KR20180023048A - 방광암 검출용 소변 표지 - Google Patents

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KR20180023048A
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패리 존 길포드
나탈리에 제인 케르
로버트 폴록
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퍼시픽 에지 리미티드
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Abstract

종양의 조기 검출은 방광 종양을 포함한 종양 질환을 앓고 있는 환자의 수명을 좌우하는 중요한 요인이다. BTM 또는 UBTM군의 일원인 표지들은 방광 종양 조직과 다른 종양 조직에서 고도로 또한 일관되게 축적되고/축적되거나 환자의 오줌 속에 축적되므로 방광암과 기타 다른 암의 표지가 된다. 몇몇 실시 태양에서 BTM 또는 UBTM은 오줌 속에 축적되므로 UBTM군 표지들은 진단의 유효한 접근 방법이 된다. 다른 실시 태양에서는 정량적인 PCR 방법이 마이크로어레이 분석에 비하여 유리하다. 또 다른 실시 태양에서는 복수의 BTM 또는 UBTM을 탐지하고 계량화하여 방광암의 진단 감도와 특이성을 높일 수 있었는데, 이는 방광암의 병기와 형을 결정하는 방법을 제공하는 것으로 이어진다. 본 발명의 검출 방법을 쉽고 편리하게 수행하기 위한 키트도 제공한다.

Description

방광암 검출용 소변 표지{URINE MARKERS FOR DETECTION OF BLADDER CANCER}
본 발명은 암의 검출에 관한 것이다. 더 자세하게는 방광암 검출을 위한 요 표지들의 용도에 관한 것이다. 더 자세하게는 방광암을 검출하고, 유형 결정을 수행하고, 병기(病期)를 파악(staging)하기 위한 오줌 속 올리고뉴클레오티드, 단백질 및/또는 항체 표지의 용도에 대한 것이다.
우선권 주장
본 출원은 퍼시픽 에지 바이오테크놀러지 엘티디가 출원인인 2004년 7. 23자 뉴질랜드 임시 출원 제534,289호 “방광암 검진용 표지”와 2005년 4. 4자 뉴질랜드 임시 출원 제539,219호 “방광암 검진용 표지”, 그리고 발명자가 패리 존 길포드, 나탈리 제인 커와 로버트 폴락인 2005년 6. 20자 미국 출원 60/692,619호 “방광암 검진용 소변 표지”에 기초한 것이다. 이 출원들은 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용하고 있다.
암 치료를 조기에 시작할 경우 암환자의 여명은 대폭 늘어난다. 방광암의 경우, 초기에 진단을 받은 환자의 5년 생존율은 90%를 넘어, 더 암이 진행되었을 때 진단받은 환자들의 생존율 약 15~30%와 비교된다. 그러므로 방광암을 조기 진단할 수 있게 해 주는 진단법의 발견은 환자의 예후를 개선하게 된다. 소변 시료를 이용한 방광암 검진에 있어서 확립된 방법은 세포학적 방법이다. 그러나 세포학적 방법은 침습성(侵襲性 invasive) 방광암의 진단에는 약 75%, 얕은 (superficial) 방광암 진단에는 약 25% 정도의 진단 감도 밖에는 가지지 못한다는 것이 알려져 있다(Lotan과 Roehrborn, Urology 61, 109~118, 2003년). 방광암은 침습성 방광암과 얕은 방광암 두 종류로 크게 나뉜다. 침습성 방광암은 아래쪽 조직층으로 파고 드는데 반해, 얕은 방광암은 주로 방광 내강에서 폴립(polyp)과 유사하게 생장한다.
오줌 속의 특이적 표지 물질들의 확인은 암의 조기 진단과 나아가서 조기 치료, 향상된 환자의 예후로 이어질 수 있기 때문에 그 값어치가 크다. 특이적 암 표지는 또한 암의 진행을 모니터링하는 수단을 제공하므로 수술 치료, 방사능 치료와 화학 치료의 효능을 모니터링할 수 있게 해 준다. 그러나 주요 암 중 다수는 충분한 감도와 특이성을 갖춘 표지를 결여하고 있다.
현재 방광암을 검진하는 가장 믿음직한 방법은 세포 검사법(cytoscopy)과 생검(生檢 biopsy)한 환부의 조직학 분석이다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고, 침습적(侵襲的 invasive)인 방법이며 감도도 약 90%에 불과한데, 이는 이 방법을 사용할 경우 10% 정도의 암은 검출되지 않는다는 것을 뜻한다. 비침습적 검사 방법 중 박리된(exfoliated) 악성 세포를 검출하는 요세포진단법은 현재 선호된다. 세포진단법은 특이성이 95% 정도로 높지만, 낮은 등급의 병변(病變 lesion)에 대해서는 감도가 떨어지며(9~25%), 진단 결과가 시료의 품질에 극도로 좌우되며 검사자 개인에 따른 편차가 크다는 문제점이 있다.
최근에 방광에서 생체 시료를 얻어 유전적 표지를 검사하려는 시도가 있었다. 가장 흔하게 쓰이는 방법은 마이크로어레이 분석인데 이 방법은 유전자 표지로 추정되는 서열의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 단편을 갖추고 있는 마이크로어레이에 환자로부터 채취한 mRNA 또는 cDNA 시료를 노출시키는 방법이다. 이러한 방법을 통하여 최근 몇몇 연구 사례에서 방광암의 표지로 추정되는 유전자를 많이 확인하였다. 그러나 마이크로어레이 기술은 정량적인 방법이라고 하기는 비교적 어렵고 편차가 심하다.
방광암의 존재를 나타내는 소변이나 혈액 표지를 검출하는 것은 방광암의 검진법을 개선하는 데 있어서 하나의 가능성이 된다. 방광암용 혈액 표지 개발 분야에서는 거의 진전이 없었으나, 단백질 표지로는 몇 가지가 존재한다. 이들 표지를 이용한 검사는 세포진단법보다는 감도가 더 높지만 특이성면에서는 최적 수준에 못 미치는데, 그 까닭은 이들 표지가 염증, 요석증, 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia)과 같은 비악성종양성 질환에서도 높은 농도로 흔히 검출되기 때문이다. 예를 들어 특이적으로 핵 기질(nuclear matrix) 단백질을 검출하는 표지인 NMP22의 경우, 그 감도는 47~87%이고 특이성은 58~91%이다. NMP22의 높은 가변성 때문에 방광암의 신속하고 용이한 검사용으로 이 표지는 이상적이지 못하다. 다른 요 검사법에는 전사된 mRNA를 역전사 중합 효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)로 증폭하는 방법이 있는데, 예를 들어 소변 시료의 세포 덩이(cell pellet)에서 얻은 텔로머라제 hTERT 유전자를 증폭하는 방법이다. RT-PCR은 높은 감도를 제공하지만, 현존하는 RT-PCR용 표지들의 특이성은 여전히 불확실하다. 암의 조기 검진과 진단을 위한 도구를 더 발전시킬 필요가 있다. 본 발명은 암 표지, 특히 방광암 표지를 바탕으로 한 개량된 검출 방법, 검출용 조성물, 검진 키트와 장치를 제공하며 암의 조기 검출과 진단을 돕는다.
본 발명은 암 표지, 특히 방광암 표지를 바탕으로 한 개량된 검출 방법, 검출용 조성물, 검진 키트와 장치를 제공하며 암의 조기 검출과 진단을 돕는다.
본 발명자들은 마이크로어레이 분석과 정량적 중합 효소 연쇄 반응(quantitiave polymease chain reaction, qPCR)을 조합하여 방광암에 선택성이 있는 특이적 유전자 표지를 확인할 수 있었다. 일부 실시예에서 본 발명자들은 방광 종양의 병기를 가려낼 수 있는 표지를, 다른 실시 태양에서는 암의 종류를 가려낼 수 있는 표지를 확인하였다. 또 다른 실시 태양에서 본 발명자들은 예상 밖에도 둘 이상의 표지를 조합하면 방광암을 높은 신뢰도와 감도를 가지고 검출할 수 있음을 발견하였다. 그와 다른 실시 태양에서 본 발명자들은 혈액 내 세포가 아니라 방광암 세포에서 고도로 발현되는 유전자 표지들을 확인할 수 있었다. 따라서 많은 실시 태양에서 본 발명의 검사 방법은 종래의 방광암 검사법보다 예측할 수 없는 뛰어난 효과가 있다.
어떤 실시 태양에서는 마이크로어레이를 이용, 비악성 방광 조직과 비교했을 때 방광 종양 조직에서 발현이 크게 늘어난 유전자들을 확인하였다. 이 유전자들, 그리고 이들이 암호화하는 단백질들은 본 명세서에서 방광 종양 표지(bladder tumor marker, BTM)이라고 지칭한다. 방광 종양 표지(BTM)라고 할 때 이 표지가 방광 종양에 대해서만 특이적일 필요는 없다는 것을 주지하여야 할 것이다. 오히려 BTM은 악성 종양을 포함하는 다른 종류의 종양에서도 고도로 발현될 수 있다. 또한 BTM에는 혈액 세포에서 고도 발현되지 않는 표지들도 포함된다는 점을 밝히고자 한다.
본 발명에서는 시료를 소변에서 채취하므로 종래 기술의 생체 시료 채취에서 흔히 있던 이종(異種) 세포 발현 현상은 나타나지 않는다. BTM이란 용어는 방광암 검출에 쓸모 있는 개별 표지를 조합한 경우도 포함한다.
본 발명의 다른 실시 태양에서는 시료 속 표지의 존재를 확인하는 방법을 제공하는 데, 여기에는 면역조직학적 방법과 qPCR이 포함된다. qPCR 검사법은 마이크로어레이법에 흔하게 나타나는 인공적 허상(artifact)에 시달릴 가능성이 적다. 이러한 인공적 허상으로는 어레이 화소(dot)에 놓인 리간드 올리고뉴클레오티드 수의 차이, 어레이 상에서 상보결합하고 있는 올리고뉴클레오티드에 대한 염료 물질의 불균일하고 예측할 수 없는 결합, 어레이 기판 위 비특이적 물질에 대한 세척의 불균일성과 그 밖의 다른 문제들을 들 수 있다.
본 명세서에서 개시하는 유전자 중 일부는 세포에서 분비되거나 잘려 나오거나, 세포 사멸시 세포에서 방출되는 단백질을 암호화한다. 이 단백질과 그 mRNA는 방광암 진단에 쓰이는 용도뿐 아니라 확립된 질환의 진행 추이를 모니터링하는 또 다른 용도에도 쓰일 수 있다. 이 표지들은 단독으로 사용될 수도 있고 다른 표지와 조합하여 쓰일 수도 있다. 덧붙여서 다른 유전자, RNA 전사체와 그에 의하여 암호호화되는 단백질들도, 이들이 세포 내에 머물거나 세포 표면에 결합되는 경우에 단독으로 또는 조합을 통하여 소변 표지로 쓰일 수 있다.
얕은(superficial) 방광암과 침습성 방광암에 대한 치료법은 서로 다를 수 있다. 침습성 방광암은 얕은 방광암과 비교했을 때 외과적 절제 시술의 필요성이 더 시급하고 치료 방법에서 대안 선택 여지가 좁다. 반대로 얕은 방광암은 방광내 화학요법(intravesicular chemotherapy) 또는 방광내 BCG 면역요법을 사용하여 성공적으로 치료할 수 있다.
그러나 현재 세포검사 분석 없이 얕은 방광암과 침습성 방광암을 쉽고 믿을 수 있게 구별하는 방법은 존재하지 않는다. 이 두 종류의 방광암을 요 검사와 같은 비침습성 방법을 이용하여 구별할 수 있다면 임상의는 세포검사 분석 없이도 적절한 치료법을 선택할 수 있게 될 것이다. 세포검사 분석은 비용이 많이 들고 불편하며, 종종 환자들이 잘 받아들이지 못한다.
본 발명자들은 어떤 소변 표지들, 특히 피 속에 높은 농도로 존재하지 않는 것들을 조합하여서, 혹은 단독으로 사용할 경우, 방광암을 현저한 고도의 신뢰성과 감도를 가지고 특이적으로 진단할 수 있다는 특성을 발견하였다.
본 발명의 실시 태양을 상술하기 전에 본 명세서에서 사용할 용어를 정의하는 것이 유용할 것이다.
"표지"란 어떤 생물학적 현상의 존재와 정량적으로 또는 정성적으로 연관된 분자를 일컫는다. "표지"의 예로는 유전자, 유전자 단편, RNA, RNA 단편, 단백질 또는 단백질 단편, 관련 대사 물질, 부산물 또는 해당 현상의 바탕에 놓인 메커니즘에 직·간접적으로 관련된 다른 식별 분자를 들 수 있다.
"감도(sensitivity)"란 해당 질환의 환자 중 검사 결과가 양성인 비율을 말한다. 따라서 감도가 높을수록 거짓인 음성 검사 결과가 적음을 뜻한다.
"특이성(specificity)"이란 병을 앓지 않는 사람들 중 검사 결과가 음성으로 나타나는 비율을 말한다. 따라서 특이성이 늘어나면 거짓 양성 검사 결과가 적어진다.
"방광 종양 표지(bladder tumor marker, BTM)" 또는 "BTM" 또는 "BTM군 표지"란 방광암에 관련된 표지를 말한다. BTM이란 용어에는 조합을 통하여 방광암 검진의 감도와 특이성이 늘어나는 개별 표지들의 조합도 포함된다. 본 명세서의 특정 부분에서는 BTM에 UBTM(여기서 정의함)도 포함되는 것으로 하며, BTM의 예로는 도 3과 도 4의 기재를 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
BTM 여부를 확인하는 한 가지 방식은 방광암이 의심되는 환자의 조직 시료에서 RNA를 추출한 다음 그 RNA를 다수의 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 마이크로어레이에 가하여 그 시료 RNA와 상기 마이크로어레이의 올리고뉴클레오티드가 하이브리드를 이루도록 하고 각 마이크로어레이 부착점(spot)마다 결합한 RNA의 양을 정량하는 것이다. 어떤 표지를 BTM으로 간주하기 위하여서는 그 표지의 마이크로어레이 수치가 정상, 비종양 조직의 해당 수치보다 적어도 1.2배는 되어야 한다. 혹은 상기 정상치의 약 2배, 3배, 4배 또는 5배로 문턱값(threshold)을 설정할 수 있다. "정상"이란 정상적인 모집단의 상위 10%(90th percentile) 이내이거나, 특정한 경우 상위 5% 이내(즉 평균에서 표준편차의 약 2배 이탈한 범위), 또 다른 경우는 상위 2.5% 이내(약 표준편차 3배) 또는 상위 1% 이내를 뜻할 수 있다.
또 다른 경우에는 종양 조직에서는 존재하지만 혈액 속에서는 실질적인 양으로 존재하지 않는 BTM을 고를 수 있다. "실질적인 양으로"라는 것은 종양 조직 속에 존재하는 양이 혈액 속에 존재하는 양보다 qPCR로 적어도 약 5 사이클 이상 차이가 나는 것을 말한다.
"요 방광 종양 표지(urine bladder tumor marker, UBTM)" 또는 "UBTM" 또는 "UBTM군 표지"라 함은 방광암과 관련 있는, 소변 속에서 검출되는 BTM으로서, TOP2A, MDK 또는 BIRC5를 포함하지 않는 것을 말한다. UBTM이란 용어에는 소변 시료 속 방광암을 검출하는 데에 있어서 감도와 선택성을 높여줄 수 있는, 둘 또는 세 표지의 조합도 포함된다. 본 명세서 도 14a와 14b는 UBTM의 보기로서 제한적이지 않은 예를 들고 있다.
그 밖의 경우 UBTM은 요 시료에서 마이크로어레이를 이용하거나, qPCR 분석을 통하여 확인할 수 있는데, qPCR의 경우 분석 대상 표지를 감안한 탐식자(probe)와 정방향, 역방향 프라이머를 이용한다. 소변 시료의 방광암 검진을 위한 문턱값은 정상 피검자의 소변 속 표지량보다 1 사이클(2배), 2 사이클(4배), 3 사이클(8배), 4 사이클(16배), 5 사이클(32배) 혹은 그 이상 높을 수 있다.
본 명세서에서 "qPCR"이란 정량적 중합효소 연쇄반응을 의미한다. 본 명세서에서 "발현"이란 용어에는 유전자 또는 유전자의 일부로부터 mRNA 생성, RNA 또는 유전자 또는 유전자 일부로부터 암호화되는 단백질의 생성, 그리고 발현과 연관된 피검 물질의 출현이 포함된다. 예를 들어, 항체와 같은 결합 리간드가 유전자나 다른 올리고뉴클레오티드, 단백질 또는 단백질 단편과 결합하면 이 결합 리간드를 가시화하는 것도 "발현"에 포함된다. 따라서 웨스턴 블럿팅(Western blotting)과 같은 면역 블럿팅 상의 흡입점 밀도 증가도 해당 생분자의 "발현"의 범주에 포함된다.
"발현율"이란 전사체(transcript) 또는 단백질의 양이 시간에 지남에 따라 변화하는 정도를 의미한다.
"과잉발현"이란 본 명세서에서 일정 시간 동안 한 표지의 한 세포 혹은 세포 유형 안의 발현율이 다른 세포 또는 세포형에 대하여 높은 경우를 일컫는다.
"축적"이라 함은 정상 평균값보다 시료 속 표지의 양이 증가한 것을 일컫는다. "양이 증가하였다"라고 함은 해당 표지의 양이 정상치 범위의 상위 10%, 5%, 2.5%, 1% 또는 그보다 상위 이내보다 마이크로어레이 분석 기준으로 적어도 1.2배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 많은 것을 일컫는다. qPCR로 측정하였을 때 표지의 "양이 증가하였다"라고 함은 정상치 범위의 상위 10%, 5%, 2.5%, 1% 이내보다 1 사이클(2배), 2 사이클(4배), 3 사이클(8배), 4 사이클(16배), 5 사이클(32배) 이상으로 많은 것을 의미한다.
축적에는 세포 속 표지의 양이 증가(세포 당 기준)한 경우와 해당 표지를 지니고 있는 시료 중에 세포의 수가 늘어난 경우가 모두 포함된다. 따라서 축적은 소변 속 어느 표지의 총량이 방광암이 아닌 상태와 비교하였을 때 증가(단위 부피 당 기준)한 것을 의미할 수도 있다.
축적에는 어느 세포형 내에서 BTM의 발현율이 늘어난 것이 드러날 수도 있고/있거나, 정상적인 발현율로 BTM을 발현하는 세포수가 늘어난 것이 반영될 수도 있다. 게다가 축적에는 세포막의 비정상 상태 또는 세포 사멸과 파괴 때문에 유리된 mRNA가 늘어나는 것이 반영될 수도 있다.
발명의 구현 형태에 대한 기술
본 발명은 방광을 포함하여 종양을 검진하고 평가하는 데에 쓰이는 표지를 제공한다. 방광의 종양에는 수많은 유전자와 단백질이 관련되어 있음이 밝혀졌다. 방광 종양과 정상 요로 상피에서 채취한 비악성 시료를 마이크로어레이 분석한 결과 많은 방광 종양에서 어떠한 유전자의 과잉 발현이 일어나는 특정 양상이나 소변 속 유전자 산물(gene product)의 축적이 방광암과 관련성이 있다는 놀라운 발견을 할 수 있었다. 가장 놀랍게도 방광암 환자의 소변 시료에는 높은 농도로 존재하지만 건강한 사람, 특히 혈뇨를 포함한 비악성 비뇨기 질환을 가진 사람에게서는 낮은 농도로만 존재하는 표지들을 검출할 수 있었다. 표지, 예를 들어 유전자 산물(mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드 따위)과 올리고뉴클레오티드로부터 번역된 단백질과 펩티드를 검출했다는 것은 따라서 종양의 존재, 특히 방광 종양을 가리킨다.
어느 특정 표지 또는 표지 집단의 양은 존재하는 표지량에 대한 소변량의 비에 따라 달라질 수 있다는 것을 잘 이해하는 것이 중요하다. 그 결과, 피검자의 오줌 생성이 줄어드는 상태에 있는 경우(예를 들어 오줌량의 감소), 한 표지의 농도는 늘어날 수 있지만 방광암을 가리키는 것은 아닐 수 있다. 그러므로 일부 실시 태양에서는 표지량을 일정 기간 동안의 오줌 생성량에 따라 보정할 수도 있다. 한편으로 표지량은 소변 시료 속 세포의 총수에 따라 교정될 수도 있고, 다른 실시 태양에서는 소변 속 단백질 총량에 따라 교정될 수도 있다. 반면에 소변 생성이 늘어나면 종양 표지가 희석되어 방광암의 존재가 가려질 수 있다. 이러한 상태는 물 섭취가 늘어난 경우, 염류 섭취가 줄어든 경우, 이뇨제 사용이 늘어난 경우 또는 항이뇨 호르몬의 생성이나 활성을 억제한 경우에 나타날 수 있다.
몇몇 실시 태양에서는 공지기술의 방법을 이용하여 신장 기능을 측정할 수 있다. 여기에는, 예를 들어, 크레아티닌(creatinine)의 청소(clearance) 정도를 측정하는 것이 포함된다. 그러나 신장 기능을 측정하는 데에도 여러 가지 적절한 방법이 있음을 인식할 필요가 있다. 신장 기능이 비정상적인 상태에 있을 때는 적절한 보정을 통하여 표지의 축적 정도의 측정값을 조절할 수 있고 그에 따라 방광암을 더 정확하게 진단할 수 있게 된다.
시료 속 암 표지는 적절한 방법 어느 것을 사용하여서라도 검출할 수 있으며, 여기에는 올리고뉴클레오티드 탐식자, qPCR 또는 암 표지를 항원으로 하는 항체가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
종양으로 의심받는 조직만이 분석할 대상이 아니라는 점도 밝히고자 한다. 표지는 혈청으로 분비될 수도 있고, 세포막에서 떨어져나왔거나 오줌 속으로 쓸려 나간 세포들에 결부된 것일 수도 있다. 따라서 시료에는 모든 인체 시료가 포함되며 혈액, 혈청, 복막 세척액, 뇌 척수액, 대소변 시료가 포함된다.
시료 속에서 한 암 표지를 검출하면 이는 그 피검자 체내에 종양의 존재를 가리킬 수 있다. 그러나 여러 개의 암 표지의 존부와 발현량을 분석함으로써 진단의 감도를 높이는 동시에 거짓 양성 및/또는 거짓 음성 반응 결과가 나오는 빈도를 낮출 수 있다는 점에 주목할 필요가 있다. 따라서 본 발명의 복수 표지를 사용하면 암의 조기 검출과 진단을 향상시킬 수 있다.
일반적인 암 검출 방법
BTM 또는 UBTM군을 이용하여 방광암을 포함하는 암의 검출 방법을 이하 설명하지만, 이들에 한정되지는 않는다.
어느 표지에 대하여 선택적인 핵산 탐식자를 이용한 하이브리드 생성 방법
이 방법은 핵산 탐식자를 지지체에 결합시킨 뒤 실험할 시료에서 얻은 RNA 또는 cDNA와 적절한 조건에서 하이브리드를 형성하는 방법이다(Sambrook, J. E., Fritsch, E.와 Maniatis 공저, "분자 클로닝: 실험서" 3판. 2001년 콜드 스프링 하버 실험실 출판: 콜드 스프링 하버 소재). 이들 방법은 종양 조직 또는 유체 시료에서 유래한 BTM 또는 UBTM에 적절하게 이용할 수 있다. RNA 또는 cDNA 분석 시료는 검출과 정량화를 할 수 있도록 형광 또는 방사성 화합물로 표지하는 것이 전형적이다. 몇몇 경우, 하이브리드를 이룬 DNA는 가지친 형광 물질로 표지되어 신호 세기를 향상시킬 수도 있다 (Nolte, F. S.저, "Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv . Clin . Chem . 33, 201~235(1998)). 하이브리드를 이루지 못한 표지는 형광 검출 또는 젤 이미지의 밀도계측으로 하이브리드 형성을 정량화하기 전에 0.1xSSC, 0.5% SDS와 같은 저염(低鹽) 용액으로 철저하게 씻어서 없앤다. 지지체는 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막과 같이 고형이거나 액체상에 현탁되었을 때 하이브리드를 이루는 미세구(microsphere)나 비드(bead)로 이루어질 수도 있다. 세척과 정제를 위하여 이들 비드는 자성을 띠거나(Haukanes, B-I와 Kvam, C.저, Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60~63(1993)) 유동세포분석을 위하여 형광 표지된 것을 사용할 수 있다(그 보기로는 Spiro, A., Lowe, M.과 Brown, D. 공저, A Bead-based method for multiplexed identification and quantitation of DNA sequences using flow cytometry. Appl . Env . Micro. 66, 4258~4265(2000)).
하이브리드 형성 방법의 한 가지 변형은 형광 비드 지지체와 가지친 DNA 신호 증폭을 결합한 QuantiGene Plex® 검사법(미국 Fremont 소재 Genospectra社)이다. 상보결합 방법의 또 다른 변형은 Quantikine mRNA® 검사법(미국 Minneapolis 소재 R&D systems社). 그 사용 방법은 제조사의 설명서에 기재된 대로이다. 간략하게 이 검사법은 디곡시제닌(digoxigenin)에 접합된(conjugated) 올리고뉴클레오티드 하이브리드 탐식자를 사용한다. 하이브리드 형성은 알칼리성 인산 가수분해효소(alkaline phosphatase)에 결합한 항디곡시제닌 항체로 비색 분석한다.
또 다른 방법들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으므로 여기서 설명하지 않는다.
정량적 PCR(qPCR)
정량적 PCR은 종양, 혈청, 혈장 그리고 소변 시료에 대하여 BTM에 특이적인 프라이머와 탐식자를 사용하여 수행할 수 있다. 통제된 반응 조건에서 중합 효소 연쇄 반응 생성물의 양(Sambrook, J. E., Fritsch, E.와 Maniatis, T. 공저. 분자 클로닝: 실험서, Cold Spring Harbor 출판(2001), 미국 Cold Spring Harbor)은 출발 물질 주형의 양과 상관관계가 있다. PCR 생성물의 정량은 연쇄 반응이 대수 성장기(log phase)에 있을 때 시약의 양이 제한받기 전에 반응을 멈춤으로서 이룰 수 있다. 이 PCR 생성물을 다음에 아가로스나 폴리아크릴아미드 젤 속에서 전기영동하고 브롬화에티듐 또는 그에 견줄만한 DNA 염료로 염색한 다음 밀도 계측법으로 이 염색된 정도를 측정한다. 혹은 대안적으로 PCR의 진행 정도는 실시간으로 생성물의 축적 정도를 측정하는 Applied Biosystem社의 Prism 7000 또는 Roche社 LightCycler와 같은 PCR 장치로 측정할 수 있다. 실시간 PCR은 Sybr Green같은 염료가 합성된 PCR 생성물에 DNA 층간 삽입하면 일어나는 형광을 측정하거나 소광 분자(消光分子 quencher molecule)로부터 정보 제공 분자(reporter molecule)가 끊어지면서 나오는 형광을 측정한다. 정보 제공 분자와 소광 분자는 프라이머 올리고뉴클레오티드로부터 DNA 가닥 연장이 일어나면 그 후에 표적 DNA 분자와 하이브리드를 형성하는 올리고뉴클레오티드 탐식자 분자의 일부가 된다(incorporation). 이 올리고뉴클레오티드 탐식자는 다음 PCR 사이클에서 Taq 중합효소의 작용에 의하여 떼어내어지고 분해되어 소광 분자로부터 정보 제공 분자를 풀어 놓는다.
몇몇 실시 태양에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머와 탐식자 조합에는 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 27이 각각 포함된다. 다른 가능한 조합으로는 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 28을 각각 들 수 있다. 또 다른 실시 태양에서 상응하는 조합으로는 조합 순서대로 각각 SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 29와 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 30과 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 31과 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 32와 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 33과 SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 34와 SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 35와 SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 36과 SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 37과 SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 38을 들 수 있고 또 SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 39를 들 수 있다.
효소결합면역측정법(Enzyme-Linked Immunological Assays, ELISA)
간략하게, 샌드위치 ELISA 분석에서는 BTM 또는 UBTM에 대한 다중클론 혹은 단일클론 항체가 고형의 지지체 혹은 현탁 비드에 결합해 있다(Crowther, J. R. 저 The ELISA guidebook. Humana 출판, 미국 뉴저지 소재(2000); Harlow, E.와 Lane, D. 공저 Using antibodies; a laboratory manual, Cold spring harbor laboratory 출판, 미국 Cold spring harbor 소재(1999)). 해당 분야에서는 다른 방법도 알려져 있으며 이들을 여기서 더 상술할 필요는 없다. 단일 클론 항체는 하이브리도마에서 유래하거나 파지 항체 라이브러리(Hust, M.와 Dubel, S. 공저 Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments, Methods Mol Biol. 295:71~96(2005))에서 선택할 수 있다. 비특이적 결합 자리는 비표적 단백질 제제나 세제로 차단할 수 있다. 포획(capture) 항체는 이제 BTM 혹은 UBTM 항원을 지니는 소변 또는 조직 시료 속에 배양된다. 이 혼합물은 이 항원-항체 착물이 표적 BTM 또는 UBTM을 검출하는 제2 항체와 배양되기 전에 씻게 된다. 제2 항체는 효소 반응이나 정보 제공 물질에 접합한 제 3의 항체 (Crowther, 같은 책)에 의하여 검출되는 형광 분자 또는 다른 정보 제공 분자에 접합되는 것이 전형적이다. 혹은 직접 ELISA에서는 BTM 또는 UBTM을 가지고 있는 시료를 지지체나 비드에 결합시킨 다음 표적 항원을 정보 제공 물질과 접합한 항체로 직접 검출할 수도 있다 (Crowther, 같은 책).
단일클론 항체와 다중클론 항혈청은 이 분야에서 잘 알려져 있고 여기서 더 이상 설명할 필요는 없다.
면역조직화학
종양 표지의 확인과 위치 결정은 방광 종양, 림프절 또는 멀리 떨어진 전이 조직에 대한 항표지 항체를 이용하여 이룰 수 있다. 이러한 방법은 또한 예를 들어 결장직장암, 이자암, 난소암, 흑색종(melanoma), 간암, 식도암, 위암, 자궁내막암과 뇌암에 대하여도 이용할 수 있다.
일반적으로 조직에서 면역조직화학을 이용하면 BTM을 검출할 수 있다(Harlow, E.와 Lane, D. 공저 Using antibodies; a laboratory manual, Cold spring harbor laboratory 출판, 미국 Cold spring harbor 소재(1999)). 간략하게 설명하자면, 파라핀 또는 OCT에 포매(包埋 embedding)한 조직 시료를 4~8 마이크로미터 절편으로 잘라 글래스 슬라이드에 놓고 고정한 다음 투과화(permeabilization)시킨 뒤, BTM에 대한 제1 단일클론항체 또는 다중클론 항체와 함께 배양한다. 제1 항체는 직접 항원 검출을 위하여 검출 분자 또는 정보 제공 물질과 접합(conjugation)되거나 혹은 제1 항체 자체를 정보 제공 물질 또는 검출 분자와 접합한 제2 항체를 통하여 검출할 수도 있다. 정보 제공 분자가 있다면 세척과 활성화시킨 다음, BTM의 존부를 현미경을 통하여 가시화할 수 있다.
이 방법은 다음 경우에도 쓰일 수 있는데, 방광암 환자의 종양 제거 수술 전후에 채취한 혈청 또는 혈장 속 표지군 물질의 면역검출과 다른 암, 비제한적인 예를 들자면 결장직장암, 이자암, 난소암, 흑색종, 간암, 식도정맥암, 위암, 자궁내막암과 뇌암을 포함하는 암의 환자들로부터 표지군 물질의 면역 검출, 그리고 방광암 환자의 대소변으로부터의 표지군 물질의 면역 검출이다.
BTM과 UBTM은 조직 또는 소변 시료로부터 면역 블럿팅 또는 면역침전법(Harlow, E.와 Lane, D. 공저 Using antibodies; a laboratory manual, Cold spring harbor laboratory 출판, 미국 Cold spring harbor 소재(1999))을 비롯한 다른 표준적인 면역검출 방법을 사용하여서도 검출할 수 있다. 면역 블럿팅에서는 조직이나 유체로부터 마련한 단백질 시료에 있는 BTM 또는 UBTM을 변성 조건 또는 비변성 조건의 폴리아크릴아미드 젤 속에서 전기영동하게 된다. 이 단백질들은 그 다음 나일론과 같은 막 지지체로 옮겨진다. BTM 또는 UBTM을 그 다음 면역조직화학법의 방식으로 단일클론 혹은 다중클론 항체와 직간접적으로 반응시킨다. 이 방법의 대안으로서, 어떤 시료 제조 방식에서는 단백질을 사전에 전기영동하지 않고 곧바로 막에 옮길 수도 있다. 신호는 밀도 계측법으로 정량할 수 있다.
면역침전법에서는 BTM 또는 UBTM을 지니는 수용성 시료를 해당 BTM 또는 UBTM에 대한 단일 혹은 다중클론 항체와 함께 배양한다. 이후 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 소재이고 단백질 A 또는 단백질 G가 공유결합된 비활성 비드와 배양시킨다. 이 단백질 A 또는 단백질 G 비드는 비드에 달라붙어 항체-BTM 또는 항체-UBTM 착물을 이루며 고정되는 항체에 특이적으로 상호작용한다. 세척 후 결합한 BTM 또는 UBTM은 면역흡입 또는 ELISA 검사법을 이용하여 검출하고 정량화할 수 있다.
컴퓨터를 이용한 마이크로어레이 또는 qPCR 데이터 분석
1차 데이터를 수집하고 변화 배율을 분석하는 일(fold change analysis)은 방광 종양 유전자 발현 수준을 비종양 조직에서 같은 유전자의 발현 수준과 비교함으로써 이루어진다. 발현이 증가하였다고 결론을 내릴 때의 문턱값을 이하 제공할 것이다(예를 들어, 1.5배 증가, 2배 증가, 또 다른 실시 태양에서는 3배 증가, 4배 증가 또는 5배 증가). 발현량이 증가하였다고 결론을 내릴 때의 문턱값은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 다른 값으로 정할 수 있음을 밝히고자 한다. 종양 유전자 발현을 분석하는 다른 방법에는 발현량의 증가를 나타내는 유전자와 방광 종양 발현 프로필과 대응시켜 종양을 진단하는 방법이 포함된다.
BTM과 UBTM을 사용하여 TCC 요법의 진행을 감시하는 방법
이행세포암종(transitional cell carcinoma, TCC)의 조기 검출과 빠른 진단 외에도, 조직, 혈청 또는 소변에서 검출된 BTM과 UBTM 표지는 치료법에 대한 환자의 반응을 살피는 데에도 쓰일 수 있다. 이러한 적용예에서는 소변 및/또는 혈청 시료를 전신, 방광내 또는 혈관내에서 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법을 시작하고나서 간격을 두고 채취한다. 표지 축적이 줄어들면 이는 종양 크기가 줄어든 것을 가리킬 수 있어 효과적인 치료를 가리킬 수 있다. 이 감소율은 각 환자 또는 치료법에 있어서 최적 치료 투여량을 예측하는 데에 쓰일 수 있다.
평가할 표지는 알려진 사람 유전자들에서 선택한다. 이 평가할 유전자는 도 3과 도 4에 나타내었다. 도 3과 도 4에 포함된 내용은 유전자의 명칭, HUGO 식별 기호, MWG 올리고 번호, NCBI mRNA 참조 서열 번호와 단백질 참조 번호이다. 전장(全長) 길이 서열은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez에서 찾을 수 있다.
방광암의 검진과 평가에 유용하다고 확인된 표지는 도 2와 본 출원에 첨부한 서열 목록에 나타내었다.
본 발명의 측면들
따라서 본 발명의 일측면에서는 UBTM군 표지들의 소변 속 축적을 검출하는 것을 포함하는 방광암 검출 방법을 포함한다.
다른 측면에서는 이 UBTM군 표지는 실질적으로 혈액과 결부되어 있지 않다.
또 다른 측면에서 UBTM은 도 3 또는 도 4에 나타낸 군에서 선택한다.
또한 본 발명의 일측면에서는 검출 단계는 BTM 또는 UBTM의 mRNA 축적을 검출함으로써 이루어진다.
몇몇 측면에서 검출 단계는 마이크로어레이를 이용하여 이루어진다.
다른 측면들에서, 검출 단계는 정량적 중합효소 연쇄반응 또는 하이브리드 형성을 이용하여 이루어진다.
또 다른 측면에서는 이 검출 단계가 UBTM 단백질의 축적을 검출함으로써 이루어진다.
한편 본 발명의 일측면에서는 검출 단계가 UBTM 펩티드의 축적을 검출함으로써 이루어진다.
몇몇 측면에서는 검출 단계가 단일 혹은 다중클론 UBTM 항체를 이용하여 이루어진다.
또 다른 측면에서는 상기 시료에서 둘 혹은 그 이상의 수의 UBTM군 표지의 축적을 검출하는 것을 포함한다.
추가적으로 본 발명의 다른 측면에서는 TOP2A, MDK 또는 BIRC5를 검출하는 것과 연관된다.
또 다른 측면에서는 TOP2A-HOXA13, TOP2A-IGBP5와 TOP2A-SEMA3F로 이루어진 군에서 하나 이상의 표지쌍을 검출하는 것과 관련된다.
본 발명의 또 한 측면인 방광암의 검출 방법은 방광암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서 도 14a 또는 14b의 BTM군 표지들 중 둘 또는 그 이상의 수의 조합이 축적되는 것을 검출하는 것을 포함한다.
이들 측면 중 몇몇은 상기 생물학적 시료를 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 대소변, 뇌 척수액과 복막 세척액으로 이루어지는 군에서 선택한다.
본 발명의 그 밖의 측면은 BTM 또는 UBTM에 특이적인 항체와 그들의 다중 클론 혹은 단일 클론 항체로서의 제조 방법을 포함한다.
이들 측면 중 일부에서는 도 3 또는 4에 나타낸 군에서 선택되는 BTM 혹은 UBTM에 대한 단일 클론 항체를 사용할 수 있다.
이들 측면 중 나머지에서는 또 다른 BTM 또는 UBTM에 대한 새로운 항체를 더 포함하는 방법을 사용하게 된다.
본 발명의 또 다른 측면은 BTM 검출용 장치를 포함하는데, 이 장치에는 BTM 또는 UBTM 포획 시약들의 조합을 갖는 기질(substrate)이 포함되며, 상기 조합은 도 14a 또는 14b로부터 선택된다. 상기 장치에는 상기 기질과 결합된 감지기가 포함되는데, 이 감지기는 상기 포획 시약과 결합된 BTM 또는 UBTM의 조합을 검출할 수 있다.
이러한 측면들 중 일부는 올리고뉴클레오티드를 포획 시약으로 포함한다.
또 다른 측면에서는 포획 시약이 항체를 포함한다.
몇몇 측면에서는 BTM 또는 UBTM은 도 3 또는 4에 특정한 군으로부터 선택된다.
본 발명은 암을 검출하는 키트도 포함하고 있는데, 이 키트는 기질, 이 기질위에 포획 시약으로서 적어도 둘 이상의 BTM 또는 UBTM을 포함하는 조합과 사용 설명서를 포함하여 이루어지며, 상기 조합은 도 14a 또는 14b에서 선택된다.
이 키트 중 몇몇에는 BTM 또는 UBTM에 특이적인 올리고뉴클레오티드 또는 BTM 특이적 항체로 된 포획 시약이 갖추어져 있다. 일부 키트에서는 BTM 또는 UBTM을 도 3 또는 4에 나타낸 군으로부터 선택할 수 있다.
몇몇 키트에서는 IGFBP5, MGP, SEMA3F와 HOXA13으로 이루어지는 군에서 표지가 선택된다.
본 발명의 추가적인 측면은 방광암의 존부를 검출하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 소변시료에서 BIRC2, CDC2, HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NOV, NRP1, SEMA3F, SPAG5, TOP2A로 이뤄지는 표지군에서 선택되는 하나 이상의 표지의 존재를 결정하는 것을 포함하며, 그 표지는 혈액 속에서 실질적으로 존재하지 않는다.
본 발명의 다른 측면으로서, 비악성 방광 질환으로부터 악성 방광 질환을 가려내는 방법이 포함되는데, 이 방법은 상기 환자의 소변에서 HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NRP1, SEMA3F, SMC4L1, TOP2A와 UBE2C로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표지의 축적 여부를 결정하고, 상기 시료에서 상기 표지의 비율을 결정하는 것으로 이루어지는데, 이 비율은 방광암의 존부에 관련된다.
이들 측면 중 일부는 소변 속에서 적어도 하나 이상의 2차 BTM의 축적을 측정하는 것을 포함한다.
이 실시 태양 중 일부는 첫 번째 표지를 TOP2A로, 두 번째 표지는 HOXA13, IGFBP5, SEMA3F로 이루어지는 군에서 선택하게 된다.
또 다른 측면에서 본 발명은 얕은 방광암, 1기 침습성 방광암 또는 2~3기 침습성 방광암을 가리키는 인디케이터로써 축적 비율의 상관 관계를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에서는 방광암 치료법의 효능을 결정하는 방법이 포함되는데, 이 방법은 먼저 환자의 시료에서 측정되는 도 3 또는 4에서 선택되는 하나 이상의 표지의 존부와 그 환자가 치료를 일정 기간 받고 난 뒤 측정되는 도 3 또는 4에서 선택되는 하나 이상의 표지의 존부를 비교하는 것을 포함한다.
이하 기술하는 바와 같이 암 검출은 하나 혹은 그 이상의 종양 표지의 발현을 측정함으로써 이룰 수 있다. 예상 밖으로 복수의 BTM 또는 UBTM의 발현 증가와 방광암의 진단과는 연관 관계가 지극히 높다는 것이 발견되었다. 가장 유의미하지 않은 연관 관계는 p 값이 약 0.018로 검출되었다. 연관 관계 중 많은 수는 p 값이 10-10보다 작은 수준에서 유의하였다. 그토록 높은 유의성이라면 하나 보다 많은 수의 BTM 또는 UBTM의 발현 증가를 검출하지 않아도 될 것이다. 그러나 본 발명에서 여분의 BTM을 사용하면 방광암 검출의 신뢰도를 더욱 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 제공하는 방법들은 높은 감도를 가지는 분석 방법도 포함한다. qPCR은 극히 민감하며, 시료 속에서 카피 수가 매우 낮은 유전자 산물(예를 들어 1~100)을 검출하는 데 쓰일 수 있다. 그러한 감도라면 방광암에 연관된 사건들을 아주 일찍 검출할 수 있게 된다.
실험 방법
종양 수집
방광 종양 시료와 비악성 요로상피 시료는 일본 쿄토대학 병원과 일본의 다른 협력 병원에서 절제한 외과 표본(surgical specimen)들로부터 수집하였다.
소변 채취
비악성 대조군과 방광암 환자의 소변 시료는 일본의 쿄토대학 병원에서 얻었다(도 1). 건강한 대조군 시료는 백인종과 일본인 자원자로부터 얻었다.
RNA 추출
종양 조직은 트리리에이전트(TriReagent)의 물의 3:1 혼합액 속에서 균질화한 다음 클로로포름으로 추출하였다. 총 RNA는 수성층으로부터 카이아젠(Qiagen)社의 RNeasy™ 방법을 이용하여 정제하였다. RNA는 또한 16 개의 암세포주로부터 추출되어서 참조 RNA 역할을 하였다.
RNA는 소변 시료를 같은 부피의 용해(lysis) 완충액(5.64 M 구아니딘-HCl, 0.5% 사르코실(sarkosyl), 50 mM 아세트산나트륨(pH 6.5)과 1 mM 베타-메르캅토에탄올, pH 8의 1.5 M 헤페스(Hepes)로 pH를 7.0으로 조절)과 섞어서 소변에서 추출하였다. 총 RNA는 이어서 트리졸(Trizol)과 RNeasy™ 방법을 이용하여 추출하였다. 이렇게 마련한 RNA는 cDNA 합성에 앞서서 카이아젠社 QIAquick™ PCR 정제 키트로 정제하였다.
RNA는 3.6% 덱스트란 속에서 침강시켜 온혈액(whole blood)으로부터 농축한 세포에 대하여 트리졸/RNeasy 추출법을 수행하여 건강한 세 명의 자원자의 혈액으로부터 추출하였다.
마이크로어레이 슬라이드의 준비
에폭시 수지로 피복된 유리 슬라이드(MWG 바이오테크社)에 약 30,000개의 50머(mer) 올리고뉴클레오티드(MWG 바이오테크社)를 진머신(Gene Machines)社 마이크로어레이 제조 로봇(microarraying robot)을 이용하여 제조사의 사용 설명서대로 인쇄하였다.
RNA 표지화와 하이브리드 생성
5 마이크로그램 총 RNA로부터 cDNA를 전사하였는데, Superscript II™ 역전사 효소(인비트로젠 Invitrogen社)를 이용하여 5-( 3-아미노알릴)-2’-디옥시유리딘-5’-삼인산 (5-(3-aminoallyl)-2' deoxyuridine-5'-triphosphate)을 포함하는 조건하에서 반응시켰다. 반응 생성물을 마이크로콘(Microcon) 컬럼을 거쳐 탈이온화한 다음 탄산수소 완충액 속에서 1시간 동안 실온에서 사이3(Cy3) 또는 사이5(Cy5)와 함께 배양시켰다. 일체화되지 않은 염료는 카이아젠社 Qiaquick 컬럼을 이용하여 제거하였고 시료는 스피드백(SpeedVac) 장치를 이용하여 15 마이크로리터로 농축하였다. Cy3과 Cy5로 표지된 cDNA는 암비온(Ambion)社 ULTRAhyb™ 완충액과 섞은 다음 2분 동안 섭씨 100도에서 변성시킨 뒤 섭씨 42도에서 16시간 동안 마이크로어레이 슬라이드와 하이브리드 생성 체임버 속에서 하이브리드 생성시켰다. 이 슬라이드를 세척한 다음 전력값이 다른 두 개의 조건에서 액손(Axon)社 4000A™ 스캐너로 두 번 스캔하였다.
암표지 유전자의 마이크로어레이 분석
53개의 방광암 조직과 20개의 비악성(“정상”) 방광 조직 시료에서 얻은 RNA를 Cy5로 표지한 다음 Cy3으로 표지한 참조(reference) RNA와 2중 또는 3중으로 하이브리드생성시켰다. 정규화 처리(normalization)한 다음에 29,718개 유전자 각각의 발현량 변화를 변화 배율(fold change)과 통계적 확률로 추정하였다.
정규화 처리 절차
진픽스(Genepix™) 소프트웨어로 검출한 형광 세기의 중앙값(median)을 국소적 배경(local background) 형광 세기를 빼 줌으로써 보정하였다. 배경 형광을 보정한 화소점(spot) 중 그 세기가 0보다 적은 것들은 제외하였다. 정규화 처리를 용이하게 하기 위하여 세기 비율과 총 화소점 세기는 로그 변환(log-transform)하였다. 록핏(LOCFIT™) 패키지에 마련된 국소 회귀(local regression) 기능을 이용하여 염료와 공간적 바이어스에 대하여 세기 비율의 로그값을 보정하였다. 국소 회귀의 잔차(殘差 residual)는 변화 배율의 로그값의 보정치를 제공하였다. 데이터 질 관리를 위하여 정규화된 마이크로어레이 각각의 비율을 화소점 세기와 국소화(localization)에 대하여 그래프로 그렸다. 이 그래프를 가지고 그 후 남아 있는 인위적 오차(artifact)의 여부를 육안으로 검사하였다. 추가적으로 아노바(ANOVA) 모델을 적용하여 핀 끝(pin-tip) 바이어스에 대하여 진단하였다. 정규화 처리의 모든 결과와 파라미터는 통계학적 분석을 위하여 포스트그레스(postgres) 데이터베이스에 입력하였다.
통계 분석
어레이별로 측정된 변화 배율의 비교를 더 잘할 수 있도록 log2(비율)은 어레이마다 총 표준편차를 가지게끔 크기를 조절하였다. 이러한 표준화는 평균 조직내 클래스 가변성(within-tissue class variability)을 줄여 주었다. log2(비율)은 각 올리고뉴클레오티드에 대하여 중앙값이 0이 되도록 바꾸어 주어 결과를 육안으로 일람하기 쉽게 하였다. 변화 배율에 바탕한 순위 검정(rank test)을 이용하여 잡음 둔감성(noise robustness)을 향상시켰다. 이 검정은 두 단계로 이루어진다. (i) 어레이 내 변화 배율 순위(Rfc)의 계산 (ii) 종양 조직 Rfc 중앙값에서 정상 조직의 Rfc 중앙값을 차감. 배율 순위 중앙값의 차이로 변화 배율 순위의 점수를 정의한다. 세 가지 통계 검정을 또한 표준화 데이터에 덧붙여 수행하였다. (1) 표본 스튜던트 t-검정(Two sample student's t-test) 2회 (2) 윌콕슨(Wilcoxon) 검정 (3) 마이크로어레이 통계 분석(SAM). 통계 조사로 결정된 상향조절 유전자들 중 가장 유의한 것 300개(변화 배율 순위, t-검정, 윌콕슨 검정, SAM)에 대하여 각 조사 방법마다 순위 점수를 매겼다. 어느 유전자가 한 목록에 나타나지만 다른 목록 중 하나 이상에 나타나지 않는다면, 그 점수에 가중치 500을 더했다. 모든 순위 점수는 하나의 총합 순위 점수로 더하였다.
표지 조합의 통계 분석
둘 또는 세 표지의 조합을 통하여 종양과 비악성 시료를 구별하는 방법에 대하여 평가하기 위하여 종양 시료와 비악성 시료의 qPCR 데이터를 다음과 같이 분석하였다. 비악성 시료와 종양 시료의 평균과 표준 편차를 이용하여 정규 분포를 작성하였다. 종양 발현 데이터에서 취한 값이 비악성 분포에서 정한 일정한 문턱값(예를 들어 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99%)을 초과할 확률을 결정하였다(즉, 감도). 표지 조합에 대해서는 적어도 하나의 표지가 그러한 문턱값을 초과할 확률을 계산하였다.
소변 시료와 종양 시료의 표지 조합을 분석하는 것의 유용성을 예시하기 위하여, 도 1의 제2계열에 나타낸 이행세포암종(TCC) 환자외 비악성 대조군의 소변 시료에서 얻은 qPCR 데이터에 대해서도 정규 분포 분석을 수행하였다. 이행세포암종 환자의 qPCR 데이터에서 취한 값이 비악성 시료 분포의 특정 문턱값(예를 들어 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99%)을 초과할 확률을 계산하였다.
소변 속 방광암 표지의 검출 방법
여러 실시 태양에서 소변 시료에 대하여 BTM 분석을 바람직스럽게 이룰 수 있다. 일반적으로 이들 유체에 대하여 올리고뉴클레오티드, 단백질과 펩티드 분석을 하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예시를 위하여, 하지만 어느 BTM의 소변 내 농도를 샌드위치형 효소면역분석법(ELISA)으로 정량화할 수도 있음을 밝힌다. 혈장이나 혈청 분석을 위해서는 적절히 희석하였거나 연속 희석(serial dilution)한 표준 BTM 5 마이크로리터와 과산화효소-접합 항사람 BTM 항체 75 마이크로리터를 마이크로타이터(microtiter) 접시의 웰에 가하면 된다. 섭씨 30도에서 30분간 배양한 다음 이 웰을 0.05% 트윈 20(Tween 20)이 있는 인산염 완충액(PBS)으로 씻어주어 결합하지 않은 항체를 제거한다. 그 후 BTM과 항BTM 항체의 결합 착물을 과산화수소를 함유한 오르토페닐렌디아민(o-phenylenediamine)과 섭씨 30도에서 15분간 배양한다. 1 M 황산을 가하여 반응을 중지시키고 492 nm에서 마이크로타이터 접시 리더(plate reader)로 흡광도를 측정한다. 항BTM 항체는 단일 클론 항체이거나 다중 클론 항혈청일 수 있음을 밝혀둔다.
수많은 단백질이 (1) 세포로부터 분비되거나 (2) 세포막에서 잘려 나오거나 (3) 세포 사멸시 세포에서 소멸되거나 (4) 박리된(sloughed) 세포 속에 갇히기 때문에 BTM을 소변 속에서 검출할 수 있다는 점을 알리고자 한다. 이에 덧붙여서 방광암은 시료 내 BTM 발현이나 시료 내 BTM 축적을 측정함으로써 진단할 수도 있다. 이러한 진단 방법에 관한 공지기술에는 세포검사법(cytoscopy), 세포학적 방법과 이들 방법을 적용하여 추출한 세포의 분석 등을 들 수 있다. 이러한 방법들은 종양 세포의 존재를 소변 혹은 요로상피의 브러시(brush) 시료 속에서 혹은 다른 경우에는 방광 벽(bladder wall)의 생검(biopsy) 시료에서 확인하는 것에 의존한다. 이러한 방법들은 몇 종류의 오차를 피할 수 없는데, 이러한 오차에는 표본 수집(sampling) 오차, 관측자마다 세포 확인에서 나타나는 오차 등이 있다.
실시간 정량적 PCR
실시간 혹은 정량적 PCR(qPCR)은 PCR 주형 카피 수를 절대적으로 혹은 상재적으로 정량하는데 쓰인다. Taqman™ 탐식자와 프라이머 조합은 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)社의 프라이머 익스프레스V 2.0 (Primer Express V 2.0™)을 이용하여 설계하였다. 가능한 경우에는 모든 잠재적인 잘라잇기(splicing) 변이체를 생성되는 앰플리콘(amplicon)에 포함시켰는데, 앰플리콘 선호도는 MWG 바이오테크社 유래의 마이크로어레이 올리고뉴클레오티드가 포괄하는 영역에 높게 두었다. 프라이머와 탐식자 서열은 도 2에 나타내었다. 혹은 표적 유전자가 원하는 앰플리콘을 포괄하는 어플라이드 바이오시스템사의 Assay -on-Demand™ 발현 분석 장치에 수록되어 있는 경우는 그를 이용하였다. 본 발명자가 적절히 변형한 분석 방법에 의하면 SYBR 그린(green) 표지 방법과 참조 RNA로부터 제조한 cDNA를 이용하여 프라이머 농도를 적정할 수 있다. 증폭 반응은 ABI Prism™ 7000 서열 검출 시스템을 이용하여 표준 사이클링 조건하에서 수행하였다. 해리 곡선에서 단일한 증폭 생성물만 보일 경우, 표준 곡선을 625배의 농도 영역에서 작성하였는데, 최적 프라이머 농도와 최종 농도 250 nM에서 5’FAM-3’TAMRA 인산화물 Taqman™ 탐식자(Proligo 社)를 이용하였다. 회귀 계수 0.98이상의 표준 곡선이 나오는 분석 방법을 추후에도 계속 이용하였다.
96웰 접시 두 개를 이용하여 분석을 수행할 수 있는데, 각 RNA 시료는 하나의 cDNA로 나타내었다. 각 접시는 참조 cDNA 표준 곡선을 625배 농도 영역에서 이중 실험값으로 가지고 있었다. 분석은 △CT(표적 유전자 CT-평균 참조 cDNA CT)를 계산하는 것으로 이루어졌다. △CT는 log2변화배율의 마이너스값에 직접 비례한다. 평균 비악성 log2변화배율에 대한 log2변화배율을 그 다음 계산하였다(log2 변화배율-평균 정상 log2변화배율). 변화 배율은 빈도 클래스(frequency class)들로 묶을 수 있고 그래프나 나무상자-수염 그림(box and whisker plot)으로 나타낼 수 있다.
방광 악성 종양에 대한 혈청과 소변 표지의 선택
잠정적인 혈청 표지는 마이크로어레이 데이터로부터 다음 기준에 따라 선택할 수 있다. (i) 암호화되는 단백질이 세포에서 분비되거나 세포막으로부터 떨어져 나올 가능성. 분비될 가능성은 TargetP™ 분석에 기초하였다(Emanuelsson 외, J. Mol . Biol ., 300, 1005~1006(2000)). (ii) 이러한 가능성의 총합 순위 점수. 그러나 종양 시료의 과잉 발현 정도의 차이는 종양 자체의 이질성 말고도 종양 시료가 “정상” 조직으로 오염된 정도도 나타내는데, 이러한 오염시키는 조직에는 평활근, 연결 조직, 점막밑(submucosal) 조직(미국 특허 제 6,335,170호), 간질 세포(stromal cell)와 비악성 상피가 포함된다. 많은 경우, “정상적인” 오염 정도는 5에서 70%였는데 그 중앙값은 약 25%였다.
따라서 본 발명자들은 소변 시료 속 BTM을 분석하면서 이러한 “거짓 양성” 응답을 줄일 수 있었는데, 소변은 정상 방광 세포로 심하게 오염되어 있지는 않다. 게다가 qPCR 분석 방법을 이용함으로써 본 발명자들은 공지 기술의 마이크로어레이 방법에 견주었을 때 더 정확하게 소변 시료 속 mRNA의 양을 측정할 수 있었다. 그러므로 본 발명자들은 다른 방광 세포 유형에서 오는 주된 오염을 피할 수 있었고 나아가 임상 시료의 마이크로어레이 분석 기술에서 보이는 보다 어려운 문제 중 하나를 피해갈 수 있었다.
소변 표지의 축적을 측정하고, 종양 내 발현율에 의존하지 않음으로써 본 발명자들은 예상 밖에도 방광암의 검출과 병기(stage) 혹은 그 유형을 결정하는데 유용한 BTM 여러 개를 발견하였다. 게다가 방광암의 가능성에 대하여 환자들이 의사를 찾게끔 하는 초기 증상이 소변 속 혈액의 존재이기 때문에, 본 발명자들이 BTM이 혈액 내에서 고도로 발현되지 않는다는 점을 밝힌 것은 진단에 있어서 값어치가 매우 크다. 이들 표지에는 IGFBP5, MGP, SEMA3F와 HOXA13이 포함된다. (도 9 참조)
축적을 측정하는 것은 “과잉 발현”을 정의하는 것보다 유리하다. 앞서 밝혔듯이 축적이 증가했다면 이는 분자생물학적 의미에서 진정한 과잉발현 또는 발현 속도의 증가를 반영한다. (즉 단위 시간 당 세포 당 이핵(異核 heteronuclear) RNA(hnRNA) 분자, mRNA 분자 또는 단백질 수의 증가) 그러나 축적은 또한 발현 속도가 증가하지 않은 경우에 있어서도 특정 용량, 예를 들어 소변에 있어서 표지량의 증가를 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 비록 종양 세포가 어느 표지를 정상적인 양으로 생산한다고 하여도, 시료 속에 그러한 세포 수가 늘어나면 이는 암의 존재를 가리킨다. 또한 축적은 시료 내 유리된 RNA나 수용성 RNA의 존재를 반영할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 표지를 생산한 종양 세포는 사멸해서 그 세포 내용물이 주변 조직에 유출될 수 있다. 이 세포 내용물이 소변에 포함되게 되면 유리 표지 RNA는 소변에서 검출될 것이다. 이러한 현상은 얕은 방광암을 진단할 때 특히 유용한데, 얕은 방광암은 선택성과 특이성 있게 검진하기가 어려웠다. 소변 속 표지의 축적은 얕은 방광암의 초기 신호 중 하나일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법과 장치를 이용하면 초기의 방광암을 검출하는 것이 가능하다.
본 발명자들은 아울러 축적을 측정할 때 시료 부피의 변화에 대하여 보정할 때 주의하여야 한다는 점을 밝혀둔다. 예를 들어 소변 속에서 단위 부피당 표지의 양은 피검 대상자의 신장 기능에 좌우될 수 있다. 따라서 소변량이 줄어드는 상태에 있을 때는 소변 속 세포(종양 세포 포함) 수가 농축될 수 있고 그에 따라 인위적으로 축적량(단위 부피 당)이 크게 나타날 수 있다. 그러한 인위적 오차들은 소변 생성량(예를 들어 단위 시간 당 오줌 생성량)과 요 청소율(urinary clearance, 예를 들어 크레아티닌이나 BUN의 측정)을 별도로 측정하면 줄일 수 있다. 역으로 이뇨와 같이 소변 배출이 늘어난 상황에서는 표지를 가지고 있는 세포 수가 희석되어 인위적으로 낮은 축적치를 얻게 된다. 그러나 시료 내 표지량이나 표지 축적의 참값과 무관한 표지 축적의 변화를 가져 올 수 있는 이뇨제의 사용, 물 섭취량과 다른 요인들은 조절이 가능하다. 이러한 상황에서는 오줌 생성 속도에 대하여 표지량을 보정해 주어야 한다.
따라서 소변 속 BTM의 양을 측정함으로써 공지기술과 비교하였을 때 본 발명자들은 거짓 양성 응답 빈도를 줄일 수 있었고, 이는 본 발명의 방법이 공지기술보다 우월함을 가리킨다.
소변 표지는 앞서 밝힌대로 마이크로어레이 데이터로부터 선택하였으나, 다만 분비 또는 세포막에서 절단 여부에 관한 기준은 적용하지 않았다. 따라서 세포내 표지와 세포막 결합 표지 중 유용한 혈청 표지로 예측되지 않았던 것들도 소변 표지로 포함된다.
본 발명은 암 표지, 특히 방광암 표지를 바탕으로 한 개량된 검출 방법, 검출용 조성물, 검진 키트와 장치를 제공하며 암의 조기 검출과 진단을 돕는다.
본 발명의 도면의 내용은 다음과 같다.
도 1은 qPCR 분석에 사용된 시료의 수와 채취원을 기술하는 표이다.
도 2는 본 발명의 방광암 qPCR 분석을 위한 표지와 표지의 올리고뉴클레오티드 탐식자(probe)를 나타낸 표이다.
도 3은 침습성 방광암 시료에 마이크로어레이법을 사용하여 확인한 BTM(bladder tumor marker, 방광 종양 표지)을 나타낸 표이다.
도 4는 얕은 방광암 시료에 마이크로어레이법을 사용하여 확인한 BTM을 나타낸 표이다.
도 5는 특정한 BTM에 대해서 qPCR 분석을 수행한 결과를 나타낸 표이다.
도 6a~6af는 침습성과 얕은 방광암에 대한 다양한 종양 표지를 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 데이터로서 상대적 빈도 대 log2(변화배율) 값을 나타낸 히스토그램이다. 도 6a: SPAG5 침습성, 도 6b: SPAG5 얕음(superficial), 도 6c: TOP2a 침습성, 도 6d: TOP2a 얕음, 도 6e: CDC2 침습성, 도 6f: CDC2 얕음, 도 6g: ENG 침습성, 도 6h: ENG 얕음, 도 6i: IGFBP5 얕음, 도 6j: NOV 얕음, 도 6k: NRP1 침습성, 도 6l: NRP1 얕음, 도 6m: SEMA3F 얕음, 도 6n: EGFL6 침습성, 도 6o: EGFL6 얕음, 도 6p: MGP 침습성, 도 6q: SEM2 침습성, 도 6r: SEM2 얕음, 도 6s: CHGA 침습성, 도 6t: CHGA 얕음, 도 6u: BIRC5 침습성, 도 6v: BIRC5 얕음, 도 6w: UBE2C 침습성, 도 6x: UBE2C 얕음, 도 6y: HoxA13 침습성, 도 6z HoxA13 얕음, 도 6aa: MDK 침습성, 도 6ab: MDK 얕음, 도 6ac: Thy1 침습성; 도 6ad: Thy1 얕음, 도 6ae: SMC4L1 침습성, 도 6af: SMC4L1 얕음.
도 7은 소변 시료에서 몇몇 BTM을 대상으로 한 qPCR 분석 결과를 나타내는 표이다.
도 8은 환자와 건강한 대조군 피검자의 오줌에서 방광암 표지의 상대적인 축적 정도를 나타낸 나무 상자-수염 그림(box and whisker plot)이다. 데이터는 각각의 12 개 BTM에 대하여 쌍으로 나타내었다. 각 쌍에서 위에 있는 나무 상자가 건강한 대조군의 소변 시료이고 아래쪽 상자가 방광암 환자의 시료이다. 이 상자들은 제1사분위(25th percentile), 2사분위(50th percentile), 3사분위(75th percentile)를 나타낸다. 모든 데이터는 건강한 대조군의 중앙값(median)에 대한 log2(변화배율) 값을 나타낸다. 점들은 특이값(outlier)를나타낸다.
도 9는 방광암 조직에서 얻은 RNA와 대비한, 온 혈액(whole blood)에서 추출한 총 RNA의 qPCR 결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 방광암 환자의 오줌에서 일어나는 표지 전사체(transcript)의 과잉 축적의 중앙값을 나타낸다. 환자와 건강한 대조군, 환자와 비악성 대조군 사이의 log2편차 값을 각각 나타내었다.
도 11은 건강한 대조군과 비악성 대조군과 대비한, 암 환자 소변 속의 표지 전사체의 과잉 대표 현상을 보여주는 나무 상자-수염 그림이다. 상자들은 제1사분위, 2사분위와 3사분위를 나타낸다. 모든 데이터는 건강한 대조군의 중앙값에 대하여 상대적으로 표시하였다. 점으로 채워진 상자는 건강한 피검자의 시료를, 진한 색으로 칠해진 상자는 비악성 비뇨기 질환 시료를, 해시(hash)선으로 채워진 상자는 방광암 시료를 표시한다. a. HOXA13, b. IGFBP5, c. MDK d. MGP, e. NRP1, f. SEMA3F, g. SMC4L1, h. TOP2A, i. UBE2C. 점들은 특이값을 나타낸다.
도 12a와 12b는 각각 침습성과 얕은 방광암에 대하여, 정상 발현의 중앙값 상위 5% 이내로 고도 발현된 표지의 수를 나타내는 히스토그램이다. 각 종양 시료에 대하여 표지 12개에 대한 qPCR 데이터를 보여주고 있다.
도 13a~13b는 종양 조직과 비악성 조직을 정확하게 구별하는 능력에 대하여 여러 개의 표지의 사용이 미치는 효과를 나타내는 표이다. 이 표는 qPCR에서 유도한 정규 분포로부터 작성하였다. 도 13a는 여러 개의 표지의 사용이 95% 특이성 수준에서 침습성 방광암 조직과 비악성 조직을 구별하는 능력에 미치는 효과를 보여주고, 도 13b는 같은 수준에서 얕은 방광암 조직과 비악성 조직을 구별하는 능력에 미치는 효과를 나타낸다.
도 14a와 14b는 95% 특이성 수준에서 침습성 이행세포암종(transitional cell carcinoma, TCC)에 대하여 조합 표지가 가지는 감도를 나타낸 표인데, qPCR 데이터의 정규 분포로부터 계산하였다. 도 14a: 침습성 전이성 세포 암종(TCC), 도 14b: 얕은 TCC.
도 15는 여러 개의 표지의 사용이 방광암(TCC)의 소변 시료와 비악성 비뇨기 질환의 소변 시료를 구별하는 능력에 미치는 영향을 나타낸 표이다. 이 표는 소변의 qPCR 분석한 데이터를 정규 분포로 구성한 것으로부터 작성하였다.
도 16은 95% 특이성 수준에서 TCC에 대한, 소변 속 표지를 조합하여 사용한 경우의 감도를 나타낸 표인데, 소변 qPCR 데이터의 정규 분포로부터 계산하였다.
도 17은 침습성과 얕은 방광암 환자 모두의 소변에서 추출한 RNA에서 BTM의 비율을 보여주는 나무상자-수염 그림이다. 이 상자는 제1사분위, 2사분위, 3사분위를 나타낸다. 회색 칠한 상자는 얕은 방광암 환자의 시료를, 해칭선으로 나타낸 상자는 침습성 방광암 환자의 시료를 표시한다. a. TOP2A/HOXA13 조합, b. TOP2A/IGFBP5 조합, c. TOP2A/SEMA3F 조합. 점들은 특이값을 나타낸다.
도 18은 다른 병기에 있는 방광암 환자의 소변에서 BTM 비율을 보여주는 나무 상자-수염 그림이다. 이 상자는 제1사분위, 2사분위, 3사분위를 나타낸다. 점으로 채운 상자는 얕은 방광암 환자의 시료를, 회색 칠한 상자는 침습성 방광암 제1기 환자의 시료를, 해칭선으로 나타낸 상자는 침습성 방광암 제2기와 3기 환자의 시료를 표시한다. a. TOP2A/HOXA13 조합, b. TOP2A/IGFBP5 조합, c. TOP2A/SEMA3F 조합. 점들은 특이값을 나타낸다.
도 19는 침습성과 얕은 방광 종양 모두에서 추출한 RNA에서 BTM의 비율을 보여주는 나무상자-수염 그림이다. 이 상자는 제1사분위, 2사분위, 3사분위를 나타낸다. 회색 칠한 상자는 얕은 방광 종양 시료를, 해칭선으로 나타낸 상자는 침습성 방광 종양 시료를 표시한다. a. TOP2A/HOXA13 조합, b. TOP2A/IGFBP5 조합, c. TOP2A/SEMA3F 조합. 점들은 특이값을 나타낸다.
도 20은 하나의 표지를 사용한 조합을 방광암 검출에 적용한 나무 상자-수염 그림이다. 이 그림은 건강한 피검자와 비악성 환자 대조군과 비교하여 방광암 환자의 소변에서 4개로 이루어지는 표지군이 과잉 대표되는 것을 보여준다. 이 상자는 제1사분위, 2사분위, 3사분위를 나타낸다. 모든 데이터는 건강한 대조군 중앙값에 상대적으로 나타내었다. 회색 칠한 상자는 비악성 비뇨기 질환 환자의 시료를, 해칭선으로 나타낸 상자는 방광암 환자의 시료를 표시한다. a. HOXA13, b. MGP, c. SEMA3F, d. TOP2A. 점들은 특이값을 나타낸다.
도 21은 방광암의 조직학적 유형을 결정하기 위한 조합 표지를 나타내는 나무 상자-수염 그림이다. 이 그림은 침습성과 얕은 방광암 환자 모두의 소변에서 추출한 RNA에서 BTM의 비율을 보여준다. 이 상자는 제1사분위, 2사분위, 3사분위를 나타낸다. 회색 칠한 상자는 얕은 방광암 환자의 시료를, 해칭선으로 나타낸 상자는 침습성 방광암 환자의 시료를 표시한다. a. TOP2A/SEMA3F 조합, b. TOP2A/HOXA13 조합. 점들은 특이값을 나타낸다.
본 명세서에서 기술하는 실시예는 발명의 실시 태양을 도시하기 위한 용도일 뿐 발명의 범위를 제한하기 위함이 아니다. 다른 실시 태양, 방법과 분석 유형도 분자 진단술에 관하여 보통의 지식이 있는 사람의 능력 안에 포함되며 여기서 상세히 설명할 필요는 없다. 공지 기술 내의 다른 실시 태양 중 본 명세서에 의하여 시사된 것은 본 발명의 일부로 보아야 한다.
실시예 1: 얕은 방광 종양과 침습성 방광 종양에 대한 표지의 확인
침습성 방광암과 얕은 방광암의 유전자 발현 패턴에 대한 마이크로어레이 데이터를 계보적 군집분석(hierachical clustering)한 결과는 수많은 주요한 차이를 드러냈다. 그 결과 이들 암 유형은 이하 분석에서 다르게 취급하였다. 그럼에도 불구하고 높은 비율의 유전자들이 양 암 유형에서 공통으로 과잉발현된다. 도 3은 침습성 방광암 표지에 대한 마이크로어레이 연구 결과를 보여준다. 침습성 표지 199개 중 31개가 앞서 설명한 혈청 표지(도에서 "S"로 표시함)에 대한 기준을 만족한다. 도 4는 얕은 방광암에 마이크로어레이 연구 결과를 보여준다. 얕은 방광암 표지 170개 중 34개가 혈청 표지에 대한 위 기준을 만족한다. 도 3과 4는 해당 유전자에 대한 HUGO 기호("기호")와 MWG 바이오테크 올리고뉴클레오티드 번호, NCBI mRNA 조회 서열 번호, 단백질 조회 서열 번호, 종양발현과 비악성 유전자 발현 사이의 평균 변화 배율, 개별 종양 시료 사이의 최대 변화 배율, 비악성 시료의 발현 중앙값, 보정하지 않은 최초의 스튜던트 t-검정 결과, 2-표본 윌콕슨 검정 결과와 총합 순위 점수를 포함하고 있다.
침습성 방광암 표지 분석에서 199개 유전자들의 평균 변화 배율(종양:비악성 조직)은 1.3배에서 5.3배에 이르렀고 최대 변화 배율은 2.1에서 60.9 사이였다. 얕은 방광암 표지 분석에서는 170개 표지의 평균 과잉발현이 1.13에서 3.0 사이였고, 최대 과잉발현은 1.9에서 144 사이였다. 나타낸 각 표지에 대해서 그들의 암 표지로서의 통계적 유의성은 매우 높은 것으로 나타났다. 스튜던트 t-검정의 경우, 거의 예외 없이 그 검정치가 10-3 이하였고 이는 이들 표지를 이용한 진단 결과가 방광암과 아주 강하게 관련 있음을 가리킨다. 마이크로어레이 연구에 의하여 생성된 변화 배율은 qPCR처럼 더 정확한 방법을 통하여 얻은 실제 발현 변화보다 변화 배율을 과소평가하는 경향이 있음을 주목해야 한다. 그러나, 다른 곳에서 설명하였듯이, 마이크로어레이 분석은 하나 혹은 여러 가지의 심각한 인위적 오차에 시달릴 수 있다. 따라서 방광암의 병기와 존재를 정확히 검출하기 위하여 qPCR에 바탕한 분석 방법을 개발하였다.
실시예 2: qPCR 분석
qPCR을 이용하여 도 3과 4에서 나타낸 유전자들의 부분집합에 대하여 그 유전자 발현을 좀 더 정확하고 감도 높게 정량화하였다. 마이크로어레이 분석으로 확인한 18개 유전자를 대상으로(도 3 및 4) 최대 30개의 침습성 방광암과 25 개의 얕은 방광암, 그리고 18개의 정상 요로상피 시료에서 얻은 전령 RNA를 분석하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. SPAG5, TOP2a, CDC2, ENG, NRP1, EGFL6, SEM2, CHGA, UBE2C, HOXA13, MDK, THY1, BIRC5와 SMC4L1 표지에 대해서는 침습성과 얕은 방광암 모두에 대하여 그 데이터를 나타내었다. SEMA3F, IGFBP5와 NOV 표지는 정상 요로상피와 비교하였을 때, 얕은 방광암에서만 과잉발현되었고, MGP 표지는 침습성 방광암에서만 과잉발현되었다. 이들 표지들은 과잉발현되지 않은 종양 조직 속에서는 발현 양상이 정상 요로상피와 유사하였다. 도 5는 유전자 이름, 유전자 별칭, 유전자 기호, 종양 조직(T) 대 비악성 조직(N) 사이의 변화 배율의 중앙값, 개별 종양 시료 사이의 변화 배율 중앙값, 비악성 조직 발현의 중앙값과 발현 수준이 비종양 시료의 발현 수준의 상위 5% 내에 드는 종양 시료의 퍼센트 비율을 포함한다.
도 5의 표지의 변화 배율 중앙값(비악성 조직 발현 중앙값에 대한 종양 조직)은 CHGA를 제외하고 침습성 방광 종양은 2에서 128배, 얕은 방광암은 2에서 39배 사이였다. 침습성 종양의 최대 변화 배율은 24에서 2526배였고, 얕은 방광 조양은 6에서 619배 사이였다. CHGA의 발현 패턴은 주목할만 한데, 이는 CHGA가 종양 중 일부(도 6s에서 6t)에서는 매우 높은 발현을 보였지만 나머지에서는 발현이 감지되지 않았기 때문이다. 얕은 방광 종양 시료 25개 중 15개 시료, 침습성 종양 시료 29개 중 15개, 정상 시료 10개 중 9개에서는 발현이 나타나지 않았다. 정상 시료에서 발현이 낮았기 때문에 정상 시료에 대한 종양내 과잉발현 비율을 정확하게 정량화하는 것은 불가능하지만 BTM mRNA 축적을 측정하고 정량화할 수 있을 때에는 방광암 진단의 기초로 사용할 수 있다. 침습성 종양의 경우, SPAG5, TOP2A와 CDC2 유전자의 종양 속 발현 수준은 "정상" 범위의 상위 5% 이내에 속하는 경우가 90% 이상이었다. BIRC5를 제외하면 침습성 종양에서 조사한 도 5의 나머지 유전자들은 그 발현 수준이 정상치의 상위 5% 내에 속하는 경우가 45% 이상이었다. 얕은 방광 종양의 경우는 SPAG5, TOP2A, CDC2, ENG와 NRP1 유전자의 종양 속 발현 수준이 비악성 시료의 발현 수준의 상위 5% 내에 속하는 경우가 80% 이상이었다. CHGA, UBEC2C, BIRC5를 제외하면 얕은 방광 종양에서 조사한 도 5의 나머지 유전자는 정상 발현의 상위 5% 이내에 속하는 경우가 40%보다 많았다.
도 6a에서 6af는 정상 조직(흰 막대)과 얕은 방광 종양 또는 침습성 종양 조직(검은 막대)에 대해서 18개 유전자의 발현 빈도(세로 축)와 상기 유전자의 발현 수준의 log2 변화배율 값(가로 축)을 나타낸 히스토그램이다. 놀랍게도 본 발명자들은 이들 18개 유전자 각각에서 종양 조직과 정상 조직 사이에서 그 빈도 분포에 상당한 차이를 발견하였다. 예를 들어 도 6c는 침습성 종양에서 TOP2a의 발현 결과를 나타낸다. 종양 시료 중 단지 2개만이 정상 범위 내의 발현 수준을 나타낸다.
환자와 대조군 소변 속에서 일어나는 BTM 18개, 즉 SPAG5, TOP2A, CDC2, ENG, IGFBP5, NOV, NRP1, SEMA3F, EGFL6, MGP, SEM2, CHGA, UBE2C, HOXA13, MDK, THY1, BIRC5와 SMC4L1의 축적(도 1: 시료 제1계열)을 같은 부피의 소변에서 채취한 총 RNA에 대해서 qPCR 분석하였다. BTM 중 17개는 환자의 소변 속에서 대조군 소변 시료보다 더 큰 축적을 나타내었는데, EGFL6은 예외였다(도 7). 17개 BTM의 변화 배율 중앙값은 2에서 265배 사이였다. 한 환자 시료와 대조군 중앙값 사이의 최대 편차는 26 배에서 10,000배를 넘는 차이까지 이르렀다.
도 8은 13개 BTM에 대하여 BTM 전사체의 축적을 나무상자-수염 그림으로 나타내고 대조군 시료의 발현의 중앙값에 대하여 표준화하고 있다. 도 8은 MDK, SEMA3F와 TOP2A의 경우 암 환자와 대조군 소변 시료 사이에서 겹치는 부분이 전혀 없음을 보여준다. 또한 IGFBP5, HOXA13, MGP, NRP1, SMC4L1, SPAG4와 UBE2C 전사체의 높은 축적 수준은 거의 언제나 방광암과 관련되어 있음도 보여준다. 도 8에 나타낸 나머지 BTM, 즉 BIRC5, NOV와 CDC2의 경우 방광암 환자 소변 속 발현이 정상 대조군 시료에 비하여 적어도 3 배 이상 늘어난다.
방광암의 존부에 대하여 검사받게끔 하는 주된 임상적 증상은 혈뇨(즉 소변 속에 거시적 또는 미시적 양의 혈액의 존재)이다. 혈뇨의 피는 육안으로 혹은 "딥스틱(dipstick)"을 이용한 헤모글로빈의 화학적 검출로 밝혀낸다. 거시적 또는 미시적 혈뇨 중 각각 약 15%와 4%만이 방광암과 관련이 있다. 따라서 방광암 검사가 높은 특이성을 지니려면 온혈액 속의 표지 발현 수준이 적거나 어떤 경우 감지할 수 없어야 하는 것이 중요하다. 그러므로 높은 특이성을 가진 표지의 확인을 더욱 향상시키기 위하여 도 8에 나타낸 표지 13개 중 12개의 발현을 피 속 RNA로부터 qPCR로 측정하였다. qPCR은 도 2에 기술한 탐식자와 프라이머를 이용하여 피와 방광 종양 조직으로부터 추출한 총 RNA 5 μg에 대하여 수행하였다. 도 9는 각 표지에 대하여 배경보다 큰 양일 때 그 사이클 수를 나타낸다. MGP, IGFBP5, SEMA3F와 HoxA13 표지에 대해서는 피 속에서 전사체를 감지할 수 없었으나 SMC4L1과 UBE2c는 특히 피 속에서 발현되었다. PCR 사이클 수를 나타내는 데이터는 사이클 수 하나가 늘어나는 것이 신호의 두 배 증가를 가리키므로 근본적으로 log2 그래프라는 점에 주목하였다. 따라서 종양 조직과 피 속에서 표지 존재량의 차이를 평가함에 있어서, 두 사이클 차이는 발현 수준의 4배 차이를 가리킨다. 이와 비슷하게 5 사이클 차이(예를 들어 TOP2A)는 발현 25, 즉 32배 차이를 나타낸다. TOP2A와 MDK 같은 다른 표지들은 피 속에서 발현이 감지되지만 방광 종양 속 발현과 혈액 속 발현의 차이가 크므로 적절한 표지가 된다.
온혈액과 방광 종양 사의 표지 발현의 차이를 좀 더 알아보고 방광암 소변 표지의 선택을 개선하기 위하여 추가로 환자 20명과 정상 대조군 13명 그리고 비악성 대조군 26명(도 1: 시료 제2계열)의 소변 RNA를 채취하여 9개의 표지에 대하여 추가적인 분석을 하였다. 비악성 대조군은 세포학 조사에 의하여 소변 속에서 잠재혈액 세포 또는 백혈구가 검출된 시료 20개를 포함한다. 9개 표지 모두 대조군과 암 환자 시료 사이에서 구별이 되었는데, 암 환자 시료 속에서 log2(과잉대표된 비율)의 중앙값이 건강한 대조군 시료에 비교해서는 5.4에서 10.4, 비악성 대조군에 대해서는 4.0에서 10.1에 이르렀다(도 10). 이 데이터를 나타내는 나무상자-수염 그림을 도 11에 보였다.
혈액 qPCR 데이터로부터 예측한 것처럼 UBE2C와 SMC4L1 표지는 비악성 대조군 소변 속에서 건강한 대조군과 비교했을 때 뚜렷한 축적의 증가를 나타냈다. NRP1 역시 건강한 대조군과 비교했을 때 비악성 대조군 시료 속에서 유의하게 늘어났고 암 환자 시료와 비악성 환자 시료 사이에서 상당한 중복이 있었다. TOP2A와 MDK 또한 늘어났지만 이들은 이행세포암종에서 매우 고도로 발현되기 때문에 비악성 환자 소변 시료와 암 환자 시료 속의 RNA 축적의 차이가 크게 유지되었다. 이와 대조적으로 HOXA13, IGFBP5, SEMA3F, MGP는 건강한 대조군 시료와 비교했을 때 비악성 소변 시료 속에서 약간 늘어났을 뿐이다.
전체적으로 6 개 표지(SEMA3F, HOXA13, MDK, IGFBP5, MGP, TOP2A)는 암 환자 시료와 비악성 대조군 사이에 겹치는 부분이 최소한도에 그쳤다. 나머지 표지 세 개(NRP1, UBE2C, SMC4L1)는 비악성 대조군의 부분집합 내에서 상당한 증가를 나타내었고 암 환자 시료와 겹치는 부분이 있었다. 건강한 대조군과 비교하여 비악성 대조군 소변 속에서 RNA 표지가 더 많이 축적되는 것은 이들 표지가, 조혈세포 또는 내피로부터 유래하였고, 비악성 종양 질환을 앓는 환자들의 소변 속에 존재하는세포들 속에서 발현되는 것과 부합한다. 따라서 소변 시료를 이용하여 방광암을 진단하기 위한 개별 표지의 용도는 혈액 내 표지 발현을 고려하지 않는 종래 기술에 비교했을 때 개선된 감도와 특이성을 나타낸다. 이러한 결과는 공지기술에 바탕해서는 전혀 예측할 수 없는 것이다.
실험 데이터에서 방광암에 대하여 높은 감도와 특이성을 가지는 소변 표지의 효용을 종양 유전자 발현 데이터만으로는 정확하게 예측할 수 없다는 놀라운 점을 발견할 수 있다. 조혈세포 및/또는 내피 유래의 세포 속에서 잠재적 표지들의 발현을 고려하여야 할 필요가 있다. 이러한 고려 사항은 (i) 혈액 시료의 qPCR 분석 (ii) 발현 데이터베이스 분석(예를 들어 혈액과 혈관/내피 세포 RNA에 대한 EST 라이브러리) 및/또는 (iii) 분획하지 않은 소변에서 채취한 RNA의 qPCR 분석
감도와 특이성
본 명세서에서 분석하고 기술한 두 계열의 시료를 기준으로 할 때 방광암에 대한 검출 감도는 95%를 넘는다. 비악성 질환 환자의 시료를 포함하였던 제2계열의 감도도 95%를 넘는다.
실시예 3: 방광암 검출을 위한 복수의 표지 사용
도 12a에서 12b는 정상 시료와 비교했을 때 개별 종양 시료에서 유의하게 발현이 늘어난("과잉 발현") 유전자의 수를 나타낸 히스토그램이다. 이 히스토그램은 도 5의 첫 12 개 표지로부터 얻은 qPCR 데이터에 기초한 것이다. 이 PCR 분석의 침습성 종양 30개 중 27개(90%)는 적어도 4개 이상의 유전자를 정상 범위의 상위 5% 이내에 과잉발현시켰다(도 12a). 이 분석에서 얕은 방광 종양 25개 중 23개(92%)는 상위 5% 이내에 적어도 네 개의 유전자를 과잉발현시켰다(도 12b). 이러한 결과는 정상 조직에 비교했을 때 여러 개의 유전자가 과잉발현되는 상황에서는 암 검출의 신뢰도가 매우 높아질 수 있어서 암의 진단을 더 확실히 할 수 있음을 가리킨다. 그러나 몇몇 경우에서는 단일 표지 유전자의 발현 증대만으로도 암 진단에 충분히 이를 수 있다.
종양과 비종양 시료를 표지의 조합을 이용하여 성공적으로 구별하는 방법에 대한 신뢰도를 도 13에 나타낸 통계 분석으로 좀 더 자세히 도시하였다. 이 분석에서 종양 시료와 비악성 시료의 qPCR 유전자 발현 데이터의 정규분포들을 서로 비교하였다. 이 qPCR 데이터는 도 5에 요약하였다. 이러한 분석은 종양 시료와 비악성 시료를 구별하는 검사법의 감도(특이성은 95%에 고정)에 사용 표지 수의 증가가 가져오는 효과를 나타낸다. 이 분석에서 표지 18개 중 홀로 사용되었을 때 감도가 90, 95, 99% 이상인 것은 거의 없으나 표지 둘 또는 셋의 조합예 중 많은 경우에 있어서 높은 감도를 이룰 수 있었다.(도 14a와 14b)
도 14a와 14b는 특정 표지와 표지의 조합에 대해서 침습성과 얕은 이행세포암종을 고정된 95% 특이성 수준에서 검출하는 감도를 보여준다. 감도가 90%를 넘는 조합만을 나타내었다. 도 14a에 나타낸 표지 15개 중에서 침습성 방광암은 TOP2A, SPAG5, CDC2 단독으로 약 95%의 감도를 검출할 수 있다. 다른 표지는 단독으로 쓰였을 때 이보다 감도가 낮다.
그러나 상기 표지 중 둘을 조합하였을 때는 침습성 방광암의 검출 감도를 비약적으로 개선할 수 있다(도 13a와 도 14a). 95%를 넘는 감도는 표지 두 개의 조합 105 개 중 13 개에서 얻을 수 있다. 실제로 표지 2개의 조합 105개 중 42개에서 최소 감도가 90%가 된다.
얕은 방광암의 경우(도 13b와 도 14b), 90%를 넘는 감도는 표지를 단독으로 사용하였을 때는 발견할 수 없었으나, 이 감도의 문턱값에 두 표지 조합 136개 중 11개가 도달할 수 있었다. 세 표지 조합은 22개가 95%를 넘는 감도를 나타냈다.
표지 조합을 사용하면 소변 시료의 방광암 검출 감도를 비약적으로 높일 수 있다. 도 15와 16은 개별 표지와 표지 조합에 있어서 소변 qPCR 데이터를 이용한 검출 감도를 나타낸다. 도 16에 나타난 것과 같이 비록 IGFBP5만이 95% 이상의 감도를 가지지만 두 표지 조합 8개와 세 표지 조합 37개가 이 문턱값에 달하였다.
실시예 4: 침습성과 얕은 방광암 환자 사이에서 축적되는 전사체의 차별성
도 5에서 SEMA3F, HOXA13, TOP2A와 SPAG5를 포함하는 몇 종류의 BTM이 침습성과 얕은 방광암 사이에서 구별되는 발현 양상을 보인다는 것을 알 수 있다. 이러한 관찰을 더 확대하기 위하여 소변 속에서 일어나는 이들 전사체의 축적을 침습성과 얕은 방광암에서 비교하였다.
RNA는 도 1에 기술한 환자들로부터 얻은 같은 부피의 오줌에서 추출하였고, BTM의 축적은 qPCR로 측정하였다. 특정 BTM 조합의 축적을 그 후 비율로 표현하였다. BTM 조합은 얕은 방광 종양과 비교했을 때 침습성 방광 종양에서 과잉발현이 고도로 일어나는 하나의 BTM과, 침습성 방광 종양과 비교했을 때 얕은 방광 종양에서 과잉발현이 고도로 일어나는 BTM으로 이루어졌다.
도 17은 얕은 이행세포암종 환자 20명과 침습성 이행세포암종 환자 14명로부터 얻은 소변 시료에 대하여 표지 조합의 세 쌍의 효능을 분석한 결과를 보여준다. 사용된 세 표지 조합은 (1) TOP2A와 HOXA13 (2) TOP2A와 IGFBP5 (4) TOP2A와 SEMA3F이다. 이들 표지 조합이 침습성과 얕은 이행세포암종 환자 사이에서 그 소변 시료를 구별할 수 있음을 볼 수 있다. 침습성과 얕은 이행세포암종 사이에서 다른 발현 양상을 나타내는 도 5의 다른 표지들 역시 소변 시료 분석을 기준으로 했을 때 이행세포암종의 유형을 구별할 수 있다.
게다가 도 18은 TOP2A를 포함하는 두 표지 조합을 사용하여 침습성 방광암을 1 내지 2기와 3기 종양으로 구별할 수 있음을 보여준다. 이러한 관찰 결과로부터 몇몇 BTM 전사체의 소변 속 축적 여부는 침습성과 얕은 형태의 방광암을 구별할 수 있게 해 준다는 것을 알 수 있다. 더 나아가 방광암 환자의 소변 시료로부터 qPCR 로 얻은 BTM 비율은 종양 RNA에 대한 동일한 분석으로 얻을 수 있는 것보다 더욱 강력하게 침습성과 얕은 방광암을 구별할 수 있게 해 준다. 이러한 점은 도 19에 도시되어 있는데, 도 19는 약 23 개의 얕은 방광 종양과 28개의 침습성 방광 종양 RNA 시료의 qPCR 데이터에서 얻은 (i)TOP2A-HOXA13, (ii) TOP2A-IGFBP5, (iii) TOP2A-SEMA3F 조합의 나무상자-수염 그림을 나타낸다. 비록 이들 BTM의 비율이 침습성과 얕은 방광암을 구별할 수 있게 하지만 침습성과 얕은 방광 종양 시료에서의 축적 비율에 겹치는 부분이 더 많음을 알 수 있다. 이러한 점은 악성 세포와 동일한 BTM 비율을 가지고 있지 않은 근육이나 섬유모세포와 같은 유형의 세포에 의하여 종양 RNA 시료가 오염된 것을 반영할 수도 있다. 혹은 소변으로 박리되어 들어간 악성 세포에서 종양의 내부에 머물러 있는 악성 세포보다 차별적인 BTM 발현이 더 분명하게 일어나는 것을 반영할 수도 있다. 이러한 결과를 관찰하게 된 원인이 무엇이건 간에, 소변 속 BTM의 축적을 검출하는 방법은 조직 시료에 대한 전형적인 분석 방법인 마이크로어레이 방법보다 상당한 잇점을 제공한다고 결론 지을 수 있다.
실시예 5: 방광 종양 표지에 대한 항체
본 발명의 추가적인 측면에서는 BTM에 대한 항체를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하면 마이크로어레이 및/또는 qPCR 방법을 통하여 신규한 BTM을 확인할 수 있다. 일단 잠재적인 표지를 확인하면 면역 반응을 적절히 일으키기에 충분한 양을 생산할 수 있다. 몇몇 경우에는 전장 길이의 BTM을 사용하며 다른 경우에도 BTM 펩티드 단편만으로 항원 역할을 맡기에는 족할 수 있다. 이 항원은 적절한 숙주(예를 들어, 마우스, 토끼 등)에 주사할 수 있고 필요하다면 프로인트 완전 항원 보강제(Freund's complete adjuvant), 프로인트 불완전 항원 보강제와 같은 보강제를 주사하여 면역 반응 규모를 증대시킬 수 있다.
항체 제조는 면역학 분야에서 공지된 기술이므로 여기서 더 이상 상술하지 않을 것이다. 요컨대 여기서 기술한 방법에 의하여 확인한 BTM 또는 UBTM에 대항하는 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 태양에서는 본 명세서에서 확인한 종양 표지 단백질 또는 그 단백질 핵심부 또는 BTM에 고유한 올리고뉴클레오티드 서열에 대항하는 항체를 생산할 수 있다. 비록 어떤 단백질들은 당화(glycosylation)되지만 당화 패턴의 변화는, 일정한 상황에서 통상적인 당화 패턴을 갖추지 않은 형태의 BTM에 대해서는 검출이 안 되는 결과를 낳을 수 있다. 따라서 본 발명의 특정 일측면에서 BTM 항원들은 탈당화(deglycosylation)된 BTM이나 BTM 단편을 포함한다. 탈당화는 공지 기술의 탈당화 효소(deglycosylase)를 사용하면 된다. 혹은 BTM cDNA을 대장균과 그와 유사한 세포주를 포함한 원핵세포주들처럼 당화 능력이 결여된 세포주 내에서 발현할 수도 있다.
BTM을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조할 수도 있다. 그러한 벡터 중 많은 것들이 공지기술로 알려진 표준적인 벡터에 기반하고 있다. 벡터는 BTM을 생산하는 세포주를 수립하기 위하여 이용할 수 있는데, 이러한 세포주들을 이용하여 BTM에 특이적 항체나 BTM 검출을 위한 다른 시약의 제조 또는 BTM 혹은 UBTM의 검사 방법을 표준화하기 위하여 원하는 양만큼 BTM을 생산할 수 있다.
실시예 6: 키트
본 발명에서 발견한 내용에 기초할 때 몇 종류의 검사 키트를 구상하고 생산하는 일이 가능하다. 먼저 키트는 검출 기능 분자(또는 "포획 시약(capture reagent)으로 사전에 충진된 검출 장치를 가지는 키트를 만들 수 있다. BTM mRNA의 검출을 위한 실시 태양에서 그러한 장치는 포획 시약으로서 검출 대상 mRNA와 하이브리드를 생성하는 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 기질(예를 들어 유리, 실리콘, 석영, 금속 등)을 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 mRNA의 직접 검출은 mRNA를 기질 상의 올리고뉴클레오티드와 하이브리드를 생성시킴으로써 이룰 수 있다. 다른 실시 태양에서 mRNA의 검출은 먼저 원하는 mRNA에 상보적인 DNA(cDNA)를 만들고 이 표지된 cDNA를 기질 위에 있는 올리고뉴클레오티드와 하이브리드를 생성시킨 뒤 검출하여 이루어진다.
사용된 검출 방법에 관계 없이 검사 대상 BTM의 발현을 어떠한 발현 표준과 비교하는 일은 바람직하다. 예를 들어 RNA 발현은 총 세포 DNA에 대하여 또는 구성 발현 RNA(예를 들어 리보솜 RNA)에 대하여 혹은 다른 비교적 유동성이 일정한 표지의 발현에 대하여 표준화시킬 수 있다. 오줌과 같은 생체 유체 속의 BTM을 측정하는 실시 태양에서는 여기서 보인 바와 같이 악성 질환이 없는 검사 대상자로부터 얻은 오줌으로서 같은 부피인 것을 표준으로 삼을 수도 있다.
항체 역시 포획 시약으로 키트에 쓰일 수 있다. 몇몇 실시예에서 기질(예를 들어 멀티웰-플레이트)에 BTM 또는 UBTM에 특이적인 포획 시약을 그 위에 부착되어 있을 수 있다. 일부 실시 태양에서 키트는 차단제(blocking reagent)를 포함할 수도 있다. 차단제는 비특이적 결합을 억제하기 위하여 사용된다. 예를 들어 BTM 올리고뉴클레오티드를 지니고 있지 않고 편리한 재료, 예를 들어, 연어 정액 DNA로부터 얻은 과량의 DNA를 사용하면 올리고뉴클레오티드의 비특이적 결합을 억제할 수 있다. 비특이적 항체 결합은 혈청 알부민과 같은 차단 단백질을 과량으로 사용하여 줄일 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 단백질을 검출하는 수많은 방법이 공지기술로 알려져 있고 BTM에 연관된 분자들을 특이적으로 검출할 수 있는 어떠한 방법이라도 본 발명의 범위 내에서 사용되고 고려될 수 있다.
항체 검출에 의존하는 실시 태양에서는 BTM 단백질 또는 펩티드를 세포마다 기반하여 발현시키거나 총 세포, 조직 또는 유체 단백질, 유체 부피, 조직 질량(무게)에 기반하여 발현시킬 수도 있다. 추가적으로 혈청 BTM은 알부민과 같은 상대적으로 풍부하게 존재하는 혈청 단백질에 기반하여 발현시킬 수 있다.
기질에 추가하여 검사 키트에는 (탐식자와 같은) 포획 시약과 (예를 들어 SSC, 다른 염류, 완충 용액, 세제 등의) 세척 용액 그리고 검출용 부위(예를 들어 cy3, cy5, 방사성 표지 등)가 포함될 수 있다. 키트는 사용 설명서와 패키지를 포함할 수 있다.
실시예 7: 방광암 검출용의 BTM 표지 조합 I
분획하지 않은 소변 또는 소변 속 세포 침강물을 검사하여 방광암을 검출하기 위한 용도로 본 발명의 실시 태양의 한 계열에서는 HOXA13, MGP, SEMA3F, TOP2A으로 된 BTM군의 표지를 단독으로 또는 조합하여 키트로 꾸밀 수 있다. 암 환자와 대조군 속에서 이들 BTM이 축적되는 범위는 도 20에 나타내었다. 이들 소변 시료는 방광암 진단을 환자 중에서 암의 진행이나 치료 방법에 대한 반응을 감시할 필요가 있는 사람과 거시적 또는 미시적 혈뇨를 포함한 비뇨기적 증상을 가진 사람, 그리고 증상이 없는 사람들에게서 채취하였다. 분획하지 않은 소변 속 BTM을 측정하는 키트로 검사받는 환자 또는 사람들로부터는 약 2 mL의 소변을 검사용으로 취할 수 있다. 소변 펠렛(pellet)에 대한 검사용으로는 20 mL를 넘는 소변을 채취할 수 있다.
적절한 키트에는 (i) 사용 방법과 결과 해석에 대한 설명 (ii) 분획하지 않은 소변이나 소변 펠렛으로부터 RNA를 정제하고 안정화시키는 시약 (iii) dNTP와 역전사 효소를 포함하는 cDNA 합성용 시약과 (iv) BTM cDNA 정량에 쓰이는 시약이 포함된다. 어느 한 형태에서 이들 시약은 정량적 PCR에 사용될 것이며 엑손(exon) 영역을 포괄하는 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 검출용 탐식자로 표지된 제3의 올리고뉴클레오티드와 PCR에 필요한 Taq 중합효소와 다른 완충 용액, 염류 그리고 dNTP를 포함할 것이다. 키트는 또한 전사체의 검출을 위하여 BTM RNA를 표지된 탐식자와 직접 하이브리드를 생성시키거나 가지친(branched) DNA 기술과 같은 다른 방법을 사용할 수도 있다.
또 (v) 검사 품질 관리를 위한 수단으로서 β-액틴(actin)과 같이 고도로 전사되는 유전자의 전사체를 검출하기 위한 탐식자와 올리고뉴클레오티드, 그리고 (vi) 내부 검정 표준(internal calibration standard)으로서, 또한 건강한 대조군과 비악성 대조군에서 일어나는 BTM 전사체 축적의 상한값에 대한 참조용으로서 수량을 정량한 BTM 표적 서열 시료가 포함된다. 상한값은 대조군 범위의 상위 5% 또는 1%로 정의할 수 있고 다른 상한값도 가능하다. 특히 얕은 방광암의 진단을 위해서 편리한 문턱값은 약 50% 수준인데 다른 경우에는 약 60%, 70% 또는 80%이다.
따라서 본 발명의 방법을 사용하여 방광암과 그 병기, 유형을 종래 기술에 비교하였을 때 늘어난 감도와 특이성을 가지고 검출할 수 있다.
어떤 실시 태양에서는 전형적인 방법(예를 들어 크레아티닌 측정)을 사용하여 신장 기능을 측정할 수 있다. 이들 실시 태양 중 일부에서는 표지 축적 정도를 신장 기능의 척도(예를 들어 소변량, 세포 부피, 세포 수 또는 소변 시료 속 총세포단백질량)에 대하여 보정할 수 있다.
qPCR에 관련된 검사에서 검사 시료가 미리 정해진 상한값을 초과하는 경우 그 시료에서 그 상한값보다 PCR 사이클 수가 하나 이상 클 경우 점수가 양성으로 매겨진다. 다른 검출 방법에서 정상치의 상한값보다 2배 이상 큰 결과(예를 들어 상위 10%, 5% 또는 2.5%)는 점수가 양성으로 매겨진다.
실시예 8: 방광암 검출용의 BTM 표지 조합 II
본 발명의 실시 태양 중 또 하나의 계열에서는 TOP2A/SEMA3F와 TOP2A/HOXA13 표지 조합 중 어느 하나 혹은 양쪽 모두가 소변 속에서 축적되면 이는 소변 또는 혈액 검사법 중 어느 것이라도 이용하여 방광암 진단을 받은 환자에 있어서 방광암의 조직학적 형태에 대한 강력한 예측 수단이 된다. 따라서 세포분석법과 조직학적 검사는 방광암의 형 결정을 위하여 필요하지 않을 수도 있다.
이러한 축적 비율을 검사하기 위한 키트는 실시예 7에서 기술한 (i) 내지 (iv)의 요소를 포함한다. 표준적인 qPCR 방식에 따른 BTM의 축적 정량화에 이어서 TOP2A/SEMA3F와 TOP2A/HOXA13의 축적 비율을 계산하게 된다. 침습성 방광암과 얕은 방광암 환자 소변 속에서 나타나는 이들의 축적 비율 범위를 도 21에 보였다. qPCR 검사법을 사용할 때 TOP2A와 SEMA3F 사이에는 그 차이가 5 사이클 미만이며 이중 SEMA3F 전사체가 더 많은 실험 결과는 침습성 방광암을, 5 사이클 이상의 차이는 얕은 방광암을 예측할 수 있다. TOP2A와 HOXA13의 경우, 그 차이가 8 사이클 미만이면서 HOXA13 전사체가 더 많은 실험 결과는 침습성 방광암을, 8 사이클을 넘는 차이는 얕은 방광암을 예측할 수 있다.
실시예 9: BTM을 이용한 방광암 진행의 평가
방광 종양의 진행을 평가하기 위하여 방광벽을 생검하여 조직 시료를 얻거나 방광암 환자로부터 시간을 두고 소변 시료를 채취한다. BTM, UBTM 또는 이들의 조합의 축적 여부를 시료에 대해서 시간을 달리하여 평가한다. BTM 또는 UBTM 개별표지 또는 조합의 축적이 늘어난 경우는 방광암이 진행함을 가리킨다.
실시예 10: BTM을 이용한 방광암 치료의 평가
방광 종양의 치료법의 효능을 평가하기 위하여 치료가 시작되기 전에 조직 및/또는 소변 시료를 채취힌다. 하나 또는 그 이상의 BTM 혹은 UBTM 표지에 대하여 바탕선(baseline) 값을 결정하고, 다양한 BTM과 UBTM 표지들의 서로에 대한 비율도 결정한다. 치료를 시작하게 되는데, 수술, 방사능 요법 또는 화학요법을 포함하여 해당 질병의 유형과 병기에 걸맞은 치료법으로서 관련 분야에서 알려진 어느 것이라도 포함할 수 있다. 치료 도중 조직 및/또는 소변 시료를 채취한 뒤 BTM 및/또는 UBTM의 존부와 그 양에 대하여 분석한다. 다양한 BTM과 UBTM의 비율을 결정한 뒤 그 결과를 (1) 환자의 치료 전 바탕선 값 또는 (2) 방광암을 앓지 않는 사람들의 집단에서 얻은 정상치와 비교한다.
인용 문헌
본 출원에서 인용한 모든 간행물과 특허는 참조 문헌으로서 완전하게 본 명세서의 일부로서 제공하고 있다. 이 출원에는 뉴클레오티드 및/또는 단백질 서열이 포함된다. 컴퓨터로 읽을 수 있는 형태인 서열 목록과 그를 담은 디스켓을 본 출원에 첨부하였으며 이들은 본 명세서에서 참조 문헌으로서 포함되어 있다.
BTM과 UBTM군 표지들을 검출하는 방법은 마이크로어레이 및/또는 실시간 PCR 분석 방법을 이용하여, 핵산, 단백질과 펩티드를 검출하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물과 방법은 질병의 진단, 치료법 효능의 평가와 BTM군 표지 또는 UBTM군 표지들의 발현을 측정하는데 적절한 시험 키트와 시약의 제조에 유용하다.
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Claims (36)

  1. 소변 시료 속에서 요 방광 종양 표지(Urine Bladder Tumor Maker, UBTM)군에 속하는 표지의 축적을 검출하는 단계를 포함하는 방광암의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 UBTM군에 속하는 표지는 실질적으로 혈액과는 연관되어 있지 않은 표지인 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 UBTM은 도 3 또는 도 4에 나타낸 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계는 방광종양표지(Bladder Tumor Marker, BTM) 또는 UBTM mRNA의 축적을 검출함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계는 마이크로어레이를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계는 정량적 중합효소 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 또는 하이브리드화(hybridization) 방법을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계는 UBTM 단백질의 축적을 검출함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출 단계는 UBTM 펩티드의 축적을 검출함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 검출 단계는 UBTM 항체를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 다중 클론 항체인 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항체는 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방광암의 검출 방법은 상기 소변 시료에서 UBTM군의 표지들 중 둘 또는 그 이상의 수의 축적을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방광암의 검출 방법은 TOP2A, MDK 또는 BIRC5를 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방광암의 검출 방법은 TOP2A-HOXA13, TOP2A-IGFBP5 및 TOP2A-SEMA3F로 이루어지는 군에서 선택된 한 쌍 이상의 표지를 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  15. 방광암이 의심되는 환자의 생물학적 시료에서 도 14a 또는 14b에 나타낸 군으로부터 선택되는, 둘 또는 그 이상의 수의 BTM군 표지들의 조합이 축적되는 것을 검출하는 단계를 포함하는 방광암의 검출 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직 또는 소변에서 얻은 것을 특징으로 하는 방광암의 검출 방법.
  17. BTM 또는 UBTM에 특이적인 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체는 다중 클론 항체인 것을 특징으로 하는 BTM 또는 UBTM에 특이적인 항체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체는 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는, BTM 또는 UBTM에 특이적인 항체.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTM 또는 UBTM은 도 3 또는 도 4에 나타낸 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, BTM 또는 UBTM에 특이적인 항체.
  21. 제17항의 항체와 다른 BTM 또는 UBTM에 대한 또 다른 항체를 포함하는 항체 혼합물.
  22. 도 14a 또는 14b에서 선택되는 BTM 또는 UBTM 표지 조합에 대한 포획 시약들을 표면에 지니는 기질(substrate) 및;
    상기 기질에 연결되고 상기 포획 시약들이 목표하는 BTM 또는 UBTM 표지 조합을 검출할 수 있는 감지기를 포함하는 BTM 감지 장치.
  23. 제22항에 있어서, 상기 포획 시약 중 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 BTM 감지 장치.
  24. 제22항에 있어서, 상기 포획 시약 중 적어도 하나는 항체를 포함하는 BTM 감지 장치.
  25. 제22항에 있어서, 상기 BTM 또는 UBTM은 도 3 또는 도 4에 기재된 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 BTM 감지 장치.
  26. 기질;
    상기 기질 표면에 존재하고, 도 14a 또는 14b에 나타낸 군에서 선택되는 적어도 둘 이상의 BTM 또는 UBTM 포획 시약들의 조합 및;
    사용 설명서를 포함하는 암 검출 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 포획 시약들 중 적어도 하나는 BTM 또는 UBTM에 특이적인 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 암 검출 키트.
  28. 제26항에 있어서, 상기 포획 시약들 중 적어도 하나는 BTM에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 암 검출 키트.
  29. 제26항에 있어서, 상기 BTM 또는 UBTM은 도 3 또는 도 4에 나타낸 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 검출 키트.
  30. 소변 시료 속에 BIRC2, CDC2, HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NOV, NRP1, SEMA3F, SPAG5, TOP2A로 이루어지는 표지 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 표지가 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하되,
    상기 표지는 혈액 속에서 실질적인 양으로 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 방광암 검출 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 표지는 IGFBP5, MGP, SEMA3F 및 HOXA13으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방광암 검출 방법.
  32. 비악성 방광 질환 환자의 소변 속에서 HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NRP1, SEMA3F, SMC4L1, TOP2A 및 UBE2C로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 표지의 축적이 일어나는지 여부를 측정하는 단계; 및
    상기 소변 내 상기 표지들의 축적 비율을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 표지들의 축적 비율은 방광암의 존부와 연관된 것을 특징으로 하는 비악성 방광 질환과 악성 방광 질환을 구별하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 적어도 하나 이상의 이차 BTM의 소변 내 축적을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방광암 검출 방법.
  34. 제33항에 있어서, 일차적으로 TOP2A에 대한 소변 내 축적을 측정하고, 이차적으로 HOXA13, IGFBP5 및 SEMA3F로 이루어지는 군에서 선택되는 이차 BTM에 대해 측정하는 것을 특징으로 하는 방광암 검출 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 표지의 축적 비율을, 얕은 방광암(superficial bladder cancer), 침습성 1기 방광암 또는 침습성 2 내지 3기 방광암의 인디케이터로서 상관 관계 분석을 하는 것을 특징으로 하는 방광암 검출 방법.
  36. 도 3 또는 도 4에서 기재된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 표지에 대해서 방광암 환자의 치료 전 시료 속 그 존부와,
    상기 환자가 방광암 치료를 일정 기간 받은 후에 도 3 또는 도 4에서 기재된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 표지에 대해서 상기 환자로부터 채취한 시료 속 그 존부를 비교하는 단계를 포함하는,
    방광암 치료법의 효능을 측정하기 위한 방법.
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