CN110872358B - HA-Fc融合蛋白及其制备方法和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种HA‑Fc融合蛋白及其制备方法和疫苗，涉及生物医药技术领域。该HA‑Fc融合蛋白含有禽流感HA片段和抗体的Fc区域，禽流感HA片段的C段连接抗体的Fc区域，并且HA‑Fc融合蛋白由CHO细胞表达系统表达。该HA‑Fc融合蛋白具有较高的禽流感抗原的免疫原性。

Description

HA-Fc融合蛋白及其制备方法和疫苗
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种HA-Fc融合蛋白及其制备方法和疫苗。
背景技术
高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由甲型流感病毒引起的一类人畜共患的烈性传染病，鸡作为主要动物传染源，对人类公共卫生造成持续性威胁。甲型流感病毒属于正粘病毒科，根据病毒表面的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)和酸苷酶蛋白(neuraminidase，NA)两个糖蛋白又分为不同亚型。到目前为止，共鉴定出16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)。
目前，传统的禽流感疫苗为灭活苗或减毒活疫苗等，这些方法具有高效快速的优点，但是禽流感疫苗生产还存在许多问题，如野生型禽流感病毒具有高致病性、利用鸡胚制成的禽流感疫苗要比人类流感疫苗的产量低，以及免疫原性低等问题。因此一种改进的禽流感疫苗是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种HA-Fc融合蛋白，该HA-Fc融合蛋白具有较高的禽流感抗原的免疫原性。
本发明的第二目的在于提供编码上述HA-Fc融合蛋白的基因。
本发明的第三目的在于提供和HA-Fc融合蛋白相关的生物材料。
本发明的第四目的在于提供上述HA-Fc融合蛋白的制备方法，改制备方法能够获得稳定的HA-Fc融合蛋白。
本发明的第五目的在于提供一种疫苗，该疫苗免疫效果好。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种HA-Fc融合蛋白，含有禽流感HA片段和抗体的Fc区域，禽流感HA片段的C段连接抗体的Fc区域，所述HA-Fc融合蛋白由CHO细胞表达系统表达。
优选地，编码所述禽流感HA片段的基因经偏嗜性密码子优化；
优选地，所述禽流感HA片段由含有如SEQ ID NO.1所示序列的基因编码。
优选地，所述抗体的Fc区域包括Fc区域的完整结构域；
优选地，所述Fc区域为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或IgY的Fc区域；
优选地，所述抗体的物种来源包括人、牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅；
优选地，所述Fc区域为猪源IgM的Fc区域；
优选地，所述猪源IgM的Fc区域由含有如SEQ ID NO.2所示序列的基因编码；
优选地，所述Fc区域为人源IgG的Fc区域；
优选地，所述人源IgG的Fc区域由含有如SEQ ID NO.3所示序列的基因编码。
优选地，所述禽流感HA片段和所述抗体的Fc区域通过连接肽连接；
优选地，所述连接肽含有如SEQ ID NO.4所示序列。
优选地，所述HA-Fc融合蛋白的N端和/或C端设置有标签；
优选地，所述标签包括His标签、Flag标签、NusA标签、SUMO标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种；
优选地，所述HA-Fc融合蛋白的N端设置有His标签。
优选地，所述HA-Fc融合蛋白由CHO-S细胞表达。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码上述HA-Fc融合蛋白的基因。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了生物材料，该生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达上述HA-Fc融合蛋白，或含有上述基因。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述HA-Fc融合蛋白的制备方法，包括将编码所述HA-Fc融合蛋白的基因在宿主细胞中表达，所述宿主细胞包括CHO细胞系；
优选地，所述CHO细胞系包括CHO-S细胞系；
优选地，提供含有表达所述HA-Fc融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，使宿主细胞表达HA-Fc融合蛋白；
优选地，所述表达载体包括pcDNATM3.1-TOPO表达载体；
优选地，使用FreeStyleTM MAX试剂将所述表达载体转染至宿主细胞中
优选地，所述制备方法还包括单克隆稳定表达所述HA-Fc融合蛋白的宿主细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含上述HA-Fc融合蛋白、上述基因和上述生物材料中的至少一种。
优选地，所述疫苗包含上述HA-Fc融合蛋白和任选的辅料；
优选地，所述禽流感HA片段由含有如SEQ ID NO.1所示序列的基因编码；
优选地，所述Fc区域为猪源IgM的Fc区域或人源IgG的Fc区域；
优选地，所述猪源IgM的Fc区域由含有如SEQ ID NO.2所示序列的基因编码；
优选地，所述人源IgG的Fc区域由含有如SEQ ID NO.3所示序列的基因编码；
优选地，所述辅料包括疫苗佐剂；
优选地，所述疫苗佐剂包括Montanide ISA 50V2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的HA-Fc融合蛋白中含有禽流感病毒中的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)的片段，作为HA-Fc融合蛋白的主要免疫原。HA含有中和抗体所识别的关键抗原决定簇，是中和抗体的主要目标。HA-Fc融合蛋白中抗体的Fc区域用于提高HA-Fc融合蛋白的免疫原性。本发明提供的HA-Fc融合蛋白由CHO细胞表达系统表达，CHO细胞表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子。本发明提供的HA-Fc融合蛋白具有较高的禽流感抗原的免疫原性。
以HA-Fc融合蛋白、编码其的基因和与HA-Fc融合蛋白相关的生物材料中的一种或多种作为活性成分的疫苗具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较的抗体滴度，使动物获得较好的保护效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中酶切鉴定的实验结果；
图2为本发明实施例2中pcDNATM3.1-HA-Fc的质粒图谱；
图3为本发明实施例3中免疫印迹的实验结果；
图4为本发明效果例中IFA检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种含禽流感HA的HA-Fc融合蛋白，所述HA-Fc融合蛋白中，禽流感HA片段的C段连接有抗体的Fc区域，所述HA-Fc融合蛋白由CHO细胞表达。
本发明提供的HA-Fc融合蛋白中含有禽流感病毒中的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)的片段，作为HA-Fc融合蛋白的主要免疫原。HA是构成病毒囊膜纤突的主要成分，属于Ⅰ型糖蛋白，具有受体结合和膜融合的功能。HA含有中和抗体所识别的关键抗原决定簇，是中和抗体的主要目标。编码所述禽流感HA片段的基因优选经偏嗜性密码子优化，以将异源的免疫原基因的密码子优化为接种动物偏嗜使用的密码子，以提高抗原的表达效率。在一些优选的实施方式中，所述禽流感HA片段由含有如SEQ ID NO.1所示序列的基因编码。
本发明提供的HA-Fc融合蛋白中，HA片段融合的抗体的Fc区域用于提高HA-Fc融合蛋白的免疫原性。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。抗体的Fc(crystalline fragment，Fc)区域，是抗体分子发挥效应作用的主要部位，是Fc受体识别的主要区域。Fc区域可以与Fc受体结合，激活机体的免疫反应，可以提高禽流感HA片段的免疫原性，增强免疫效果。禽流感HA片段的C段优选连接有Fc区域的完整结构域，使其构象更加趋近于天然抗体结构类型，有利于空间折叠效应，从而使Fc受体更容易识别Fc区域，从而提高HA-Fc融合蛋白的免疫原性。本发明不限制Fc片段的抗体类型，Fc片段的抗体类型包括但不限于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或IgY等；本发明不限制Fc片段的物种来源，物种来源包括但不限于人、牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭或鹅。优选地，抗体的Fc区域为猪源IgM的Fc区域，其中猪源IgM的Fc区域优选由含有如SEQ ID NO.2所示序列的基因编码。优选地，抗体的Fc区域为人源IgG的Fc区域，其中人源IgG的Fc区域优选由含有如SEQ ID NO.3所示序列的基因编码。
本发明中，禽流感HA片段的C段连接抗体的Fc区域，可以为直接将禽流感HA片段和抗体的Fc区域连接，也可以为在禽流感HA片段和抗体的Fc区域之间间隔一个或几个氨基酸残基，或间隔多肽片段。在一些优选的实施方式中禽流感HA片段和抗体的Fc区域通过连接肽连接，以提高HA-Fc融合蛋白的折叠及稳定性、表达量和生物活性。
为了方便后续蛋白的分离、纯化和鉴定，所述HA-Fc融合蛋白的N端和/或C端还可以设置有标签，标签可选择本领域的常规标签，包括但不限于His标签、Flag标签、NusA标签、SUMO标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。可选的，可以在HA-Fc融合蛋白的N端或C端择一设置标签，例如在N端设置Flag标签；可选地，在C端设置SUMO标签；也可以在N端和C端同时设置标签，可选的，在N端设置His标签，在C端设置GST标签。在一些优选的实施方式中，在HA-Fc融合蛋白的N设置有His标签，以方便后续使用镍柱纯化HA-Fc融合蛋白，同时由于His标签较小，对HA-Fc融合蛋白本身的理化性质影响较小。
本发明提供的HA-Fc融合蛋白由CHO细胞表达系统表达。CHO细胞表达系统(Chinese hamster ovary cell system，CHO)是目前重组蛋白生产的首选系统。因为它具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子，并且能够分泌表达等优点。此外，相对于其他哺乳动物细胞表达体系，CHO细胞的转染机制更为明确，可以高效的稳定转染；可以在染色体活跃位点整合较长的DNA片段，同时还具有长而稳定的基因表达期。因此用CHO表达系统制备出的HA-Fc融合蛋白，有助于产品的商业竞争和广泛使用。HA-Fc融合蛋白更优选使用CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢悬浮传代细胞)表达。使用悬浮的CHO细胞表达蛋白时，细胞的比表面积更高，生物反应器中的传质、传热效率更高，同时也可以提高生物反应器空间使用效率。
根据本发明的另一个发明，本发明还提供了编码上述HA-Fc融合蛋白的基因，以及和HA-Fc融合蛋白相关的生物材料。所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种。其中表达盒指的是包含调控原件和至少编码上述HA-Fc融合蛋白的基因的核酸构建体，调控原件的实例有启动子、终止子、核糖体结合位点和转录因子结合位点等调控原件。载体指的是含有编码HA-Fc融合蛋白的基因，并且能够使其在宿主中行使复制、转录或翻译功能，或者将编码HA-Fc融合蛋白的基因整合至宿主细胞中的质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组等。重组微生物和细胞系指是能够复制和/或表达编码HA-Fc融合蛋白的基因的微生物和细胞系。
可选地，所述生物材料是含有编码HA-Fc融合蛋白的表达盒；可选地，所述生物材料是含有编码HA-Fc融合蛋白基因的质粒，该质粒能够在宿主复制，以增加基因的拷贝量；可选地，所述生物材料是含有编码HA-Fc融合蛋白基因的质粒，该质粒能够在宿主中表达HA-Fc融合蛋白；可选地，所述生物材料是重组微生物，例如大肠杆菌，该大肠杆菌转化有包含上述编码HA-Fc融合蛋白基因的质粒，这些质粒能够在大肠杆菌中克隆，以增加质粒以及所述基因的拷贝量；可选地，所述生物材料是表达HA-Fc融合蛋白的CHO-S细胞系。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述HA-Fc融合蛋白的制备方法，包括将编码所述HA-Fc融合蛋白的基因在宿主细胞中表达，所述宿主细胞包括CHO细胞系。利用CHO表达系统，具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化等优点。其中CHO细胞系优选使用CHO-S细胞系。
在一些可选的实施方式中，按照如下步骤制备HA-Fc融合蛋白：
(1)将禽流感HA基因与抗体Fc结构域通过偏嗜性密码子优化后，人工合成编码HA-Fc融合蛋白的基因。
(2)将人工合成的HA-Fc融合蛋白基因插入真核表达载体pcDNATM3.1-TOPO中，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，获得pcDNA3.1-HA-Fc质粒。
载体pcDNATM3.1-TOPO为双顺反子克隆载体，可用于大部分哺乳动物细胞中，使重组蛋白达到非常高的表达水平。目的基因插入在TOPO克隆位点处，上游有CMV启动子促进目的基因转录，下游有TKpA终止子。该载体含有两个抗性标记基因，分别是用于筛选大肠杆菌阳性转化株的氨苄抗性基因和用于筛选稳定转染CHO-S细胞的细胞株的新霉素抗性基因。采用pcDNATM3.1-TOPO为双顺反子克隆载体，使得CHO-S细胞表达HA蛋白产量显著提高，降低了生产成本。
(3)pcDNA3.1-HA-Fc质粒，使用FreeStyleTM MAX Reagent转染至CHO-S细胞，命名为CHO-HA-Fc。通过CHO-S细胞瞬时表达，纯化获得含禽流感HA融合蛋白的细胞上清液，4℃保存备用。
FreeStyleTM MAX试剂，是一种新型阳离子脂质体转染试剂，通过表面的高正压电荷密度凝聚带负电的DNA分子，形成紧密的FreeStyleTM MAX-DNA复合物，并可黏附到带有负电荷的细胞表面残基，进入细胞，能够大幅提高转染效率。
在一些优选的实施方式中，按照如下步骤制备HA-Fc融合蛋白产量较高：
(1)将禽流感HA基因与抗体Fc结构域通过偏嗜性密码子优化后，人工合成编码该融合蛋白的基因。
(2)将人工合成的基因插入真核表达载体pcDNATM3.1-TOPO中，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，获得pcDNA3.1-HA-Fc质粒。
(3)将pcDNA3.1-HA质粒，使用FreeStyleTM MAX Reagent转染至CHO-S细胞，命名为CHO-HA-Fc。该步骤具体的优选按照如下方法实施：采用HyClone的无血清培养基Hycell培养CHO-S细胞，使其密度达到1.5×106活细胞/mL，按V转染试剂(FreeStyleTM MAX)/M质粒为1:1，采用50mL TPP管在振荡摇床培养箱中培养(37℃，8％CO2，125rpm)，培养96h，取培养液上清用检测目的蛋白表达量。
(4)将筛选稳定转染CHO-S细胞的细胞株经单细胞克隆技术，获得高表达的融合蛋白。单细胞克隆指的是分离单个细胞，其增殖产生的后代都是来源于同一个细胞，即为单细胞克隆。对筛选出的稳定转染CHO-S细胞的细胞株进行单克隆能够获得高产HA-Fc融合蛋白的细胞株。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含上述HA-Fc融合蛋白、上述基因和上述生物材料中的至少一种。可选地，所述疫苗为DNA疫苗，包含上述基因或含有上述基因的载体；可选地，所述疫苗为亚单位疫苗，包含上述HA-Fc融合蛋白；可选地，所述疫苗包含多价型疫苗，包含多种血清型的HA-Fc融合蛋白；可选地，所述疫苗包括多联疫苗，含有上述HA-Fc融合蛋白外，还可以含有其他致病性微生物的抗原等。
在一些优选的实施方式中，所述疫苗以上述HA-Fc融合蛋白作为主要活性成分。HA-Fc融合蛋白中禽流感HA片段优选由含有如SEQ ID NO.1所示序列的基因编码。抗体的Fc区域优选为猪源IgM的Fc区域或人源IgG的Fc区域。其中猪源IgM的Fc区域优选由含有如SEQID NO.2所示序列的基因编码，人源IgG的Fc区域优选由含有如SEQ ID NO.3所示序列的基因编码。
本发明提供的疫苗中还可以包含本领域任选的常规辅料，“任选的”指的是所述疫苗中可以含有辅料，也可以不含有辅料；其中辅料优选含有疫苗佐剂，疫苗佐剂能够非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答，诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高疫苗的免疫原性。在一些优选的实施方式中，所述疫苗佐剂包括Montanide ISA 50V2。Montanide ISA 50V2是一种基于矿物油设计的佐剂，被开发以1∶1的体积比用于稳定的油包水乳剂的生产。通过诱导强而持久的免疫应答提高疫苗的效力。它包含高级的注射用矿物油和植物来源的甘露醇和油酸高度精炼的乳化剂。
下面结合优选实施了进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
禽流感HA-Fc基因合成：
根据登录GenBank获得禽流感HA基因，基因序列来源于GenBank:ABW90137.1，经偏嗜性密码子优化后，HA基因序列如SEQ ID NO.1所示。猪源IgM的Fc区域的序列如SEQ IDNO.2所示、人源IgG的Fc区域的序列如SEQ ID NO.3所示。将HA基因分别与猪源IgM的Fc区域和人源IgG的Fc区域拼接；在N端加入6个组氨酸的His标签，在基因两端插入酶切位点HindIII和BamHI，送往合成公司进行基因合成。
实施例2
pcDNATM3.1-HA-Fc质粒构建
1.连接反应：回收PCR产物与pcDNA3.1的连接，连接体系(10μL/管)如下：pcDNA3.1载体1μL、回收酶切产物2μL、ddH2O 2μL、Solution I 5μL、16℃连接仪上连接过夜。
2.大肠杆菌感受态细胞的制备：从培养皿上挑取单个菌落接种于含有10mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜培养。取100μL菌液转接到一个含有10mL液体LB培养基的离心管中，37℃震荡培养2h；将菌液分装到1.5mL离心管中，冰浴20min；4℃4000rpm离心5min，弃上清；加入1/5体积(200μL)预冷的CaCl2缓冲液，轻轻悬浮细胞；4℃4000rpm离心5min，弃上清；加入1mL预冷的CaCl2轻轻悬浮细胞，放置于冰上30min；4℃3000rpm离心5min，弃上清；加入预冷的CaCl2悬浮，置于-70℃保存备用，即为感受态细胞。
3.转化：将连接产物全部转入100μL感受态菌中，用枪尖轻轻混匀。冰浴30min后，42℃水浴热休克90s，然后快速将其放入冰浴5min；加入800μL LB培养基液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h；取出300μL将其涂于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体平板，37℃培养过夜。
4.阳性克隆筛选以及重组质粒的抽提：从平板上随机挑取单个白色菌落，分别接种到2mL LB(含Amp)中培养约12h。按照OMEGA质粒小量提取试剂盒说明要求提取重组质粒。
5.重组质粒的酶切鉴定：将上述提取的重组质粒37℃酶切过夜，酶切鉴定的体系为：10×H buffer 2μL、重组质粒3μL、HindIII和BamHI各1μL、ddH2O 11μL、0.1％BSA 2μL。反应结束后取5μL酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果，酶切鉴定结果如图1所示。将酶切鉴定为阳性的重组质粒命名为：pcDNATM3.1-HA-Fc，pcDNATM3.1-HA-Fc图谱如图2所示。
6.重组质粒的DNA序列测定与分析：将阳性重组质粒pcDNATM3.1-HA送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。
实施例3
CHO表达系统制备HA-Fc融合蛋白
1.细胞培养
CHO-S细胞，培养条件为37℃，5％CO2，125rpm，培养基(Hycell+8mM GlutaMAX)购自HyClone公司。FreeStyleTM MAX试剂购自Invitrogen公司。CHO-S细胞密度和活力采用台盼蓝染色计数和观察。CHO-S细胞悬浮培养，细胞密度1.5×106/mL，细胞活力≧90％时进行转染。于振荡摇床培养箱中培养，培养参数：37℃，5％CO2，125rpm。
2.质粒大提：通过PureLinkTM Hipure Plasmid Maxiprep Kit大提质粒(无内毒素)试剂盒说明书要求提取重组质粒，用于转染。
3.转染：将pcDNATM3.1-HA-Fc质粒，使用FreeStyleTM MAX Reagent转染至CHO-S细胞，14天收取细胞上清即为所需抗原。
4.纯化：表达的蛋白样品(8000×g，10min，4℃)，使用Ni+亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符。HA-Fc融合蛋白含量为1mg/mL，纯化样品于-80℃冻存。
5.SDS-PAGE和免疫印迹鉴定：
蛋白质凝胶电泳：SDS-PAGE胶为上层5％浓缩胶和下层10％分离胶，以100V电压、400mA条件电泳10min，然后以150V电压、400mA电泳1h。
免疫印迹：将样品经SDS-PAGE凝胶分离后在转膜缓冲液中转至PDVF膜中，转膜条件为100V电压、400mA电流1h，PDVF膜经封闭和孵育HA蛋白的单克隆抗体作用4h后，加入HRP标记羊抗鼠二抗稀释液，室温孵育2h，经PBST清洗三次，每次10min，最后利用DAB显色液进行显色检测，免疫印记结果如图3所示，图三中泳道M为Protein Marker，泳道1为HA-Fc(IgG)，泳道2为HA-Fc(IgM)。
实施例4
将实施例3制备得到的HA-Fc(IgG)和HA-Fc(IgM)分别使用PBS溶液稀释，将稀释后的蛋白溶液与Montanide ISA 50V2佐剂按1：1混合后，以8000r/min的转速搅拌10min，充分振荡混匀后获得稳定的乳剂，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
效果例
1.动物实验：筛选AIV抗原和抗体阴性的小鼠，隔离饲养观察3日。选择实施例3制备的亚单位疫苗，按照分组进行免疫，分组见表1。
表1
Figure GDA0003011993340000131
免后采血检测，评估抗体水平变化规律，首免后14日，进行二次免疫。首免后28日采血，分离血清，应用北京义翘神州科技有限公司的ELISA诊断试剂盒进行检测(Cat:KIT11048)。应用IFA检测技术进行HA抗体检测。
2.实验结果
2.1IFA检测结果：应用间接免疫荧光试验检测可知，各免疫组抗体水平均转阳，CHO-HA疫苗免疫组HA抗体平均效价均不低于1:1024；与参考疫苗组抗体水平差异不显著；对照组没有抗体产生。说明表达的HA-Fc融合蛋白具有良好的免疫原性，能够产生针对HA的特异性抗体，见图4和表2，图4中a为免疫组，b为对照组。
表2禽流感HA亚单位疫苗组合物免后28日IFA检测结果
Figure GDA0003011993340000132
Figure GDA0003011993340000141
2.2ELISA检测结果：应用北京义翘神州科技有限公司的ELISA诊断试剂盒进行检测(Cat:KIT11048)。疫苗免疫后28日，免疫组所有鼠抗体水平均转阳，S/P值均不低于1.5；参考疫苗组和对照组均没有相应抗体产生。结果见表3。
表3禽流感HA亚单位疫苗组合物免后28日ELISA抗体检测
Figure GDA0003011993340000142
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物(上海)有限公司
天康生物股份有限公司
<120> HA-Fc融合蛋白及其制备方法和疫苗
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1695
<212> DNA
<213> 禽流感病毒(Influenza A virus)
<400> 1
atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60
attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120
actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta 180
gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac 240
ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300
ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420
catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgcccatacc agggaaagac ctcctttttc 480
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600
gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660
ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720
aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900
ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa 960
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaacgagag 1020
acgcgaggat tatttggagc tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta 1080
gatggttggt atgggtacca ccatagcaat gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa 1140
gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc accaataagg tcaactcgat cattgacaaa 1200
atgaacactc agtttgaggc cgttggaagg gaatttaaca acttagaaag gagaatagag 1260
aatttaaaca agaagatgga agacgggttc ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt 1320
ctggttctca tggaaaatga gagaactcta gactttcatg actcaaatgt caagaacctt 1380
tacgacaagg tccgactaca gcttagggat aatgcaaagg agctgggtaa cggttgtttc 1440
gagttctatc ataaatgtga taatgaatgt atggaaagtg taagaaatgg aacgtatgac 1500
tacccgcagt attcagaaga agcgagacta aaaagagagg aaataagtgg agtaaaattg 1560
gaatcaatag gaatttacca aatactgtca atttattcta cagtggcgag ttccctagca 1620
ctggcaatca tggtagctgg tctatcctta tggatgtgct ccaatggatc gttacaatgc 1680
agaatttgca tttaa 1695
<210> 2
<211> 1453
<212> DNA
<213> 猪（swine）
<400> 2
gggagtgcat ccgccccaac ccttttcccc ctcgtctcct gtgagaattc cccgtcggat 60
acgagcagcg tggccgttgg ctgcctcgca caggacttcc ttcccgactc catcactttc 120
tcctggaaat acaagaacaa ctctgacatc agcagcaccc ggggcttccc atcagtcctg 180
agagggggca agtacgcagc cacctcacag gtgctgctgc cttccaagga cgtcatgcag 240
ggcacagacg aacacgtggt gtgcaaagtc cagcacccca acggcaacaa agaaaagaac 300
gtgcctcttc cagtgattgc cgagctgcct cccaaagtga gcgtcttcgt cccaccccgc 360
gacggcttct tcggcaaccc ccgcaagtcc aagctcatct gccaggccac gggtttcagt 420
ccccggcaga ttcaggtgtc ctggctgcgc gaggggaagc aggtggggtc tggcgtcacc 480
acggaccagg tgcaggctga ggccaaagag tctgggccca cgacctacaa ggtgaccagc 540
acactgacca tcaaagagag cgactggctc agccagagca tgttcacctg ccgcgtggat 600
cacaggggcc tgaccttcca gcagaatgcg tcctccatgt gtgtccccga tcaagacaca 660
gccatccggg tcttcgccat ccccccatcc tttgccagca tcttcctcac caagtccacc 720
aagttgacct gcctggtcac agacctgacc acctatgaca gcgtgaccat ctcctggacc 780
cgccagaatg gcgaagctgt gaaaacccac accaacatct ccgagagcca ccccaatgcc 840
actttcagcg ccgtgggtga ggccagcatc tgcgaggatg actggaattc cggggagagg 900
ttcacgtgca ccgtgaccca cacagacctg ccctcgccac tgaagcagac catctcccgg 960
cccaaggggg tggccctgca caggcccgat gtctacttgc tgccaccagc ccgggagcag 1020
ctgaacctgc gggagtcggc caccatcacg tgcctggtga cgggcttctc tcccgcggac 1080
gtcttcgtgc agtggatgca gagggggcag cccttgtccc cggagaagta tgtgaccagc 1140
gccccaatgc ctgagcccca ggccccaggc cggtacttcg cccacagcat cctgaccgtg 1200
tccgaagagg aatggaacac gggggagacc tacacctgcg tggtggccca tgaggccctg 1260
cccaacaggg tcaccgagag gaccgtggac aagtccaccg gtaaacccac cctgtacaac 1320
gtgtccctgg tcatgtccga cacagctggc acctgctact gaccctgctg gcctgcccac 1380
aggctcgggg cggctggccg ctctgtgtgt gcatgcaaac taacccgtgt caacggggtg 1440
agatgttgca tct 1453
<210> 3
<211> 987
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcagcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcgccctgtc cagtggcgtg cataccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag catggtgacc gtgccggcca gcagcctgtc cagcaagagc 240
tacacctgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacaagcg tgttggaaca 300
aagaccaaac caccatgtcc catatgccca gcctgtgaat caccagggcc ctcggtcttc 360
atcttccctc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacacccca ggtcacgtgc 420
gtggtggttg atgtgagcca ggagaacccg gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480
gtagaggtgc acacggccca gacgaggcca aaggaggagc agttcaacag cacctaccgc 540
gtggtcagcg tcctacccat ccagcaccag gactggctga acgggaagga gttcaagtgc 600
aaggtcaaca acaaagacct cccagccccc atcacaagga tcatctccaa ggccaaaggg 660
cagacccggg agccgcaggt gtacaccctg cccccacacg ccgaggagct gtccaggagc 720
aaagtcagca taacctgcct ggtcattggc ttctacccac ctgacatcga tgtcgagtgg 780
caaagaaacg gacagccgga gccagagggc aattaccgca ccaccccgcc ccagcaggac 840
gtggacggga cctacttcct gtacagcaag ttctcggtgg acaaggccag ctggcagggt 900
ggaggcatat tccagtgtgc ggtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 960
tctatctcca agactccggg taaatga 987
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtgggggcg gaagcggggg aggtggatct ggtgggggcg gaagcggggg aggtggatct 60

Claims (13)

1.一种HA-Fc融合蛋白，由禽流感HA片段和抗体的Fc区域组成，禽流感HA片段的C端和所述抗体的Fc区域通过连接肽连接，所述HA-Fc融合蛋白由CHO细胞表达系统表达；
所述禽流感HA片段由如SEQ ID NO.1所示序列的基因编码；
所述抗体的Fc区域是猪源IgM或人源IgG的Fc区域的完整结构域；
所述猪源IgM的Fc区域由如SEQ ID NO.2所示序列的基因编码；
所述人源IgG的Fc区域由如SEQ ID NO.3所示序列的基因编码；
编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示序列；
所述HA-Fc融合蛋白的N端设置有His标签。
2.编码权利要求1所述HA-Fc融合蛋白的基因。
3.生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达权利要求1所述HA-Fc融合蛋白，或含有权利要求2所述的基因。
4.权利要求1所述的HA-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，将编码所述HA-Fc融合蛋白的基因在宿主细胞中表达，所述宿主细胞包括CHO细胞系。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞系包括CHO-S细胞系。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，提供含有表达所述HA-Fc融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，使宿主细胞表达HA-Fc融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体包括pcDNA™3.1-TOPO表达载体。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，使用FreeStyle™ MAX试剂将所述表达载体转染至宿主细胞中。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括单克隆稳定表达所述HA-Fc融合蛋白的宿主细胞。
10.疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的HA-Fc融合蛋白。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1所述的HA-Fc融合蛋白和任选的辅料。
12.根据权利要求11所述的疫苗，其特征在于，所述辅料包括疫苗佐剂。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂包括Montanide ISA50V2。
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