CN117947184A - 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 - Google Patents
检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117947184A CN117947184A CN202410355231.8A CN202410355231A CN117947184A CN 117947184 A CN117947184 A CN 117947184A CN 202410355231 A CN202410355231 A CN 202410355231A CN 117947184 A CN117947184 A CN 117947184A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sf3b3
- gene
- oplegnathus fasciatus
- dna
- oplegnathus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000353172 Oplegnathus fasciatus Species 0.000 title claims abstract description 116
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 101150050367 Sf3b3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 67
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 23
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 4
- 238000010008 shearing Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 23
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000353145 Oplegnathus Species 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010072724 U2 Small Nuclear Ribonucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000006986 U2 Small Nuclear Ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101001028702 Homo sapiens Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001417534 Lutjanidae Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100037173 Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000269810 Pagrus Species 0.000 description 1
- 241000123241 Sparassis Species 0.000 description 1
- 101710190370 Splicing factor 3B subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010022412 splicing factor 3a Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体是一种检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用。检测条石鲷基因内含子区DNA插入变异特异性标记为条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基。该方法缩短了条石鲷sf3b3基因内含子区变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在条石鲷基于sf3b3基因雌、雄前体mRNA剪切效率研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体是一种检测条石鲷sf3b3基因内含子（DNA）插入变异特异性标记、特异性引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。
背景技术
条石鲷为栖息在我国黄海、东海等海域的一种恋礁定居性观赏和养殖鱼类。它主要分布在温带和亚热带的岩礁区，外形优美被称为"梦幻之鱼"。条石鲷不仅食用价值高，而且还是一种受欢迎的观赏鱼。我国近年来在条石鲷的人工繁殖、苗种养殖等方面取得了长足进步。此外，它作为混养对象还可降低其他水产养殖的成本。据研究条石鲷采用性别决定机制为X1X1X2X2/X1X2Y。雄鱼生长速度更快是因为带有Y染色体。未来如果能研发快速鉴定鱼苗性别的技术，有助于选育生长更快的雄性品种，从而提高养殖效率和产值，更好地开发利用这一重要渔业资源。
剪接因子3b亚基3基因（Splicing factor 3b subunit 3, sf3b3）编码剪接因子3b 蛋白复合物的第3亚基。Sf3b3蛋白与剪接因子 3a 和一个 12S RNA 单元一起形成 U2小核糖核蛋白复合物 (U2 snRNP)，复合物以序列独立的方式结合内含子分支位点上游的前体 mRNA，并可能将 U2 snRNP 锚定到前体mRNA。剪接体复合体对于去除内含子和将外显子连接在一起以产生成熟的信使核糖核酸分子至关重要。如果没有适当的剪接，遗传信息就无法准确地转录和翻译成功能蛋白。Sf3b3基因的突变与各种疾病有关，包括某些类型的癌症和遗传性疾病。了解这种基因的功能对于开发针对这些疾病的靶向疗法和治疗方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA插入变异检测技术不足，提供了一种检测条石鲷sf3b3基因内含子（DNA）插入变异特异性标记、特异性引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记，检测条石鲷基因内含子区DNA插入变异特异性标记为条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1（ChrX1sf3b3）和SEQ ID NO:2（ChrYsf3b3）所示碱基。
检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记，所述条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示碱基为条石鲷雌、雄鱼X1染色体共有sf3b3基因内含子区未发生DNA插入变异的同源片段，其为条石鲷sf3b3基因内含子区碱基非插入与插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第283位点和284位点之间、第354位点和355位点之间插入序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列。
一种所述的检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记的应用，所述特异性标记在检测条石鲷雌雄遗传性别中的应用。
一种所述特异性标记鉴定条石鲷基因内含子区插入变异的方法，
（1）PCR扩增：取待测条石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用条石鲷sf3b3基因内含子区特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记进行对比；
（2）结果判断：从待测条石鲷的基因组DNA中扩增出528bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和1251bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测条石鲷为sf3b3基因内含子区发生DNA片段插入变异个体；
（3）待测条石鲷的基因组DNA中仅扩增出528bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测条石鲷为条石鲷sf3b3基因内含子区未发生DNA片段插入变异个体。
所述特异性引物为
Chsf3b3_F:1 : 5’-ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCC-3’；
Chsf3b3_R:2 : 5’-GAACCTCCAGGTATCAGAGTGG-3’。
所述步骤（2）中待测条石鲷个体为雄鱼（X1X2Y）；
步骤（3）中待测条石鲷个体为雌性（X1X1X2X2）。
一种条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记的引物，
Chsf3b3_F:1 : 5’-ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCC-3’；
Chsf3b3_R:2 : 5’-GAACCTCCAGGTATCAGAGTGG-3’。
一种鉴定条石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的引物。
本发明所具有的优点：
本发明通过条石鲷雄鱼融合染色体Y上的sf3b3基因与位于雌鱼同源染色体X上的sf3b3基因相比较发生了大片段的内含子序列插入，进而高效、快速精准鉴定条石鲷sf3b3基因内含子是否发生DNA插入变异，对于揭示条石鲷的雌、雄前体mRNA剪切效率及变异，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升条石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从条石鲷全基因组序列中筛选并获得了条石鲷X和Y染色体sf3b3基因内含子同源区段且有大片段DNA插入标记序列，进一步建立了条石鲷sf3b3基因内含子DNA插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷sf3b3基因内含子是否发生DNA插入。该方法利用一对引物在sf3b3基因内含子DNA插入个体中扩增出1251bp和528bp两个相差723bp的条带，在sf3b3基因内含子为发生DNA插入个体中仅扩增出528bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了条石鲷sf3b3基因内含子变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在条石鲷基于sf3b3基因雌、雄前体mRNA剪切效率及变异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得X染色体sf3b3基因与Y染色体sf3b3基因的核苷酸序列比对图。
图2为本发明实施例提供的ChrX1sf3b3和ChrYsf3b3在X与Y染色体上的具体位置信息图。
图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1sf3b3与Y染色体ChrYsf3b3核苷酸序列比对图。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1sf3b3与Y染色体ChrYsf3b3核苷酸序列同源插入差异DNA片段模式图。
图5为本发明实施例提供的条石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首先通过采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了条石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了条石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组（SRP160016，SRP220007，Xiao et al., 2019, 2020）；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体sf3b3基因内含子区，条石鲷雄鱼Y染色体上同源sf3b3基因内含子区发生了1处大片段DNA序列插入变异（图1）。选择雌鱼X1染色体上sf3b3基因内含子区26500bp~27100bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列插入的27800bp~29100bp区为研究目标区域（图1）。X1染色体上DNA片段长度为528bp，命名为ChrX1sf3b3，其序列为X sf3b3ID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为1251bp，包含了与X1染色体上sf3b3基因内含子区同源序列，命名为ChrYsf3b3，其序列为Y sf3b3ID No:1；ChrYsf3b3与ChrX1sf3b3同源序列比对发现在与ChrX1 sf3b3r对应的第66位点和67位点、第99位点和100位点之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小共计为723bp（图2和图3），雄鱼Y染色体sf3b3基因内含子区在27800bp~29100bp区域比雌鱼X1染色体上sf3b3基因内含子区同源区域插入了723bp大小的DNA序列，这个片段即为检测条石鲷sf3b3基因内含子区是否发生DNA片段插入变异的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrYsf3b3则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。
图1为本发明实施例提供的获得X染色体sf3b3基因与Y染色体sf3b3基因的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表sf3b3基因在X与Y染色体上的高度同源区域，其中标注的区域为本发明目标序列ChrX1sf3b3和ChrYsf3b3所在的位置。图2为本发明实施例提供的ChrX1sf3b3和ChrYsf3b3在X与Y染色体上的具体位置信息；528bp代表ChrX1sf3b3片段的长度，1251bp代表ChrYsf3b3的长度；ChrYsf3b3中间低位区域代表插入的723bp核苷酸序列，该区域与ChrX1sf3b3片段无同源匹配序列。图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1sf3b3与Y染色体ChrYsf3b3核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；*：代表ChrX1sf3b3和ChrYsf3b3序列一致性，空白区域表示两者碱基不一致序列；_ _ _ _ ：代表插入缺失序列；黑色下划线代表插入序列所在区域。图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1sf3b3与Y染色体ChrYsf3b3核苷酸序列同源插入差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息。图5为本发明实施例提供的条石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♂：生理雄鱼；♀：生理雌鱼；图中呈现两条带（1251bp和528bp）的个体为sf3b3基因内含子发生DNA插入个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼，呈现单条带（528bp）的个体为sf3b3基因内含子未发生DNA插入个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性。
本发明基于条石鲷雄鱼Y染色体sf3b3基因内含子区27800bp~29100bp位置发现的长片段DNA插入序列特征标记来确定条石鲷sf3b3基因内含子区是否发生DNA片段插入变异，发明了一种条石鲷sf3b3基因内含子区DNA插入变异快速检测方法，并将该方法应用到了条石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的条石鲷是否存在Ysf3b3ID No:1的核苷酸片段（1251bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对条石鲷Y染色体上的sf3b3基因内含子区序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上sf3b3基因内含子区Xsf3b3ID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上Ysf3b3ID No:1核苷酸序列，利用在上述sf3b3基因内含子区同源区域在条石鲷Y染色体有大片段插入这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检条石鲷sf3b3基因内含子区是否发生DNA片段插入变异；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于条石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chsf3b3_F:1 : 5’- ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCC-3’ (Xsf3b3 ID No:2)
Chsf3b3_R:2 : 5’- GAACCTCCAGGTATCAGAGTGG-3’ (Xsf3b3 ID No:3)。
使用上述引物鉴定条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段插入变异的步骤主要包括：提取高质量的条石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体sf3b3基因内含子区DNA插入变异的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在条石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出1251bp和528bp两个DNA片段，1251bp片段为发生DNA插入变异sf3b3基因内含子区特有标记片段；而在条石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出528bp的单一DNA片段。
本发明基于条石鲷雌雄全基因组测序和雌、雄个体sf3b3基因内含子区定位及DNA序列比对分析，可见条石鲷雄鱼Y染色体上的sf3b3基因内含子区发生了DNA长片段的插入变异，进而通过其作为条石鲷Y染色体上sf3b3基因内含子区碱基插入变异特有的DNA标记，并利用条石鲷sf3b3基因内含子区DNA序列插入变异快速鉴定条石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检条石鲷是否发生sf3b3基因内含子区序列插入变异。该方法会在sf3b3基因内含子区发生DNA插入的条石鲷个体中扩增出1251bp和528bp两条带，其中1251bp条带为特异性目的条带，而在未发生DNA插入的sf3b3基因内含子区个体中仅扩增出单一条带（528bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现条石鲷sf3b3基因内含子区发生DNA序列插入与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（1251bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于条石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。
实施例1条石鲷sf3b3基因内含子区序列变异特有DNA标记的筛选及验证
条石鲷Y和X染色体sf3b3基因内含子区同源区段且含大片段插入目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托武汉菲沙基因信息有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了条石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果已公布（SRP160016，SRP220007， Xiao et al., 2019, 2020）。采用比较基因组生物信息学分析条石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1），条石鲷雄鱼异形染色体Y上sf3b3基因内含子区与条石鲷雌鱼X1染色体sf3b3基因内含子区同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上sf3b3基因内含子区目标DNA片段长度为528bp，命名为ChrX1sf3b3，其序列为SEQ ID NO:1：
ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCCTTTTTCAGACTCTAGTAAAGACAAAGCTAAAGTAAATGGTTAAAACAATATTTATTTAGCAAGGTAAGAAGTTCGACTTCACTTTTACACCGTAAAGTAACTGGAAAAAATGACACGATCATTTATATCAGTAGTTGAAGGGACATTTTAATAGAATGGATGCGATGGTTAGCCATTAGCCATGCTATTGTTTACTTCGGAAACCGGCTAAGCCTGGCCGAGCATACTGCAAAATGAATCGATTGAACAGTTTCATACTGCTATGAAAAGCAATATAAAGTTACTGCGTTCGTCGGTAGTATGTAGTAGGCGGTTCCAAATACAGCAGTAGCTGTTCGTGTCTCAGGCTGAAGTGATCAGGGAGCTGGATGAATCCTACCAAACAACAATAACACATGACCGTCTTTCTCCATCCATTGTCTCTCCAGGCTGAGGTGGTAGTGAACTATCATGTAGGAGAGACGGTGTTATCTCTCCAGAAAACCACTCTGATACCTGGAGGTTC。
而在雄鱼异形染色体Y上sf3b3基因内含子区同源的目标DNA片段长度为1251bp，其包含了与X1同源序列，命名为ChrYsf3b3，其序列为SEQ ID NO:2:
ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCCTTTTTCAGACTCTAGTAAAGACAAAGCTAAAGTAAATGGTTAAAACAATATTTATTTAGCAAGGTAAGAAGTTCGACTTCACTTTTACACCGCAAAGTAACTGTAAAAAATGACACGATCATTTATATCAGTAGTTGAAGGGACATTTTAATAGAATGGATGCGATGGTTAGCCATTAGCCATGCTATTGTTTACTTCGGAAACCGGCTAAGCCTGGCCGAGCATACTGCAAAATGAATCGATTGAACAGTTTCATACTGCATACTACTATGAAAAGCAATATAAAGTTACTGCGTTCGTCGGTAGTATGTAGTAGGCGGTTCCGAATACAGCAGTAGCCTAGCTTAGAACGTAAACACAAAGCATGTTTGATGTCTGTTACGTTTCACCATCCAATTAGTTCAGCCGTAAGGAAACCTACTACTTACAGCCCGGTCTGTTAAAAATTGTTACGGGCGATCATTATGTCGAGAATTGACTTTTAAATTTTAAAGTTTTCTGCATCGAGACATAATCATTAAAGAGAGAATCGCAATGCGTCTAATCAACTTATTTCCACACCTCTAATCAACACCCACTGGATTCATTGTGGTAGAAAATTAAACAATGCACAGGTGCAGTCCAATACTTTTTACAGGCACATACGCAAACCATTCATGTGTCTGGACTGGGCGTCATGTCAGGAGCACATGACTAACATGTATCCATCTTATGCAAGACCTGCGTGGCTGCAGTTTAAACTCAAGAGCAGCCCAGGGGTCTTCCAGTAAGGTTTCAGTTCTGGTCCTGCATCGCGCTCCCACCACCTGGTTTTGCCTCGCTCAAACCGTGCATTGCCTGCTCAGTACATTTAGCTATATGATAGGAAATCAAAATAGATGTATTAATGGGTTTTAACATGTACAATTTGGAAGATTGGAAGAAAGGTTTTTTGTCATTTAGAGCATAAAAAATACAATTGCGGTCACATGGAGTGTTGCTCAAAATGAAAAGAATTTTGTTCTGAGCGATGGGGGGTCAGAAATGAAAGATTGCCATCTGTATTATGATCTATCTGTTCGTGTCTCAGGCTGAAGTGATCAGGGAGCTGGATGAATCCTACCAAACAACAATAACACATGACCGTCTTTCTCCATCCATTGTCTCTCCAGGCTGAGGTGGTAGTGAACTATCATGTAGGAGAGACGGTGTTATCTCTCCAGAAAACCACTCTGATACCTGGAGGTTC。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体sf3b3基因内含子区定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体sf3b3基因内含子区片段ChrX1sf3b3同源的ChrYsf3b3（Y染色体）发生了2处DNA序列插入，分别对应ChrX1sf3b3的第283位点和284位点、第354位点和355位点之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小共计为723bp（图2和图3）。Y染色体上sf3b3基因内含子区目标区域（ChrYsf3b3）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1sf3b3）插入了723bp大小的DNA序列，这个片段即为条石鲷sf3b3基因内含子区碱基插入变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别条石鲷sf3b3基因内含子区是否发生DNA序列插入变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYsf3b3这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1sf3b3则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图1和图2所示。
sf3b3基因内含子区序列变异特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体sf3b3基因内含子区的SEQ ID NO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄条石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chsf3b3_F:1、Chsf3b3_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为25µL，包括艾科瑞生物2×Accurate Taq Master Mix 12.5µL；ChSf3b3_F:1 1.0µL；ChSf3b3_R:2 1.0 µL；DNA模板1.0µL，9.5µL ddH2O；混匀后离心。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，59℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，58.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出DNA片段插入与非插入sf3b3基因内含子区个体存在差异。将插入与非插入DNA序列sf3b3基因内含子区差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了条石鲷X、Y染色体同源sf3b3基因内含子区含大片段插入目标DNA序列片段，如图3和图4所示。
实施例2条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段插入变异鉴定技术的建立与应用
对于来自山东威海市文登区海和水产育苗有限公司养殖的条石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，12尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取条石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至60ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用条石鲷sf3b3基因内含子区大片段序列变异特异的DNA片段引物Chsf3b3_F:1和Chsf3b3_R:2通过PCR方法检测条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段插入变异与否。PCR反应体系为25µL，包括艾科瑞生物2×Accurate Taq Master Mix12.5µL；ChSf3b3_F:1 1.0µL；ChSf3b3_R:2 1.0 µL；DNA模板1.0µL，9.5µL ddH2O；混匀后离心。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，59℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，58.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10×Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分别条石鲷sf3b3基因内含子区发生DNA插入与非插入变异个体（参见图5）。
由图5可见，在sf3b3基因内含子区发生DNA插入的条石鲷个体中会扩增出两条目的条带（1251bp和528bp），其中1251bp条带为发生DNA片段插入sf3b3基因内含子区特异性目的条带ChrY sf3b3，而在未发生DNA片段插入sf3b3基因内含子区个体中只能扩增出单一带型ChrX1sf3b3（528bp）。由于ChrYsf3b3标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYsf3b3这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1sf3b3则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的条石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷sf3b3基因内含子区是否发生DNA片段插入变异，而且在条石鲷基于sf3b3基因内含子区雌、雄前体mRNA剪切效率及变异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Claims (8)
1.一种检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记，其特征在于：检测条石鲷基因内含子区DNA插入变异特异性标记为条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基。
2.根据权利要求1所述的检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记，其特征在于：所述条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列SEQ IDNO:1所示碱基为条石鲷雌、雄鱼X1染色体共有sf3b3基因内含子区未发生DNA插入变异的同源片段，其为条石鲷sf3b3基因内含子区碱基非插入与插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第283位点和284位点之间、第354位点和355位点之间插入序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列。
3.一种权利要求1所述的检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记的应用，其特征在于：所述特异性标记在检测条石鲷雌雄遗传性别中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记鉴定条石鲷基因内含子区插入变异的方法，其特征在于，
（1）PCR扩增：取待测条石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用条石鲷sf3b3基因内含子区特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的条石鲷sf3b3基因内含子区DNA片段非插入与插入特异性标记进行对比；
（2）结果判断：从待测条石鲷的基因组DNA中扩增出528bp和1251bp两个DNA片段，即为判断该待测条石鲷为sf3b3基因内含子区发生DNA片段插入变异个体；528bp为SEQ ID NO:1所示碱基，1251bp为SEQ ID NO:2所示碱基；
（3）待测条石鲷的基因组DNA中仅扩增出528bp的单一DNA片段，即为判断该待测条石鲷为条石鲷sf3b3基因内含子区未发生DNA片段插入变异个体；528bp为SEQ ID NO:1所示碱基。
5.根据权利要求4所述的鉴定条石鲷基因内含子区插入变异的方法，其特征在于，特异性引物为
Chsf3b3_F:1 : 5’-ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCC-3’；
Chsf3b3_R:2 : 5’-GAACCTCCAGGTATCAGAGTGG-3’。
6.根据权利要求4所述的鉴定条石鲷基因内含子区插入变异的方法，其特征在于，步骤（2）中待测条石鲷个体为雄鱼X1X2Y；
步骤（3）中待测条石鲷个体为雌性X1X1X2X2。
7.一种检测权利要求1所述的检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记的引物，其特征在于：
Chsf3b3_F:1 : 5’-ATTGTGAAGTAGCATTAGCGTCC-3’；
Chsf3b3_R:2 : 5’-GAACCTCCAGGTATCAGAGTGG-3’。
8.一种鉴定条石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：试剂盒含权利要求7所述的引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410355231.8A CN117947184B (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410355231.8A CN117947184B (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117947184A true CN117947184A (zh) | 2024-04-30 |
| CN117947184B CN117947184B (zh) | 2024-06-18 |
Family
ID=90794806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410355231.8A Active CN117947184B (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117947184B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN110607375A (zh) * | 2019-10-11 | 2019-12-24 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种快速鉴定斑石鲷和金钱鱼的方法 |
| CN112481389A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-12 | 江苏省家禽科学研究所 | 用于寿光鸡种鉴定的分子标记引物组合及鉴定方法 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
-
2024
- 2024-03-27 CN CN202410355231.8A patent/CN117947184B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| KR102086984B1 (ko) * | 2019-01-16 | 2020-05-15 | 옐로우 씨 피셔리즈 리서치 인스티튜트, 차이니즈 아카데미 오브 피셔리 사이언시즈 | 강담돔 웅성 특이적 dna 마커 및 유전적 성별 감식 방법 |
| CN110607375A (zh) * | 2019-10-11 | 2019-12-24 | 江苏省海洋水产研究所 | 一种快速鉴定斑石鲷和金钱鱼的方法 |
| CN112481389A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-12 | 江苏省家禽科学研究所 | 用于寿光鸡种鉴定的分子标记引物组合及鉴定方法 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BO GAO ET AL.,: "The complete mitochondrial genome of the spotted knifejaw Oplegnathus punctatus", MITOCHONDRIAL DNA, vol. 8, no. 12, 31 December 2023 (2023-12-31), pages 1435 - 1439 * |
| 陈睿毅等: "条石鲷(Oplegnathus fasciatus)雌核发育的人工诱导与鉴定", 海洋与湖沼, vol. 54, no. 3, 31 May 2023 (2023-05-31), pages 829 - 835 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117947184B (zh) | 2024-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2019128350A1 (zh) | 白来航鸡红羽致因突变基因型鉴定及红羽粉壳蛋鸡配套系培育方法 | |
| CN105594664B (zh) | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN114107522B (zh) | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 | |
| AU2017101108A4 (en) | Construction method of animal model of mucopolysaccharidosis type II and use thereof | |
| CN111926017B (zh) | 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用 | |
| CN111394445B (zh) | 用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用 | |
| CN106947827A (zh) | 一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用 | |
| CN113584079A (zh) | 一种应用于钙离子成像的斑马鱼心脏特异标记品系的建立 | |
| CN111926086A (zh) | 一种影响鸡体斜长的分子标记及其应用 | |
| CN117947184B (zh) | 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| Lyu et al. | TEAseq-based identification of 35,696 Dissociation insertional mutations facilitates functional genomic studies in maize | |
| CN112029843B (zh) | 一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异性分子标记及其引物和应用 | |
| CN114480601A (zh) | 一种鉴别线纹海马遗传性别的分子标记、引物、方法及应用 | |
| CN117965711B (zh) | 条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒 | |
| CN111910009B (zh) | 一种影响鸡法氏囊指数的分子标记及其应用 | |
| CN117947182B (zh) | 检测条石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117947183B (zh) | 检测条石鲷基因内含子区缺失变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117925862B (zh) | 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117867138B (zh) | 斑石鲷erc2基因内含子DNA插入变异的分子标记、引物对、检测方法、应用和试剂盒 | |
| CN117965757B (zh) | 斑石鲷遗传性别的分子标记、引物、方法、试剂盒及应用 | |
| CN117867091B (zh) | 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 | |
| CN117844913B (zh) | 斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记、方法、引物对、应用和鉴定试剂盒 | |
| CN113718042A (zh) | 一种红白锦鲤性别特异dna标记及其应用 | |
| CN117867092B (zh) | 斑石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、检测方法、特异性引物和试剂盒 | |
| CN112680479A (zh) | Cyp1b1基因缺失斑马鱼的制备 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |