir de las dos muestras y se usa directamente sin selección por tamaño de los ARN pequeños, y se etiqueta el extremo 3' usando la ARN ligasa T4 y conectores de ARN corto etiquetados con dos fluoróforos diferentes. Las muestras se pueden mezclar e hibridar en una única micromatriz que luego se escanea, permitiendo la visualización de los genes del miARN regulados por aumento y por disminución en un único ensayo.

En las micromatrices de oligonucleótidos prefabricados o en las micromatrices monocanal, las sondas están diseñadas para que coincidan con las secuencias de los miARN conocidos o predichos.

En el mercado hay diseños disponibles que cubren genomas completos (por ejemplo, de Affymetrix o Agilent). Estas micromatrices dan estimaciones del valor absoluto de la expresión génica y, por lo tanto, la comparación de dos condiciones requiere el uso de dos micromatrices individuales.

En algunas realizaciones, es deseable el uso de una RT-PCR cuantitativa. La RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) es una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa usada para medir rápidamente la cantidad de un producto de la reacción en cadena de la polimerasa. La qRT-PCR se usa frecuentemente para determinar si una secuencia genética, tal como un miR, está presente en una muestra, y si está presente, el número de copias que hay en la muestra. Cualquier método de PCR que pueda determinar la expresión de una molécula de ácido nucleico, incluyendo un miARN, está dentro del alcance de la presente divulgación. Existen algunas variaciones del método de qRT-PCR conocidas en la técnica, tres de las cuales se describen a continuación.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" normalmente significa dentro de un intervalo de error aceptable para el tipo de valor y el método de medición. Por ejemplo, puede significar dentro del 20 %, más preferentemente dentro del 10 % y lo más preferentemente aún, dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. Alternativamente, en especial, en los sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa dentro de aproximadamente un logaritmo (es decir, un orden de magnitud), preferentemente dentro de un factor de dos de un valor dado.

Como se utiliza en el presente documento, "determinación del nivel de expresión", "determinar el nivel de expresión" o "detectar el nivel de expresión", como en, por ejemplo, "determinar el nivel de expresión de un miARN", se refiere a cuantificar la cantidad de miARN presente en una muestra. La detección de la expresión del miARN específico, o de cualquier microARN, se puede conseguir usando cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento. La detección de la expresión del miARN incluye la detección de la expresión de una forma madura del miARN o de una forma precursora que esté correlacionada con la expresión del miARN. Normalmente, los métodos de detección del miARN implican la detección específica de la secuencia, tal como mediante una RT-PCR. Se pueden diseñar cebadores y sondas específicos del miARN usando las secuencias de ácidos nucleicos del miARN precursor y maduro, que se conocen en la técnica.

Como se utiliza en el presente documento, un nivel de expresión "alterado" de un miARN en comparación con un nivel de referencia o un nivel control es al menos de 0,5 veces (por ejemplo, al menos: 1-2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 30; 40; 50; 75; 100; 200; 500; 1.000; 2000; 5.000; o 10.000 veces) el nivel de expresión alterado del miARN. Se entiende que la alteración puede ser un aumento o una disminución. Alternativamente, un nivel de expresión alterado se define como un aumento en la puntuación de probabilidad de riesgo usando parámetros del modelo de regresión logística establecidos a partir de un grupo de pacientes de entrenamiento, en comparación con la puntuación de probabilidad para el valor de corte obtenido a partir del conjunto de entrenamiento.

Las expresiones "disminuir", "disminuido", "reducido", "reducción" o "regulado por disminución" se usan todos en el presente documento generalmente para significar una disminución en una cantidad estadísticamente significativa. Sin embargo, para evitar cualquier duda, "reducido", "reducción", "regulado por disminución", "disminuido" o "disminuir" significa una disminución en al menos un 10% en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, una disminución de al menos aproximadamente un 20 %, o de al menos aproximadamente un 30 %, o de al menos aproximadamente un 40 %, o de al menos aproximadamente un 50 %, o de al menos aproximadamente un 60 %, o de al menos aproximadamente un 70 %, o de al menos aproximadamente un 80 %, o de al menos aproximadamente un 90 % o hasta, e incluyendo, una disminución del 100 % (es decir, un nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre el 10 y el 100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos de aproximadamente 0,5 veces (por ejemplo, de al menos: 1-2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 30; 40; 50; 75; 100; 200; 500; 1.000; 2000; 5.000; o 10.000 veces ) o más en comparación con un nivel de referencia.

Las expresiones "aumentado", "aumento" o "regulado por aumento" se usan todos en el presente documento generalmente para significar un aumento en una cantidad estadísticamente significativa; para evitar cualquier duda, Las expresiones "aumentado" o "aumento" significa un aumento en al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente un 20 %, o de al aproximadamente menos un 30 %, o de al menos aproximadamente un 40 %, o de al menos aproximadamente un 50 %, o de al menos aproximadamente un 60 %, o de al menos aproximadamente un 70 %, o de al menos aproximadamente un 80 %, o de al menos aproximadamente un 90 %, o hasta, e incluyendo, un aumento del 100 % o cualquier aumento entre el 10 y el 100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos de aproximadamente 0,5 veces (por ejemplo, de al menos: 1-2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 30; 40; 50; 75; 100; 200; 500; 1.000; 2000; 5.000; o 10.000 veces ) o más en comparación con un nivel de referencia.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "se dirige selectivamente", por ejemplo, en el contexto de una sonda para detectar la expresión del miARN, significa que el agente de direccionamiento se une específicamente al objetivo y no se une inespecíficamente a otros objetivos.

A lo largo de la solicitud y en las reivindicaciones adjuntas, debe entenderse, y se pretende que se entienda, que el uso de las expresiones "fármaco", "medicación", "agente" y "agente terapéutico" son expresiones intercambiables que definen las mismas o similares entidades. Un "fármaco" se refiere generalmente a un compuesto químico, una molécula pequeña u otra composición biológica, tal como un compuesto antisentido, un anticuerpo, un inhibidor de la proteasa, una hormona, una quimiocina o una citocina, capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra apropiadamente a un sujeto.

Como se utiliza en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" de un estado, trastorno o afección incluye: (1) prevenir o retrasar la aparición de los síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o afección que se desarrolla en un mamífero que puede estar afectado o predispuesto al estado, trastorno o afección, pero que aún no experimenta ni muestra síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o afección (por ejemplo, fibrosis de un aloinjerto renal y/o pérdida del aloinjerto); y/o (2) inhibir el estado, trastorno o afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de un tratamiento de mantenimiento) o al menos un síntoma clínico o subclínico de la misma; y/o; (3) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión del estado, trastorno o afección, o de al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos; y/o (4) causar una disminución en la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad. El beneficio para un sujeto que se va a tratar es estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o para el médico.

Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibir" una enfermedad o afección (por ejemplo, la fibrosis de un aloinjerto renal y/o la pérdida del aloinjerto) significa, por ejemplo, detener el desarrollo de uno o más síntomas de una enfermedad en un sujeto antes de que se produzcan o sean detectables, por ejemplo, por el paciente o el médico del paciente. Preferentemente, la enfermedad o afección no se desarrolla en absoluto, es decir, no hay síntomas detectables de la enfermedad. Sin embargo, también puede dar como resultado un retraso o una ralentización en el desarrollo de uno o más síntomas de la enfermedad. De forma alternativa o adicional, puede dar lugar a la disminución de la gravedad de uno o más síntomas desarrollados posteriormente.

Como se utiliza en el presente documento, "terapia combinada" significa el tratamiento de un sujeto que necesita tratamiento con una determinada composición o fármaco en el que el sujeto es tratado o se le administran una o más composiciones o fármacos para la enfermedad junto con la primera y/o junto con una o más terapias, tales como, por ejemplo, una terapia inmunosupresora u otra terapia contra el rechazo. Dicha terapia combinada puede ser una terapia secuencial en donde el paciente se trata en primer lugar con una modalidad de tratamiento (por ejemplo, un fármaco o una terapia) y luego con la otra (por ejemplo, un fármaco o una terapia), y así sucesivamente, o bien todos los fármacos y/o terapias pueden ser administrados simultáneamente. En cualquier caso, se dice que estos fármacos y/o terapias se "administran conjuntamente". Debe entenderse que "administrado conjuntamente" no significa necesariamente que los fármacos y/o las terapias se administren de forma combinada (es decir, pueden administrarse por separado o conjuntamente en el mismo sitio o en sitios diferentes en el mismo o en diferentes momentos).

La expresión "derivado farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un éster, de un compuesto; que, tras su administración al receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto o un metabolito activo o un residuo del mismo. Dichos derivados son conocibles por los expertos en la materia, sin una excesiva experimentación. No obstante, se hace referencia a la enseñanza de Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5a edición, vol. 1: Principles and Practice. Algunos derivados farmacéuticamente aceptables incluyen sales, solvatos, ésteres, carbamatos y/o ésteres de fosfato.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz", utilizadas indistintamente, aplicadas a una dosis o cantidad, se refieren a una cantidad de una composición, un compuesto o una formulación farmacéutica que es suficiente para dar como resultado una actividad deseada tras su administración a un animal que lo necesite. Dentro del contexto de la presente divulgación, la expresión "terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de una composición, un compuesto o una formulación farmacéutica que es suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma de una enfermedad o afección especificada en el presente documento, por ejemplo, fibrosis de un aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto. Cuando se administra una combinación de principios activos, la cantidad eficaz de la combinación puede incluir o no cantidades de cada principio que habrían sido eficaces si se hubieran administrado individualmente. La dosis de la formulación terapéutica variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad o afección, de los antecedentes médicos del paciente, de la frecuencia de administración, del modo de administración, de la eliminación del agente del hospedador, y similares. La dosis inicial puede ser mayor, seguida de dosis de mantenimiento menores. La dosis puede administrarse, por ejemplo, semanalmente, cada dos semanas, diariamente, bisemanalmente, etc., para mantener un nivel posológico eficaz.

Las dosis terapéuticamente eficaces pueden determinarse paso a paso mediante combinaciones de enfoques tales como (i) la caracterización de las dosis eficaces de la composición o del compuesto en ensayos de cultivo celular in vitro usando el crecimiento y/o la supervivencia de células tumorales como lectura, seguido de (ii) la caracterización en estudios con animales usando la inhibición del crecimiento tumoral y/o la supervivencia de los animales como lectura, seguido de (iii) la caracterización en ensayos en seres humanos usando la disminución de la fibrosis y/o la disminución del rechazo del aloinjerto como lectura.

Como se utiliza en el presente documento, La expresión "ácido nucleico" u "oligonucleótido" se refiere a un desoxirribonucleótido o un ribonucleótido en forma mono o bicatenaria. La expresión abarca también estructuras similares a ácidos nucleicos con cadenas principales sintéticas. Los análogos de cadena principal del ADN proporcionados por la divulgación incluyen fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquilo, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno (metilimino), 3'-N-carbamato, carbamato de morfolino y ácidos nucleicos peptídicos (PNA); véase Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, edición de F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, volumen 600, Eds. Baserga y Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36: 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los PNA contienen cadenas principales no iónicas, tales como unidades de N-(2-aminoetil) glicina.

Los enlaces de fosforotioato se describen en los documentos WO/97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197. Otras cadenas principales sintéticas englobadas en el término incluyen enlaces metilfosfonato o enlaces alternantes metil-fosfonato y fosfodiéster (Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692 8698), y enlaces bencilfosfonato (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156). La expresión ácido nucleico se usa de forma intercambiable con ADNc, ARNc, ARNm, oligonucleótido, sonda y producto de amplificación.

Las expresiones "microARN", "miR" y "miARN" se usan de forma intercambiable y, como se utilizan en el presente documento, tienen el mismo significado que el típico en la técnica, es decir, a un transcrito de ARN procesado o sin procesar que es capaz de regular la actividad de un ARNm objetivo. El transcrito del gen miR sin procesar también se denomina "miR precursor", y comprende normalmente un transcrito de ARN de aproximadamente 70-100 nucleótidos de longitud. El miR precursor puede ser procesado por digestión con un ARNsec en una molécula de ARN activa de 19-25 nucleótidos. Esta molécula de ARN activa de 18-25 nucleótidos también se denomina transcrito del gen del miR "procesado" o miARN "maduro".

La expresión "hibridación de ácidos nucleicos" se refiere al apareamiento entre ácidos nucleicos de cadenas complementarias. El mecanismo de apareamiento implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser de Watson-Crick, enlaces de hidrógeno de Hoogsteen o Hoogsteen invertidos, entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias (nucleobases) de las cadenas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparean mediante la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede producirse en diversas circunstancias. Las moléculas de ácidos nucleicos son "hibridables" entre sí cuando al menos una cadena de una molécula de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con las bases complementarias de otra molécula de ácido nucleico en condiciones de rigurosidad definidas. La rigurosidad de la hibridación se determina, por ejemplo, mediante (a) la temperatura a la que se realiza la hibridación y/o el lavado, y (ii) la fuerza iónica, y (iii) la concentración de desnaturalizantes, tales como formamida, de las soluciones de hibridación y de lavado, así como otros parámetros. La hibridación requiere que los dos cadenas contengan secuencias sustancialmente complementarias. Dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, sin embargo, se puede tolerar un cierto grado de emparejamiento incorrecto. En condiciones de "baja rigurosidad", es tolerable un mayor porcentaje de emparejamientos incorrectos (es decir, no se impedirá la formación de un híbrido antiparalelo). Véase Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3a ed., Nueva York y Londres: Garland Publ., 1994, cap. 7.

Normalmente, la hibridación de dos cadenas con una alta rigurosidad requiere que las secuencias muestren un alto grado de complementariedad a lo largo de una amplia porción de su longitud. Algunos ejemplos de condiciones de alta rigurosidad incluyen: hibridación con el ADN unido al filtro en NaHPO40,5 M, con un 7 % de SDS, EDTA 1 mM a 65 °C, seguido de un lavado con 0,1 x SSC/0,1 % de SDS (donde lx de SSC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,15 M) a 68 °C o para los inhibidores de oligonucleótidos (oligo) lavando con 6 x SSC/0,5 % de pirofosfato de sodio aproximadamente a 37 °C (para oligos de 14 nucleótidos de longitud), aproximadamente a 48 °C (para oligos de aproximadamente 17 nucleótidos de longitud), aproximadamente a 55 °C (para oligos de 20 nucleótidos de longitud) y aproximadamente a 60 °C (para oligos de 23 nucleótidos de longitud).

Las condiciones de rigurosidad intermedia o moderada (tales como, por ejemplo, una solución acuosa de 2 x SSC a 65 °C; alternativamente, por ejemplo, hibridación con el ADN unido al filtro en NaHPO4 0,5 M, con un 7 % de SDS, EDTA 1 mM a 65 °C seguido de un lavado con 0,2 x SSC/0,1 % de SDS a 42 °C) y de baja rigurosidad (tales como, por ejemplo, una solución acuosa de 2 x SSC a 55 °C), requieren una complementariedad global correspondientemente menor para que se produzca la hibridación entre dos secuencias. Las condiciones específicas de temperatura y sal para cualquier reacción de hibridación rigurosa dependen de la concentración de la molécula de ADN o ARN objetivo y de la longitud y la composición de las bases de la sonda, y normalmente se determinan empíricamente en experimentos preliminares, que son rutinarios (véase Southern, J. Mol. Biol. 1975; 98: 503; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 2, cap. 9.50, CSH Laboratory Press, 1989; Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en la pág. 2.10.3). Una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en, por ejemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. ("Tijssen").

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones de hibridación convencionales" se refiere a las condiciones de hibridación que permiten la hibridación de dos moléculas de nucleótidos que tienen al menos un 50 % de identidad de secuencia. De acuerdo con una realización específica, pueden usarse unas condiciones de hibridación de mayor rigurosidad para permitir la hibridación únicamente de secuencias que tengan al menos un 75 % de identidad de secuencia, al menos un 80 % de identidad de secuencia, al menos un 90 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "en condiciones de hibridación" significa en unas condiciones que faciliten la hibridación específica de un subconjunto de oligonucleótidos de captura con secuencias complementarias presentes en el ADNc o el ARNc. Las expresiones "hibridar específicamente con" e "hibridación específica" e "hibridar selectivamente con", como se utilizan en el presente documento, se refieren a la unión, la duplicación o la hibridación de una molécula de ácidos nucleicos preferentemente con una secuencia de nucleótidos particular en unas condiciones al menos moderadamente rigurosas, y preferentemente, en unas condiciones altamente rigurosas, como se ha analizado anteriormente.

Métodos de diagnóstico

La presente invención se refiere a métodos útiles para la caracterización de (por ejemplo, la evaluación clínica, el diagnóstico, la clasificación, la predicción, la identificación genética) del riesgo de que el receptor de un aloinjerto desarrolle fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto tomando como base los niveles o la aparición de determinados analitos (por ejemplo, miARN).

En una realización, se proporciona un método de diagnóstico para evaluar si el receptor de un aloinjerto tiene un riesgo mayor de lo normal de desarrollar fibrosis del aloinjerto y/o aloinjerto, que comprende las etapas de comparar el nivel de expresión de 4 marcadores de miARN en la muestra con el nivel normal de expresión del marcador en un control, por ejemplo, una muestra de un individuo sano.

Un nivel alterado, incluyendo, por ejemplo, un nivel de expresión significativamente alterado de los 4 marcadores de miARN en la muestra del receptor en comparación con el nivel de control (por ejemplo, normal) es una indicación de que el paciente presenta riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto.

Como se utiliza en el presente documento, los niveles se refieren a la cantidad o concentración de un analito en una muestra (por ejemplo, una muestra de plasma o de suero) o en un sujeto. Mientras que la aparición se refiere a la presencia o ausencia de un analito detectable en una muestra. Por lo tanto, el nivel es un indicador continuo de la cantidad, mientras que la aparición es un indicador binario de un analito. En algunos casos, una aparición puede determinarse usando un nivel umbral por encima del cual un biomarcador está presente y por debajo del cual un biomarcador está ausente.

Los marcadores de miARN descritos en el presente documento son particularmente útiles para caracterizar (por ejemplo, valorar o evaluar) el riesgo de que el receptor de un aloinjerto desarrolle fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto. Además, los métodos descritos en el presente documento son útiles para diagnosticar el riesgo de que el receptor de un aloinjerto desarrolle fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto. Como se utiliza en el presente documento, el diagnóstico incluye tanto el diagnóstico como la ayuda al diagnóstico. Por lo tanto, pueden evaluarse otros criterios de diagnóstico junto con los resultados de los métodos para hacer un diagnóstico.

De acuerdo con algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de expresión (es decir, determinar el nivel, midiendo la cantidad o midiendo el nivel) de cada (es decir, de todos) los miARN dentro de un grupo de moléculas de miARN (por ejemplo, hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p).

Los niveles de los analitos pueden obtenerse para un sujeto mediante cualquier método reconocido en la técnica. Normalmente, el nivel se determina midiendo el nivel del metabolito en un líquido corporal (muestra clínica), por ejemplo, sangre, suero o plasma. El nivel puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una (q)PCR cuantitativa o una micromatriz, u otras técnicas conocidas para determinar la presencia y/o la cantidad de miARN.

En algunos casos, los métodos divulgados en el presente documento implican la comparación de los niveles de expresión o de las apariciones con una referencia. La referencia puede adoptar diversas formas. En algunos casos, la referencia comprende unos valores predeterminados para la pluralidad de miARN (por ejemplo, cada uno de la pluralidad de miARN). El valor predeterminado puede adoptar diversas formas. Puede ser un nivel o la aparición de un analito obtenido a partir del receptor de un aloinjerto diagnosticado previamente como en riesgo de fibrosis del aloinjerto y de pérdida de aloinjerto, u obtenido a partir del receptor de un aloinjerto que se sabe que no está en riesgo de fibrosis del aloinjerto y de pérdida de aloinjerto (por ejemplo, un sujeto asintomático). Puede ser un nivel o una aparición obtenida a partir de un sujeto que no haya recibido un aloinjerto renal. Puede ser un nivel o una aparición en el mismo receptor, por ejemplo, en un punto temporal diferente. Un valor predeterminado que representa un nivel o niveles de un analito se denomina en el presente documento nivel predeterminado. Un nivel predeterminado puede ser un valor de corte único, total como una mediana o una media. Puede ser un intervalo de valores de corte (o umbral), tal como un intervalo de confianza. Puede establecerse sobre la base de grupos comparativos, tal como cuando el riesgo en un grupo definido es una vez más alto, o más bajo, (por ejemplo, aproximadamente 2 veces, 4 veces, 8 veces, 16 veces o más) que el riesgo en otro grupo definido. Puede ser un intervalo, por ejemplo, donde una población de sujetos (por ejemplo, sujetos de control) se divide de forma equitativa (o desigual) en grupos, tal como un grupo de riesgo bajo, un grupo de riesgo medio y un grupo de riesgo alto, o en cuartiles, siendo el cuartil más bajo los sujetos con menor riesgo y el cuartil más alto los sujetos con mayor riesgo, o en n-cuantiles (es decir, n intervalos regularmente espaciados) siendo el más bajo de los n-cuantiles los sujetos con menor riesgo y el más alto de los n-cuantiles los sujetos con mayor riesgo. Además, la referencia podría ser una referencia calculada, preferentemente la media o la mediana, para la cantidad relativa o absoluta de un analito de una población de individuos que comprenden el sujeto que se va a investigar. Las cantidades absolutas o relativas de los analitos de dichos individuos de la población pueden determinarse como se especifica en cualquier otro sitio del presente documento. Cómo calcular un valor de referencia adecuado, preferentemente, la media o la mediana, es bien conocido en la técnica. La población de sujetos a la que se hace referencia anteriormente comprenderá una pluralidad de sujetos, preferentemente, al menos 5, 10, 50, 100, 1.000 sujetos. Debe entenderse que el sujeto que se va a diagnosticar mediante el método de la presente invención y los sujetos de dicha pluralidad de sujetos son de la misma especie.

Los sujetos asociados a unos valores predeterminados se denominan normalmente sujetos de control (o controles). Un sujeto de control puede haber recibido o no un aloinjerto renal. En algunos casos puede ser deseable que el sujeto de control sea un sujeto sintomático, y en otros casos puede ser deseable que un sujeto de control sea un sujeto asintomático.

En algunos métodos del presente documento, es deseable detectar y cuantificar los ARN, incluyendo los miARN, presentes en una muestra. La detección y la cuantificación de la expresión del ARN se puede conseguir mediante uno cualquiera de numerosos métodos bien conocidos en la técnica. Usando las secuencias conocidas para los miembros de la familia de miARN, se pueden diseñar sondas y cebadores específicos para usar en los métodos de detección descritos a continuación, según sea apropiado.

Un nivel, en algunas realizaciones, puede ser en sí mismo un nivel relativo que refleja una comparación de niveles entre dos estados. Los niveles relativos que reflejan una comparación (por ejemplo, relación, diferencia, diferencia logarítmica, cambio porcentual, etc.) entre dos estados (por ejemplo, sano y enfermo) pueden denominarse valores delta. El uso de niveles relativos es beneficioso en algunos casos porque, hasta cierto punto, excluyen las variaciones relacionadas con la medición (por ejemplo, personal de laboratorio, laboratorios, dispositivos de medición, lotes/preparaciones de reactivos, kits de ensayo, etc.). Sin embargo, la invención no está limitada de esta manera.

Los niveles de expresión y/o los niveles de expresión de referencia pueden almacenarse en un medio de almacenamiento de datos adecuado (por ejemplo, una base de datos) y están, por lo tanto, también disponible para futuros diagnósticos. Esto permite también diagnosticar eficazmente la prevalencia de una enfermedad, ya que se pueden identificar resultados de referencia adecuados en la base de datos una vez que se ha confirmado (en el futuro) que el sujeto a partir del cual se obtuvo la muestra de referencia correspondiente desarrolló fibrosis del aloinjerto y/o experimentó un rechazo del aloinjerto. Como se usa en el presente documento, una "base de datos" comprende los datos recogidos (por ejemplo, información del nivel del analito y/o de la referencia y/o información del paciente) en un medio de almacenamiento adecuado. Además, la base de datos, puede comprender además un sistema de gestión de la base de datos. El sistema de gestión de la base de datos está, preferentemente, basado en una red de trabajo, un sistema de gestión de bases de datos jerárquico u orientado a objetos. Más preferentemente, la base de datos se implementará como un sistema distribuido (federal), por ejemplo, como un sistema cliente-servidor. Más preferentemente, la base de datos está estructurada para permitir que un algoritmo de búsqueda compare un conjunto de datos de ensayo con los conjuntos de datos comprendidos por la recogida de datos. Específicamente, usando dicho algoritmo, se pueden buscar en la base de datos conjuntos de datos similares o idénticos que sean indicativos de riesgo de rechazo del aloinjerto renal. Por lo tanto, si se puede identificar un conjunto de datos idéntico o similar en la recogida de datos, el conjunto de datos del ensayo se asociará con el riesgo de rechazo del aloinjerto renal. Por consiguiente, la información obtenida a partir de la recogida de datos se puede usar para diagnosticar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto desarrolle fibrosis del aloinjerto y/o la pérdida del aloinjerto o tomando como base un conjunto de datos de ensayo obtenidos a partir de un sujeto. Más preferentemente, la recogida de datos comprende valores característicos de todos los analitos comprendidos por uno cualquiera de los grupos enumerados anteriormente.

También se proporcionan bases de datos de firmas de expresión génica/proteínas de diferentes categorías de trasplantes, por ejemplo, AR, STA, NS y similares. Las firmas de expresión génica/proteínas y las bases de datos de las mismas pueden proporcionarse en una variedad de medios para facilitar su uso (por ejemplo, en un formato accesible/legible para el usuario). "Medios" se refiere a una fabricación que contiene información sobre el perfil de expresión de la presente divulgación.

Las bases de datos se pueden registrar en medios legibles por ordenador, por ejemplo, cualquier medio que se pueda leer y al que el usuario pueda acceder directamente empleando un ordenador. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnético, tales como discos flexibles, medios de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento ópticos tales como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctricos tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. Un experto en la materia puede apreciar fácilmente cómo cualquiera de los actuales medios legibles por ordenador se pueden usar para crear una fabricación que comprenda un registro de información de la presente base de datos. "Grabado" se refiere a un proceso para almacenar información en un medio informático legible, usando cualquiera de dichos métodos como es conocido en la técnica. Se puede elegir cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, sobre la base de los medios usados para acceder a la información almacenada. Para el almacenamiento se pueden usar diversos programas y formatos de procesamiento de datos, por ejemplo, ficheros de procesadores de texto, formato de bases de datos, etc. Por lo tanto, las bases de datos de perfiles de expresión del sujeto son accesibles por un usuario, es decir, los archivos de la base de datos se guardan en un formato legible por el usuario (por ejemplo, un formato legible por ordenador, donde un usuario controla el ordenador).

En un aspecto, los métodos divulgados en el presente documento comprenden el diagnóstico del riesgo del receptor, incluyen el cálculo del riesgo del receptor aplicando los niveles de expresión determinados en la muestra del receptor a un modelo de ajuste por regresión logística penalizado. En algunas realizaciones, el modelo de ajuste por regresión logística penalizado a partir del cual se calculará el riesgo utiliza la fórmula:

i° gT ( ;k = P V P * ig i+P*¡g¡+- P*4g4

donde (p(x) es la probabilidad de desarrollar fibrosis, p*i es el coeficiente penalizado y gi es el valor de la expresión del miARN i. El modelo de ajuste por regresión logística penalizado puede usarse para calcular una puntuación de probabilidad que represente el riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. La puntuación de probabilidad puede determinarse usando un sistema informático. En algunos aspectos, la puntuación de probabilidad se usa para determinar el valor de corte.

Como se utiliza en el presente documento, "un sistema informático" se refiere a medios de soporte físico, medios de soporte lógico y medios de almacenamiento de datos usados para analizar la información de la presente invención. El soporte físico mínimo de los sistemas informáticos de la presente invención comprende una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto puede apreciar fácilmente que uno cualquiera de los sistemas informáticos disponibles actualmente es adecuado para su uso en la presente invención. Los medios de almacenamiento de datos pueden comprender cualquier fabricación que comprenda un registro de la presente información como se ha descrito anteriormente, o un medio de acceso a memoria que pueda acceder a dicha fabricación.

Se pueden usar diversos formatos estructurales para los medios de entrada y de salida para introducir y extraer la información de los sistemas informáticos de la presente divulgación, por ejemplo, para y desde un usuario. Un formato para un medio de salida clasifica los perfiles de expresión que poseen grados variables de similitud con un perfil de expresión de referencia. Dicha presentación proporciona al experto una clasificación de similitudes e identifica el grado de similitud contenido en el perfil de expresión del ensayo.

En una realización típica, un laboratorio clínico obtendrá el valor de la expresión usando una muestra del paciente y la enviará al médico del paciente. El médico comunicará a continuación este valor a su proveedor de servicios basado en la red. El proveedor de servicios introducirá ese valor en el sistema bioinformático que ya tiene el coeficiente penalizado para cada gen del conjunto de genes preseleccionado y el valor de corte a partir del modelo de regresión logística del conjunto de entrenamiento. El sistema bioinformático usará esta información para calcular la puntuación de probabilidad del paciente. La puntuación calculada reflejará el estado de riesgo del paciente.

La divulgación proporciona además la comunicación de los resultados del ensayo o los diagnósticos, o ambos, a los técnicos, médicos o pacientes, por ejemplo. En ciertas realizaciones, los ordenadores se usarán para comunicar los resultados del ensayo o los diagnósticos, o ambos, a las partes interesadas, por ejemplo, los médicos y sus pacientes.

En algunas realizaciones, el método divulgado en el presente documento comprende además modificar la historia clínica del receptor para identificar si el receptor está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto. La historia clínica puede almacenarse en cualquier medio de almacenamiento de datos adecuado (por ejemplo, un medio legible por ordenador).

En algunas realizaciones se comunica al receptor del aloinjerto un diagnóstico basado en los métodos proporcionados en el presente documento tan pronto como sea posible una vez que se ha obtenido el diagnóstico. El diagnóstico puede ser comunicado al receptor por el médico responsable del tratamiento del receptor. Alternativamente, el diagnóstico se puede enviar a un receptor por correo electrónico o comunicarse al sujeto por teléfono. El diagnóstico se puede enviar a un receptor en forma de un informe. Se puede usar un ordenador para comunicar el diagnóstico por correo electrónico o por teléfono. En ciertas realizaciones, el mensaje que contiene los resultados de una prueba diagnóstica puede generarse y enviarse automáticamente al receptor usando una combinación de soporte físico y soporte lógico informático con la que estarán familiarizados los expertos en telecomunicaciones.

Algunos aspectos incluyen productos de programas informáticos para identificar un sujeto que se ha sometido a un aloinjerto renal y que está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, en donde el producto de programa informático, cuando se carga en un ordenador, está configurado para emplear un resultado de la expresión del miARN de una muestra obtenida del sujeto para determinar si un sujeto que se ha sometido a un aloinjerto renal está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida de aloinjerto, en donde el resultado de la expresión génica comprende los datos de la expresión de al menos el grupo de los 4 miARN proporcionados en el presente documento.

Se proporcionan también perfiles de expresión de referencia para un fenotipo que es uno de: (a) riesgo bajo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto; o (b) riesgo alto de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto; en donde el perfil de expresión se registra en un medio legible por ordenador al que puede acceder un usuario, por ejemplo, en un formato legible por un usuario. En ciertas realizaciones, el perfil de expresión incluye. En ciertas realizaciones, el perfil de expresión es un perfil de un fenotipo que es de riesgo bajo. En ciertas realizaciones, el perfil de expresión es un perfil de un fenotipo que es de riesgo alto.

La invención también puede proporcionar kits para evaluar los niveles de expresión del miARN en un sujeto (por ejemplo, un receptor de un aloinjerto renal). Los kits de la invención pueden tomar diversas formas. Normalmente, los kits incluirán los reactivos adecuados para determinar los niveles de expresión del miARN (por ejemplo, los divulgados en el presente documento) en una muestra. Opcionalmente, los kits pueden contener una o más muestras del control. También, los kits, en algunos casos, incluirán información escrita (indicios) que proporcionen una referencia (por ejemplo, valores predeterminados), en donde una comparación entre los niveles de expresión del miARN del sujeto y la referencia (valores predeterminados) es indicativa de un estado clínico.

En algunos casos, los kits comprenden un soporte lógico útil para comparar los niveles de expresión o las apariciones del miARN con una referencia (por ejemplo, un modelo predictivo). Normalmente, el soporte lógico se proporcionará en un formato legible por ordenador, tal como un disco compacto, pero también puede estar disponible para su descarga a través de Internet. Sin embargo, los kits no están limitados de esta manera y otras variaciones serán evidentes para un experto en la materia. Los presentes métodos pueden también usarse para seleccionar un tratamiento y/o determinar un plan de tratamiento para un sujeto, tomando como base la aparición o los niveles del miARN (por ejemplo, los divulgados en el presente documento). En algunas realizaciones, usando los métodos divulgados en el presente documento, un profesional sanitario (por ejemplo, un médico) identifica que un receptor está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto, y, basándose en esta identificación, el profesional sanitario determina un plan de gestión adecuado para el sujeto. En algunas realizaciones, usando el método divulgado en el presente documento, un profesional sanitario (por ejemplo, un médico) diagnostica que un receptor está en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y/o pérdida del aloinjerto basándose en la aparición o en los niveles de determinados miARN en una muestra clínica obtenida del sujeto, y/o basándose en una clasificación de una muestra clínica obtenida del sujeto. A través de este diagnóstico, el profesional sanitario determina un tratamiento adecuado o un plan de tratamiento para el sujeto, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además administrar el tratamiento al sujeto.

Un procedimiento ilustrativo que describe la aplicación de un grupo de 4 miARN como el descrito en el presente documento para el diagnóstico del riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto se proporciona como sigue:

1) Selección del grupo de entrenamiento: se seleccionará cuidadosamente un grupo de pacientes con trasplante de riñón con casos de alto y bajo riesgo (número total N = ~100). El grupo de entrenamiento debe tener una demografía bien caracterizada y unas indicaciones clínicas que han sido revisadas por al menos dos patólogos.

2) Medición de la expresión de 4 miARN: se medirán los niveles de expresión de 4 miARN procedentes de la muestra de sangre después del trasplante de cada paciente del grupo de entrenamiento mediante tecnología de micromatriz, RT-PCR o Nanostring. El uso de estas técnicas se describe en los siguientes ejemplos.

3) Establecimiento de un modelo de regresión y corte: a continuación se aplicará un modelo de ajuste por regresión logística penalizado usando el paquete logistf R sobre los valores de la expresión de los 4 miARN para derivar el modelo estadístico a partir del cual se derivará el valor p* de cada miARN y se calculará la puntuación de probabilidad de rechazo agudo para cada paciente.

l o g - ^ =PVP*igi+P*¡g¡+..+P*4g4

donde (p(x) es la probabilidad de desarrollar fibrosis, p*i es el coeficiente penalizado y gi es el valor de la expresión del miARN i.

Tomando como base la puntuación de probabilidad, la estadística predictiva, tal como la predicción del AUC (área bajo la curva) de la curva ROC (característica operativa del receptor) de la tasa de verdaderos positivos con respecto a la tasa falsos positivos, la sensibilidad/especificidad, se determinarán los valores positivos (PPV) y los valores predictivos negativos (NPV). A una especificidad dada (90 %), se establecerá un corte de la puntuación de probabilidad que prediga mejor el desarrollo de fibrosis. Esto puede ser una división clara entre dos grupos, en los que si están en el grupo superior tendrán una probabilidad alta de desarrollar fibrosis y el ensayo se considera positivo, pero si están en el grupo inferior tendrán una probabilidad muy baja de desarrollar fibrosis y el ensayo se considera negativo. La alternativa es que los pacientes se dividan en terciles tomando como base su puntuación de probabilidad determinada como anteriormente. En este caso, si el paciente está en (1) el tercil superior tiene una probabilidad alta de desarrollar fibrosis y el ensayo se considera positivo; (2) están en el segundo tercil o grupo intermedio no se puede determinar con precisión su riesgo; y (3) están en el tercil inferior, tienen una probabilidad muy baja de desarrollar fibrosis y el ensayo se considera negativo.

El coeficiente (valor p*) y el valor de corte derivados a partir del grupo de entrenamiento se introducirán y almacenarán en un sistema bioinformático basado en la red al que se puede acceder desde el laboratorio clínico/consulta del médico a través de Internet.

4) Criterios de diagnóstico: Para un nuevo paciente, los niveles de expresión del conjunto de 4 miARN se medirán con la misma tecnología usada para el conjunto de entrenamiento en el laboratorio clínico. Usando un sistema bioinformático basado en la red, la puntuación de probabilidad se calculará compendiando el valor de la expresión (gi) del miARN multiplicado por sus valores pi que se derivan a partir del conjunto de entrenamiento, y la puntuación de probabilidad se comparará con el valor de corte para determinar la probabilidad de desarrollar fibrosis. El resultado clínico enviará los resultados del ensayo al médico, donde si el resultado de la muestra está por encima de nuestro valor de corte para una probabilidad alta de fibrosis, el ensayo se comunicará como positivo, y si está por debajo de nuestro valor de corte para una probabilidad baja de fibrosis, se comunicará como negativo.

5) Tratamiento: Si las pruebas indican que el paciente tiene un alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, puede tratarse, por ejemplo, y sin limitación, mediante la administración al receptor del aloinjerto de un fármaco antifibrótico o un cambio en la inmunosupresión.

Métodos de tratamiento

En algunas realizaciones de la divulgación, los métodos divulgados en el presente documento incluyen el tratamiento del receptor del aloinjerto para inhibir la fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto (rechazo) si el receptor del aloinjerto se ha diagnosticado como de riesgo (por ejemplo, de alto riesgo) de fibrosis del aloinjerto y de pérdida del aloinjerto. Los métodos para determinar si un paciente es de alto riesgo y debe ser tratado con una intervención, se han descrito anteriormente.

En algunas realizaciones, el tratamiento incluye la modificación del régimen de inmunosupresión del receptor del aloinjerto, tal como, por ejemplo, administrando, interrumpiendo la administración o ajustando la dosis de uno o más fármacos inmunosupresores, que incluyen, por ejemplo, o uno o más fármacos contra el rechazo.

En algunas realizaciones, el tratamiento incluye la administración al receptor del aloinjerto de un fármaco contra el rechazo al receptor del aloinjerto.

Los receptores de aloinjertos identificados como de alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto pueden tratarse, por ejemplo, y sin limitación, mediante la administración de fármacos inmunosupresores. La inmunosupresión se puede conseguir con muchos fármacos diferentes, que incluyen esteroides, anticuerpos dirigidos y CNI, tales como tacrólimus. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, un inhibidor de la calcineurina (CNI), tal como ciclosporina o tacrólimus, o un fármaco inmunosupresor menos fibrogénico tal como micofenolato de mofetilo (MMF) o sirólimus. La clase principal de inmunosupresores son los inhibidores de la calcineurina (CNI), que incluye tacrólimus (Prograf® y Advagraf®/Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) y genéricos de Prograf®) y ciclosporina (Neoral® y Sandimmune® (Novartis AG) y genéricos). Se pueden administrar también esteroides, tales como prednisona, para tratar a los pacientes que están riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. Algunos agentes antiproliferativos tales como micofenolato de mofetilo, micofenolato de sodio y azatioprina son también útiles en dichos tratamientos. De éstos, el tacrólimus es uno de los más potentes en cuanto a la supresión del sistema inmunitario. El fármaco contra el rechazo belatacept (Bristol Myers Squibb) también puede emplearse para el tratamiento de pacientes con riesgo de rechazo o de fibrosis.

Los receptores de aloinjertos identificados como de alto riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto pueden tratarse, por ejemplo, y sin limitación, mediante el tratamiento del receptor del aloinjerto con un fármaco antifibrótico o modificando el régimen de inmunosupresión de los receptores del aloinjerto. Por lo tanto, el tratamiento del receptor del aloinjerto puede incluir la administración, la interrupción de la administración o el ajuste la dosis de uno o más fármacos antifibróticos. En algunos aspectos, el fármaco antifibrótico puede incluir agentes antifibróticos tales como, por ejemplo, pirfenidona, relaxina, proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y factor de crecimiento hepático (HGF) 6.

La administración de un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA), tal como lisinopril, o de un bloqueante del receptor de la angiotensina II, tal como losartán, a dichos pacientes, también está dentro del alcance de la presente divulgación.

En algunos aspectos, el método incluye el cambio de la inmunosupresión de un inhibidor de la calcineurina a un fármaco que no esté asociado con el desarrollo de fibrosis, tal como el fármaco contra el rechazo belatacept, rapamicina o micofenolato de mofetilo.

Kits

En ciertas realizaciones, se proporcionan kits para determinar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto. En un ejemplo no limitativo, los reactivos para aislar el miARN, etiquetar el miARN y/o evaluar una población de miARN usando una matriz, se incluyen en un kit. El kit puede incluir además reactivos para crear o sintetizar sondas de miARN. Por lo tanto, los kits comprenderán, en medios contenedores adecuados, una enzima para etiquetar el miARN mediante la incorporación de nucleótidos etiquetados o de nucleótidos no etiquetados que se etiquetan posteriormente. También puede incluir uno o más tampones, tales como tampón de reacción, tampón de etiquetado, tampón de lavado o un tampón de hibridación, compuestos para preparar las sondas de miARN y componentes para aislar el miARN. Otros kits pueden incluir componentes para crear una matriz de ácidos nucleicos que comprenda oligonucleótidos complementarios de los miARN, y por lo tanto, pueden incluir, por ejemplo, un soporte sólido.

Para cualquier realización del kit, incluyendo una matriz, puede haber moléculas de ácidos nucleicos que contengan una secuencia que es idéntica o complementaria a la totalidad o parte de cualquiera de las secuencias del presente documento.

Los kits anteriores pueden incluir sondas de código de barras que hibridan específicamente con uno o más de hsamir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p (por ejemplo, para usar en el análisis Nanostring). Los kits pueden contener además uno o más reactivos de extracción del miARN y/o reactivos de hibridación.

En algunas realizaciones, los kits contendrán los cebadores para amplificar un miARN seleccionado del grupo que consiste en hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p; y, opcionalmente, que comprende cebadores para amplificar las secuencias de control, tales como, por ejemplo, cebadores para amplificar la beta actina (ACTB) y la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), ARN ribosómico 18S (para los ensayos de qPCR) y fragmentos de los mismos.

En otra realización, un kit puede contener un inhibidor de miARN (por ejemplo, dirigido a un miARN que está regulado por aumento en receptores de aloinjertos con riesgo alto de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto (por ejemplo, hsa-miR-128, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-378e, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-361-5p y hsa-miR-22-3p)).

Los kits, independientemente del tipo, comprenderán generalmente uno o más recipientes en los que se introducen los agentes biológicos y, preferentemente, están adecuadamente distribuidos en alícuotas. Los componentes de los kits pueden envasarse en un medio acuoso o en forma liofilizada. Los kits pueden comprender también uno o más excipientes, diluyentes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos no limitantes de excipientes, diluyentes y/o portadores farmacéuticamente aceptables incluyen agua exenta de ARNasa, agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución glucosada, tampones de reacción, tampones de etiquetado, tampones de lavado y tampones de hibridación.

El kit también puede incluir instrucciones para emplear los componentes del kit, así como el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden ser implementadas. Se contempla que dichos reactivos sean realizaciones de kits de la invención. También, los kits no se limitan a los elementos particulares identificados anteriormente, y pueden incluir cualquier reactivo usado para la manipulación o la caracterización del miARN.

También se contempla que cualquier kit, matriz u otra técnica o herramienta de detección, o cualquier método, pueda implicar la identificación genética de cualquiera de estos miARN. También, se contempla que cualquier realización analizada en el contexto de una matriz de miARN pueda implementarse con o sin el formato de matriz en los métodos de la invención; en otras palabras, cualquier miARN de un matriz de miARN puede ser cribado o evaluado en cualquier método de la invención de acuerdo con cualquier técnica conocida por los expertos en la materia. El formato de matriz no es necesario para implementar los métodos de cribado y de diagnóstico.

Los kits contemplados en el presente documento pueden contener además uno o más reactivos de extracción del ARNm y/o reactivos para la síntesis del ADNc.

Se contemplan los kits para usar matrices de miARN para aplicaciones terapéuticas, de pronóstico o de diagnóstico, y dichos usos. Los kits pueden incluir una matriz de miARN, así como información sobre un perfil de miARN patrón o normalizado para los miARN de la matriz. También, en ciertas realizaciones, se puede incluir en el kit ARN o ADN de control. El ARN de control puede ser un miARN que se puede usar como control positivo para el etiquetado y/o el análisis de la matriz.

Ensayo Nanostring

El kit de ensayo Nanostring incluirá:

1) Un conjunto de códigos personalizados (conjuntos de sondas de código de barras para un grupo de 4 miARN, incluyendo 3 miARN internos y controles negativos proporcionados por Nanostring)

2) El kit nCounter® Master que incluye nCounter Cartridge, nCounter Plate Pack y nCounter Prep Pack

3) El kit All prep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA, EE.UU.)

Experimentos Nanostring:

El ARN total se extraerá usando el kit All prep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante; las sondas de código de barras hibridarán con el ARN total en solución a 65 °C con el kit maestro. La sonda de captura capturará el objetivo que se va a inmovilizar para obtener los datos. Después de la hibridación, la muestra se transferirá a la nCounter Pre Station y la sonda/objetivo se inmovilizará en el nCounter Cartridge, y a continuación, las sondas se contarán mediante el nCounter Digital Analyzer.

Análisis de los datos transcriptómicos del miARN

Los datos de recuento bruto del analizador Nanostring se procesarán en el siguiente procedimiento: los datos de recuento bruto se normalizarán en primer lugar al recuento de los miARN constitutivos, y los miARN con unos recuentos inferiores a la mediana más 3 veces la desviación estándar de los recuentos de los controles negativos se eliminarán con el filtrado. Debido a la variación de datos resultante del lote de reactivos, el recuento de cada ARNm procedente de diferentes lotes de reactivos se calibrará multiplicando por un factor de la relación de los recuentos promediados de las muestras sobre diferentes lotes de reactivos. Los recuentos calibrados de diferentes lotes experimentales se ajustarán adicionalmente con el paquete ComBat.

Ensayo de qPCR o ensayo de matriz qPCR El kit de ensayo de qPCR incluye:

1) Recipiente de cebadores (8 tubos con un ensayo de qPCR por tubo para un grupo de 4 miARN y 3 miARN de referencia, y la sonda de control del ARN 5s). Los ensayos se pedirán a LifeTech, o las matrices de qPCR se depositarán con ensayos de qPCR en los pocillos de una placa de 96 pocillos

2) Síntesis de ADNc de miARN NCode™ VILO™

3) MATRIZ DE PLACAS DE 96 POCILLOS TaqMan® 6x16

4) Kits NCode™ EXPRESS SYBR® GreenER™ para qRT-PCR de miARN

Procedimiento experimental y análisis de datos:

El ARN total se extraerá a partir de muestras de biopsia de aloinjertos usando el kit All prep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA, EE.UU.). El Ad Nc se sintetizará usando la síntesis de ADNc de miARN NCode1M VILO™ (LifeTech). Los ensayos de qPCR TaqMan para los 4 miARN, los 3 miARN de referencia y los ARNr 5s se adquirirán en ABI Life Technology (Grand Island, NY). Los experimentos de qPCR se realizarán con ADNc usando los kits de qRT-PCR de miARN NCode™ EXPRESS Sy BR® GreenER™ (LifeTech) y las reacciones de PCR se controlarán y adquirirán usando un sistema ABI7900HT. Las muestras se medirán por triplicado. Se generarán valores por ciclo de tiempo (CT) para el conjunto de miARN predictivos, así como para las 3 referencias. El valor ACT de cada miARN se calculará restando el valor promedio de CT para el miARN de referencia del valor CT de cada miARN.

De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, inmunología, biología celular y otras técnicas relacionadas pertenecientes a la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology.

John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4a ed. Wiley-Liss; entre otros. Los protocolos actuales enumerados anteriormente se actualizan varias veces al año.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Métodos y materiales

Extracción del ARN total:

Se extrajo el ARN total de las muestras de sangre obtenidas a los 3 meses del trasplante usando el kit All prep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA, EE.UU.). La calidad del ARN se evaluó usando el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

Secuenciación del ARN:

Se extrajo el ARN total de muestras de sangre de 96 receptores 3 meses después del trasplante usando TRIzol, y la calidad del ARN se evaluó con el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Las colecciones se generaron siguiendo el protocolo del fabricante y se secuenciaron con el secuenciador Illumina HisSeq2000. En resumen, el ARNm se extrajo a partir de 2 |jg de ARN total usando perlas magnéticas de oligo-dT y se fragmentó a alta temperatura. A continuación, se preparó una colección de ADNc a partir del ARNm fragmentado mediante transcripción inversa, la síntesis de la segunda cadena y la ligación de adaptadores específicos. La secuenciación de última generación se llevó a cabo en el Illumina Hiseq 2000 con 51 ciclos de lectura simple. El análisis de imágenes y la llamada de bases se realizó en tiempo real mediante la línea de análisis de Illumina.

Los datos de ARNsec en bruto se procesaron de acuerdo con el siguiente procedimiento: en primer lugar se alinearon las lecturas de buena calidad con varias bases de datos de referencia humanas, incluyendo del genoma humano hgl9, de exones, de las uniones de empalme y de contaminación, que incluyen las secuencias de ARN ribosómico y mitocondrial, usando el algoritmo de alineación BWA. Después de filtrar las lecturas se cartografiaron con una base de datos de contaminación, las lecturas que se alinean de forma única con el exón y los sitios de unión-empalme con un máximo de 2 emparejamientos incorrectos para cada transcrito se contaron después como nivel de expresión para la correspondiente transcripción y se sometieron además a una normalización cuantílica de las muestras cruzadas después de la transformación log2.

Experimentos Nanostring:

La identificación genética del miARN de las muestras de sangre de 102 pacientes trasplantados se realizó con Nanostring siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se usó el ensayo de expresión de microARN V2 humano NanoString nCounter sobre 800 miARN humanos (NanoString Technologies) para hibridar 100 ng de miARN introducidos con sondas de código de barras específicas del objetivo. La muestra se inmovilizó en un nCounter Cartridge usando la nCounter Prep Station, y las sondas se contaron después con el nCounter Digital Analyzer.

Análisis de los datos transcriptómicos del microARN

Los datos de recuento bruto del analizador Nanostring se procesaron con el siguiente procedimiento (véase la figura 1). Los datos de recuento bruto se normalizaron a los primeros 100 microARN (miARN) expresados, y los miARN con unos recuentos inferiores a la mediana más 3 veces las desviaciones estándar de los recuentos de los controles negativos se eliminarán con el filtrado. Debido a la variación de datos resultante del lote de reactivos, el recuento de cada miARN procedente de diferentes lotes de reactivos se calibró multiplicando por un factor de la relación de los recuentos promediados de las muestras sobre diferentes lotes de reactivos. Los recuentos calibrados de diferentes lotes experimentales ajustaron adicionalmente mediante el paquete ComBat.

Para identificar los miARN expresados diferencialmente en pacientes con un CADI alto (>1) en comparación con un CADI bajo (<=1) (según la definición de Yilmaz et al., 2003, Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 14: 773-779), se aplicó el paquete bioconductor de análisis de variables sustitutas (SVA) sobre los datos ajustados por lotes para identificar y eliminar las variaciones desconocidas frente a estos dos grupos. A continuación, se realizó el ensayo LIMMA (modelos lineales para datos de micromatrices) para identificar los miARN expresados diferencialmente con un valor de p de corte <0,05.

Para investigar los procesos biológicos en los que podrían estar implicados los miARN expresados diferencialmente, se correlacionaron los datos de la expresión génica del ARNsec y los datos del miARN en los mismos pacientes. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de expresión del miARN y sus objetivos génicos previstos (http://www.microRNA.org) y los genes correlacionados negativamente se seleccionaron a p<0,05 y se sometieron al análisis de redes y al análisis de enriquecimiento de ontología génica.

Identificación del conjunto predictivo de miARN

Para identificar un conjunto de miARN óptimo para predecir la progresión de la fibrosis renal, los 102 pacientes se dividieron en conjunto de entrenamiento (N = 68) y conjunto de ensayo (N = 34). El conjunto de entrenamiento se sometió a un ajuste del SVA para eliminar las variables no deseadas para los grupos de CADI alto (CADI >1) y bajo (CADI<=1). Las características demográficas de los 102 pacientes (conjunto de entrenamiento (N = 68) y conjunto de ensayo (N = 34)) se proporcionan en la tabla 1.

Tabla 1.

Leyenda: Indice de daño crónico del aloinjerto (CADI) a los 12 meses;

Valor de P 1 - comparación entre la columna 2 y la columna 3, Valor de P 2 - comparación entre la columna 5 y la columna 6 (prueba de la t para datos independientes o prueba no paramétrica; ANOVA o medias no paramétricas)

Se realizó el ensayo LIMMA en el conjunto de entrenamiento ajustado por SVA para identificar los miARN expresados diferencialmente en los pacientes con un CADI alto (en comparación con un CADI bajo) y los datos de expresión de los miARN expresados diferencialmente se ajustaron en el modelo de regresión logística penalizado para la predicción de un CADI alto y bajo. Los miARN con una asociación significativa con un CADI alto/bajo (p<0,05) se identificaron como el conjunto predictivo óptimo del modelo de regresión. La puntuación del AUC y la sensibilidad y especificidad se calcularon a partir del modelo de regresión logística usando el conjunto de genes final. Comparamos las curvas de características operativas del receptor del conjunto óptimo final con conjuntos de genes seleccionados aleatoriamente de igual tamaño para predecir un CADI alto frente a uno bajo, para demostrar que el conjunto de genes óptimo final daba la mejor predicción. Se seleccionaron aleatoriamente mil conjuntos de miARN y se calcularon las AUC de estos conjuntos de miARN y se compararon con las AUC del conjunto óptimo final.

Este conjunto óptimo final se validó de forma cruzada usando un método de validación cruzada triple. (figura 9) En resumen, los pacientes se dividieron aleatoriamente en 3 grupos de igual tamaño e igual número de pacientes con CADI alto y bajo, y se usaron los datos de dos grupos cualesquiera como conjunto de entrenamiento y del tercero como conjunto predictivo. El modelo de regresión logística penalizado que se construyó en el conjunto de entrenamiento se aplicó en el conjunto predictivo para predecir el resultado y las tasas de verdaderos y falsos positivos. La exactitud de la predicción se calculó a partir del conjunto de datos predictivos y luego se promedió a partir de tres permutaciones posibles. Repetimos las etapas más de 100 veces. Se calcularon las tasas globales de verdaderos o falsos positivos y la precisión de la predicción. Se representó gráficamente la distribución de las AUC en el conjunto de ensayo tomando como base el modelo derivado usando el conjunto de entrenamiento para 100 iteraciones.

Por último, el conjunto predictivo se validó en el conjunto de ensayo. El modelo de SVA construido en el conjunto de entrenamiento se usó entonces para ajustar cada muestra del conjunto de ensayo, y el modelo de regresión logística construido en el conjunto de entrenamiento usando el conjunto predictivo se aplicó en el conjunto de entrenamiento ajustado para calcular la probabilidad de predicción para cada muestra.

Tomando como base estas probabilidades se trazó la curva ROC y se calculó la puntuación del AUC de la curva ROC. El modelo de regresión logística del conjunto de entrenamiento construido a partir de un conjunto de miARN seleccionados aleatoriamente también se aplicó al conjunto predictivo, y el AUC del conjunto de entrenamiento de 100 iteraciones de selección aleatoria del conjunto predictivo se comparó con el AUC original del conjunto óptimo.

Resultados

Análisis transcriptómico del miARN:

Para estudiar el papel de los miARN sanguíneos en el desarrollo de la fibrosis renal, se realizó una identificación genética de la expresión del miARN en muestras de sangre a los 3 meses del trasplante de 102 pacientes con trasplante de riñón usando el kit de ensayo de expresión humana Nanostring para la detección de 800 miARN humanos. Los datos se procesaron según el procedimiento representado en la figura 1, recuadro 1 ("Procesamiento de datos"). Tras la normalización y el filtrado riguroso, los 134 miARN finales pasaron el control de calidad con buena calidad, y los datos se ajustaron con éxito para las variaciones de los lotes de reactivos y de los lotes experimentales (figura 5). Hemos observado que los datos de dos muestras duplicadas de diferentes lotes/partidas eran muy reproducibles, con un coeficiente de correlación R > 0,94 (figura 6 y figura 7). Todo ello indicaba que se generaron datos de alta calidad con la tecnología NanoString.

Para identificar los miARN expresados diferencialmente en pacientes con puntuaciones de CADI alto con respecto a un CADI bajo, los datos normalizados se sometieron en primer lugar al análisis de variables sustitutas (SVA) para eliminar las variaciones entre dos grupos figura 8a y 8b). Los dos parámetros demográficos (género y raza) contribuyeron significativamente a la variación de los datos (figura 8a) y se eliminaron tras la corrección del SVA (figura 8b). El ensayo LIMMA sobre los datos ajustados con el SVA identificó 24 miARN expresados diferencialmente (13 regulados por aumento y 11 por disminución) con un valor de p de 0,05 en los pacientes con un CADI alto (figura 2). Los miARN que estaban regulados por aumento en el grupo con un CADI alto eran hsa-miR-128, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-378e, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-361-5p y hsa-miR-22-3p. Los miARN que estaban regulados por disminución en el grupo con un CADI alto eran hsa-miR-7b-5p, hsa-miR-199 l-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-7b-5p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-7g-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-1226-3p y hsa-miR-29b-3p. (figura 2)

El mir-128, un importante miARN sobreexpresado en muchos tipos de tumores, era el principal miARN regulado por aumento en los pacientes con un CADI alto. El mi29b-3p, conocido como supresor tumoral, era el más significativamente regulado por disminución en los pacientes con un CADI alto. Para esclarecer mejor los papeles funcionales de estos miARN expresados diferencialmente en la progresión de la fibrosis renal, se correlacionaron los datos de la expresión de los miARN y de sus objetivos predichos a partir de los ARNsec en los mismos pacientes (N = 96) y se identificaron los genes corregidos negativamente para cada miARN. Los datos demostraron una asociación de la regulación por aumento del mir-128 con la regulación por disminución de genes en la respuesta inmunitaria y la muerte celular, y la regulación por disminución del mir-29b-3p con la regulación por aumento de genes en la regulación de la transcripción, el ciclo celular y la reparación de daños en el ADN a través de las vías de señalización ATM (figuras 3a (mir-128) y 3b (mi29b-3p). Estos datos sugirieron el importante papel de los microARN en la regulación de la proliferación celular en sangre necesaria para el posterior desarrollo de la fibrosis renal.

Firma de miARN para predecir el riesgo de fibrosis renal en receptores de aloinjertos renales

Este ejemplo demuestra que pueden usarse ciertos miARN y conjuntos de miARN para predecir el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto.

Para identificar una potencial firma de miARN pronóstico para predecir el desarrollo de fibrosis renal y pérdida del aloinjerto, los 102 pacientes se dividieron en conjunto de entrenamiento (N = 68) y conjunto de ensayo (N = 34). Se determinó que 4 miARN (mir-128, mir-29b-3p, mir-302b-3p y mir-192-5p), que se derivaron a partir de los datos ajustados por SVA del conjunto de entrenamiento mediante un modelo de regresión logística penalizado, eran muy predictivos. Esta firma de 4-miARN (mir-128, mir-29b-3p, mir-302b-3p y mir-192-5p) tiene un AUC de predicción de 0,886 (figura 4a) que era superior a cualquier AUC derivada a partir de 4 miARN seleccionados aleatoriamente (figura 4b). La validación cruzada triple con 100 iteraciones mostró que el valor predictivo positivo (PPV) y el valor predictivo negativo (NPV) eran de 0,87 y 0,66, respectivamente, lo que sugiere que el ensayo es muy preciso. (figura 9)

Tras el ajuste de cada muestra del ensayo usando el modelo de SVA construido sobre el conjunto de entrenamiento, se aplicó un modelo de regresión logística de los 4 miARN del conjunto de entrenamiento para predecir el resultado del conjunto de entrenamiento independiente (N = 34) con un AUC de 0,882 (figura 10), que también es superior a cualquier AUC derivado a partir de 4 miARN seleccionados aleatoriamente.

Sumario

El estudio anterior describe la identificación genética del miARN usando la tecnología Nanostring en sangre periférica obtenida 3 meses después del trasplante de una cohorte de 102 pacientes con trasplante de riñón del estudio Genomics of Chronic Allograft Rejection (GoCAR).

El análisis LIMMA de los perfiles de expresión de los miARN identificó un conjunto de 24 miARN significativamente asociados con un CADI alto de ml2. La correlación de los perfiles de expresión del miARN con los perfiles de expresión génica del ARNsec en los mismos pacientes (N = 96) identificó los objetivos predichos de miARN correlacionados negativamente, y el enriquecimiento de ontología génica predijo además los procesos biológicos en los que podrían participar los miARN. El mir-128, que se sabe que desempeña un papel en la oncogénesis, fue el más significativamente regulado por aumento en los pacientes con un alto CADI y estaba asociado con genes de la respuesta inmunitaria y de la proliferación y la apoptosis celulares. El mir-29b-3p es el más regulado por disminución en los pacientes con un CADi alto y está asociado a los genes en la regulación de la transcripción, las vías de reparación del ADN a través de la vía ATM.

Además, los 102 pacientes se dividieron en conjunto de entrenamiento (N = 68) y conjunto de ensayo (N = 34), los 4 miARN (mir-128, mir-29b-3p,mir-302b-3p y mir-192-5p) se derivaron a partir del conjunto de entrenamiento para predecir los pacientes con alto y bajo CADI con un AUC de 0,886 usando un modelo de regresión logística penalizado con un valor de corte de la puntuación de probabilidad de 0,5. La validación cruzada triple indicó que el PPV y el NPV eran de 0,87 y 0,66, respectivamente. Estos 4 miARN fueron validados adicionalmente en un conjunto de entrenamiento independiente (N = 34) por el valor de corte con un AUC de 0,882, una sensibilidad del 83 %, una especificidad del 69 %, un PpV = 75 % y un NPV = 79 %.

La solidez de la predicción de estos 4 miARN (mir-128, mir-29b-3p, mir-302b-3p y mir-192-5p) se evaluó adicionalmente a un valor de corte del CADI diferente. En el valor de corte 2 del CADI (CADI bajo <=2 y CADI alto >2), los 4 miARN se mantuvieron significativamente expresados diferencialmente a p<0,05 entre los grupos de CADI bajo y alto. El AUC predictiva en el conjunto de entrenamiento (N = 68) fue de 0,86 usando el modelo de regresión logística penalizado, y se estableció el valor de corte de la puntuación de probabilidad en 0,75 a una FPR < 10 %. Estos 4 miARN fueron validados en el conjunto de ensayo (N = 34) por este valor de corte con un AUC de 0,86, una sensibilidad del 41 %, una especificidad del 100 %, un PPV = 100 % y un NPV = 63 %. En comparación con la predicción en el valor de corte 1 del CADI, la especificidad y el PPV aumentaron.

En resumen, la identificación genética del miARN reveló una firma molecular a partir de la sangre periférica y las funciones biológicas asociadas con el futuro desarrollo de la fibrosis del aloinjerto renal, y además identificó un potencial conjunto más pequeño para la predicción de la fibrosis del aloinjerto renal. Estos datos sugieren que la identificación genética del miARN periférico puede usarse como vigilancia para estratificar a los pacientes con riesgo de fibrosis y pérdida de aloinjertos, obviando la necesidad de una biopsia del aloinjerto, y para identificar aquellos que puedan beneficiarse de intervenciones tempranas para prevenir pérdidas crónicas del aloinjerto.

Mientras que la combinación de los cuatro de mir-128, mir-29b-3p, mir-302b-3p y mir-192-5p era altamente predictiva de un riesgo alto (AUC de 0,886), las subcombinaciones de los cuatro miARN, así como los miARN individuales, también eran predictivos del riesgo alto.

Por ejemplo, el miR-128 tenía un AUC de 0,77, el mir-29b-3p tenía un AUC de 0,65, pero menos exactitud que la predicción con 4 miARN.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar el riesgo de que el receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, método que comprende:

(a) determinar los niveles de expresión de cuatro microARN en una muestra de sangre obtenida a partir del receptor, en donde los microARN son hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p;

(b) comparar los niveles de expresión de los cuatro microARN con un nivel de control para cada microARN; y

(c) diagnosticar al receptor como de alto o de bajo riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto

(i) en donde el receptor se diagnostica como de alto riesgo si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están aumentados con respecto a un nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir de un conjunto de entrenamiento; o

(ii) en donde el receptor se diagnostica como de bajo riesgo si los niveles de expresión de hsa-miR-128 y hsa-miR-302b-3p están disminuidos con respecto al nivel de control para cada microARN, y los niveles de expresión de hsa-miR-29b-3p y hsa-miR-192-5p están aumentados con respecto al nivel de control para cada microARN, tomando como base el valor de corte de la puntuación de probabilidad determinado a partir del conjunto de entrenamiento.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación de los niveles de expresión comprende

(a) aislar el ARNm a partir de la muestra de sangre;

(b) sintetizar el ADNc a partir del ARNm; y

(c) medir los niveles de expresión de los microARN hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p de la muestra.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el diagnóstico del riesgo del receptor comprende el cálculo del riesgo del receptor mediante la aplicación de los niveles de expresión determinados en la muestra del receptor a un modelo de ajuste por regresión logística penalizado, usando la fórmula:

logT^)fP*0+p*1g1+p*¡g¡+- ■ p*4g4

4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la repetición del método al menos una vez.

5. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la determinación de los niveles de expresión de los miARN hsamir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p comprende la realización de un ensayo seleccionado del grupo que consiste en qPCR, una micromatriz y un análisis Nanostring, la hibridación del ADNc que comprende los microARN con sondas de código de barras específicas para los microARN, la inmovilización del ADNc y la cuantificación de las sondas unidas al ADNc mediante un analizador digital.

6. Un kit para determinar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, en donde el kit comprende sondas de código de barras que hibridan específicamente con hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p.

7. El kit de la reivindicación 6, que comprende además uno o más reactivos de extracción de microARN; un reactivo de hibridación; instrucciones de uso y/o cebadores para la amplificación de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p.

8. Un kit para determinar el riesgo de que un receptor de un aloinjerto renal desarrolle fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto, comprendiendo el kit reactivos adecuados para determinar los niveles de expresión en una muestra de sangre de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p; una o más muestras de control que comprenden niveles predeterminados de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p, en donde la comparación de los niveles de expresión de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p en una muestra de ensayo con los niveles de expresión en las muestras de control identifica a un receptor como en riesgo de desarrollar fibrosis del aloinjerto y pérdida del aloinjerto; e instrucciones de uso del kit; en donde el kit comprende cebadores para amplificar los hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p y hsa-mir-192-5p.

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