CN103031310A - 在植物中表达蛋白质 - Google Patents

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Abstract

在植物中表达蛋白质本发明涉及在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤：将流感H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，用所述载体侵入植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，以瞬时表达所述流感病毒H5多肽和/或产生转基因植物；和回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。本发明还涉及在所述方法中使用的或者作为所述方法的结果产生的载体、转基因植物或其部分和这样的植物的子代。

Description

在植物中表达蛋白质
本发明是国际申请号PCT/ZA2006/000063，国际申请日为2006年5月2日，进入中国国家阶段日期为2007年10月26日，中国国家申请号为200680014202.5，发明名称为“在植物中表达蛋白质”的分案申请。
发明背景
本发明涉及在植物中表达蛋白。特别地，本发明涉及转基因蛋白表达和高产量蛋白生产的细胞内定位的方法。本发明还涉及在植物中生产人乳头瘤病毒(HPV)蛋白和/或流感病毒H5蛋白。本发明还涉及评估蛋白在植物内表达的快速机制。
应用转基因植物进行异源蛋白的大规模生产正逐渐获得广泛的接受，并且可能成为疫苗蛋白节约成本生产的平台。产生转基因植物研究一大类蛋白和/或表达载体的表达特征并不总是可行的，原因在于这一程序费时的本质。相反，瞬时表达系统能够快速评估各种不同的蛋白在各种植物物种中的蛋白表达。
关于应用转基因植物进行大规模蛋白生产的另一个问题通常是生产的异源蛋白的令人失望的低水平。植物质体，特别是叶绿体，已经成功地被表达异源蛋白的重组载体转化，以显著地增加植物中由每份总可溶蛋白所产生的蛋白水平(参见，例如，WO2005/011367和WO2004/005467A2)。质体还能够输入各种分子，包括蛋白。存在不同的方法，通过这些方法发生分子输入，一个这样的方法涉及与质体的类囊体膜相互作用。异源蛋白靶向质体是一种显著增加蛋白在植物细胞内的积聚的机制。
许多年来一直应用农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移来产生稳定的转化植物。这种方法包括将T-复合物(一种由农杆菌T-DNA和毒力基因产物形成的复合物)从农杆菌菌株转移到植物细胞(Zupan等.，2000)。将位于限定单链T-DNA的25bp同向重复序列(左和右边界)之间的任何DNA转运到植物细胞核中(Zupan等.，2000)，在这里它通过不正常重组而整合到植物染色体上(Somers和Makarevitch，2004)。在所述核内存在的许多T-DNA拷贝没有结合，但是得到转录，这引起瞬时表达。瞬时表达不受位置效应的影响，并且可以产生比稳定转化显著更高的外源蛋白水平(Kapila等.，1997)。
通常应用两种农杆菌侵入(农杆菌侵入法)方法：注射和真空侵入。农杆菌注射包括直接注射到叶片的远轴气室，而叶片仍然附着在植物上(Voinnet等.，2003)。在真空侵入过程中，对农杆菌混悬液应用真空，叶片浸没在所述混悬液中(Kapila等.，1997)。尽管通常只在少数叶片上进行，但是这一技术可以规模化：Medicago Inc.(Quebec，Canada)的研究者每周能够进行农杆菌侵入多达7500片苜蓿叶片，并且Stefan Schillberg及同事(Institute for Molecular Biotechnology，RWTH Aachen，Germany)已经进行了农杆菌侵入了多达100kg的烟草叶片(Twyman 2004)。
农杆菌介导的瞬时表达在侵入后60到72小时达到最大，然后由于转录后基因沉默(PTGS)而迅速下降(Voinnet等.，2003)。PTGS或RNA干扰是一种适应性抗病毒抵御反应，其限制病毒在植物中的复制和传播。这一过程包括在胞质中识别靶点RNA和起始序列-特异性RNA降解途径(Voinnet，2001)。某些植物病毒编码具有抑制PTGS能力的沉默阻抑制子。这些沉默抑制蛋白中的一些，诸如番茄斑萎病毒(TSWV)的NSs(Takeda等，2002)，和番茄丛矮病毒的p19(Voinnet等.，2003)已经用来延长和扩增农杆菌介导的瞬时表达，其通过包含沉默抑制基因的农杆菌的共同侵入而进行。
对于将商购蛋白在植物中的表达优化以达到使植物成为可行平台的水平存在需求。具体地，存在对于在植物中生产HPV蛋白和/或流感病毒H5蛋白的方法的需求。
还存在对载体、转基因植物或其部分和这样的植物的子代的需求以实现如前文所述的需要。
发明概述
按照本发明的第一方面，提供一种在植物中生产HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其包括步骤：
1.将HPV基因和/或流感病毒H5基因或编码它们的功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的成分的载体中；
2.用所述载体侵入至少植物的部分，或者用所述载体转化植物组织，以瞬时表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和
3.回收由植物表达的HPV多肽和/或流感病毒H5多肽。
术语‘植物’意欲包括缺少专门的感觉器官和自主运动能力的所有生命有机体。同样地，所述定义包括单子叶植物和双子叶植物以及所有的光合生物。
术语‘HPV多肽’意欲包括HPV L1蛋白；与另一HPV抗原肽融合的嵌合HPV L1肽；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源肽融合的嵌合HPV L1肽以及HPVL2蛋白或它们的功能等价物。已作必要的修正，同样的意思适用于术语‘HPV基因’。
术语‘植物成分’意欲包括质体、内质网、细胞质和质外体。优选地所述植物成分是质体。
靶向意指载体中可以包含靶向序列。这样的靶向序列可被翻译成肽，所述肽将载体或其产物导向植物中需要的成分，诸如质体。
按照本发明的载体优选地包括可操作性地连接到编码序列上的启动子和其它必需调节子，诸如终止子等。
应该理解用载体侵入植物的至少一部分可以引起蛋白的瞬时表达，并且用载体转化植物组织以产生转基因植物可以引起蛋白的转基因表达，意欲这两种形式的表达都属于本申请的范围。
在本说明书中，提及蛋白、肽或基因或它们的功能等价物包括提及其变体，所述变体能够很大程度上行使与蛋白、肽、多肽或基因相同的功能。优选地，本发明涉及HPV-16L1蛋白的生产；与另一HPV抗原肽融合的嵌合HPV L1肽；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源肽融合的嵌合HPV L1肽；HPV L2蛋白；或流感病毒H5蛋白。
优选地，所述载体是二元载体，更优选地为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)二元载体。
所述载体可以适于靶向质体，其通过使得所表达的多肽包括能够与质体的类囊体膜特别是类囊体膜的转运结构相互作用的部分而进行。这一相互作用可以使得多肽从其所表达的细胞质输入到质体中。输入到细胞质的机制对于蛋白的正确折叠可能是重要的。
然而，应该理解所述载体可以适于靶向要转化的质体本身，并且多肽的表达可以完全在质体内发生。
不希望受到理论局限，本申请人认为进入到质体的多肽以其一级结构进入，并且在质体内进行折叠成其二级和三级结构，即，远离细胞的细胞质。同样地，本申请人认为通过载体表达多肽可以发生在质体内，然后在其中它采用其二级和三级结构是发明原理的合理外延。换句话说，本申请人认为发明原理延伸到质体的转化。在这样的条件下，蛋白的表达完全发生在质体内，并且不与细胞的细胞质接触。
优选地，所述HPV L1基因；与另一HPV抗原基因融合的嵌合的HPVL1基因；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源基因融合的嵌合HPV L1基因；HPV L2基因；或流感病毒H5基因是优化的基因，例如，人密码子优化的，BCG密码子优化的或植物密码子优化的。HPV L1基因或HPV L1嵌合体的基因还可以以另一种方式修饰，例如，核定位信号缺失。
按照本发明的方法还可以包括用抑制蛋白共同侵入植物的步骤，所述抑制蛋白适于抑制植物中的转录后基因沉默。优选地所述抑制蛋白是番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的p19。最优选地所述抑制蛋白是NSs。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述质体选自叶绿体、色质体和白色体。所述质体优选地是叶绿体。
侵入可以通过直接注射或通过真空进行。按照本发明的一个方面，完整植物可以进行真空侵入。在本说明书中，‘完整植物’应该认为包括这样的植物，即，去除根的植物以及部分落叶的植物和很大程度上完整的植物。提及植物应该包括提及植物部分，其包括但不限于种子、叶片、根、茎、花、果实、胚、分生组织、下胚轴、上胚轴、子叶、花粉和组织。
在按照本发明的方法中，植物的侵入和转化可以用被转化接受了所述载体的根癌农杆菌来完成。
植物还可以选自Nicotiana benthamiana和烟草(N.tabacum)。然而，应该理解支持瞬时蛋白表达或者被转基因的任何植物应该都适用于本发明的目的。
侵入优选地在植物叶片上进行。直接注射侵入优选地在叶片的远轴区域进行。
按照本发明的第二方面，提供在植物中生产HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其中基本上通过真空侵入方法用适当的载体侵入完整的植物。
按照本发明的第三方面，提供HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，其按照上述方法随时产生。
按照本发明的第四方面，提供其中已经克隆了HPV基因和/或流感病毒H5基因的载体的应用，所述载体适于靶向植物中存在的成分，以产生能够表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的转基因植物。
按照本发明的第五方面，提供其中已经克隆了HPV基因和/或流感病毒H5基因的载体，所述载体适于靶向植物中存在的成分，以产生能够表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的转基因植物。
按照本发明的第六方面，提供预防性或治疗性疫苗，其由能够在适当宿主内诱导免疫原性反应的由上文所述的方法随时产生的HPV多肽或流感病毒H5多肽组成。
按照本发明的第七方面，提供一种转基因植物，其部分或其子代，其包含能够表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的细胞。
在本发明的这些后续方面中，已经做了必要的修正，应用第一方面的选择和优选。
对于将商购蛋白在植物中的表达优化以达到使植物成为可行平台的水平存在需求。一个实例是生产HPV L1主要衣壳蛋白，作为用于人疫苗或试剂目的的病毒壳粒和/或作为病毒样颗粒(VLPs)。
通过按照本发明的教导，通过农杆菌侵入法进行瞬时表达可以比较许多抗原性蛋白的表达，以及植物细胞区室靶向蛋白的效果。所述方法包括通过直接注射或者通过在浸没或浸泡在农杆菌培养物中的叶片上产生真空，而将携带表达载体的根癌农杆菌重组子侵入到植物中。
人密码子优化的或BCG密码子优化的HPV L1以比其它L1序列显著更高的水平进行表达，并且人密码子优化作用还导致流感H5蛋白的高表达。叶绿体靶向导致比细胞质或内质网(ER)-靶向显著更高的积聚。HPV L1完整植物提取物的电子显微镜检揭示L1在植物中组装成病毒样颗粒(VLPs)。产生的蛋白还与适当的HPV L1-特异性单克隆抗体(MAbs)反应，所述单克隆抗体识别构象-特异的表位。
通过在植物中瞬时表达获得的L1在小鼠中诱导了高水平的L1-特异性抗体，并且发现在体外中和检测中这些抗体被中和。
在植物叶绿体中促进高瞬时L1表达的表达载体用来产生转基因植物，所示转基因植物还表达如上文所述的高水平的其它多肽。
农杆菌真空侵入典型地包括从茎上去除的叶片的侵入。本发明描述了完整植物或完整的无根植物的新型真空侵入。具有小根系的完整植物可以从土壤中移出，被侵入并且重新植入，而不丧失活力。大根系可以移出，植物被侵入，然后重新植入种植泡沫中培养至少3天而不丧失活力。具有复杂根系的植物还可以水栽生长，这允许不移出根进行侵入。侵入方法之后，完整植物比松散叶片更容易培育，并且它们存活更长，因此增加外源基因的表达。侵入完整植物的优点在于可能通过瞬时表达将外源蛋白生产规模化到商业可行的水平。
本发明还教导了通过农杆菌侵入法或者在转基因植物中HPV L1蛋白靶向特定的植物细胞亚区室(ER和叶绿体)。与ER-靶向和细胞质积聚相比，叶绿体靶向显著增加了L1的积聚。叶绿体积聚可以通过细胞质中存在的蛋白酶而防止L1蛋白降解，和/或允许其积聚到更高的浓度，而并不影响植物细胞的功能。如上文所述，同样的考虑也适用于其它多肽。
实施例
现在将参考下述非限制性实施例对本发明进行描述。
实施例1
高水平表达HPV L1蛋白
表达构建体
3个农杆菌载体：pTRAc，pTRAkc-rbcs1-cTP和pTRAkc-ERH(图1)从Rainer Fischer(Fraunhofer Institute，Aachen，德国)获得。pTRAc载体由下列各项组成：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(P35SS)，重复转录增强子，查耳酮合酶5′未翻译区(CHS)和CaMV 35S多腺苷酸化信号(pA35S)用于外源基因表达；用于烟草RB7基因的2个支架附着区(SAR)；用于T-DNA整合的左和右边界；用于大肠杆菌(E.coli)和根癌农杆菌的复制起点；以及用于抗生素选择的bla基因。pTRAkc-rbcs1-cTP是pTRAc的衍生物，具有附加的rbcs-cTP序列(来自茄属(Solanum)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的叶绿体靶向信号)，与外源基因形成3′融合。pTRAkc-ERH也是pTRAc的衍生物，并且包括KDEL和his6序列，与外源基因形成5′融合。pTRAkc-rbcs1-cTP和pTRAkc-ERH载体还包括nptII基因，用于在植物中的卡那霉素抗性。
将4种HPV-16L1基因变体克隆到上文提及的农杆菌载体中：(1)南非分离体，SAL1(GenBank登记号AY177679)；(2)人密码子优化的L1(HL1，图2)；(3)植物密码子优化的L1(SYNL1，图3)，和(4)核定位信号缺陷，HL1的22个氨基酸平截物，HL1△C22。
为了促进定向克隆，通过PCR扩增将限制酶位点添加到L1基因的终点。SAL1用有义引物：5′-GGACGCGTTAGGTACATGTCTCTTTGGCTGCCT(SEQ.ID NO.1)和反义引物：5′-TCTAGACTCGAGTTACAGCTT ACGTTTTTTGCGTTT(SEQ.ID NO.2)进行扩增，用Afl III和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的相同位点，形成pTRA-SAL1；或者用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP的相同位点，形成pTRACTP-SAL1。SAL1也用上述有义引物和反义引物：5′-AGCGGCCGC CAGCTTACGTTTTTTGCG(SEQ.ID NO.3)进行扩增，用Afl III和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位点，形成pTRAERH-SAL1。
SYNL1用有义引物：5′-GGACGCGTGA GATTCATGAGCCTTTGGCTC CCT(SEQ.ID NO.4)和反义引物：5′-ATCTAGACTCGAGTTAGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT(SEQ.ID NO.5)进行扩增，用Bsp HI和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的Afl III和Xho I位点，形成pTRA-SYNL1；或者用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP的相同位点，形成pTRACTP-SYNL1。SYNL1还用上述有义引物和反义引物：5′-AGCGGCCGCGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT(SEQ.ID NO.6)进行扩增，用Bsp HI和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位点，形成pTRAERH-SYNL1。
HL1用有义引物：5′-GGACGCGTGAGGTTCATGAGCCTGTGGCTGCCC(SEQ.ID NO.7)和反义引物：5′-ATCTAGACTCGAGTCACAGCTTGCGCTTCT TCCG(SEQ.ID NO.8)进行扩增，用Bsp HI和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的Afl III和Xho I位点，形成pTRA-HL1；或者用MluI和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP的相同位点中，形成pTRACTP-HL1。HL1还用上述有义引物和反义引物：5′-AGCGGCCGCCAGCTTGCGCTTCTTCCGC(SEQ.ID NO.9)进行扩增，用Bsp HI和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位点，形成pTRAERH-HL1。
HL1△C22通过PCR扩增HL1形成，其使用上述有义引物和反义引物：5′TCTAGACTCG AGTCAGCCCA GGGTGAACTT AGG(SEQ.ID NO.10)进行，以促进在NLS之前终止(Zhou等.1991)。将PCR产物用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP的相同位点，形成pTRACTP-HL1△C22。
使用有义引物：5′GGACGCGTT A GGTCCATGGCTAGCAAAGGAGAAG(SEQ.ID NO.11)和反义引物：5′ATCTAGATTATTTGTAGAGCTCATCCATG(SEQ.ID NO.12)从pBSG1057(BiosourceTechnologies Inc，Vacaville，USA)扩增30B-GFPC3突变体(GeneBank登记号U62637)gfp基因，用Nco I和XbaI消化，并且克隆到pTRAc的相同位点，形成pTRA-GFP。
农杆菌转化
按照(Shen和Forde，1989)所述，将农杆菌GV3101::pMP90RK(从Rainer Fischer，fraunhofer Institute，Aachen获得)制成电感受态。将50-200ng上述HPV-16 L1/农杆菌载体与100μl电感受态细胞混合在0.1cm电隙杯(BioRad)中。将所述细胞在设定为1.8kV，25μF和200Ω的GenePulser(BioRad)中进行转化。
在涂布到含有50μg·ml-1羧苄西林，50μg·ml-1利福平和30·ml-1卡那霉素的LB上之前，将电穿孔的细胞在1ml LB中培养2小时。通过从重组农杆菌菌落分离质粒DNA，并且将质粒DNA重新转化到大肠杆菌DH5α细胞中，并且在100μg/ml氨苄青霉素上选择而验证阳性克隆。
表A.使用的农杆菌重组子的总结
Figure BDA00002464729400091
制备用于侵入的农杆菌
农杆菌LBA4404(pBIN-NSs)，含有TSWV的NSs沉默抑制基因，从Marcel Prins(Laboratory of Virology，Wageningen，The Netherlands)获得。将含有基于pTRAc的质粒pTRAkc-rbcs1-cTP和pTRAkc-ERH载体的农杆菌GV3101培养物补充50μg·ml-1羧苄西林和50μg·ml-1利福平。农杆菌LBA4404(pBIN-NSs)培养物补充50μg·ml-1利福平和30μg·ml-1卡那霉素。将农杆菌培养物在含有适当的抗生素的LB肉汤中在27℃摇动生长到对数期(OD600≈0.8)。细胞通过4000g离心进行收集，重悬在含有适当抗生素的诱导培养基(LB肉汤，pH 5.6，含有10mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸[MES]，20μM乙酰丁香酮，和2mM MgSO4)中，并且如上述生长。细胞通过离心收集，如上述，并且重悬在侵入培养基(10mM MgCl2，10mM MES，2％蔗糖和150μg·ml-1乙酰丁香酮，pH 5.6)中。对于真空侵入法，MgCl2被4g MS盐·1-1替代。将农杆菌混悬液在侵入培养基中稀释到OD600 1.0，并且在22℃保持2-3h。
农杆菌侵入
注射：将农杆菌-L1和农杆菌(pBIN-NSs)混悬液稀释，并且将两者在侵入培养基中组合，到最终OD600为0.25。当农杆菌(pTRA-GFP)与上述混悬液共侵入时，其在最终OD6000.0125使用。通过将农杆菌混悬液注射到叶片内面的远轴气室而侵入2-4周龄N.benthamiana植物的叶片。使用每种农杆菌混合物进行农杆菌侵入6片叶片(3株植物，2片叶片/株)。将植物在22℃，16h光照，8h黑暗条件下生长3-6天。
真空：将农杆菌(pTRA-HL1)和农杆菌(pBIN-NSs)在诱导培养基中生长过夜。将每种培养物的细胞组合并且重悬在1-8升侵入培养基中，到每种培养物最终OD600为0.25。将完整的N.benthamiana植物或完整的(去除根)的烟草(N.tabacum)L.cv.Petite Havana SR1植物浸没到农杆菌混悬液中，并且进行-90kPa的真空10min，偶尔搅动以释放截留的气泡。真空快速释放(～10kPa·秒-1)。将N.benthamiana植物重新植入土壤中。将烟草植物茎置于水饱和的植物泡沫中。将所述植物在22℃，16h光照，8h黑暗条件下生长3天。
蛋白提取和检测
从农杆菌侵入的叶片上收集叶片圆片(Eppendorf管帽)，并且在250μl高盐(0.5M NaCl)PBS/叶片圆片中碾磨。将提取物在台式离心机中以13000rpm离心5min，收集上层清液，并且重复进行离心。对真空侵入的烟草植物进行大量提取：将植物用韦林搅切器以2ml提取缓冲液(0.25M磷酸钠，0.1M焦亚硫酸钠，10mM EDTA，4％聚乙烯聚吡咯烷酮[PVPP]，pH 7.4)/g植物材料进行匀浆。将提取物通过2层粗棉布进行过滤，之后将滤液在10000g离心20min。将得到的上层清液在30000rpm超离心3h，并且将得到的沉淀重悬在PBS中，并且冷冻干燥以减小体积。使用Bradford检测(Sigma)确定总的可溶蛋白(TSP)浓度。
对于蛋白质印迹分析，将植物提取物在85℃在加样缓冲液中温育2min(Sambrook等，1989)，在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后通过半干电印迹法转移到硝化纤维素膜上。L1蛋白用H16:J4单克隆抗体(1∶3000)检测，然后使用山羊抗小鼠碱性磷酸酶缀合物(1∶10000；Sigma)检测。检测用NBT/BCIP试剂(Roche)进行。
L1蛋白通过捕获ELISA法从植物提取物中定量，所述捕获ELISA法由Studentsov等(2002)的聚乙烯醇(PVA)-封闭的ELISA方法改进而成。将96孔微量滴定平板用单克隆抗体H16.J4(结合线性HPV-16L1表位)或H16.V5(结合构象表位)在37℃包被1h，洗涤并且封闭。然后在37℃将植物提取物加入1h，之后进行洗涤步骤，并且在37℃加入兔抗HPV-16VLP多克隆血清(1∶1000)1h。这一血清用猪抗兔HRP缀合物(1∶5000；DAKO，Denmark)和1，2-苯二胺二盐酸盐(OPD；DAKO)底物进行检测。
GFP通过捕获ELISA进行检测。将植物提取物稀释在1％牛奶溶液中(
Figure BDA00002464729400111
奶粉在具有0.05％吐温20的PBS中[PBS-T])，并且在37℃在Reacti-Bind抗-GFP包被平板(Pierce)上温育1h。将平板用PBS-T洗涤4次，之后加入山羊抗-GFP HRP缀合物(1∶2000，在1％牛奶溶液中；Abcam)，将平板在37℃温育30min，然后用PBS-T洗涤4次。使用TMB底物(KPL)进行检测。
电镜术
将植物提取物用H16.V5抗体(1∶50)免疫捕捉到碳包被的铜载网上。所述载网用2％乙酸双氧铀染色，并且使用JEOL 200CX透射电子显微镜观察。
用植物提取物免疫小鼠和血清分析
将已经用农杆菌(pTRA-HL1)和农杆菌(pBIN-NSs)真空侵入的约350g烟草按上文所述进行提取，并且重悬在0.5μlPBS中。将BALB/c小鼠用100μl植物提取物(11μg L1)皮下免疫，加入弗氏不完全佐剂(4只小鼠)或者不加入弗氏不完全佐剂(5只小鼠)。对照组用10μg杆状病毒产生的VLPs免疫两次，或者用1μg杆状病毒产生的VLPs免疫一次。免疫后4周从眼静脉收集血清。
应用改进的PVA-封闭ELISA(Studentsov等，2002)来检测小鼠中针对L1的抗体。将微量滴定板用杆状病毒产生的HPV-16L1VLPs(2μg·ml-1)包被，在4℃用在PBS中的0.5％PVA封闭2h，然后用PBS洗涤6次。将血清连续稀释在0.5％PVA(1∶40-1∶40960)中，并且在37℃在平板上温育1hr。用PBS洗涤6次后，在37℃加入兔抗小鼠HRP缀合物(1∶2000；DAKO)30min。用OPD底物(DAKO)进行检测。
按照(Pastrana等.，2004)的方法进行HPV-16假病毒中和抗体检测。检测所需的质粒从John Schiller(Laboratory of Cellular Oncology，NationalCancer Institute，Bethesda，USA)获得。
植物转化和再生
将烟草(N.abacum)L.cv.Petite Havana SR1叶片切成±1cm2的片，在10％漂白液中灭菌并且在无菌水中润洗。将叶片圆片浸没在相关的重组子农杆菌培养物中，并且在共培养培养基(表2)上在持续光照下生长2天。然后将叶片圆片每两周置于新鲜的再生培养基(表2)上，直到出现小苗(4-6周)。将1.5-2cm的苗转移到生根培养基(表2)上。培育苗直到明显出现强壮的根生长，然后移植到土壤/蛭石混合物(2∶1)上，在移到直接光照之前用塑料袋覆盖，并且远离直接光照3天。使用Extract-N-Amp植物PCR试剂盒(Sigma)和L1-特异性引物通过PCR筛选转基因植物。
表B：用于烟草转化和再生的培养基。所有的培养基都包含具有维生素(Highveld Biological，South Africa)、1％蔗糖和0.8％琼脂的MS。
Figure BDA00002464729400131
证明侵入的注射方法对于快速比较许多农杆菌构建体是有用的，并且对于侵入培养物浓度的优化是有用的。在用携带人密码子优化的HPV-16L1基因(HL1)的农杆菌侵入后，N.benthamiana叶片样品的蛋白印迹分析(图4)表明55kDa L1单体的成功表达。6天后HL1从pTRA-HL1载体的表达(L1的细胞质定位)不可检测，除非发生农杆菌(pBIN-NSs)的共同侵入。另一方面，叶绿体靶向的HL1(pTRACTP-HL1载体)在无农杆菌(pBIN-NSs)情况下，产生可检测水平的HL1，其受到农杆菌(pBIN-NSs)共同侵入的增强。
上述结果由捕获ELISA(图5)证实。而且，由于用于这一捕获ELISA的H16.V5mAb对于由五聚体和VLPs形成的构象表位特异，所以ELISA确定L1组装到产生中和抗体所需的多聚体结构上。VLPs的形成由N.benthamiana叶片粗提物的电子显微镜检证实(图6)，其中所述N.benthamiana叶片用农杆菌GV3101(pTRACTP-HL1)侵入。
密码子优化和植物区室靶向显著影响L1积聚(图7)。SYNL1和SAL1在农杆菌侵入的叶片中积聚的水平通常是低的，或者不可检测的，然而，HL1积聚到高水平(多达～600mg L1/kg叶片材料；～17％TSP)。令人吃惊的是植物密码子优化的L1(SYNL1)以比天然L1(SAL1)更低的水平表达。L1靶向叶绿体比细胞质和ER靶向的L1显著增加了其积聚，并且可能是免受细胞质中存在的蛋白酶破坏的结果。当它靶向ER时，L1表达最低。农杆菌(pTRA-GFP)用来测量叶片之间的侵入效率偏差(发现这通常很小，在最大和最小有效侵入之间有14％的差异)。
我们证明通过真空侵入HPV-L1在N.benthamiana和N.tabacum L.cv.Petite Havana SR1中进行中等或可能的大规模表达的潜力。完整N.benthamiana植物的真空侵入易于在90-100％的叶片区域上发生，并且在70-90％烟草叶片区域上发生。通过完整植物的真空侵入，而不是如由Kapila等(1997)所述的松散叶片侵入，相对容易地将侵入放大到2kg烟草植物材料。
用烟草/HL1粗提取物单一免疫BALB/c小鼠诱导高HPV-16VLP-特异性抗体滴度(40960)(图8)，这等价于在小鼠中用10μg杆状病毒产生的VLPs免疫2次所激发的滴度。在植物提取物中加入弗氏不完全佐剂似乎没有提高针对HL1引发的体液应答，这表明在没有弗氏不完全佐剂的样品中共存的植物蛋白可能具有佐剂特性。使用上述小鼠血清进行了体外HPV-16假病毒中和检测(表3)。这一检测基于中和血清阻滞SEAP HPV-16假病毒进入细胞因此阻止SEAP报道基因转移进入细胞的能力。用粗烟草/HL1提取物免疫的小鼠成功地激发了比通过用10μg杆状病毒产生的VLPs免疫2次所激发的那些更高的中和抗体水平。令人惊讶的是当向其中加入弗氏不完全佐剂时，由烟草/HL1提取物激发的中和抗体水平更低。
烟草(N.tabacum)L.cv.Petite Havana SR1植物成功转化了携带人密码子优化的HPV-16L1基因的农杆菌。正如通过瞬时表达所观察到的那样，叶绿体靶向的L1在转基因植物中高水平积聚(达到60mg L1/kg植物材料，10.6％TSP)(图9)。用构象特异性H16.V5mAb从转基因叶片提取物中检测L1的观察表明在这些植物中存在壳粒和可能的VLP形成。
表C.SEAP HPV-16假病毒中和测试检测用粗植物/HL1提取物免疫后的小鼠中中和抗体的诱导。在烟草(N.tabacum)L.cv.Petite Havana SR1植物用农杆菌(pTRA-HL1)和农杆菌(pBIN-NSs)真空侵入后3天，产生浓缩的植物提取物，并且用于免疫小鼠。免疫后4周采取血清。中和滴度定义为引起SEAP活性至少50％减少的最高血清稀释度的倒数。低于25的滴度认为是负的。
Figure BDA00002464729400151
实施例2
高水平表达的流感病毒H5HA蛋白
质粒构建
将流感A/Viet Nam/1194/2004(H5N1)病毒(GenBank登记号AY651333)全长基因HA基因(H5，1704bp，图10)和23个氨基酸平截的HA基因(H5tr，1635bp，图11)进行人密码子优化，并且通过Geneart(Germany)合成。H5tr从核苷酸1597-1665剪截以去除其膜锚定结构域(图12)：这应该阻止HA蛋白与细胞膜缔合，并且应该允许H5tr蛋白在ER中适当处理后从植物细胞分泌，这可以极大地辅助其纯化。在基因合成过程中添加酶识别序列以有助于克隆。
将H5和H5tr基因分别克隆到实施例1中的3个根癌农杆菌载体中。H5和H5tr基因用Nco I和Xba I消化，并且克隆到pTRAc的Afl III和Xba I位点，形成克隆pTRA-H5和pTRA-H5tr。为了克隆到pTRAkc-ERH，载体和H5/H5tr基因都用Nco I和Not I消化，形成pTRAERH-H5和pTRAERH-H5tr。将H5和H5tr基因用Mlu I和Xba I消化，并且克隆到pTrakc-rbcs1-cTP，形成克隆pTRACTP-H5和pTRACTP-H5tr。第四套克隆，pTRAa-H5和pTRAa-H5tr，通过将H5和H5tr基因(用Nco I和XbaI消化)克隆到Nco I和Xba I消化后的pTRAkc-ERH载体中而构建，由此去除ER保留信号(SEKDEL)以产生质外体靶向的构建体。
农杆菌转化
农杆菌转化按照实施例1进行。
农杆菌侵入
将含有H5和H5tr二元载体克隆的重组根癌农杆菌GV3101培养物，以及含有番茄丛矮病毒的p19沉默抑制基因的根癌农杆菌GV3101(pTRA-P19)在补充了50μg·ml-1羧苄西林、50μg·ml-1利福平和30μg·ml-1卡那霉素的LB肉汤中在27℃摇动生长到对数期(OD600≈0.8)。细胞通过在4000g离心收集，重悬在添加适当的抗生素的诱导培养基(LB肉汤，pH5.6，含有10mM MES、20μM乙酰丁香酮、和2mM MgSO4)中，并且如上述进行生长。通过离心收集细胞，如上述，并且重悬在侵入培养基(10mM MgCl2，10mM MES，2％蔗糖和150μg.ml-1乙酰丁香酮，pH 5.6)中。将根癌农杆菌混悬液稀释在侵入培养基中达到OD6001.0，并且在22℃保持2-3h。
将根癌农杆菌-H5或根癌农杆菌-H5tr混悬液与根癌农杆菌(pTRA-P19)组合，并且将每一培养物用侵入培养基稀释到0.25的最终OD600。N.benthamiana植物的叶片通过将细菌混悬液注射到叶片底侧的远轴气室而进行侵入。使用每种农杆菌混合物进行农杆菌侵入4片叶片。将植物在16h光照、8h黑暗、22℃条件下生长6天。
蛋白提取和HA检测
N.benthamiana叶片圆片(使用2ml微量离心管帽切割)从农杆菌侵入的叶片收集，并且在250μl高盐磷酸缓冲液(0.5M NaCl)/圆片中碾磨。提取物在13000rpm离心5min，收集上层清液，并且重复进行离心。
样品通过蛋白质印迹分析检测HA的存在。将植物提取物在加样缓冲液中在85℃温育2min{Sambrook，198933369/id}，在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后通过半干电印迹法转移到硝化纤维素膜上。HA蛋白用H5阳性鸡血清(1∶000；James Kitching，Elsenburg，Western Cape Dept ofAgriculture)，兔抗鸡血清(1∶1000；Ed Rybicki，UCT)，然后用猪抗兔碱性磷酸酶缀合物(1∶10000；Sigma)进行检测。检测使用NBT/BCIP试剂(Roche)进行。
农杆菌侵入法证明对于快速比较植物中众多HA构建体的表达是有用的。初步结果表明当使用pTRAERH-H5和pTRAERH-H5tr构建体时获得HA蛋白的最高积聚，所述pTRAERH-H5和pTRAERH-H5tr构建体将蛋白靶向ER(图13)。当使用其它构建体时不能检测到HA。
实施例3
质粒构建
农杆菌载体pTRAc，pTRAkc-ERH，pTRAkc-A，和pTRAkc-rbcs1-cTP(图14)由Rainer Fischer(Fraunhofer Institute for Molecular Biology andApplied Ecology IME，Aachen，Germany)提供。限制酶位点通过聚合酶链式反应(PCR)包含在L2ORF的任一末端，以辅助定向克隆到3种农杆菌载体中。通过PCR扩增野生型HPV-16 L2 1.4kb开放阅读框(ORF)(saL2)，优化在植物中表达的HPV-16 L2 ORF密码子(plantised)和对于哺乳动物表达密码子优化的HPV-16 L2 ORF(人源化的)。HPV-16 L2(pL2)对烟草的密码子优化通过
Figure BDA00002464729400171
(Regensberg，Germany)进行。人源化的HPV-16L2(hL2)由Martin Müller(Germany)提供。
pTRA载体拥有许多优化外源基因表达的特点。pTRAc包含骨架特征并且专门适于在植物细胞的细胞质中进行转基因表达(图14)。pTRAkc-ERH载体包括pTRAc的所有特点，并且有一些额外特点(图14)。加入了卡那霉素抗性基因(nptII)，这允许这些载体用来产生转基因植物。然而，在这一研究中，应用瞬时表达。pTRAkc-ERH还包括形成His标记和内质网(ER)保留信号(KDEL)羧基端融合的序列。认为KDEL序列将蛋白保留在ER中，在这里它们可以被保护免于降解。由于不能形成它们的最终构象的蛋白保留在ER中，所以KDEL序列可以提供抗降解保护(1)。没有KDEL序列而存在于ER中的蛋白被降解(1)。pTRAkc-A载体来源于pTRAkc-ERH载体，其包含分泌信号′LPH′，但是没有′KDEL′，因此蛋白从细胞中分泌出来到质外体空间。基于pTRAc的pTRAkc-rbcs1-cTP载体还包含短的基质靶向结构域(STD)序列，rbcs1-cTP，其与外源蛋白形成氨基端STD融合。蛋白可能穿过内膜和外膜相接的地方，一旦到达基质内部，STD被140kDa金属蛋白酶处理(2)。
左和右侧边界侧连转移到植物细胞中的DNA区域，T-DNA。支架附着区，也叫作基质附着区，在转基因的任一侧。认为这些区域与核基质蛋白相互作用，在DNA中形成环结构域，这已经表明在质粒中增加插入片段的表达(3)。转基因的表达通过双重P35S CaMV启动子和重复转录增强子而控制。已经表现出这一启动子比常规单一P35S CaMV增加表达(4)。P35S基因的多腺苷酸化信号融合到外源基因的末端；这稳定RNA转录物。质粒在农杆菌中的复制在RK2复制起点起始。由于质粒在农杆菌中的低拷贝数，载体可以备选地在大肠杆菌(Escherichia coli)中使用ColE1复制起点进行复制(5)。许多农杆菌对氨苄青霉素的抗性发展已导致羧苄西林和氨苄青霉素抗性在bla基因中的融合。氨苄青霉素用作大肠杆菌中的标记，羧苄西林作为农杆菌中的标记。
使用适用的引物对将所有基因克隆到它们各自的载体中。saL2 ORF用引物对F L2-ERH和R L2-pTRAc(表1)扩增。引物对F PL2-pTRAc和RPL2-pTRAc用于扩增pL2 ORF，F-hL2-pTRAc和R hL2-pTRAc对用来扩增hL2ORF，以辅助克隆到pTRAc中。将1.4kb片段克隆到
Figure BDA00002464729400181
-T easy(PROMEGA)中，并且测序以确定PCR保真度。SaL2用限制酶BspHI和XbaI剪切，并且亚克隆到pTRAc的AflIII和XbaI位点，形成质粒pTRA-saL2-C。将限制性酶BspHI和BamHI用于切割pL2，将其亚克隆到pTRAc的AflIII和BamHI位点，制成质粒pTRA-pL2-C。hL2使用限制酶BspHI和XbaI克隆，制成质粒pTRA-hL2-C。
为了将saL2克隆到pTRAkc-ERH中，saL2ORF用引物对F L2-ERH和R L2-ERH(表1)扩增，并且使用BspHI和NotI克隆到pTRAkc-ERH的NcoI和NotI位点，制成质粒pTRA-saL2-E。类似地，使用引物对F hL2pTRAc和R hL2-pTRA E将hL2 ORF克隆到pTRAkc-ERH中。
表1.用于PCR的引物，其序列以及它们连接的限制性位点
红色突出标记的序列显示L2ORF的起始密码子。
蓝色突出标记的序列显示L2ORF的终止密码子。
为了克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP中，saL2、pL2和hL2分别用引物对FL2-Plast和R L2-pTRAc，F PL2-cTP和R PL2-pTRAc，以及F hL2-pTRA-P的R hL2-pTRAc(表1)进行PCR扩增。使用酶MluI和XbaI将hL2和saL2进一步克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP的MluI和XbaI位点，形成质粒pTRA-saL2-P和pTRA-hL2-P。MluI和BamHI用于将pL2克隆到pTRAkc-rbcs1-cTP的MluI和BamHI位点，产生pTRA-pL2-P。
pTRA-hL2-A克隆通过克隆与用于制备pTRA-hL-C相同的BspHI和XbaI片段并且克隆到pTRAkc-ERH的BspHI-XbaI片段而制备。
重组农杆菌的产生
根癌农杆菌GV3101由Rainer Fischer(Fraunhofer Institute forMolecular Biology and Applied Ecology IME，Aachen，Germany)提供。GV3101菌株包含辅助质粒，pMP90RK，其包含重要的vir基因(5)。如先前提及的那样，pTRA载体可以在大肠杆菌以及农杆菌中复制。载体构建体首先克隆到DH5α细胞中，其与农杆菌比较更容易培养并且具有更高拷贝数的质粒(5)。在26℃摇动，在含有抗生素50μg/ml利福平(Rif)和30μg/ml卡那霉素(Kan)的Luria肉汤(LB)中，将农杆菌GV3101细胞生长到对数期0.8 OD600。通过用Milli-Q水洗涤3次，并且用10％甘油重悬在1/20的培养物体积中，而使细胞成为电感受态。通过UV分光光度计在260nm确定从DH5α细胞分离的质粒DNA浓度。在0.1cm杯中，将质粒DNA(400ng)与100μl电感受态GV3101细胞混合，并且使用下列参数200Ω，25μF和1.5kV(Gene Pulse，)进行电穿孔。在26℃在Luria 肉汤(LB)中培养1小时后，将电穿孔的细胞涂布到含有50μg/ml Rif，30μg/ml Kan和50μg/ml羧苄西林(Carb)的Luria-琼脂(LA)上，并且在26℃生长3-4天。
成功的转化通过菌落PCR或者通过限制酶分析而确定。由于农杆菌中的低质粒拷贝数，提取来自成功电穿孔的GV3101菌落的质粒并且转化到大肠杆菌中，以获得足够的DNA用于限制性分析。这通过用已经在26℃在luria琼脂上生长的农杆菌菌落接种含有Rif、Kan和Carb的LB而完成。用来自农杆菌的分离质粒DNA转化感受态DH5α细胞，并且涂布在具有100μg/ml氨苄青霉素的LA上，在37℃培养O/N。对于每一存活的农杆菌菌落将5个DH5α菌落用来接种含有100μg/ml氨苄青霉素的LB，在37℃生长到对数期。培养物用于少量质粒DNA制备，并且进行限制性消化分析以确定插入物是否存在。制备合适的农杆菌菌落的甘油贮备物，制备9个L2农杆菌GV3101菌株，其包含质粒：pTRA-saL2-E，pTRA-saL2-C，pTRA-saL2-P，pTRA-pL2-C，pTRA-pL2-P，pTRA-hL2-A，pTRA-hL2-C，pTRA-hL2-E，和pTRA-hL2-P(表2)。
植物株系
将野生Nicotiana benthamiana在16h光照、8h黑暗、22℃条件下生长。植物在从育苗盘移植到盆后14-28天使用。
制备用于侵入的农杆菌
侵入流程通过乙酰丁香酮刺激农杆菌诱导的天然程序。诱导和侵入培养基都包含激活多种vir基因的乙酰丁香酮(6)。将来自甘油贮备物的农杆菌菌株在26℃在具有Rif、Kan和Carb的LB中生长到OD600到1-2。将农杆菌在室温(RT)下5,000×g离心10min，并且重悬在诱导培养基(LB，10mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸[MES]，2mM MgSO4，20μM乙酰丁香酮，pH 5.6，具有Rif，Carb，和Kan)中，并在26℃生长到OD600到1-2。将细胞在RT下5,000×g离心10min，并且重悬在侵入培养基(10mM MES，10mMMgCl2，2.2105g/l Murashige Skoog[MS]盐，35g/l蔗糖，150μM乙酰丁香酮，pH 5.6)中。检测细胞的光学密度，并且稀释到OD600 0.4-1.0。在侵入前将细胞在侵入培养基中培养3h。
表2.农杆菌菌株、所用载体、制备的质粒、它们所含的插入物以及异源蛋白靶向的位置的总结
Figure BDA00002464729400211
*农杆菌菌株由James MacLean提供
HPV-16saL2-野生型L2ORF。
HPV-16pL2-在烟草属(Nicotiana)中表达优化的L2ORF。
HPV-16saL 1-野生型L1ORF。
HPV-16hLl-在人(Homo saplens)中表达优化的L1 ORF。
侵入步骤
克隆到细胞质靶向的载体(pTRA-hL1)中在GV3101中的哺乳动物优化的HPV-16L 1基因由Dr.James MacLean(UCT，Cape Town，South Africa)友好馈赠。含有L2或L 1构建体的农杆菌GV3101菌株单独侵入或者与等量的GV3101(pTRA-p19)混合，所述GV3101(pTRA-p19)编码沉默阻抑制子p19，这一菌株也由Dr.James MacLean(UCT，Cape Town，South Africa)友好馈赠。使用两种不同的侵入方法：注射侵入或在真空下的侵入。对于注射侵入，使用2ml注射器将悬浮在侵入培养基中的农杆菌注射到N.benthamiana叶片的远轴气室。
对于真空侵入，将完整的N.benthamiana植物悬浮在含有农杆菌菌株的侵入培养基中，并且在60mbar真空下放置5min。农杆菌使用真空的释放而侵入。所述流程与Vaquero等(1999)所用的流程不同(7)。将完整植物连根拔起，真空侵入，并且重新种植。Vaquero等(1999)真空侵入PetiteHavanna植物的完整的叶片。使用完整的植物不但更容易，而且可以给叶片额外的营养以增加转基因表达。随后将植物在28℃在可控湿度的室内培养。
蛋白提取和蛋白质印迹
通过在液氮中碾磨材料而进行匀浆。匀浆样品悬浮在2μl/mg的8M尿素中。通过两轮离心(10,000×g，10min，RT)分离细胞碎片和其它更大的分子。十二烷基硫酸钠(SDS)-PAGE加样缓冲液加入到样品中，并且煮沸10min。将样品加样到10％SDS-PAGE上，并且在100V电泳～2.5h。将蛋白在15V，400mA通过半干印迹法持续2h(Trans
Figure BDA00002464729400221
半干，
Figure BDA00002464729400222
具有电源Electrophoresis Power Supply，)转移到尼龙膜(Nitrobind，Cast，纯硝化纤维素，0.45微米，OSMONICS INC.)上。转移后通过凝胶考马斯蓝染色而检测转移的成功。将所述膜在混悬在含有0.05％吐温-20的PBS中的5％脱脂牛奶中封闭O/N。在RT将膜用针对HPV-16L2激发的兔多克隆抗血清(1∶3,000)，针对HPV-16L1(J4)的小鼠单克隆抗体(1∶5,000)再温育4小时。在RT将膜用与碱性磷酸酶(
Figure BDA00002464729400224
-Aldrich)缀合的稀释到1∶10,000的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗体温育2h。使用按照生产者指导(
Figure BDA00002464729400225
Diagnostics)制备的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)进行免疫检测。
通过瞬时表达法在N.benthamiana植物中表达L2
用含有不同L2ORFs的所有9种农杆菌菌株侵入N.benthamiana植物。L2的表达不能通过对含有pL2 ORF或saL2 ORF的任何菌株进行蛋白质印迹进行检测(数据未显示)。这可能是由于密码子使用的原因，如早先已经关于L1所公布的(8)。然而，当从具有hL2基因的任何克隆表达时，表达是显著的(图15)。注意到L2由这组载体的相似的表达。在不同载体中还注意到相似量的降解产物。这可能表明，L2位于植物细胞的相同区域，而不管载体内的信号分子。预计特别是叶绿体靶向的蛋白的某种程度的保护。这些图与使用这些载体进行的其它发现相互矛盾，例如，使用ER-靶向的载体L1表达显著低于使用叶绿体或细胞质靶向的载体的表达(Dr.James MacLean，personal communication)。
L2表现高度表达。
将来自每次侵入的植物材料称重，并且因此加入相同量的缓冲液(8M尿素)。这允许经验确定加样到蛋白质印迹上的植物材料的初始重量成为可能(图3)。这一免疫印迹表明，达到0.4mg的初始植物材料L2仍然可以检测到。我们只能推测相对于总的可溶性蛋白而存在的L2的量，尝试了通过ELISA的进一步分析，但是由于只有多克隆抗体可用而没有成功。
L1和L2在同一区域的共表达。
L2和L1同时共同侵入到N.benthamiana植物。L1和L2的表达都能在这些叶片样品中检测到，然而从这些结果不能确定L1和L2是否在同一细胞中表达。参考文献表明它们更可能在同一细胞中表达，其中已经证实具有形成其的多个亚基的抗体的表达。(29)
针对L1的免疫应答已经表明随着GSK和Merck HPV疫苗的出现而产生类型特异的抗体，这为第二代疫苗铺平了道路，所述第二代疫苗更可能结合L2及其交叉中和特性。已经表明，异源蛋白特别是亚基疫苗在植物中的生产比其它表达系统更节约成本。总之，这两种简单但是重要的观念的结合可导致在与宫颈癌对抗中最需要的东西：便宜并且有效的疫苗。
实施例4
高水平表达的嵌合HPV L1蛋白
WO2003/097673中描述的方法用来高水平表达嵌合HPV L1蛋白，如上文所述，将WO2003/097673文件通过参考结合于本文。
附图说明
说明书应该参考下列图阅读，其中：
图1显示农杆菌载体pTRAc，pTRAkc-rbcs1-cTP和pTRAkc-ERH。
图2显示人密码子优化的HPV-16 L1(HL1)(SEQ.ID NO.13)。
图3显示植物密码子优化的HPV-16 L1(SYNL1)(SEQ.ID NO.14)。
图4显示用携带HPV-16 L1基因的农杆菌侵入后N.benthamiana叶片样品的蛋白质印迹。N.benthamiana叶片通过注射农杆菌-L1构建体而侵入，或者用农杆菌-L1和农杆菌(pBIN-NSs)共同侵入。蛋白质印迹在侵入后6天的粗叶片提取物上进行，其使用H16.J4抗-HPV-16L1单克隆抗体进行。泳道1-5的样品来自用携带下列载体的农杆菌侵入的叶片：1，pTRACTP-GFP；2，pTRA-HL1；3，pBIN-NSs和pTRA-HL1；4，pTRACTP-HL1；5，pBIN-NSs和pTRACTP-HL1。
图5显示在用携带HPV-16L1基因的农杆菌侵入后在N.benthamiana叶片样品中检测L1。N.benthamiana叶片通过用农杆菌-L1构建体注射而侵入，或者用农杆菌-L1和农杆菌(pBIN-NSs)共同侵入。侵入后6天通过H16.V5捕获ELISA评估粗叶片提取物。
图6显示侵入农杆菌GV3101(pTRACTP-HL1)后粗N.benthamiana植物提取物的电子显微镜照片。VLPs由箭头指示。
图7显示通过农杆菌侵入法在植物中产生的HPV-16L1的毫克数。N.benthamiana叶片用农杆菌-L1构建体、农杆菌(pBIN-NSs)和农杆菌(pTRA-GFP)的混合物侵入。侵入后6天，通过H16.V5和H16.J4mAb捕获ELISAs评估粗叶片提取物。对于具体的构建体，显示表示为总可溶性蛋白(TSP)的％的L1水平。
图8显示用粗植物/HL1提取物单次免疫后在BALB/c小鼠中诱导的HPV-16 VLP-特异性全身抗体滴度。在烟草(N.tabacum)L.cv.PetiteHavana SR1植物用农杆菌(pTRA-HL1)和农杆菌(pBIN-NSs)真空侵入后3天，产生浓缩的植物提取物，并且用来免疫小鼠。对照组用10μg杆状病毒产生的VLPs免疫两次，或者用1μg杆状病毒产生的VLPs免疫一次。免疫后4周采取血清，连续稀释(对于每组小鼠收集到一起)并且用于针对HPV-16VLPs的ELISA。检测OD 492nm值，并且结果记录为OD为＞2×预先采血的OD时的最高稀释度的倒数。
图9显示每kg转基因植物材料产生的HPV-16L1毫克数。烟草(N.tabacum)L.cv.Petite Havana SR1植物用携带HPV-16L1基因的农杆菌转化。通过H16.V5和H16.J4mAb捕获ELISAs检测粗叶片提取物中的L1。对于具体的构建体，显示表示为％TSP的L1水平。
图10显示流感A/Viet Nam/1194/2004(H5N1)病毒(GenBank登记号AY651333)的人密码子优化全长基因HA基因(H5，1704bp)(SEQ.ID NO.15)。
图11显示23个氨基酸平截的人密码子优化HA基因(H5tr，1635bp)。H5tr从核苷酸1597-1665剪截，以去除其膜锚定结构域(SEQ.ID NO.16)。
图12显示H5基因的跨膜预测(CBS Prediction Servers，http://www.cbs.dtu.dk)。
图13显示用携带H5或H5tr基因的农杆菌侵入后N.benthamiana叶片样品的蛋白质印迹。农杆菌样品如下：1，pTRA-H5；2，pTRA-H5tr；3，pTRACTP-H5；4，pTRACTP-H5tr；5，pTRAERH-H5；6，pTRAERH-H5tr。泳道7含有未侵入的N.benthamiana提取物。
图14显示本研究所用的农杆菌载体，即pTRAc，pTRAkc-ERH，pTRAkc-rbcs1-cTP，和pTRAkc-A。亮蓝条电表示在转染时转移到植物细胞的T-DNA。异源基因在多克隆位点(MCS)克隆到载体中。所述载体具有许多共同特征，由灰色区域所示。T-DNA区域侧连左侧边界(left border)(LB)和右侧边界(right border)(RB)。在MCS的任一端是支架附着区(SAR)。转基因的表达由双重35S花椰菜花叶病毒启动子(P35SS CaMV)控制，所述启动子连接同一CaMV基因(pA35S)的多腺苷酸化信号。所述载体在农杆菌中的复制在RK2起点起始。分离的复制起始位点ColE1用于大肠杆菌。PTRAc载体只包含一种抗生素抗性标记(bla)，其允许用氨苄青霉素/羧苄西林进行选择。pTRAkc-ERH，pTRAkc-A，和pTRAkc-rbcs1-cTP含有第二抗生素标记(nptII)，允许在植物中用卡那霉素进行选择。nptII基因受控于农杆菌基因胭脂氨酸合成酶(Pnos)的启动子，同一基因的多腺苷酸(polyadentlation)附着到nptII上(pAnos)。pTRAkc-ERH另外包括分泌信号(LPH)，His标记(His6)序列和在MCS下游的内质网保留信号(KDEL)序列。pTRAkc-rbcs1-cTP包括在MCS上游的叶绿体信号肽(rbcs1-cTP)序列。
图15显示L2的表达可以用4种载体的每一种检测。将N.benthamiana用相同OD的含有不同载体的农杆菌进行瞬时侵入，所述载体具有人源化的L2基因。这些为pTRA-hL2-A(hL2-A)，pTRA-hL2-C(hL2-C)，pTRA-hL2-E(hL2-E)，和pTRA-hL2-P(hL2-P)。作为阴性对照，还提取了没有用农杆菌侵入的植物材料(-ve)。大肠杆菌表达的HPV-16L2用作阳性对照(+ve)。在2天后(A)和5天后(B)提取植物材料，并且进行免疫印迹。蛋白质印迹使用兔pAb-αL2进行探测。
图16显示侵入后在叶片材料中存在的L2量的初步量化。N.benthamiana用含有pTRA-hL2-C载体的农杆菌菌株进行侵入。在侵入后4天提取植物材料。凭经验确定不同量的叶片材料(8mg，0.8mg和0.4mg)，并且加样到蛋白质印迹上。蛋白质印迹使用兔pAb-αL2进行探测。
图17显示L1和L2在同一区域共表达。将N.benthamiana用相同OD的含有细胞质靶向的人源化L1基因的农杆菌进行侵入，其与在也靶向蛋白到细胞质的载体中含有人源化L2基因的农杆菌混和并共同侵入。共同侵入的植物材料在4天后进行提取，并且进行免疫印迹(L1/L2)。未侵入的植物材料用作阴性(-ve)。加样大肠杆菌表达的L2并且电泳作为阳性对照。免疫印迹用小鼠mAb J4(αL1)或用兔多克隆Ab-αL2(αL2)进行探测。
在本说明书中，在描述或者另外列出按照本发明的任何序列的情形中，本发明意欲包括这样的序列，其具有至少75％同源性，更优选地至少77％同源性，甚至更优选地至少80％同源性，甚至更优选地至少82％同源性，甚至更优选地至少85％同源性，甚至更优选地至少87％同源性，甚至更优选地至少90％同源性，甚至更优选地至少92％同源性，甚至更优选地至少95％同源性，最优选地至少97％同源性。
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Claims (15)

1.在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤：
i)将流感病毒H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，其中所述植物组分选自由内质网和质外体组成的组；
ii)用所述载体侵入所述植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，从而瞬时表达所述流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和
iii)回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。
2.权利要求1的方法，其中一个或多个靶向序列包含于所述载体中，所述靶向序列编码将所述流感病毒H5多肽从细胞质导向所述植物组分的多肽。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述载体包括可操作地与所述载体的编码序列连接的启动子和其它调节子等。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述载体是二元载体，优选根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)二元载体。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述流感病毒H5基因是密码子使用优化的基因，优选人密码子使用优化的基因、BCG密码子使用优化的基因或植物密码子使用优化的基因。
6.前述权利要求任一项的方法，其还包括用在植物中适于抑制转录后基因沉默的抑制蛋白共同侵入所述植物的步骤，所述抑制蛋白如番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的p19。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述侵入通过直接注射或通过真空进行。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述植物的侵入和/或转化用根癌农杆菌完成，所述根癌农杆菌已经被转化接受了所述载体。
9.前述权利要求任一项的方法，其中所述植物选自Nicotiana benthamiana和烟草(N.tabacum)。
10.前述权利要求任一项的方法，其中所述流感病毒H5基因或编码其功能等价物的核酸选自图10和11所示的序列。
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述侵入是在所述植物叶片上进行的，优选其中所述侵入是通过在所述叶片的远轴区上直接注射进行的。
12.权利要求1-10任一项的方法，其中基本上将完整的植物通过真空侵入方式用适当的载体侵入。
13.已经在其中克隆了流感病毒H5基因的载体的应用，所述载体适于靶向植物中存在的内质网和质外体组分，从而在细胞质中瞬时表达所述流感病毒H5多肽，然后将所述流感病毒H5多肽输入到所述植物组分中，和/或产生转基因植物，在所述转基因植物中，所述流感病毒H5多肽在细胞质中表达，然后被输入到所述植物组分中。
14.已经在其中克隆了流感病毒H5基因的载体，所述载体适于靶向植物中存在的内质网和质外体组分，从而在细胞质中瞬时表达所述流感病毒H5多肽，然后将所述流感病毒H5多肽输入到所述植物组分中，和/或产生转基因植物，在所述转基因植物中，所述流感病毒H5多肽在细胞质中表达，然后被输入到所述植物组分中。
15.权利要求1-13任一项的方法产生的转基因植物、其部分或其子代，其包含能够表达流感病毒H5多肽的细胞。
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