BR122020001099B1

BR122020001099B1 - Processos para a detecção de câncer de bexiga em indivíduos

Info

Publication number: BR122020001099B1
Application number: BR122020001099-1A
Authority: BR
Inventors: Parry John Guilford; Natalie Jane Kerr; Robert Pollock
Original assignee: Pacific Edge Biotechnology Ltd
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2021-12-14
Also published as: CA3147181A1; US11130789B2; CN114250299A; KR101652854B1; CA2616277A1; TW201734454A; JP2017104118A; ES2612482T3; CA2616277C; PT2444505T; JP6248297B2; EP2436779A1; TW201217787A; JP2018183162A; BRPI0513692B1; TWI540321B; CA2862993C; JP2008507558A; DK2434024T3; TWI585411B

Abstract

a detecção precoce de tumores é um determinante principal da sobrevivência de pacientes sofrendo de tumores, incluindo tumores de bexiga. os membros da família btm ou ubtm podem ser altamente e coerentemente acumulados no tecido tumoral de bexiga e outros tecidos tumorais e/ou ser acumulados na urina de paciente e assim são marcadores para câncer de bexiga e de outros tipos. em certas modalidades, btms ou ubtms podem se acumular na urina e a detecção dos membros da família ubtm pode ser uma abordagem para diagnóstico eficiente. em algumas modalidades, os processos de pcr quantitativa possuem vantagens sobre os processos de microarranjo. em outras modalidades, a detecção e a quantificação de um grande número de btms ou de ub-tms podem aumentar a sensibilidade e a especificidade da detecção do câncer de bexiga e, portanto, fornecem processos para a determinação do estágio e do tipo de câncer de bexiga. os kits fornecem maneiras convenientes fáceis para a realização dos processos desta invenção.

Description

Reivindicação de Prioridade

[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório da Nova Zelândia No: 534.289 depositado em 23 de julho de 2004 intitulado "Markers for Detection of Bladder Cancer" Requerente: Pacific Edge Biotechnology Ltd., ao Pedido de Patente Provisório da Nova Zelândia No: 539.219 depositado em 4 de abril de 2005 intitulado "Markers for Detection of Bladder Cancer" Requerente: Pacific Edge Biotechnology Ltd. e ao Pedido de Patente Provisório U.S. No: 60/692.619 depositado em 20 de junho de 2005 intitulado "Urine Markers for Detection of Bladder Cancer" Inventores: Parry John Guilford, Natalie Jane Kerr e Robert Pollock. Cada um dos pedidos de patentes anteriores é incorporado completamente aqui como referência.

Campo da Invenção

[0002] Esta invenção refere-se à detecção de câncer. Especificamente, esta invenção refere-se ao uso de marcadores para a detecção de câncer de bexiga. Mais especificamente, esta invenção refere-se ao uso de marcadores da urina para a detecção de câncer de bexiga. Ainda mais especificamente, esta invenção refere-se ao uso de marcadores de oligonucleotídeo, proteína e/ou anticorpo na urina para detecção, tipagem e determinação do estágio do câncer de bexiga.

Antecedentes Introdução

[0003] A sobrevivência de pacientes com câncer é enormemente aumentada quando o câncer é tratado precocemente. No caso do câncer de bexiga, os pacientes diagnosticados com a doença em estágio precoce possuem taxas de sobrevivência durante 5 anos de >90%, comparados com aproximadamente 15-30% para os pacientes diagnosticados com a doença avançada. Portanto, os desenvolvimentos que levam ao diagnóstico precoce de câncer de bexiga podem levar a um melhor prognóstico para os pacientes. O método estabelecido para a detecção de câncer de bexiga utilizando amostras de urina é a citologia. Entretanto, é sabido que a citologia é apenas aproximadamente 75% sensível para a detecção de câncer de bexiga invasivo e apenas aproximadamente 25% sensível para a detecção do câncer de bexiga superficial (Lotan e Roebrborn, Urology 61, 109-118 (2003)).

[0004] O câncer de bexiga é amplamente dividido em duas classes, invasivo e superficial. O tipo invasivo penetra nas camadas de tecido subjacentes, enquanto que o tipo superficial tende a se desenvolver primariamente na forma de um crescimento similar a pólipo no lúmen da bexiga.

[0005] A identificação de marcadores específicos para câncer na urina pode fornecer uma abordagem valiosa para o diagnóstico precoce do câncer, levando ao tratamento precoce e a um prognóstico melhor. Os marcadores específicos para câncer também fornecem um meio para monitorar a progressão da doença, possibilitando que a eficiência dos tratamentos cirúrgicos, radioterapêuticos e quimioterapêuticos seja monitorada. Entretanto, para um número de cânceres principais, os marcadores disponíveis sofrem de sensibilidade e especificidade insuficientes.

[0006] Atualmente, o método mais confiável para a detecção do câncer de bexiga é a cistoscopia acompanhada pela histologia de lesões que sofreram biópsia. Entretanto, esta técnica é demorada, invasiva e sua sensibilidade é de apenas aproximadamente 90%, significando que aproximadamente 10 por cento dos cânceres não são detectados utilizando estes métodos. Das metodologias não invasivas, a citologia da urina, que detecta células malignas esfoliadas microscopicamente, é o método preferido atual. Embora a citologia tenha uma especificidade de aproximadamente 95%, possui uma fraca sensibilidade (9-25%) para lesões de grau baixo, é extremamente dependente da qualidade da amostra e sofre de alta variabilidade interobservador.

[0007] Mais recentemente, foram feitas tentativas para detectar marcadores genéticos em biópsias da bexiga. O método mais comumente utilizado é a análise de microarranjo, em que um arranjo contendo oligonucleotídeos complementares às partes de um suposto marcador gênico é exposto a uma amostra de mRNA ou de cDNA obtida da amostra de um paciente. Utilizando estes métodos, vários relatos recentes identificaram um número de supostos marcadores para câncer de bexiga. Entretanto, a tecnologia de arranjo é relativamente não quantitativa e é altamente variável.

[0008] A detecção de sangue ou de marcadores na urina que indicam a presença de câncer de bexiga fornece um método potencial para a melhor detecção desta doença. Embora pouco progresso tenha sido feito com o desenvolvimento de marcadores do sangue para câncer de bexiga, estão disponíveis vários marcadores de proteínas na urina. Os testes para estes marcadores oferecem melhor sensibilidade que a citologia, mas tendem a sofrer de especificidade subótima porque os níveis elevados destes marcadores também são comumente observados em pacientes com doenças não-malignas incluindo inflamação, urolitiase e hiperplasia prostática benigna. Por exemplo, NMP22, que detecta uma proteína de matriz nuclear específica, possui uma sensibilidade de 47-87% e uma especificidade de 58-91%. A alta variabilidade de NMP22 significa que este pode não ser ideal para a detecção fácil rápida de câncer de bexiga.

[0009] Outros testes da urina incluem a amplificação pela RT-PCR de produtos da transcrição gênica, tal como hTERT com a enzima telomerase partindo da pélete de amostras de urina. Os testes de RT- PCR oferecem o potencial de alta sensibilidade, embora a especificidade de marcadores para RTPCR existentes permaneça obscura.

[00010] Há uma necessidade de ferramentas adicionais para a detecção e o diagnóstico precoces de câncer. Esta invenção fornece métodos, composições, kits e dispositivos adicionais com base nos marcadores para câncer, especificamente marcadores para câncer de bexiga, para auxiliar na detecção e no diagnóstico precoces do câncer.

Sumário da Invenção

[00011] Utilizando uma combinação de análises de microarranjo e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), foi possível identificar os marcadores genéticos específicos que são seletivos para câncer de bexiga. Em algumas modalidades, foram descobertos marcadores que podem ser utilizados para diferenciar o estágio de um tumor de bexiga e em outras modalidades, foram identificados marcadores que podem distinguir tipos de tumores. Em outras modalidades, foi descoberto de forma inesperada que combinações de dois ou mais marcadores podem fornecer uma detecção altamente confiável e sensível de câncer de bexiga. Ainda em modalidades adicionais, foram identificados marcadores que são altamente expressos em células de câncer de bexiga e não nas células sangüíneas. Assim, em muitas modalidades, os testes para câncer de bexiga são inesperadamente melhores que os testes da técnica anterior.

[00012] Em certas modalidades, a análise de microarranjo é utilizada para identificar genes que são altamente expressos no tecido tumoral de bexiga quando comparado com o tecido de bexiga não-maligno. Estes genes e as proteínas codificadas por estes genes, são denominados aqui marcadores de tumor de bexiga (BTM). Deve ser entendido que o termo BTM não requer que o marcador seja específico somente para tumores de bexiga. Ao invés disso, a expressão de BTM pode ser maior em outros tipos de tumores, incluindo tumores malignos. Deve também ser entendido que BTM inclui marcadores que não são altamente expressos nas células sangüíneas. Em virtude da amostragem da urina, a expressão de outros tipos de células comumente presentes nas amostras de biópsia da técnica anterior não está presente. O termo BTM também inclui combinações de marcadores individuais que são úteis para a detecção de câncer de bexiga.

[00013] Em outras modalidades, são fornecidos métodos para identificar a presença de marcadores nas amostras incluindo a imunohistoquímica e a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Os métodos de qPCR são menos susceptíveis a artefatos que são comuns nos métodos de microarranjo. Tais artefatos incluem diferenças no número de oligonucleotídeos ligantes colocados sobre um ponto de arranjo, na ligação desigual e imprevisível de corantes aos oligonucleotídeos hibridizados em um ponto do arranjo, na lavagem desigual de materiais inespecíficos dos pontos do arranjo e outros problemas.

[00014] Certos dos genes descritos aqui codificam proteínas que são secretadas por, clivadas da célula ou liberadas de uma célula após a morte celular. Estes produtos da transcrição de mRNA e suas proteínas possuem a utilidade adicional como marcadores para o diagnóstico de câncer de bexiga ou como marcadores para monitorar a progressão da doença estabelecida. Estes marcadores podem ser utilizados isoladamente ou em combinação uns com os outros. Em adição, outros genes, produtos da transcrição de RNA e as proteínas codificadas permanecem dentro ou associados com a célula e podem ser utilizados isoladamente ou em combinação uns com os outros como marcadores da urina.

[00015] As estratégias para o tratamento de câncer de bexiga superficial e invasivo podem ser diferentes. O câncer de bexiga invasivo requer resseção cirúrgica mais urgentemente e permite menos alternativas de tratamento que permite o tipo superficial de câncer de bexiga. Em contraste, o câncer de bexiga superficial pode ser tratado de forma bem sucedida com quimioterapia intravesicular ou imunoterapia com BCG intravesicular.

[00016] Atualmente, entretanto, não há métodos para distinguir facilmente ou de forma confiável entre as classes superficial e invasiva de cânceres de bexiga sem realizar a cistoscopia. A capacidade de distinguir entre estas classes utilizando um método não invasivo tal como um teste de urina, permitiria que os clínicos selecionassem estratégias de tratamento apropriadas sem se basear na cistoscopia, que é cara, inconveniente e freqüentemente fracamente aceita pelos pacientes.

[00017] Foi descoberto de forma inesperada que certos marcadores da urina, em particular os não encontrados no sangue em altos níveis, quando utilizados em combinação ou isoladamente podem fornecer um diagnóstico altamente confiável, sensível e específico de câncer de bexiga.

Breve Descrição das Figuras

[00018] Esta invenção é descrita com referência a modalidades específicas da mesma e com referência às figuras, em que:

[00019] A figura 1 representa uma tabela que apresenta o número e a origem das amostras utilizadas em 30 análises de qPCR.

[00020] A figura 2 representa uma tabela de marcadores e sondas de oligonucleotídeo de marcadores para a análise de qPCR de câncer de bexiga desta invenção.

[00021] A figura 3 representa uma tabela de BTMs identificados utilizando métodos de microarranjo em amostras de câncer de bexiga invasivo.

[00022] A figura 4 representa uma tabela de BTMs identificados utilizando métodos de microarranjo em amostras de câncer de bexiga superficial.

[00023] A figura 5 representa uma tabela de resultados obtidos em estudos realizados utilizando análise de PCR quantitativa para BTM específicos.

[00024] As figuras 6a-6af representam histogramas que exibem a freqüência relativa vs. os dados de quantidade de alteração em log2 obtidos partindo de estudos de PCR quantitativa de vários marcadores de tumor de tumores de bexiga invasivos e superficiais. figura 6a: SPAG5, invasivo; figura 6b: SPAG5, superficial; figura 6c: TOP2a, invasivo; figura 6d: TOP2a, superficial; figura 6e: CDC2, invasivo; figura 6f: CDC2, superficial; figura 6g: ENG, invasivo; figura 6h: ENG, superficial; figura 6i: IGFBP5, superficial; figura 6j: NOV, superficial; figura 6k: NRP1, invasivo; figura 6l: NRP1, superficial; figura 6m: SEMA3F, superficial; figura 6n: EGFL6, invasivo; figura 6o: EGFL6, superficial; figura 6p: MGP, invasivo; figura 6q: SEM2, invasivo; figura 6r: SEM2, superficial; figura 6s: CHGA, invasivo; e figura 6t: CHGA, superficial; figura 6u: BIRC5, invasivo; figura 6v: BIRC5, superficial; figura 6w: UBE2C, invasivo; figura 6x: UBE2C, superficial; figura 6y: HoxA13, invasivo; figura 6z: HoxAl3, superficial; figura 6aa: MDK, invasivo; figura 6ab: MDK, superficial; figura 6ac: Thyl, invasivo; figura 6ad, Thyl, superficial; figura 6ae: SMC4L1, invasivo; 6af: SMC4L1, superficial.

[00025] A figura 7 representa uma tabela de resultados obtidos de estudos realizados utilizando análises de PCR quantitativa para BTMs específicos utilizando amostras de urina.

[00026] A figura 8 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que exibem o acúmulo relativo de marcadores para câncer de bexiga na urina de pacientes e de controles saudáveis. Os dados são mostrados em pares para cada doze BTMs; a caixa superior em cada par representa amostras de urina de pacientes de controle saudáveis e a caixa inferior representa amostras de urina de pacientes com câncer de bexiga. As caixas definem os percentuais de 25, 50 e 75. Todos os dados estão em quantidades de alteração em log2 em relação à mediana do controle saudável. Os pontos representam pontos fora da curva.

[00027] A figura 9 representa um gráfico de barras da análise de PCR quantitativa do RNA total extraído do sangue total comparado com o RNA do tecido de câncer de bexiga.

[00028] A figura 10 representa o superacúmulo médio dos produtos da transcrição do marcador na urina de pacientes com câncer de bexiga. A diferença em log2 entre os pacientes e os controles saudáveis e os pacientes e os controles não-malignos é mostrada separadamente.

[00029] A figura 11 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que mostram a super-representação dos produtos da transcrição do marcador na urina de pacientes com câncer comparados com os controles saudáveis e não-malignos. As caixas definem os percentuais de 25, 50 e 75. Todos os dados são relativos à mediana do controle saudável. As caixas com o preenchimento pontilhado correspondem às amostras de indivíduos saudáveis. As caixas com preenchimento sombreado correspondem às amostras de pacientes com doença urológica não-maligna e as caixas com o preenchimento hachurado correspondem às amostras de pacientes com câncer de bexiga. a. HOXA13; b. IGFBP5; c. MDK; d. MGP; e NRP1; f. SEMA3F; g. SMC4L1; h. TOP2A; UBE2C. Os pontos representam pontos fora da curva.

[00030] As figuras 12a-12b representam histogramas que exibem o número de marcadores com uma expressão maior que o percentual de 95 da expressão normal mediana para os tumores dos tipos invasivo e superficial, respectivamente. Os resultados se baseiam nos dados de qPCR para 12 marcadores e são mostrados separadamente para cada amostra de tumor.

[00031] As figuras 13a-13b representam tabelas que exibem o efeito de vários marcadores sobre a capacidade de discriminar de forma acurada entre o tecido tumoral e o tecido não-maligno. A tabela foi construída partindo de distribuições normais derivadas de dados de qPCR. A figura 13a representa o efeito de vários marcadores sobre a capacidade de discriminar de forma acurada entre o tecido de câncer de bexiga invasivo e o tecido não-maligno a uma especificidade de 95%. A figura 13b representa o efeito de vários marcadores sobre a capacidade de discriminar de forma acurada entre o tecido de câncer de bexiga superficial e o tecido não-maligno a uma especificidade de 95%.

[00032] As figuras 14a-14b representam tabelas que exibem a sensibilidade de combinações de marcadores para carcinoma invasivo de células transicionais (TCC) a uma especificidade de 95%, calculada partindo das distribuições normais dos dados de qPCR. figura 14a: carcinoma invasivo de células transicionais (TCC). figura 14b: TCC superficial.

[00033] As figuras 15 representam uma tabela que mostra o efeito de vários marcadores sobre a capacidade de discriminar de forma acurada entre amostras de urina obtidas de pacientes com câncer de bexiga (TCC) e amostras de urina de pacientes com doenças urológicas não- malignas. A tabela foi construída partindo da distribuição normal dos dados obtidos das análises de qPCR da urina.

[00034] A figura 16 representa uma tabela que mostra a sensibilidade de combinações de marcadores na urina para a detecção de TCC a uma especificidade de 95%, calculada partindo da distribuição normal dos dados de qPCR da urina.

[00035] A figura 17 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que mostram as proporções de BTMs no RNA extraído da urina de pacientes tanto com câncer de bexiga superficial quanto invasivo. As caixas definem os percentuais de 25, 50 e 75. As caixas sombreadas acinzentadas representam amostras de pacientes com câncer de bexiga superficial e as caixas hachuradas representam amostras de pacientes com câncer de bexiga invasivo. a. combinação TOP2A/HOXA13; b. combinação TOP2A/IGFBP5; e c. combinação TOP2A/SEMA3F. Os pontos representam pontos fora da curva.

[00036] A figura 18 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que mostram as proporções de BTMs na urina de pacientes com câncer de bexiga de estágios diferentes. As caixas definem os percentuais de 25, 50 e 75. As caixas com o preenchimento pontilhado correspondem às amostras de pacientes com tumores superficiais, as caixas sombreadas acinzentadas correspondem às amostras de pacientes com tumores invasivos em estágio 1 e as caixas hachuradas correspondem às amostras de pacientes com tumores em estágios 2-3: a. combinação TOP2A/HOXA13; b. combinação TOP2A/IGFBP5; e c. combinação TOP2A/SEMA3F. Os pontos representam pontos fora da curva.

[00037] A figura 19 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que mostram as proporções de BTMs no RNA extraído tanto de tumores de bexiga superficiais quanto invasivos. As caixas definem os percentuais de 25, 50 e 75. As caixas sombreadas acinzentadas representam amostras de tumores de bexiga superficiais e as caixas hachuradas representam amostras de tumores de bexiga invasivos: a. combinação TOP2A/HOXA13, b. combinação TOP2A/IGFBP5 e c. combinação TOP2A/SEMA3F. Os pontos representam pontos fora da curva.

[00038] A figura 20 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que mostram uma combinação de marcador para a aplicação à detecção de câncer de bexiga. As representações gráficas mostram a super-representação de um grupo de quatro marcadores na urina de pacientes com câncer comparados com controles saudáveis e não- malignos. As caixas definem os percentuais de 25, 50, e 75. Todos os dados são relativos à mediana do controle saudável. As caixas com o preenchimento pontilhado correspondem às amostras de indivíduos saudáveis. As caixas com preenchimento sombreado acinzentado correspondem às amostras de pacientes com doença urológica não- maligna e as caixas com o preenchimento hachurado correspondem às amostras de pacientes com câncer de bexiga: a. HOXA13, b. MGP: c. SEMA3F e d. TOP2A. Os pontos representam pontos fora da curva.

[00039] A figura 21 apresenta representações gráficas em caixa e filamentos que mostram combinações de marcadores para a determinação do tipo histológico de câncer de bexiga. As representações gráficas mostram as proporções de BTMs no RNA extraído da urina de pacientes com tanto câncer de bexiga superficial quanto invasivo. As caixas definem os percentuais de 25, 50 e 75. As caixas sombreadas acinzentadas representam amostras de pacientes com câncer de bexiga superficial e as caixas hachuradas representam amostras de pacientes com câncer de bexiga invasivo: a. combinação TOP2A/SEMA3F, b. combinação TOP2AJHOXA13. Os pontos representam pontos fora da curva.

Descrição Detalhada Definições

[00040] Antes de descrever as modalidades da invenção em detalhes, será útil fornecer algumas definições dos termos que são utilizados aqui.

[00041] O termo "marcador" significa uma molécula que está associada quantitativamente ou qualitativamente com a presença de um fenômeno biológico. Os exemplos de "marcadores" incluem um gene, um fragmento gênico, RNA, fragmento de RNA, proteína ou fragmento de proteína, metabólitos relacionados, subprodutos ou outras moléculas de identificação, sejam relacionadas diretamente ou indiretamente com um mecanismo sobre o qual o fenômeno se baseia.

[00042] O termo "sensibilidade" significa a proporção de indivíduos com a doença que tem teste positivo. Assim, uma maior sensibilidade significa menos resultados de teste falso negativos.

[00043] O termo "especificidade" significa a proporção de indivíduos sem a doença que tem teste negativo. Assim, uma maior especificidade significa menos resultados de teste falso positivo.

[00044] O termo "BTM" ou "marcador de tumores de bexiga" ou "membro da família BTM" significa um marcador que está associado com câncer de bexiga. O termo BTM inclui ainda combinações de marcadores individuais, cuja combinação aumenta a sensibilidade e a especificidade da detecção do câncer de bexiga. Em algumas seções deste pedido de patente, o termo BTM pode incluir UBTM (definido aqui) por conveniência. Os exemplos não-limitantes de BTMs estão incluídos nas figuras 3 e 4 contidas aqui.

[00045] Um BTM pode ser identificado através da extração do RNA de uma amostra de tecido de um paciente suspeito de ter câncer de bexiga, aplicando o RNA a um microarranjo que possui um número de oligonucleotídeos sobre o mesmo, permitindo que o RNA da amostra se hibridize com os oligonucleotídeos sobre o arranjo e então quantificando o nível de RNA ligado medido em cada ponto do arranjo. Um marcador é considerado como sendo um BTM se sua presença estiver acima de um limite de pelo menos aproximadamente 1,2 vez do que é encontrado em tecido não-maligno normal utilizando os métodos de microarranjo. Alternativamente, o limite pode ser acima de aproximadamente 2 vezes o normal, aproximadamente 3 vezes mais que o normal, 4 vezes ou até mesmo aproximadamente 5 vezes mais que o normal. Por "normal" entende-se mais que 90 por cento da população normal. Em outros casos, normal pode significar um nível de presença do percentual de 95 (isto é, aproximadamente 2 Desvios Padrões (SD) partindo da média) e em outros casos, mais que aproximadamente 97,5 por cento (isto é, aproximadamente 3 SD) ou 99 por cento.

[00046] Ainda em casos adicionais, pode ser selecionado um BTM que está presente no tecido tumoral, mas não está presente no sangue até uma extensão substancial. Por "extensão substancial" entende-se que a quantidade no tecido tumoral é pelo menos aproximadamente 5 ciclos maior, como medido pela qPCR, que a quantidade encontrada no sangue.

[00047] O termo "UBTM" ou "marcador de tumores de bexiga urinária" ou "membro da família UBTM" significa um marcador BTM encontrado na urina que está associado com câncer de bexiga, mas não inclui TOP2A, MDK ou BIRC5. O termo UBTM inclui ainda combinações de dois marcadores e combinações de três marcadores, cuja combinação aumenta a sensibilidade e a seletividade de detecção de câncer de bexiga em amostras de urina. Os exemplos não-limitantes de UBTMs estão incluídos nas figuras 14a e 14b contidas aqui.

[00048] Em outros casos, um UBTM pode ser identificado na urina utilizando métodos de microarranjo ou utilizando métodos de qPCR utilizando um iniciador para frente, um iniciador para trás e uma sonda selecionada com base no marcador que será avaliado. O limite para a detecção de câncer de bexiga na urina pode ser maior que o nível do marcador na urina de indivíduos normais que possuem câncer de bexiga em aproximadamente 1 ciclo (2 vezes), 2 ciclos (4 vezes), 3 ciclos (8 vezes), 4 ciclos (16 vezes), 5 ciclos (32 vezes) ou mais.

[00049] O termo "qPCR" significa a reação em cadeia da polimerase quantitativa.

[00050] O termo "expressão" inclui a produção de mRNA partindo de um gene ou de uma parte de um gene e inclui a produção de uma proteína codificada por um RNA ou gene ou parte de um gene e inclui o aparecimento de um material detectável associado com a expressão. Por exemplo, a ligação de um ligante de ligação, tal como um anticorpo, a um gene ou outro oligonucleotídeo, uma proteína ou um fragmento de proteína e a visualização do ligante de ligação está incluída dentro do âmbito do termo "expressão". Assim, a maior densidade de um ponto em um imunoblot, tal como um Western blot, está incluída dentro do termo "expressão" da molécula biológica subjacente.

[00051] O termo "taxa de expressão" significa uma alteração dependente do tempo na quantidade de um produto de transcrição ou de uma proteína.

[00052] O termo "superexpressão" é utilizado quando a taxa de expressão de um marcador em uma célula ou um tipo celular, for maior que a de uma outra célula ou um tipo celular durante um período de tempo definido.

[00053] O termo "acúmulo" significa uma maior quantidade de um marcador em uma amostra comparada com um valor médio normal. Por "maior quantidade" entende-se que a quantidade de marcador é maior que 90%, 95%, 97,5%, 99% ou superior da faixa normal em pelo menos aproximadamente 1,2 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes quando medida utilizando métodos de microarranjo. Quando medida utilizando a qPCR, "maior quantidade" significa a quantidade de marcador que é maior que 90%, 95%, 97,5% ou 99% da faixa normal em pelo menos aproximadamente 1 ciclo (2 vezes), 2 ciclos (4 vezes), 3 ciclos (8 vezes), 4 ciclos (16 vezes), 5 ciclos (32 vezes) ou mais.

[00054] O acúmulo inclui uma maior quantidade de marcador em uma célula (em uma base por célula) ou pode significar um maior número de células em uma amostra que possui o marcador particular. Assim, o acúmulo pode significar uma maior quantidade total de um marcador na urina (em uma base por volume) comparada com uma condição não caracterizada pelo câncer de bexiga. O acúmulo pode ainda refletir um aumento na taxa de expressão de um BTM em um certo tipo de célula e/ou um aumento no número de células que expressam um BTM a uma taxa de expressão normal. Além disso, o acúmulo também pode refletir o mRNA livre presente por causa da perda da integridade da membrana celular ou da morte e da destruição celular.

Descrição das Modalidades da Invenção

[00055] São fornecidos marcadores para a detecção e para a avaliação de tumores incluindo de bexiga. Foi descoberto que vários genes e proteínas estão associados com tumores de bexiga. As análises de microarranjo de amostras tiradas de pacientes com tumores de bexiga e de amostras não-malignas do urotélio normal levaram à descoberta surpreendente de que em muitos tumores de bexiga, padrões específicos de superexpressão de certos genes ou de acúmulo de produtos gênicos na urina estão associados com a doença. De forma mais surpreendente, foram isolados marcadores que estão presentes em altos níveis nas amostras de urina de pacientes com câncer de bexiga, mas estão presentes em baixos níveis em indivíduos saudáveis e, em particular, em indivíduos com doenças urológicas não-malignas, incluindo os que exibem hematúria. A detecção de marcadores, por exemplo, dos produtos gênicos (por exemplo, oligonucleotídeos tal como mRNA) e proteínas e peptídeos traduzidos partindo dos oligonucleotídeos, portanto, é um indicativo da presença de um tumor, especialmente um tumor de bexiga.

[00056] Pode ser considerado que o nível de um marcador particular ou conjunto de marcadores pode depender da quantidade de urina produzida comparada com a quantidade do marcador presente. Assim, em condições caracterizadas pela produção reduzida de urina (por exemplo, volume reduzido de urina), a concentração de um marcador pode estar maior, mas ainda pode não refletir câncer de bexiga. Portanto, em algumas modalidades, a quantidade de um marcador pode ser corrigida em relação à produção total de urina ao longo de um período de tempo fornecido. Alternativamente, a concentração do marcador pode ser corrigida em relação ao número total de células na amostra de urina e em outras modalidades pode ser corrigida em relação à proteína total presente na urina. Por outro lado, a maior produção de urina pode diluir um marcador de tumor e assim tende a mascarar a presença de câncer de bexiga. Tais condições podem estar associadas com uma maior ingestão de água, uma menor ingestão de sais, um maior uso de diuréticos ou uma supressão da produção ou da atividade do hormônio antidiurético.

[00057] Em algumas modalidades, pode-se medir a função renal utilizando métodos conhecidos na técnica. Estes incluem, com a finalidade de exemplo, a medida da eliminação de creatinina. Entretanto, pode ser considerado que há vários métodos adequados para medir a função renal. Em condições em que é observada uma função renal anormal, pode-se ajustar o acúmulo medido de um marcador utilizando correções apropriadas. Portanto, o câncer de bexiga pode ser diagnosticado de forma mais acurada.

[00058] Os marcadores de câncer podem ser detectados em uma amostra utilizando qualquer técnica adequada e podem incluir, mas não estão limitados às sondas de oligonucleotídeos, à qPCR ou aos anticorpos produzidos contra os marcadores de câncer.

[00059] Será considerado que a amostra que será testada não está restrita a uma amostra do tecido suspeita de ser um tumor. O marcador pode ser secretado no soro, desprendido das membranas celulares ou associados com células perdidas na urina. Portanto, uma amostra pode incluir qualquer amostra corporal e inclui sangue, soro, lavagens peritoneais, fluido cerebroespinhal, amostras de urina e de fezes.

[00060] A detecção de um marcador de câncer em uma amostra será um indicativo da presença de um tumor em tal indivíduo. Entretanto, será considerado que através da análise da presença e das quantidades de expressão de um grande número de marcadores de câncer, a sensibilidade do diagnóstico será maior enquanto a freqüência de resultados falsos positivos e/ou falsos negativos é diminuída. Portanto, vários marcadores de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para melhorar a detecção e o diagnóstico precoces de câncer.

Abordagens Gerais para a Detecção de Câncer

[00061] As abordagens a seguir são métodos não-limitantes que podem ser utilizados para detectar câncer, incluindo o câncer de bexiga, utilizando membros da família BTM ou UBTM.

Métodos de Hibridização Utilizando Sondas de Ácidos Nucléicos Seletivas em Relação a um Marcador

[00062] Estes métodos envolvem a ligação da sonda de ácido nucléico a um suporte e a hibridização sob condições apropriadas com RNA ou cDNA derivado da amostra de teste (Sambrook, J., E Fritsch, E. e T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). Estes métodos podem ser aplicados a BTM ou a UBTM quando apropriado derivado de uma amostra de tecido ou de fluido tumoral. As preparações de RNA ou de cDNA são tipicamente rotuladas com uma molécula fluorescente ou radioativa para possibilitar a detecção e a quantificação. Em algumas aplicações, o DNA que se hibridiza pode ser rotulado com uma estrutura rotulada de forma fluorescente ramificada para aumentar a intensidade do sinal (Nolte, F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201-35 (1998)). A marcação não hibridizada é removida através da lavagem extensiva em soluções com baixo teor de sais tal como 0,1x de SSC, 0,5% de SDS antes de quantificação da quantidade de hibridização através da detecção da fluorescência ou da densitometria de imagens dos géis. Os suportes podem ser sólidos, tais como membranas de náilon ou nitrocelulose ou consistirem em microesferas ou esferas que são hibridizadas quando estão em suspensão líquida. Para permitir a lavagem e a purificação, as esferas podem ser magnéticas (Haukanes, B-I e Kvam, C., Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993)) ou rotuladas de forma fluorescente para permitir a citometria de fluxo (ver, por exemplo: Spiro, A., Lowe, M. e Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification e Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 42584265 (2000)).

[00063] Uma variação da tecnologia de hibridização é o ensaio Quantigene Plex® (Genospectra, Fremont) que combina um suporte de esfera fluorescente com a amplificação de sinal do DNA ramificado. Ainda uma outra variação na tecnologia de hibridização é o ensaio de mRNA Quantikine® (R&D Systems, Minneapolis). A metodologia é como descrito nas instruções do fabricante. Sucintamente o ensaio utiliza sondas de hibridização de oligonucleotídeos conjugadas com Digoxigenina. A hibridização é detectada utilizando anticorpos anti-- Digoxigenina acoplados à fosfatase alcalina em ensaios colorimétricos.

[00064] Os métodos adicionais são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos adicionalmente aqui.

PCR quantitativa (qPCR)

[00065] A PCR quantitativa (qPCR) pode ser realizada em amostras de tumor, no soro, no plasma e em amostras de urina utilizando iniciadores e sondas específicos a BTM. Em reações controladas, a quantidade de produto formado em uma reação de PCR (Sambrook, J., E Fritsch, E. e T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)) se correlaciona com a quantidade de molde de partida. A quantificação do produto da PCR pode ser realizada interrompendo a reação da PCR quanto esta estiver na fase log, antes que os reagentes se tornem limitantes. Os produtos da PCR são então submetidos à eletroforese em géis de agarose ou de poliacrilamida, corados com brometo de etídio ou uma coloração de DNA comparável e a intensidade da coloração é medida por densitometria. Alternativamente, a progressão de uma reação da PCR pode ser medida utilizando máquinas de PCR tal como a Applied Biosystems' Prism 7000 ou a Roche LightCiclor que medem o acúmulo de produto em tempo real. A PCR em tempo real mede a fluorescência dos corantes que intercalam o DNA tal como Sybr Green no produto da PCR sintetizado ou a fluorescência liberada por uma molécula repórter quando clivada partindo de uma molécula de decaimento; as moléculas repórteres e de decaimento são incorporadas em uma sonda de oligonucleotídeo que se hibridiza com a molécula de DNA alvo após a extensão do filamento de DNA partindo dos oligonucleotídeos iniciadores. A sonda de oligonucleotídeo é deslocada e degradada pela ação enzimática da Taq polimerase no ciclo da PCR seguinte, liberando o repórter da molécula de decaimento.

[00066] Em algumas modalidades, um iniciador para frente, um iniciador para trás e um conjunto de sondas incluem a SEQ ID No: 1, a SEQ ID No: 14 e a SEQ ID No: 27, respectivamente. Alternativamente, os conjuntos incluem a SEQ ID No: 2, a SEQ ID No: 15 e a SEQ ID No: 28, respectivamente. Em outras modalidades, os conjuntos incluem a SEQ ID No: 3, a SEQ ID No: 16 e a SEQ ID No: 29 respectivamente, a SEQ ID No: 4, a SEQ ID No: 17 e a SEQ ID No: 30 respectivamente, a SEQ ID No: 5, a SEQ ID No: 18 e a SEQ ID No: 31 respectivamente, a SEQ ID No: 6, a SEQ ID No: 19 e a SEQ ID No: 32 respectivamente, a SEQ ID No: 7, a SEQ ID No: 20 e a SEQ ID No: 33 respectivamente, a SEQ ID No: 8, a SEQ ID No: 21 e a SEQ ID No: 34 respectivamente, a SEQ ID No: 9, a SEQ ID No: 22 e a SEQ ID No: 35 respectivamente, a SEQ ID No: 10, a SEQ ID No: 23 e a SEQ ID No: 36 respectivamente, a SEQ ID No: 11, a SEQ ID No: 24 e a SEQ ID No: 37 respectivamente, a SEQ ID No: 12, a SEQ ID No: 25 e a SEQ ID No: 38 respectivamente e a SEQ ID No: 13, a SEQ ID No: 26 e a SEQ ID No:39 respectivamente.

Ensaios Imunológicos Ligados à Enzima (ELISA)

[00067] Sucintamente, em ensaios de ELISA em sanduíche, um anticorpo policlonal ou monoclonal contra o BTM/UBTM é ligado a um suporte sólido (Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. e Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) ou esferas em suspensão. Outros métodos são conhecidos na técnica e não precisam ser descritos adicionalmente aqui. Os anticorpos monoclonais podem ser derivados de hibridoma podem ser derivados de hibridomas ou selecionados de bibliotecas de anticorpos em fagos (Hust M. e Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human anticorpo fragments. Methods Mol Biol. 295: 71-96 (2005)). Os sítios de ligação não-específicos são bloqueados com preparações de proteínas sem ser as de alvo e detergentes. O anticorpo de captura é então incubado com uma preparação de urina ou de tecido contendo o antígeno BTM/UBTM. A mistura é lavada antes do complexo de anticorpo/antígeno se incubado com um segundo anticorpo que detecta o BTM/UBTM alvo. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado a uma molécula fluorescente ou outra molécula repórter que pode ser detectada em uma reação enzimática ou com um terceiro anticorpo conjugado com um repórter (Crowther, Id.). Alternativamente, em ELISAs diretos, a preparação contendo o BTM/UBTM pode estar ligada a um suporte ou uma esfera e o antígeno de alvo pode ser detectado diretamente com um conjugado anticorpo-repórter (Crowther, Id.).

[00068] Os métodos para produção de anticorpos monoclonais de anti-soro policlonal são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos adicionalmente aqui.

Imunohistoquímica

[00069] A identificação e a localização de marcadores de tumores podem ser realizadas utilizando anticorpos antimarcadores nos tumores de bexiga, nodos linfáticos ou metástases distantes. Tais métodos também podem ser utilizados para detectar, por exemplo, os colorretais, os pancreáticos, os ovarianos, melanoma, os hepáticos, os esofageais, os de estômago, os endometriais e os cerebrais.

[00070] Em geral, os BTMs podem ser detectados em tecidos utilizando imunohistoquímica (Harlow, E. e Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). Sucintamente, amostras de tecido embebidas em parafina ou embebidas em OCT congeladas são cortadas em secções de 4-8 μm sobre lâminas de vidro, fixadas e permeabilizadas, então incubadas com um anticorpo monoclonal ou policlonal contra o BTM. O anticorpo primário pode ser conjugado a uma molécula de detecção ou repórter para a detecção direta do antígeno ou, alternativamente, o anticorpo primário pode por si só ser detectado com um segundo anticorpo conjugado com uma molécula repórter ou de detecção. Após a lavagem e a ativação de quaisquer moléculas repórteres, a presença do BTM pode ser visualizada microscopicamente.

[00071] Os métodos também podem ser utilizados para a imunodetecção de membros da família de marcadores no soro ou no plasma de pacientes com câncer de bexiga tirado antes e depois de cirurgia para a remoção do tumor, para a imunodetecção de membros da família de marcadores em pacientes com outros cânceres, incluindo, mas não-limitados a colorretais, pancreáticos, ovarianos, melanoma, hepáticos, esofageais, estomacais, endometriais e cerebrais e para a imunodetecção de membros da família de marcadores na urina e nas fezes de pacientes com câncer de bexiga.

[00072] Os BTMs e os UBTMs também podem ser detectados em tecidos ou na urina utilizando outras técnicas de imunodetecção padronizadas tal como imunoblotting ou imunoprecipitação (Harlow, E. e Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). No imunoblotting, as preparações de proteína do tecido ou do fluido contendo o BTM/UBTM são submetidas à eletroforese através de géis de poliacrilamida sob condições desnaturantes ou não desnaturantes. As proteínas são então transferidas para um suporte de membrana tal como náilon. O BTM/UBTM é então reagido diretamente ou indiretamente com anticorpos monoclonais ou policlonais como descrito para imunohistoquímica. Alternativamente, em algumas preparações, as proteínas podem ser salpicadas diretamente sobre membranas sem separação eletroforética prévia. O sinal pode ser quantificado por densitometria.

[00073] Na imunoprecipitação, uma preparação solúvel contendo o BTM ou o UBTM é incubada com um anticorpo monoclonal ou policlonal contra o BTM/UBTM. A reação é então incubada com esferas inertes feitas de agarose ou de poliacrilamida com a proteína A ou a proteína G ligada covalentemente. As esferas de proteína A ou G interagem especificamente com os anticorpos que formam um complexo imobilizado de anticorpo-BTM/UBTM-antígeno ligado à esfera. Após a lavagem o BTM/UBTM ligado pode ser detectado e quantificado por imunoblotting ou ELISA.

Análise de Arranjo ou de Dados da qPCR Data Utilizando Computadores

[00074] Os dados primários são coletados e a análise de alteração de quantidade é realizada através da comparação de níveis de expressão gênica de tumor de bexiga com a expressão dos mesmos genes em um tumor não tumoral. É fornecido um limite para concluir que a expressão é maior (por exemplo, aumento de 1,5 x, aumento de 2 vezes e em modalidades alternativas, aumento de 3 vezes, aumento de 4 vezes ou aumento de 5 vezes). Pode ser considerado que outros limites que concluem que ocorreu uma maior expressão podem ser selecionados sem sair do âmbito desta invenção. A análise adicional da expressão dos genes tumorais inclui a combinação de tais genes que exibem maior expressão com perfis de expressão de tumores de bexiga conhecidos para fornecer um diagnóstico de tumores.

Uso de BTMs e de UBTMs para Monitorar a Progressão das Terapias de TCC

[00075] Em adição ao diagnóstico rápido e à detecção precoce de TCC, os marcadores BTM e UBTM detectados no tecido, soro ou urina podem ser utilizados para monitorar a resposta de um paciente à terapia. Nestas aplicações, amostras de urina e/ou de soro podem ser tiradas em intervalos após o início da quimioterapia sistêmica, intravesicular ou intravascular, radioterapia ou imunoterapia. Um declínio no acúmulo de marcadores pode indicar uma redução no tamanho do tumor, indicativa do tratamento eficiente. A taxa de declínio pode ser utilizada para prever a dose terapêutica ótima para cada paciente ou tratamento.

[00076] Os marcadores avaliados são selecionados de genes humanos conhecidos. Os genes avaliados são indicados nas figuras 3 e 4. Nas figuras 3 e 4 estão incluídos o nome do gene, o identificador HUGO, o número de oligo MWG, o número da seqüência de referência do mRNA no NCBI e o número de referência da proteína. As seqüências de comprimento completo podem ser encontradas em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/.

[00077] Os marcadores identificados como úteis para o diagnóstico e para a avaliação do câncer de bexiga são identificados na figura 2 e na Listagem de Seqüências em anexo neste pedido de patente.

Aspectos da invenção

[00078] Assim, em certos aspectos, esta invenção inclui métodos para a detecção de câncer de bexiga, que compreende a detecção do acúmulo de um membro da família de UBTM na urina.

[00079] Em outros aspectos, o membro da família UBTM não está associado com o sangue até uma extensão substancial.

[00080] Em aspectos adicionais, o UBTM é selecionado do grupo mostrado nas figuras 3 ou 4.

[00081] Adicionalmente, em certos aspectos, a etapa de detecção é realizada através da detecção do acúmulo de mRNA de BTM ou de UBTM.

[00082] Em alguns aspectos, a etapa de detecção é realizada utilizando um microarranjo.

[00083] Em outros aspectos, a etapa de detecção é realizada utilizando a reação em cadeia da polimerase quantitativa ou métodos de hibridização.

[00084] Em aspectos adicionais, a etapa de detecção é realizada através da detecção do acúmulo de uma proteína UBTM.

[00085] Ainda em aspectos adicionais, a etapa de detecção é realizada através da detecção do acúmulo de um peptídeo de UBTM.

[00086] Em alguns destes aspectos, a etapa de detecção é realizada utilizando um anticorpo para UBTM que pode ser policlonal ou monoclonal.

[00087] Em aspectos adicionais, um método inclui a detecção do acúmulo de dois ou 10 mais membros da família UBTM na dita amostra.

[00088] Em certos destes aspectos adicionais, um método envolve a detecção de TOP2A, MDK ou BIRC5.

[00089] Ainda aspectos adicionais incluem a detecção de um ou mais pares de marcadores selecionados do grupo que consiste em TOP2A- HOXA13, TOP2A-IGFBP5 e TOP2A15 SEMA3F.

[00090] Em outros aspectos desta invenção, um método para a detecção câncer de bexiga, compreende a detecção do acúmulo de uma combinação de dois ou mais membros da família de BTM selecionados das figuras 14a ou 14b em uma amostra biológica de um paciente suspeito de ter câncer de bexiga.

[00091] Em alguns destes aspectos, a amostra biológica é selecionada do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, tecido, urina, fezes, fluido cerebroespinhal e lavagem peritoneal.

[00092] Ainda aspectos adicionais incluem anticorpos específicos para um BTM ou um UBTM e métodos para a produção dos mesmos, na forma de anticorpos policlonais ou na forma de monoclonais.

[00093] Em certos destes aspectos um anticorpo monoclonal pode ser direcionado para um BTM ou um UBTM é selecionado do grupo mostrado nas figuras 3 ou 4.

[00094] Em outros destes aspectos, um método compreende ainda um outro anticorpo direcionado contra um outro BTM ou UBTM.

[00095] Os aspectos adicionais desta invenção incluem dispositivos para a detecção de um BTM, que compreende um substrato que possui uma combinação de reagentes de captura de BTM ou UBTM sobre o mesmo, a combinação selecionada das figuras 14a ou 14b; e um detector associado com o dito substrato, o detector capaz de detectar a dita combinação de BTM ou UBTM associada com os ditos reagentes de captura.

[00096] Em certos destes aspectos, um reagente de captura compreende um oligonucleotídeo.

[00097] Em aspectos adicionais, um reagente de captura compreende um anticorpo.

[00098] Em alguns aspectos, um BTM ou um UBTM é selecionado do grupo especificado nas figuras 3 ou 4.

[00099] Esta invenção inclui ainda um kit para a detecção de câncer, que compreende um substrato; uma combinação de pelo menos dois reagentes de captura de BTM ou UBTM sobre os mesmo, a combinação selecionada das figuras 14a ou 14b; e instruções para uso.

[000100] Alguns kits incluem reagentes de captura que são oligonucleotídeos específicos a BTM ou a UBTM ou anticorpos específicos a BTM.

[000101] Em alguns kits, os BTMs ou UBTMs são selecionados do grupo representado nas figuras 3 ou 4.

[000102] Em certos kits, um marcador é selecionado do grupo que consiste de IGFBP5, MGP, SEMA3F e HOXA13.

[000103] Os aspectos adicionais incluem métodos para a detecção da presença de câncer de bexiga, que compreende a determinação da presença em uma amostra de urina, de um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em BIRC2, CDC2, HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NOV, NRP1, SEMA3F, SPAG5, TOP2A e em que o dito marcador não está substancialmente presente no sangue.

[000104] Outros aspectos desta invenção incluem métodos para distinguir doença de bexiga maligna de doença de bexiga não-maligna, que compreende a determinação do acúmulo na urina do dito paciente de um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste de HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NRP1, SEMA3F, SMC4L1, TOP2A e UBE2C; e a determinação das proporções dos ditos marcadores na dita amostra, a proporção sendo associada com a presença de câncer de bexiga.

[000105] Em certos destes aspectos, os métodos compreendem a medida do acúmulo de pelo menos um segundo BTM na urina.

[000106] Em algumas destas modalidades, um primeiro marcador é TOP2A e um segundo marcador é selecionado do grupo que consiste em HOXA13, IGFBP5 e SEMA3F.

[000107] Em aspectos adicionais, esta invenção inclui a correlação de uma proporção de acúmulo de marcadores como indicativo de câncer de bexiga superficial, câncer de bexiga invasivo em estágio 1 ou câncer de bexiga invasivo em estágios 2-3.

[000108] Ainda em aspectos adicionais, esta invenção inclui métodos para a determinação da eficiência da terapia para câncer de bexiga, que compreende a comparação da presença de um ou mais marcadores selecionados das figuras 3 ou 4 em uma primeira amostra de um paciente com a presença de um ou mais marcadores selecionados das figuras 3 ou 4 em uma segunda amostra de um paciente após um período de tratamento.

[000109] Como descrito aqui, a detecção de tumores pode ser realizada através da medida da expressão de um ou mais marcadores de tumores. Foi descoberto de forma inesperada que a associação entre uma maior expressão de um grande número de BTMs ou de UBTMs e a presença de câncer de bexiga diagnosticado é extremamente alta. A menor associação significativa detectada tinha um valor de p de aproximadamente 0,018. Muitas destas associações eram significativas em valores de p menores que 10-10. Com tal alta significância, pode não ser necessário detectar a maior expressão ou o acúmulo em mais de um BTM ou UBTM. Entretanto, a redundância nos BTMs desta invenção pode permitir a detecção de cânceres de bexiga com uma confiabilidade maior.

[000110] Os métodos fornecidos aqui também incluem ensaios de alta sensibilidade. A qPCR é extremamente sensível e pode ser utilizada para detectar produtos gênicos em um número de cópia muito baixo (por exemplo, 1 - 100) em uma amostra. Com tal sensibilidade, é tornada possível uma detecção muito precoce dos eventos que estão associados com o câncer de bexiga.

Métodos Coleta de Tumor

[000111] As amostras de tumor de bexiga e as amostras de urotélio não-maligno foram coletadas de espécimes cirúrgicos dissecados no Kyoto University Hospital, Japão e em outros hospitais japoneses colaboradores.

Coleta de Urina

[000112] As amostras de urina de controles não-malignos e de pacientes com câncer de bexiga foram obtidas no Kyoto University Hospital, Japão (fig. 1). As amostras de controles saudáveis foram obtidas de voluntários caucasianos e japoneses.

Extração do RNA

[000113] Os tecidos tumorais foram homogeneizados em uma mistura de TriReagent : água (3:1), então extraídos em clorofórmio. O RNA total foi então purificado partindo da fase aquosa utilizando o procedimento RNeasy® (Qiagen). O RNA também foi extraído de 16 linhagens de células cancerígenas e agrupado para servir como um RNA de referência.

[000114] O RNA foi extraído da urina misturando a amostra de urina com um volume equivalente de tampão de lise (5,64 M de guanidina- HCl, 0,5% de sarcosil, 50 mM de acetato de sódio (pH 6,5) e 1 mM de β-mercaptoetanol; o pH foi ajustado em 7,0 com 1,5 M de Hepes pH 8). O RNA total foi então extraído utilizando Trizol e o procedimento RNeasy®. As preparações de RNA foram adicionalmente purificadas antes da síntese do cDNA utilizando o kit de purificação da PCR Qiagen QIAquick®.

[000115] O RNA foi extraído do sangue de três voluntários saudáveis realizando uma extração com Trizol/RNeasy® em células enriquecidas provenientes do sangue total utilizando sedimentação em 3,6% de dextran.

Preparação da Lâmina do Microarranjo

[000116] Lâminas de vidro revestidas com epóxi (MWG Biotech) foram impressas com ~30.000 50mer oligonucleotídeos (MWG Biotech) utilizando um robô de produção de microarranjos Gene Machines, de acordo com o protocolo do fabricante.

Marcação e Hibridização do RNA

[000117] O cDNA foi transcrito partindo de 5 μg de RNA total utilizando a transcriptase reversa Superscript II® (Invitrogen) em reações contendo 5-(3- aminoalil)- 2' desoxiuridina - 5'-trifosfato. A reação foi então deionizada em uma coluna Microcon antes de ser incubada com Cy3 ou Cy5 em tampão bicarbonato durante 1 hora à temperatura ambiente. Os corantes não- incorporados foram removidos utilizando uma coluna Qiaquick (Qiagen) e a amostra foi concentrada em 15 μL em um SpeedVac. Os cDNAs rotulados com Cy3 e Cy5 foram então misturados com tampão Ambion ULTRAhybTM, desnaturados a 100°C durante 2 min e hibridizados às lâminas do microarranjo em câmaras de hibridização a 42°C durante 16 horas. As lâminas foram então lavadas e verificadas duas vezes em um scanner Axon 4000A® em dois ajustes de força.

Análises de Microarranjo de Genes Marcadores de Câncer

[000118] O RNA de 53 tumores de bexiga e de 20 amostras de tecido de bexiga não-maligno ("normal") foi rotulado com Cy5 e hibridizado em duplicatas ou triplicatas com o RNA de referência rotulado com Cy3. Após a normalização, a alteração na expressão em cada um dos 29.718 foi então estimada pela alteração de vezes e a probabilidade estatística.

Procedimento de Normalização

[000119] As intensidades de fluorescência medianas detectadas pelo Genepix®software foram corrigidas através da subtração das intensidades de fundo locais. Os pontos com uma intensidade corrigida de fundo menor que zero foram excluídos. Para facilitar a normalização, as proporções de intensidade e as intensidades pontuais globais foram transformadas em log. As proporções de intensidade em log foram corrigidas para o corante e para a direção espacial utilizando a regressão local implementada no pacote LOCFIT®. As proporções de intensidade em log sofreram regressão simultaneamente em relação à intensidade pontual global e à localização. Os residuais da regressão local forneceram as quantidades de alteração em log corrigidas. Para o controle de qualidade, as proporções de cada microarranjo normalizado foram representadas graficamente em relação à intensidade pontual e à localização. As representações gráficas foram subseqüentemente inspecionadas visualmente para quaisquer artefatos remanescentes. Adicionalmente, um modelo de ANOVA foi aplicado para a detecção de tendência a pontos de restrição. Todos os resultados e parâmetros da normalização foram inseridos em uma base de dados Postgres para a análise estatística.

Análise Estatística

[000120] Para melhorar a comparação das quantidades de vezes de alterações medidas entre os arranjos, log2 (proporções) tiveram a escala aumentada até o mesmo desvio padrão global por arranjo. Esta padronização reduziu a variabilidade média dentro da classe de tecidos. Os log2 (proporções) foram adicionalmente alterados para ter um valor mediano de zero para cada oligonucleotídeo para facilitar a inspesão visual dos resultados. Um teste de classificação baseado nas quantidades de alterações foi então utilizado para melhorar a intensidade do ruído. Este teste consiste em duas etapas: (i) cálculo da classificação da quantidade de alteração (Rfc) dentro dos arranjos e (ii) subtração da mediana (Rfc) para o tecido normal partindo da mediana (Rfc) para o tecido tumoral. A diferença de ambas as classificações medianas define o escore da classificação da quantidade de vezes de alterações. Três testes estatísticos adicionais também foram realizados em dados padronizados: 1) Test t de Student com duas amostras, 2) o teste de Wilcoxon e 3) a Análise Estatística dos Microarranjos (SAM). Os 300 genes regulados para mais com maior significância determinados por cada um dos métodos estatísticos (alteração de vezes da classificação, teste t, teste de Wilcoxon e SAM) receberam um escore de classificação para cada teste. Se um gene parecia em uma lista, mas não em uma ou mais das outras, um fator de peso de 500 era adicionado ao seu escore. Todos os escores de classificação foram então adicionados em um escore de classificação somado.

Análise Estatística de Combinações de Marcadores

[000121] Para determinar o valor da utilização de combinações de dois ou três dos marcadores para discriminar entre amostras tumorais e não-malignas, os dados de qPCR de amostras tumorais e não-malignas foram submetidas à análise a seguir. As distribuições normais para as amostras não-malignas e tumorais foram geradas utilizando as médias das amostras e os desvios padrões. A probabilidade de que os valores tirados dos dados de expressão de tumor excederiam um limite definido (por exemplo, mais que 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou 99%) na distribuição não-maligna foi então determinada (isto é, a sensibilidade). Para as combinações de marcadores, foi determinada a probabilidade de que pelo menos um marcador exceda o limite.

[000122] Para demonstrar o valor da análise das combinações de marcadores nas amostras de urina, assim como em amostras de tumor, a análise da distribuição normal também foi realizada sobre os dados de qPCR data obtidos utilizando amostras de urina de pacientes com TCC e de controles não-malignos descritos na figura 1, série 2. Foi demonstrada a probabilidade de que os valores tirados dos dados de qPCR de pacientes com TCC excederiam um limite definido (por exemplo, maior que 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou 99%) na distribuição de amostras não-malignas.

Métodos para a Detecção de Marcadores para Câncer de Bexiga na Urina

[000123] Em várias modalidades, os ensaios para BTM podem ser realizados de forma desejável em amostras de urina. Em geral, os métodos para avaliar os oligonucleotídeos, as proteínas e os peptídeos nestes fluidos são conhecidos na técnica. Entretanto, com a finalidade de ilustração, os níveis de um BTM na urina podem ser quantificados utilizando um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima do tipo sanduíche (ELISA). Para ensaios do plasma ou do soro, uma alíquota de 5 μL de uma amostra diluída apropriadamente ou de um padrão de BTM diluído em série e 75 μL de anticorpo anti-BTM humano conjugado com peroxidase são adicionados aos poços de uma placa de microlitros. Após um período de incubação de 30 minutos a 30°C, as cavidades são lavadas com 0,05% de Tween 20 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o anticorpo não-ligado. Os complexos ligados de BTM e anticorpo anti-BTM são então incubados com o- fenilendiamina contendo H2O2 durante 15 minutos a 30°C. A reação é interrompida através da adição de 1 M de H2SO4 ea absorbância a 492 nm é medida com uma leitora de placas de microlitro. Pode ser considerado que os anticorpos anti-BTM podem ser anticorpos monoclonais ou anti-soro policlonal.

[000124] Devido ao fato de que muitas proteínas são (1) secretadas pelas células, (2) clivadas das membranas celulares, (3) perdidas das células após a morte celular ou (4) contidas dentro de células desprendidas, será considerado que os BTMs também podem ser detectados na urina. Adicionalmente, o diagnóstico de câncer de bexiga pode ser determinado através da medida da expressão de BTMs em uma amostra ou do acúmulo de BTMs em uma amostra. Os métodos de diagnóstico da técnica anterior incluem cistoscopia, citologia e verificação de células extraídas durante estes procedimentos. Tais métodos se baseavam na identificação de células tumorais na urina ou em uma amostra de vilosidade de urotélio ou em outros casos, em espécimes de biópsia da parede da bexiga. Estes métodos sofrem de vários tipos de erros, incluindo erro de amostragem, erros na identificação entre os observadores e similares.

PCR Em Tempo Real Quantitativa

[000125] A PCR em tempo real ou quantitativa (qPCR) é utilizada para a quantificação absoluta ou relativa do número de cópias do molde da PCR. Conjuntos de sonda TaqmanTM e iniciadores foram planejados utilizando Primer Express V 2.0TM (Applied Biosystems). Quando possível, todas as variações potenciais de processamento foram incluídas no amplicon resultante, com a preferência do amplicon sendo fornecidas às regiões covertas pelo oligonucleotídeo do microarranjo derivado da MWG-Biotech. As seqüências iniciadoras e de sondas são mostradas na figura 2. Alternativamente, se o gene alvo fosse representado através de um ensaio de expressão Assay-on-DemandTM (Applied Biosystems) cobrindo os amplicons desejados, estas seriam utilizadas. Nos ensaios planejados "em casa", a concentração dos iniciadores foi titulada utilizando um protocolo de rótulo com SYBR verde e o cDNA foi feito partindo do RNA de referência. A amplificação foi realizada em um sistema de detecção de seqüências ABI PrismTM 7000 sob condições de ciclos padronizadas. Quando produtos isolados da amplificação foram observados nas curvas de dissociação, as curvas padronizadas foram geradas ao longo de uma faixa de concentração de 625 vezes utilizando concentrações ótimas de iniciadores e a sonda 5'FAM - 3'TAMRA fosfato TaqmanTM (Proligo) a uma concentração final de 250 nM. Os ensaios que fornecem curvas padronizadas coeficientes de regressão de mais de 0,98 foram utilizados nos ensaios subseqüentes.

[000126] Os ensaios podem ser realizados em duas placas de 96 cavidades com cada amostra de RNA representada por um cDNA isolado. Cada placa continha uma curva padronizada de cDNA de referência a uma faixa de concentração de mais de 625 vezes em duplicatas. A análise consistia no cálculo do ACT (gene CT alvo - CT médio do cDNA de referência). O ACT é diretamente proporcional à alteração de vezes de log2 negativo. As alterações de vezes de log2 relativas à alteração de vezes de log2 não-maligna mediana foram então calculadas (alteração de vezes de log2 - alteração de vezes de log2 normal mediana). As alterações de vezes podem então ser agrupadas em classes de freqüência e representadas graficamente ou retratadas em representações gráficas em caixa e filamentos.

Seleção de Soro e Marcadores da Urina para Malignidade na Bexiga

[000127] Os supostos marcadores de soro podem ser selecionados partindo dos dados de arranjo baseados (i) na probabilidade de que a proteína codificada é secretada da célula ou clivada da membrana; a probabilidade de secreção se baseava na análise com TargetPTM (Emanuelsson e outros; J. Mol. Biol. 300, 1005-1006 (2000)) e (ii) em seu escore de classificação somado. Entretanto, a variação no grau de superexpressão nas amostras de tumor reflete não somente a heterogeneidade do tumor, mas também variações na extensão da contaminação das amostras de tumor com o tecido "normal" incluindo músculo liso, tecido conjuntivo, células submucosa (ver, a Patente U.S. No 6.335.170), células de estroma e epitélio não-maligno. Em muitas situações, a contaminação "normal" variava de 5 até 70% com uma mediana de aproximadamente 25%.

[000128] Foi, portanto, possível diminuir estes resultados "falso positivos" através da análise de BTM nas amostras de urina, que não estão altamente contaminadas com células normais de bexiga. Além disso, utilizando métodos de qPCR, foi possível determinar de forma mais acurada os níveis de mRNA em uma amostra de urina, comparada com o uso de métodos de microarranjo, como na técnica anterior. Portanto, foi possível evitar uma contaminação maior com outros tipos celulares da bexiga e, portanto, foi evitado um dos problemas mais intratáveis na técnica das análises de microarranjo de amostras clínicas.

[000129] Medindo o acúmulo de marcadores na urina e não se baseando na taxa de expressão nos tumores, foi descoberto de forma inesperada um número de BTM que é útil na detecção de câncer de bexiga e na determinação de seu estágio e/ou seu tipo. Além disso, devido ao fato de que um dos sinais primários que pode fazer com que um paciente consulte um médico em relação a um possível câncer de bexiga é a presença de sangue na urina, foi determinado que os BTMs que não são tão altamente expressos no sangue podem ter grande valor no diagnóstico. Estes marcadores incluem IGFBP5, MGP, SEMA3F e HOXA13 (ver a figura 9).

[000130] A medida do acúmulo fornece vantagens sobre a definição "superexpressão". Como citado anteriormente, um maior acúmulo pode refletir a superexpressão real ou uma maior taxa de expressão em um sentido biológico molecular (isto é, maiores números de moléculas de RNA heteronucleares (hnRNA), moléculas de mRNA ou proteínas por célula por unidade de tempo. Entretanto, o acúmulo também pode significar uma maior quantidade de marcador em um certo volume, tal como na urina, mesmo se a taxa de expressão não for aumentada. Por exemplo, mesmo se uma célula tumoral produzir uma quantidade normal de um marcador, um aumento observado no número de tais células na amostra pode indicar a presença de câncer. Em adição, o acúmulo pode refletir RNA livre ou solúvel em uma amostra. Em alguns casos, as células tumorais que produziram um marcador podem morrer e o conteúdo celular pode ser liberado no tecido circundante. Se o conteúdo celular puder atingir a urina, então o RNA marcador livre pode ser detectado ali. Estes fenômenos podem ser particularmente úteis no diagnóstico de câncer de bexiga superficial, que foi tipicamente difícil de realizar com seletividade e especificidade. A medida de um acúmulo de marcador na urina pode ser um dos primeiros sinais de câncer de bexiga superficial. Portanto, utilizando os métodos e os dispositivos desta invenção, pode ser possível detectar câncer de bexiga em estágios precoces.

[000131] Também pode ser observado que na medida do acúmulo, é preciso tomar cuidado para corrigir as alterações no volume de amostra. Por exemplo, na urina, a quantidade de um marcador por unidade de volume pode depender da função renal do indivíduo. Assim, em condições de uma produção menor de urina, as células na urina (incluindo células tumorais) podem ser concentradas, fornecendo assim uma medida artificialmente maior do acúmulo (por unidade de volume). Tais artefatos podem ser diminuídos através da produção de medidas independentes de produção de urina (por exemplo, saída urinária por unidade de tempo), eliminação urinária (por exemplo, medida de creatinina ou BUN). De forma inversa, em situações em que a saída de urina é aumentada, tal como na diurese, as células contendo marcadores podem ser diluídas e produzem uma medida artificialmente baixa de acúmulo. Entretanto, pode-se controlar o uso de diuréticos, da ingestão de água e outros fatores que podem produzir variações no acúmulo de marcadores que não estão relacionadas com o acúmulo ou com a massa real do marcador em uma amostra. Nestas situações, pode-se corrigir a quantidade de um marcador para a taxa de produção de urina.

[000132] Portanto, medindo os BTMs na urina, foi possível reduzir a incidência de resultados falso positivos, comparados com os dos métodos da técnica anterior, indicando que estes métodos são superiores aos dos métodos da técnica anteior.

[000133] Os marcadores da urina foram selecionados dos dados de arranjo como descrito anteriormente exceto pelo fato de que os critérios de secreção ou de clivagem da membrana não foram aplicados. Portanto, os marcadores intracelulares e ligados à membrana que não eram previstos como sendo marcadores úteis do soro estão incluídos como marcadores da urina.

Exemplos

[000134] Os exemplos descritos aqui têm a finalidade de ilustrar as modalidades da invenção e não é pretendido que limitem o âmbito da invenção. Outras modalidades, métodos e tipos de análises estão dentro do âmbito das pessoas versadas nas técnicas do diagnóstico molecular e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Outras modalidades dentro do âmbito da técnica que se baseiam nos ensinamentos contidos aqui são consideradas como parte desta invenção.

Exemplo 1: Identificação de Marcadores para Malignidade Superficial e Invasiva da Bexiga

[000135] O agrupamento hierárquico dos dados de microarranjos dos padrões de expressão gênica de câncer de bexiga invasivo e superficial mostrou grandes números de diferenças significativas. Como um resultado, estes tipos de cânceres foram tratados separadamente nas análises a seguir. Contudo, uma alta proporção de genes é superexpressa em ambos os tipos de câncer. A figura 3 representa uma tabela que mostra os resultados de estudos com microarranjos para marcadores para malignidade invasiva de bexiga. Trinta e um dos 199 marcadores invasivos satisfizeram os critérios citados anteriormente para os marcadores de soro (Representados por "S" na figura). A figura 4 representa uma tabela que mostra os resultados de estudos com microarranjos para a malignidade superficial de bexiga. Trinta e quatro dos 170 marcadores superficiais satisfazem os critérios anteriores para marcadores do soro. As figuras 3 e 4 incluem o símbolo HUGO para o gene ("símbolo"), o número de oligonucleotídeo da MWG Biotech, o número de seqüência de referência do mRNA do NCBI, o número de seqüência de referência da proteína, a alteração média de vezes entre a expressão gênica tumoral e não-maligna, a alteração máxima de vezes entre a expressão em amostras tumorais individuais e a expressão mediana em amostras não-malignas, os resultados de um teste t de Student não ajustado original, os resultados do teste de Wilcoxon de 2 amostras e o escore de classificação somado.

[000136] A alteração média de vezes (tumor: tecido não-maligno) para os 199 genes na análise de marcadores de câncer de bexiga invasivo variava de 1,3 até 5,3 e a alteração máxima de vezes variava de 2,1 até 60,9. Para as análises de câncer de bexiga superficial, os 170 marcadores variavam da superexpressão média de 1.1.3 até 3,0 e a superexpressão máxima variava de 1,9 até 144. Para cada um dos marcadores mostrados, foi descoberto que a significância estatística de sua especificidade como marcadores de câncer como sendo extremamente alta.

[000137] Os valores do teste t de Student eram, com algumas exceções, todos menores que 10-3, indicando que o diagnóstico utilizando estes marcadores está muito altamente associado com o câncer de bexiga. Deve ser observado que as alterações em vezes geradas pelos estudos com microarranjos tendem a subestimar as alterações reais de expressão observadas utilizando técnicas mais precisas tal como a qPCR. Entretanto, pelas razões descritas em outros lugares, as análises de microarranjos podem sofrer de um ou mais artefatos graves. Portanto, foi desenvolvido um método com base na qPCR para uma detecção mais acurada da presença e do estágio do câncer de bexiga.

Exemplo 2: Análise de qPCR

[000138] A quantificação mais sensível e acurada da expressão gênica foi obtida para um subconjunto dos genes mostrado nas figuras 3 & 4 utilizando a qPCR. O RNA mensageiro de até 30 tumores de bexiga invasivos, 25 tumores de bexiga superficiais e 18 amostras de urotélio normal foi analisado para 18 genes identificados pelas análises de microarranjo (figura 3 & 4), com os resultados mostrados na figura 5. Os dados para câncer de bexiga tanto do tipo invasivo quanto superficial são mostrados em relação aos marcadores SPAG5, TOP2a, CDC2, ENG, NRP1, EGFL6, SEM2, CHGA, UBE2C, HOXA13, MDK, THY1, BIRC5 e SMC4L1. Os marcadores SEMA3F, IGFBP5 e NOV foram apenas superexpressos comparados com o urotélio normal no tipo superficial isoladamente e MGP era apenas superexpresso no tipo invasivo isoladamente; estes marcadores mantinham expressão similar à do urotélio normal nas amostras de tumor que não eram superexpressos. A figura 5 inclui o nome do gene, as aliases gênicas, o símbolo do gene, a alteração de vezes mediana entre o tecido tumoral (T) e não-maligno (N), a alteração de vezes máxima entre as amostras tumorais individuais e a expressão mediana de tecido não-maligno e a % de amostras de tumor com níveis de expressão maiores que 95% dos níveis de expressão em amostras não-malignas.

[000139] A alteração mediana de vezes (tecidos tumorais comparados com a expressão de tecido mediana não-maligno) para os marcadores na figura 5, exceto CHGA, variava de 2 até 128 vezes para tumores de bexiga invasivos e 2 até 39 vezes para tumores de bexiga superficiais. A alteração máxima de vezes para invasivo tumores variava de 24 até 2526 vezes e para tumores superficiais de 6 vezes até 619 vezes. O padrão de expressão de CHGA era notável porque este tinha uma expressão muito alta em uma proporção de tumores (fig. 6s-6t), mas uma expressão indetectável nos restantes. A expressão era indetectável em 15/25 tumores superficiais, 15/29 tumores invasivos e 9/10 amostras normais. A baixa expressão nas amostras normais impede a quantificação acurada do nível de superexpressão em tumores na forma de uma proporção comparada com as normais, mas quando o acúmulo de mRNA de BTM pode ser medido e quantificado e utilizado como uma base para o diagnóstico de câncer de bexiga. Para os tumores invasivos, o nível de expressão dos genes SPAG5, TOP2A e 30 CDC2 era maior em tumores que nos 95% da faixa "normal" para 90% dos casos. Com a exceção de BIRC5, os genes remanescentes da figura 5 que foram verificados nos tumores invasivos tinham uma expressão maior que nos 95% do normal em >45% de amostras. Nos tumores superficiais, o nível de expressão dos genes SPAG5, TOP2A, CDC2, ENG e NRP1 era maior nos tumores que nos 95% da faixa não- maligna para 80% dos casos. Com a exceção de CHGA, UBE2C e BIRC5, os genes remanescentes da figura 5 que foram verificados nos tumores superficiais tinham uma expressão maior que nos 95% do normal em >40% de amostras.

[000140] As figuras 6a - 6af representam histogramas que comparam a freqüência de observação de expressão de cada um de uma série de 18 genes (eixo vertical) e a alteração de vezes em log2 na expressão para tal gene (eixo horizontal), tanto para o tecido normal (barras abertas) quanto para os tecidos tumorais superficiais ou invasivos (barras pretas). Foi descoberto de forma surpreendentemente que para cada um destes 18 genes, havia uma separação substancial nas distribuições de freqüência entre os tecidos normal e tumoral. Por exemplo, a figura 6c representa os resultados para a expressão de TOP2a nos tumores invasivos. Apenas duas amostras tumorais foram observadas como possuindo um nível de expressão na faixa normal.

[000141] O acúmulo dos 18 BTMs SPAG5, TOP2A, CDC2, ENG, IGFBP5, NOV, NRP1, SEMA3F, EGFL6, MGP, SEM2, CHGA, UBE2C, HOXA13, MDK, THY1, BIRC5 e SMC4L1, na urina de pacientes e controles (figura 1: amostra 15 série 1) foi determinado utilizando a qPCR sobre o RNA total extraído partindo de volumes iguais de urina. 17 dos BTMs exibiram maior greater acúmulo na urina de pacientes comparados com os das amostras de controle de urina, com EGFL6 sendo a exceção (figura 7). A diferença mediana de vezes para os 17 BTM variavam de 2 vezes até 265 vezes. A diferença máxima entre uma amostra de um único paciente e o nível mediano nos controles variava de 26 vezes até >10.000 vezes.

[000142] A figura 8 mostra as diferenças no acúmulo do produto de transcrição de BTM para os 13 BTMs representados como gráficos em caixa e filamentos e padronizadas à expressão mediana nas amostras de controle. A figura 8 mostra que MDK, SEMA3F e TOP2A não se sobrepõem na urina de pacientes com câncer e nos controles. Adicionalmente, altos níveis de acúmulo de 25 produtos da transcrição para IGFBP5, HOXA13, MGP, NRP1, SMC4L1, SPAG4 e UBE2C estão quase sempre associados com câncer de bexiga. Para o restante dos BTMs representados na figura 8, BIRC5, NOV e CDC2, sua expressão na urina de pacientes com câncer de bexiga é aumentada em pelo menos aproximadamente 3 vezes comparada com a das amostras de controle normal.

[000143] O sintoma clínico principal que provoca o teste em relação à presença de câncer de bexiga é a hematúria (isto é, a presença de níveis macroscópicos ou microscópicos de sangue na urina). O sangue é tipicamente detectado visualmente ou através da detecção química da hemoglobina utilizando "bastões para imersão" de urina. Apenas aproximadamente 15% e 4% dos casos de hematúria macroscópica e microscópica, respectivamente, estão associados com câncer de bexiga. Conseqüentemente, para um teste de câncer de bexiga ter alta especificidade, é importante que os níveis de expressão dos marcadores no sangue total sejam baixos ou, em alguns casos, indetectáveis. Portanto, para melhorar a identificação de marcadores que possuem alta especificidade, a expressão de doze dos treze marcadores na figura 8 foi determinada no RNA do sangue utilizando a qPCR. A qPCR foi realizada em 5 mig foi realizada em 5 μg de RNA total extraídos do sangue e do tecido de tumor de bexiga utilizando os iniciadores e as sondas descritas na figura 2. A figura 9 mostra o número de ciclos acima do fundamental para cada um dos marcadores. Para os marcadores MGP, IGFBP5, SEMA3F e HoxA13, os produtos da transcrição não podiam ser detectados no sangue, mas os marcadores SMC4L1 e UBE2c, em particular, eram expressos no sangue. Foi observado que os dados, que mostram o número de ciclos da PCR, são inerentemente uma representação gráfica de log2, através da qual um aumento no número de ciclos em 1 indica uma duplicação do sinal. Assim, na avaliação das diferenças entre a presença de marcadores no tecido tumoral e no sangue, uma diferença de dois (2) ciclos, indica uma diferença de 4 vezes na expressão. Similarmente, uma diferença de 5 ciclos (por exemplo, para TOP2A) indica uma diferença de expressão of 25 ou 32 vezes. Outros marcadores tais como TOP2A e MDK possuem expressão detectável no sangue, mas permanecem marcadores razoáveis por causa da grande diferença entre a expressão no sangue e a expressão no tumor de bexiga.

[000144] Para verificar a expressão diferencial entre os marcadores no sangue total e nos tumores de bexiga adicionalmente e para refinar a seleção de marcadores para câncer de bexiga da urina, foram selecionados nove marcadores para análise adicional utilizando RNA da urina de 20 pacientes adicionais, 13 controles normais e 26 controles não-malignos (figura 1: série de amostras 2). Os controles não-malignos incluíam 20 amostras com sangue oculto ou com células sangüíneas brancas detectadas em sua urina por citologia. Todos os nove marcadores exibiam diferenciação entre as amostras de controle e as de paciente com câncer, com uma super-representação mediana em log2 nas amostras de pacientes com câncer variando de 5,4 até 10,4 e 4,0 até 10,1 comparada com as amostras saudáveis e as amostras não- malignas, respectivamente (figura 10). As representações gráficas em caixa e filamentos que ilustram estes dados são mostradas na figura 11.

[000145] Como previsto pelos dados de qPCR do sangue, os marcadores UBE2C e SMC4L1 exibiam aumentos notáveis no acúmulo na urina de controles não-malignos comparados com os de controles saudáveis. O NRP1 também estava significativamente elevado nas amostras de urina de amostras não-malignas comparado com o das amostras de urina de controles saudáveis e exibia sobreposição considerável entre as amostras de pacientes com câncer e as amostras não-malignas de pacientes, TOP2A e MDK também exibiam aumentos, mas pelo fado de que sua expressão muito alta em células TCC mantinha uma grande diferença entre o acúmulo de RNA nas amostras de urina não-malignas de pacientes e nas amostras de pacientes com câncer. Em contraste, HOXA13, IGFBP5, SEMA3F e MGP exibiam apenas pequenos aumentos nas amostras não-malignas de urina comparadas com as amostras de controles saudáveis.

[000146] De forma global, seis marcadores (SEMA3F, HOXA13, MDK, IGFBP5, MGP e TOP2A) exibiam sobreposição mínima entre as amostras de pacientes com câncer e os controles não-malignos. Os três marcadores remanescentes (NRP1, UBE2C, SMC4L1) exibiam elevação significativa em um subconjunto dos controles não-malignos e uma sobreposição com as amostras de pacientes com câncer. O maior acúmulo de marcadores de RNA na urina de controles não-malignos comparados com o dos controles saudáveis é coerente com a expressão destes marcadores nas células de origem hematopoiética ou endotelial que estão presentes na urina de pacientes com doença não- maligna. Portanto, o uso de marcadores individuais para o diagnóstico de câncer de bexiga utilizando amostras de urina demonstra maior sensibilidade e especificidade comparadas com as dos métodos da técnica anterior que não são responsáveis pela expressão do marcador no sangue. Este resultado era completamente inesperado com base na técnica anterior.

[000147] Os dados ilustram a descoberta surpreendente de que a utilidade da utilização de marcadores da urina para câncer de bexiga que exibem alta sensibilidade e especificidade não pode ser prevista de forma acurada utilizando análises de microarranjo de dados de expressão gênica de tumor isoladamente. É necessário levar em consideração a expressão dos supostos marcadores nas células de origem hematopoiética e/ou endotelial. Isto pode ser conseguido: (i) através da análise de qPCR do RNA do sangue, (ii) através da análise dos bancos de dados de expressão (por exemplo, bibliotecas de EST de RNA do sangue e de células vasculares/endoteliais) e/ou (iii) através da análise de qPCR do RNA extraído da urina não-fracionada.

Sensibilidade e Especificidade

[000148] Com base nas duas séries de amostras analisadas e descritas aqui, a sensibilidade para a detecção de câncer de bexiga excede 95%. A especificidade na série 2, que incluía as amostras de pacientes com doença não-maligna, também excede 95%.

Exemplo 3: Uso de Vários Marcadores na Detecção de Câncer de Bexiga

[000149] As figuras 12a-12b representam histogramas do número de genes que exibe uma expressão significativamente maior ("superexpressão") em amostras tumorais individuais comparada com a de amostras normais. Os histogramas se baseavam nos dados da qPCR obtidos partindo dos primeiro doze marcadores mostrados na figura 5. Dos 30 tumores invasivos na análise de PCR, 27 (90%) superexpressavam pelo menos quatro genes em mais de 95% (figura 12a). Dos 25 tumores superficiais na análise, 23 (92%) superexpressavam pelo menos quatro genes em mais de 95 por cento (figura 12b). Estas descobertas indicam que, em situações em que vários genes são superexpressos em relação ao tecido normal, a confiabilidade da detecção de câncer pode ser muito alta, tornando o diagnóstico de câncer mais certo. Entretanto, em alguns casos, a elevação da expressão de um único gene marcador é suficiente para levar ao diagnóstico de câncer.

[000150] A confiabilidade da discriminação bem sucedida de amostras tumorais e não tumorais utilizando combinações de marcadores é adicionalmente ilustrada pela análise estatística representada na figura 13. Esta análise comparava as distribuições normais dos dados de expressão gênica da qPCR de amostras tumorais e não-malignas. Os dados da qPCR foi resumido na figura 5. A análise mostra o efeito do aumento dos números de marcadores utilizados para discriminar as amostras tumorais e não-malignas sobre a sensibilidade do teste (com uma especificidade fixa de 95%). Embora alguns dos 18 marcadores tenham uma sensibilidade maior que 90, 95 ou 99% quando utilizados isoladamente nesta análise, a combinação de dois ou três marcadores possibilitou que uma alta sensibilidade fosse atingida com grandes números de combinações de dois ou três marcadores (figuras 14a e 14b).

[000151] As figuras 14a e 14b mostram a sensibilidade de marcadores específicos e de combinações de marcadores para a detecção de carcinoma de células transicionais invasivo e superficial (TCC), quando a especificidade foi fixada em 95%. Foram mostradas somente as combinações com uma sensibilidade de >90%. Dos 15 marcadores mostrados na figura 14a, o câncer de bexiga invasivo pode ser detectado com uma sensibilidade de aproximadamente 95% para TOP2A, SPAG5 e CDC2 isoladamente. Outros marcadores mostraram ter menor sensibilidade quando utilizados isoladamente.

[000152] Entretanto, combinações de dois dos marcadores anteriores aumentaram drasticamente a sensibilidade de detecção de câncer de bexiga invasivo (figura 13a e figura 14a).

[000153] Uma sensibilidade maior que 95% pode ser observada utilizando 13 das 105 combinações de dois marcadores. Na verdade, a utilização de dois marcadores resulta em uma sensibilidade mínima de 90% em 42 das 105 combinações de marcadores.

[000154] Para o câncer de bexiga superficial (figura 13b e figura 14b), uma sensibilidade maior que 90% não foi observada com quaisquer marcadores isoladamente, entretanto, este limite foi atingido com 11 de 136 combinações de dois marcadores. Uma sensibilidade de >95% foi atingida com 22 combinações de três marcadores.

[000155] O uso de combinações de marcadores também pode aumentar drasticamente a sensibilidade de detecção de câncer de bexiga utilizando amostras de urina. As figuras 15 e 16 mostram a sensibilidade de detecção de marcadores individuais e de combinações de marcadores utilizando os dados da qPCR da urina.

[000156] Como observado na figura 16, embora apenas o IGFBP5 isoladamente tivesse uma sensibilidade de >95%, oito combinações de dois marcadores e 37 combinações de três marcadores atingiram este limite.

Exemplo 4: Acúmulo Diferencial de Produtos da Transcrição em Pacientes com Câncer de Bexiga Superficial e Invasivo

[000157] Pode ser observado partindo da figura 5 que vários BTMs, incluindo SEMA3F, HOXA13, TOP2A e SPAG5, exibem uma expressão diferencial entre os cânceres de bexiga invasivos e os cânceres de bexiga superficiais. Para estender esta observação, foi comparado o acúmulo destes produtos da transcrição na urina de pacientes com câncer de bexiga invasivo e superficial.

[000158] O RNA foi extraído de volumes equivalentes de urina derivada dos pacientes descritos na figura 1 e o acúmulo de BTMs foi determinado pela qPCR. O acúmulo de combinações específicas de BTM foi então expresso na forma de proporções. As combinações de BTMs consistiam em um BTM com superexpressão maior em tumores de bexiga invasivos comparada com a de tumores de bexiga superficiais e um BTM com superexpressão maior em tumores superficiais comparada com a de tumores invasivos.

[000159] A figura 17 mostra três combinações de marcadores analisadas nas amostras de urina de 20 pacientes com TCC superficial e 14 invasivo. As três combinações mostradas são: (i) TOP2A e HOXA13, (ii) TOP2A e IGFBP5 e (iii) TOP2A e SEMA3F. Pode ser observado que estas combinações de marcadores são capazes de diferenciar entre as amostras de urina de pacientes com TCC superficial e invasivo. Outros marcadores na figura 5 que mostram uma diferença na expressão entre os tipos superficial e invasivo de TCC são também capazes de determinar o tipo de TCC, com base na análise de uma amostra de urina.

[000160] Em adição, a figura 18 mostra que o uso de combinações de dois marcadores incluindo TOP2A pode ser feito para distinguir o câncer de bexiga invasivo em tumores nos estágios 1-2 e no estágio 3.

[000161] Estas observações mostram que a determinação do acúmulo de vários produtos de BTM da transcrição na urina possibilita a distinção entre as formas invasivas e superficiais de câncer de bexiga. Além do mais, as proporções de BTM determinadas pela qPCR de amostras de urina de pacientes com câncer de bexiga possibilita uma maior diferenciação entre os tipos invasivo e superficial que a mesma análise realizada no RNA do tumor. Isto é ilustrado pela figura 19, que mostra representações gráficas em caixa e filamentos para: (i) TOP2A e HOXA13, (ii) TOP2A e IGFBP5 e (iii) TOP2A e SEMA3F utilizando os dados da qPCR de aproximadamente 23 preparações de RNA de tumor de bexiga superficial e 28 invasivo; embora as proporções destes BTMs ainda permitam a distinção entre os tipos de câncer de bexiga superficial e invasivo, há uma sobreposição maior entre as proporções superficiais e invasivas. Esta descoberta pode refletir a contaminação das preparações de RNA de tumor com tipos de células tais como musculares e fibroblastos que não têm a mesma proporção de BTM que as células malignas. Alternativamente, pode refletir um diferencial maior na expressão de BTMs nas células malignas que são desprendidos na urina que nas células que permanecem no corpo do tumor. Independentemente da razão para a observação, é concluído que a detecção do acúmulo de BTMs na urina possui vantagens substanciais em relação às análises de microarranjo convencionais de amostras de tecido.

Exemplo 5: Anticorpos para Marcadores de Tumores de Bexiga

[000162] Em aspectos adicionais, esta invenção inclui a produção de anticorpos contra BTMs. Utilizando os métodos descritos aqui, novos BTMs podem ser identificados utilizando métodos de microarranjo e/ou de qPCR. Uma vez que o suposto marcador foi identificado, este pode ser produzido em quantidade suficiente para ser adequado para ativar uma resposta imunológica. Em alguns casos, um BTM de comprimento completo pode ser utilizado e em outros, um fragmento peptídico de um BTM pode ser suficiente como um imunógeno. O imunógeno pode ser injetado em um hospedeiro adequado (por exemplo, camundongo, coelho, etc) e, se desejado, um adjuvante, tal como o adjuvante completo de Freund, o adjuvante incompleto de Freund pode ser injetado para aumentar a resposta imunológica. Pode ser considerado que a produção de anticorpos é rotineira nas técnicas imunológicas e não precisa ser descrita adicionalmente aqui. Como um resultado, pode- se produzir anticorpos contra BTMs ou UBTMs identificados utilizando os métodos descritos aqui.

[000163] Ainda em modalidades adicionais, os anticorpos podem ser produzidos contra a proteína ou o cerne da proteína dos marcadores de tumores identificados aqui ou contra uma seqüência de oligonucleotídeo exclusiva a um BTM. Embora certas proteínas possam ser glicosiladas, variações no padrão de glicosilação podem, em certas circunstâncias, levar à detecção errônea das formas de BTMs que não possuem os padrões de glicosilação usuais. Assim, em certos aspectos desta invenção, os imunógenos para BTM podem incluir BTM desglicosilado ou fragmentos de BTM desglicosilados. A desglicosilação pode ser realizada utilizando uma ou mais glicosidases conhecidas na técnica.

[000164] Alternativamente, o cDNA de BTM pode ser expresso em linhagens de células deficientes em relação à glicosilação, tais como linhagens de células procarióticas, incluindo E. coli e similares.

[000165] Podem ser produzidos vetores que possuem oligonucleotídeos que codificam BTM contidos nos mesmos. Muitos tais vetores podem ser baseados em vetores padronizados conhecidos na técnica. Os vetores podem ser utilizados para transfectar uma variedade de linhagens de células para produzirem linhagens de células que produzem BTM, que podem ser utilizadas para a produção de quantidades desejadas de BTM para o desenvolvimento de anticorpos específicos ou outros reagentes para a detecção de BTMs ou para a padronização de ensaios desenvolvidos para BTMs ou UBTMs.

Exemplo 6: Kits

[000166] Com base nas descobertas desta invenção, vários tipos de kits para testes podem ser imaginados e produzidos. Em primeiro ligar, podem ser produzidos kits que possuem um dispositivo para detecção pré-carregado com uma molécula de detecção (ou "reagente de captura"). Em modalidades para detecção do mRNA de BTM, tais dispositivos podem compreender um substrato (por exemplo, vidro, silício, quartzo, metal etc) sobre o qual se ligam os oligonucleotídeos como reagentes de captura que se hibridizam com o mRNA que será detectado. Em algumas modalidades, a detecção direta do mRNA pode ser realizada através da hibridização do mRNA (rotulado com cy3, cy5, marcação radioativa ou outra marcação) aos oligonucleotídeos sobre o substrato. Em outras modalidades, a detecção do mRNA pode ser realizada produzindo primeiramente um DNA complementar (cDNA) para o mRNA desejado. Então, o cDNA rotulado pode ser hibridizado aos oligonucleotídeos sobre o substrato e detectado.

[000167] Independentemente do método de detecção empregado, pode ser desejável uma comparação da expressão de BTM de teste com uma medida padronizada de expressão. Por exemplo, a expressão do RNA pode ser padronizada em relação ao DNA celular total, à expressão de RNAs expressos constitutivamente (por exemplo, RNA ribossomal) ou a outros marcadores relativamente constantes. Em modalidades que medem os BTMs em fluidos corporais, tal como a urina, o padrão pode ser um volume igual de urina obtido para indivíduos sem doença maligna, como mostrado aqui.

[000168] Os anticorpos também podem ser utilizados em kits como reagentes de captura. Em algumas modalidades, um substrato (por exemplo, uma placa com várias cavidades) pode ter um reagente de captura específico a BTM ou a UBTM reagente de captura ligado ao mesmo. Em algumas modalidades, um kit pode ter um reagente de bloqueio incluído. Os reagentes de bloqueio podem ser utilizados para reduzir a ligação inespecífica. Por exemplo, a ligação de oligonucleotídeos inespecífica pode ser reduzida utilizando DNA em excesso de qualquer fonte conveniente que não contenha oligonucleotídeos de BTM, tal como o DNA de esperma de salmão. A ligação inespecífica do anticorpo pode ser reduzida utilizando um excesso de uma proteína de bloqueio tal como a albumina do soro. Podem ser considerados vários métodos para a detecção de oligonucleotídeos e proteínas são conhecidos na técnica e qualquer estratégia que possa detectar especificamente moléculas associadas a BTM possa ser utilizada e seja considerada dentro do âmbito desta invenção.

[000169] Em modalidades que se baseiam na detecção com anticorpos, as proteínas ou os peptídeos de BTM podem ser expressos em uma base por célula ou em uma base de proteína total celular, de tecido ou de fluido, volume de fluido, massa de tecido (peso). Adicionalmente, o BTM no soro pode ser expresso com base em uma proteína no soro em alta abundância tal como a albumina.

[000170] Em adição a um substrato, um kit de teste pode compreender reagentes de captura (tais como sondas), soluções de lavagem (por exemplo, SSC, outros sais, tampões, detergentes e similares), assim como porções de detecção (por exemplo, cy3, cy5, radiorrotuladas e similares). Os kits podem também incluir instruções para uso e uma embalagem.

Exemplo 7: Combinações de BTMs Utilizadas para a Detecção de Câncer de Bexiga I

[000171] Em uma série de modalidades, os reagentes para o teste dos BTMs HOXA13, MGP, SEMA3F e TOP2A, isoladamente ou em combinação, podem ser incorporados em um kit para o teste da urina não-fracionada ou de sedimentos celulares na urina para detectar câncer de bexiga. A faixa de acúmulo destes BTMs em pacientes com câncer e controles são mostradas na figura 20. As amostras de urina foram coletadas de pacientes com câncer de bexiga diagnosticado que requeriam o monitoramento da progressão da doença ou da resposta ao tratamento, indivíduos com sintomas urológicos incluindo hematúria macroscópica ou microscópica ou indivíduos assintomáticos. Para os pacientes ou indivíduos que serão testados com um kit que mede os BTMs na urina não-fracionada, aproximadamente 2 mL de urina podem ser tirados para o teste. Para os testes no pélete de urina, >20 mL de urina podem ser coletados.

[000172] Um kit adequado inclui: (i) instruções para uso e para a interpretação dos resultados, (ii) reagentes para a estabilização e a purificação do RNA da urina não-fracionada ou de péletes de urina, (iii) reagentes para a síntese de cDNA incluindo dNTPs e transcriptase reverse e (iv) reagentes para a quantificação do cDNA de BTM. Em uma forma, estes reagentes seriam utilizados para a PCR quantitativa e incluiriam iniciadores de oligonucleotídeos específicos que abrangem éxons, um terceiro oligonucleotídeo rotulado com uma sonda para detecção, Taq polimerase e os outros tampões, sais e dNTPs necessários para a PCR.

[000173] O kit também pode utilizar outros métodos para a detecção dos produtos da transcrição tal como a hibridização direta do RNA de BTM com sondas rotuladas ou a tecnologia do DNA ramificado; (v) oligonucleotídeos e sonda para a detecção de produtos da transcrição partindo de um gene altamente transcrito, tal como a β-actina, para servir como uma medida de controle de qualidade; e (vi) amostras quantificadas da seqüência alvo de BTM para atuar como um padrão de calibração interna e uma referência para o limite superior de acúmulo do produto da transcrição de BTM em controles saudáveis e não- malignos. O limite superior pode ser definido na forma de 95 ou 99 por cento da faixa de controle, embora outros limites possam ser aplicados. Em particular, para o diagnóstico de câncer de bexiga superficial, um limite conveniente é acima de aproximadamente 50%, em outros casos acima de aproximadamente 60%, 70% ou 80%.

[000174] Assim, utilizando os métodos desta invenção, pode-se detectar câncer de bexiga, assim como o estágio e o tipo com sensibilidade e especificidade maiores comparadas com às dos métodos anteriores.

[000175] Em algumas modalidades, a função renal pode ser determinada utilizando métodos convencionais (por exemplo, medidas da creatinina). Em algumas destas modalidades, o acúmulo de marcadores pode ser corrigido através de uma medida da função renal (por exemplo, volume de urina, volume de células, número de células ou proteína celular total na amostra de urina).

[000176] Para os testes que envolvem a qPCR, as amostras de teste que excederam o limite superior predeterminado receberiam escores positivos se o acúmulo de BTM na amostra de teste fosse maior que um ciclo da PCR superior ao limite superior. Para outros métodos de detecção, resultados maiores que 2 vezes mais altos que o limite superior (por exemplo, 90, 95 ou 97,5 por cento) do normal receberiam escores positivos.

Exemplo 8: Combinações de BTMs Utilizadas para a Detecção de Câncer de Bexiga II

[000177] Em uma outra série de modalidades, o acúmulo na urina de qualquer uma ou de ambas as combinações de marcadores TOP2A/SEMA3F e TOP2A/HOXA13 pode ser utilizado para fornecer uma previsão forte do tipo histológico de câncer de bexiga que está presente em um paciente com um diagnóstico de câncer de bexiga feito utilizando um teste de urina ou de sangue de qualquer tipo. Assim, a cistoscopia e a verificação histológica podem não ser necessárias para diagnosticar o tipo de câncer de bexiga.

[000178] Os kits utilizados para testar estas proporções contêm (i) até (iv) dos componentes descritos no Exemplo 7. Após a quantificação do acúmulo dos BTMs de acordo com a prática padronizada da qPCR, as proporções de TOP2A/SEMA3F e TOP2A/HOXA13 foram calculadas. As faixas destas proporções na urina de pacientes com câncer de bexiga superficial e invasivo são mostradas na figura 21. Utilizando um teste de qPCR, uma diferença menor que cinco ciclos entre TOP2A e SEMA3F, com SEMA3F sendo o produto de transcrição mais abundante, pode prever o câncer de bexiga invasivo e maior que cinco ciclos pode prever o câncer de bexiga superficial. Para TOP2A e HOXA13, uma diferença menor que oito ciclos, com HOXA13 sendo o produto de transcrição mais abundante, pode prever o câncer de bexiga invasivo e maior que oito ciclos pode prever o câncer de bexiga superficial.

Exemplo 9: Avaliação da Progressão de Câncer de Bexiga Utilizando BTMs

[000179] Para avaliar a progressão de tumores de bexiga, as amostras de tecido são obtidas através de biópsia da parede da bexiga ou as amostras de urina são coletadas ao longo de um período de tempo de um paciente que possui câncer de bexiga. A avaliação do acúmulo de BTMs, UBTMs ou combinações dos mesmos é feita para amostras tiradas em momentos diferentes. O maior acúmulo individual ou de combinações de BTMs ou UBTMs é indicativo da progressão de câncer de bexiga.

Exemplo 10: Avaliação da Terapia de Câncer de Bexiga Utilizando BTMs

[000180] Para avaliar a eficiência da terapia para os tumores de bexiga, amostras de tecido e/ou de urina são obtidas antes que o tratamento seja iniciado. Os níveis da linha de base de um ou mais BTMs ou UBTMs são determinados, assim como são as proporções de vários BTMs e UBTMs em relação um ao outro. O tratamento é iniciado e pode incluir qualquer terapia conhecida na técnica, incluindo cirurgia, terapia de radiação ou quimioterapia quando apropriado para o tipo e o estágio da doença. Durante o curso da terapia, as amostras de tecido e/ou de urina são coletadas e analisadas em relação à presença e à quantidade de BTMs e/ou UBTMs. As proporções de vários BTMs e UBTMs são determinadas e os resultados são comparados: (1) aos níveis da linha de base do paciente antes do tratamento ou (2) aos valores normais obtidos partindo de uma população de indivíduos que não possuem câncer de bexiga.

Incorporação como Referência

[000181] Todas as publicações e patentes citadas neste pedido de patente são incorporadas completamente aqui como referência. Este pedido de patente contém seqüências de nucleotídeos e/ou de proteínas. Uma Listagem de Seqüências no formato que pode ser lido por computador e um disquete contendo uma Listagem de Seqüências estão incluídos dentro deste pedido de patente e são incorporados completamente aqui como referência.

Aplicabilidade Industrial

[000182] Os métodos para a detecção de membros da família de BTM e de UBTM incluem a detecção de ácidos nucléicos, proteínas e peptídeos utilizando métodos de microarranjo e/ou de PCR em tempo real. As composições e os métodos desta invenção são úteis no diagnóstico de doença, na avaliação da eficiência da terapia e para a produção de reagentes e kits de teste adequados para medir a expressão de membros da família de BTM ou de membros da família de UBTM.

Claims

1. Processo para detecção de câncer de bexiga em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar uma quantidade aumentada de mRNA específico para um marcador de tumor da bexiga urinária (UBTM) em uma amostra de urina do referido indivíduo em comparação com a quantidade do referido mRNA em uma amostra de urina de indivíduos que não sofrem de câncer de bexiga maligno, em que o UBTM é homeo box A13 (HOXA13).

2. Processo para detecção de câncer de bexiga em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar uma quantidade aumentada de mRNA específico para um marcador de tumor da bexiga urinária (UBTM) em uma amostra de urina do referido indivíduo em comparação com a quantidade do referido mRNA em uma amostra de urina de indivíduos que não sofrem de câncer de bexiga maligno, em que o UBTM é midkine - fator promotor de crescimento de neuritos 2 (MDK).

3. Processo para detecção de câncer de bexiga em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar uma quantidade aumentada de mRNA específico para um marcador de tumor da bexiga urinária (UBTM) em uma amostra de urina do referido indivíduo em comparação com a quantidade do referido mRNA em uma amostra de urina de indivíduos que não sofrem de câncer de bexiga maligno, em que o UBTM é proteína 5 de ligação ao fator de crescimento similar à insulina (IGFBP5).

4. Processo para detecção de câncer de bexiga em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar uma quantidade aumentada de mRNA específico para um marcador de tumor da bexiga urinária (UBTM) em uma amostra de urina do referido indivíduo em comparação com a quantidade do referido mRNA em uma amostra de urina de indivíduos que não sofrem de câncer de bexiga maligno, em que o UBTM é topoisomerase (DNA) II alfa (TOP2A).

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito UBTM não está presente no sangue a uma extensão substancial.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o aumento de pelo menos mais um UBTM, em que o pelo menos mais um UBTM é selecionado a partir do grupo que consiste em HOXA13, MDK, IGFBP5, TOP2A, GGH, SPP1, NRN1, SPARC, ADAMTS10, CNTN1, TLL2, PDIR, FBN1, produto gênico de KIAA0100, CALR, ITGBL1, ELA3B, SMOC2, HEXA, IGFBP7, MFAP2, CILP, OLFM1, LUM, SEM2, PRSS11, SULF1, SERPINH1, MGP, TIMP1, EGFL6, SPAG11, IGFBP5, SEMA3F, TOP2A, UBE2C, STMN1, TUBA4, HIST1H1B, HMGB2, CCNA2, CDCA1, proteína hipotética MGC5576, DEK, MLF1IP, CDCA8, proteína hipotética FLJ20647, TYMS, SMC4L1, LYN, HMGB3, PTGIR, DONSON, HMMR, CLDN6, HIST1H1D, C10orf3, KNTC1, CKS1B, RRM2, HIST1H2BH, STK6, MPHOSPH1, CCNB2, GPR32, ENG, MFHAS1, HIST1H1C, AVPR2, CENPF, HOXA13, membro g da família de histona h4, gene MGC27121, NP, ASPM, proteína hipotética FLJ11871, LBH, NUDT1, HELLS, ASB9, MCM5, IMP-2, DKFZP566M1046, TUBA2, GAS2L3, proteína hipotética FLJ12442, MCM6, DOK3, WDR18, CKAP2, KIF20A, proteína fap putativa, C6orf32, NEK2, CRY1, TGM2, DLG7, EIF2C2, DEPDC1, HIST2H4, MCM7, MTAP, KNTC2, HSPC150, SMC6L1, HIST1H2BC, ASF1B, ARH, LMNB1, proteína hipotética FLJ10719, proteína hipotética FLJ 10706, MAD2L1, SLC22A2, proteína hipotética MGC34923, SPAG5, ACVRL1, DSCR1, PRSS15, S100A9, MCM4, ST7L, PLEKHA4, EPHB1, CALD1, SMC1L1, Thy-1 co-transcrito, RAMP, FKBP11, C20orf129, HIST1H4H, CDKN3, MCAM, SNCAIP, NIPSNAP1, AP1M1, ANLN, C6orf69, TORC3, MAZ, TXNRD1, proteína hipotética xp 096695, C22orf4, VSNL1, cadeia de 83 kDa similar à Carboxipeptidase N, KIAA1598, proteína hipotética FLJ13501, DKFZP4340047, proteína hipotética FLJ38716, proteína hipotética similar ao (região L1H3), proteína hipotética KIAA1875, PRIM1, proteína hipotética BC001096, MCM2, GJA3, C11orf30, similar à proteína hipotética FLJ30672, THY1, LRP3, LASS2, C18orf8, ZNF81, NARF, MTHFD2, D6T, SIAT7D, MMPL1, KLK11, KPNA2, FGFR1OP2, VIM, proteína FLJ44108, PAPOLG, FHOD1, RASL12, HMGN2, PITPNM2, DER1, EPHA4, VSIG1, RGS5, proteína KIAA1639, SH2B, PGLYRP4, CDC45L, MLSTD1, proteína hipotética MGC11266, TNFRSF13B, NET1, LHFPL5, MX2, SPHK1, ABCG4, SERPINB2, GALNT10, LEPR, MXD4, FAPP2, NUP210, CSK, NRP1, MGAT1, produto gênico de KIAA0100, LCN7, BMP7, ADAMTS10, PM5, NOMO3, CPA6, NPPC, proteína hipotética FLJ23221, ERP70, GALNT14, ITIH3, PAPPA2, LOXL1, TNFRSF6B, SPARC, MSMB, CLDN6, PTMA, AVPR2, proteína similar ao transportador de creatina dependente de sódio e cloreto, TMEM19, proteína hipotética xp 047287, proteína hipotética FLJ11871, PROSC, MGC27121 gene, NQO1, CKAP4, proteína hipotética BC001096, PDPK1, regulador da formação do fuso mitótico 1, MIRAB13, PORCN, SIX6, GJB2, proteína FLJ35784, SLC37A3, SPRY4, LHX3, C7orf27, SLC39A1, ZNF307, MIF, BST2, PSTPIP1, SOX4, NCOA5, proteína hipotética FLJ31438, ODD, SLC23A2, SHFM1, SRPK2, RAMP2, BPGM, RGS5, CXADR, MEIS2, TENS1, SNAI2, CHST2, HCA127, Thy- 1 co-transcrito (LOC94105), LRFN3, proteína hipotética FLJ22390, TRIB2, KRTHA3B, KIF21A, ANKRD17, RAG1, NUBP2, proteína hipotética FLJ20489, CASK, HIP1, PRKCDBP, TIE, C5orf15, CGI-72. ENTPD8, SH3BGRL3, homólogo da subunidade MLRQ da NADH:ubiquinona oxidorredutase, VG5Q, BG1, BCL2L11, ARK5, TLE3, ITIH5, RGS11, TM7SF3, SCRN3, PLXNA1, GJA4, proteína hipotética DKFZp434G1415, WSB2. CDA, GART, ZMPSTE24, TMEM33, GPI, proteína hipotética FLJ11000, CAMK1D, PTPN21, e TNS.

7. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o aumento de pelo menos mais um UBTM definido pelo CDC2.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a dita detecção é realizada utilizando um microarranjo.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a dita detecção é realizada utilizando processos de reação em cadeia da polimerase quantitativa ou de hibridização.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo inclui a detecção do acúmulo de dois ou mais UBTM na dita amostra.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de um ou mais pares de marcadores selecionados do grupo que consiste em TOP2A-HOXA13, TOP2A-IGFBP5, TOP2A-MDK, HOXA13-IGFBP5, HOXA-13-MDK, IGFBP5-MDK, e CDC2-MDK.

12. Processo para a detecção de câncer de bexiga em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a detecção de uma quantidade aumentada de mRNA específico para uma combinação de UBTM selecionada do grupo que consiste em CDC2, HOXA13, MDK e IGFBP5 (CDC2-HOXA13-MDK- IGFBP5), CDC2-HOXA13-MDK-TOP2A, CDC2-MDK-IGFBP5-TOP2A, HOXA13-MDK-IGFBP5-TOP2A, HOXA13-IGFBP5-MDK, HOXA13- IGFBP5-TOP2A, HOXA13-MDK-TOP2A, IGFBP5-MDK-TOP2A e CDC2-HOXA13-MDK-IGFBP5-TOP2A, em uma amostra de urina do referido indivíduo em comparação com a quantidade de cada um dos referidos marcadores em uma amostra de urina de indivíduos que não sofrem de câncer de bexiga maligno.