PT2374892T - Expressão de proteínas virais em plantas - Google Patents

Description

capazes de importar uma variedade de moléculas, incluindo proteinas. Existem diferentes processos através dos quais isso ocorre, um dos quais envolve a interagao com a membrana tilacoide do plastidio. A segmentagao de proteinas heterólogas para o plastidio é um mecanismo de aumento significativo da acumulagao de proteinas dentro da célula vegetal. A transferência de genes mediada por Agrobacterium foi utilizada por muitos anos para gerar plantas transformadas de forma estavel·. Este método envolve a transferência do complexo T (um complexo formado com os produtos agrobacterianos do gene T-ADN e da virulência) das estirpes de Agrobacterium as células vegetais (Zupan et al., 2000). Qualquer ADN localizado entre as repetigöes diretas de 25 pb (fronteiras esquerda e direita) que delimitam o T-ADN de cadeia simples é transferido para o nucleo da célula vegetal (Zupan et al.,2000), onde se integra ao cromossomA da planta através de recombinagao ilegitima (Somers e Makarevitch, 2004). Muitas das cópias de T-ADN presentes no nücleo nao se integram, mas sao transcritas, causando expressao transitoria. A expressao transitoria nao é afetada pelo efeito de posigao e pode produzir niveis de proteinas estranhas dramaticamente maiores do que a transformagao estavel (Kapila et al., 1997).

Dois métodos de infiltragao por Agrobacterium (agroinfiltragao) sao habitualmente utilizados: Injegao e infiltragao em vacuo. A injegao de Agrobacterium envolve injegao direta nos espagos aéreos abaxiais de uma folha, enquanto a folha ainda esta anexada a planta (Voinnet et al., 2003). Durante a infiltragao no vacuo, aplica-se vacuo a uma suspensao agrobacteriana em que as folhas sao submersas (Kapila et al.,1997). Embora normalmente sejam executadas em apenas algumas folhas, esta técnica pode ser ampliada: pesquisadores da Medicago Ine. (Quebec, Canada) podem filtrar agrofiltradas até 7500 folhas de alfafa por semana, e Stefan Schillberg e colegas (Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen, Alemanha) agilizaram até 100 kg de folhas de tabaco (Twyman 2004).

Os picos de expressao transitoria mediados por Agrobacterium 60 a 72 horas após a infiltragao e depois diminuem acentuadamente como resultado do silenciamento de genes pós-transcrigao (PTGS) (Voinnet et al. , 2003). A interferência de PTGS ou ARN é uma resposta de defesa antiviral adaptativa que limita a replicagao do virus e se espalhou nas plantas. Este processo envolve o reconhecimento de um ARN alvo e a iniciagao de uma via de degradagao de ARN especifica de sequência no citoplasma (Voinnet, 2001). Certos virus de plantas codificam os supressores de silenciamento que têm a capacidade de inibir o PTGS. Algumas dessas proteinas supressoras de silenciamento, como NS do virus da marreta manchada de tomate (TSWV) (Takeda et al., 2002) e pl9 do virus de torgao de tomate (Voinnet et al.,2003) foram utilizados para prolongar e amplificar a expressao transitoria mediada por Agrobacterium pela co-infiltragao de Agrobacterium contendo um gene supressor silenciador.

Huang Chun-Yuan et al. (1999) revelam plantas de tabaco transgénicas expressando de forma estavel a proteina H5 do virus da gripe. Existe uma necessidade de otimizar a expressao de proteinas comercialmente viaveis nas plantas em niveis que fariam das plantas uma plataforma viavel. Em particular, existe uma necessidade de um método de produgao de proteina H5 de virus da gripe em uma planta.

Existem ainda necessidades para vetores, plantas transgénicas ou suas partes e a progénie de tais plantas para efetuar a necessidade como aqui descrito anteriormente,

SUMARIO DA INVENCAO

De acordo com um primeiro aspeto da presente invengao é proporcionado um método para produzir um polipéptido H5 do virus da gripe numa planta compreendendo os passos de: 1. clonagem de um gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica um polipéptido H5 num vetor adaptado para atingir um componente presente na planta, em que o componente da planta é o reticulo endoplasmatico; 2. infiltrando, pelo menos, uma porgao da planta com o vetor ou tecido de planta transformante com o vetor de modo a expressar transitoriamente o polipéptido H5 do virus da gripe; e 3. recuperar o polipéptido H5 do virus da gripe expresso pela planta. 0 termo "planta" pretende abranger todos os organismos vivos que nao possuem órgaos sensoriais especializados e o poder do movimento voluntario. Como tal, a definigao inclui tanto monocotiledóneas quanto dicotiledóneas e todos os organismos fotossintéticos. 0 termo "polipéptidos HPV" pretende abranger a proteina LI de HPV; um péptido quimico de HPV Ll fundido com outro péptido de antigénio HPV; um péptido quimérico de HPV Ll fundido a um péptido heterólogo derivado de qualquer epitopo antigénico, célula B ou célula especifica de células especificas e uma proteina LV de HPV ou seus equivalentes funcionais. 0 mesmo se aplica, mutatis mutandis ao termo "gene HPV". O termo "componentes da planta" destina-se a abranger plastidios, reticulos endoplasmaticos, citoplasma e apoplastos.

Ao segmentar, pretende-se que as sequências de segmentagao possam ser incluidas no vetor. Tais sequências de direcionamento podem ser traduzidas para um péptido que direciona o vetor ou seu produto para o componente desejado na planta. 0 vetor de acordo com a presente invengao inclui de preferência promotores e outros reguladores necessarios tais como terminadores ou semelhantes ligados de forma operacional a sequência de codificagao.

Sera apreciado que a infiltragao de, pelo menos, uma porgao da planta com o vetor pode originar a expressao transitoria da proteina e transformar o tecido da planta com o vetor de modo a criar uma planta transgénica pode dar origem a expressao transgénica da proteina, ambas das quais formas de expressao sao contempladas para se enquadrarem no ambito da presente divulgagao. Nesta referência de especificagao a uma proteina, péptido ou um gene ou seus equivalentes funcionais inclui referências a suas variantes que sao capazes de realizar em grande parte a mesma fungao que a proteina, péptido, polipéptido ou gene. Esta descrigao descreve a produgao da proteina LI HPV-16; um péptido quimico de HPV LI fundido com outro péptido de antigénio HPV; um péptido quimérico HPV Ll fundido com um péptido heterólogo derivado de qualquer epitopo antigénico, células B ou células T especificas; uma proteina HPV L2; ou uma proteina H5 do virus da gripe.

De preferência, os vetores sao vetores binarios, mais preferidos sao os vetores binarios Agrobacterium tumefaciens.

Um vetor da presente descrigao pode ser adaptado para direcionar plastidios fazendo com que um polipéptido expresso inclua uma porgao capaz de interagir com as membranas de tilacoides dos plastidios, em particular o mecanismo de transferência das membranas de tilacoides. Esta interagao pode fazer com que o polipéptido seja importado para o plastidio do citoplasma onde é expresso. 0 mecanismo de importagao para o citoplasma pode ser importante para a dobragem adequada das proteinas.

No entanto, sera apreciado que o vetor pode ser adaptado para direcionar os próprios plastidios para se tornarem transformados e a expressao do polipéptido pode ocorrer inteiramente dentro do plasto.

Sem querer ser vinculado pela teoria, o candidato é de opiniao de que um polipéptido importado para o plastidio é importado em sua estrutura primaria e sofre dobrando em sua estrutura secundaria e terciaria dentro do plastidio, ou seja, remoto do citoplasma da célula. Como tal, o candidato considera isso como uma extensao logica da divulgagao de que a expressao do polipéptido pelo vetor pode ocorrer dentro do plasto, após o que adota suas estruturas secundarias e terciarias. Em outras palavras, os requerentes consideram a divulgagao para se estender a transformagao dos plastidios. Sob tais condigöes, a expressao da proteina ocorreria inteiramente dentro do plastidio e sem contato com o citoplasma da célula.

De preferência, o gene H5 do virus da gripe é um gene otimizado, por exemplo, otimizado pelo codao humano, codao otimizado com o BCG ou o codao vegetal otimizado. 0 método de acordo com a presente invengao pode ainda incluir o passo de co-infiltragao da planta com uma proteina supressora adaptada para inibir o silenciamento de genes pós-transcrigao em uma planta. De preferência, a proteina supressora é a proteina NSs do virus da toxina manchada de tomate ou o pl9 do virus de acrobacias do busto de tomate. Mais preferencialmente, a proteina supressora é NSs.

Sao descritos aqui plastidios selecionados a partir de cloroplastos, cromoplastos e leucoplastos. Os plastidios sao preferencialmente cloroplastos. A infiltragao pode ser feita por injegao direta ou por vacuo. De acordo com urn aspeto da presente invengao, plantas inteiras podem ser infiltradas a vacuo. Nesta especificagao, "plantas inteiras" devem ser consideradas para incluir suas plantas que tiveram suas raizes removidas, bem como plantas que foram parcialmente desfolhadas, bem como plantas em grande parte intactas. A referência a planta deve incluir referência as partes da planta, incluindo, entre outras, semente, folha, raiz, caule, flor, fruta, embriao, meristema, hipocótilo, epicotilico, cotiledao, polen e tecido.

No método de acordo com a presente invengao, tanto a infiltragao como a transformagao da planta podem ser conseguidas com Agrobacterium tumefaciens que foi transformado para aceitar o vetor. A planta também pode ser selecionada de Nicotiana benthamiana e N. tabacum. Contudo, sera apreciado que qualquer planta que suporte a expressao da proteina transitoria ou seja transgénica seja adequada para os propósitos da presente invengao. A infiltragao é preferencialmente realizada nas folhas da planta. A infiltragao por injegao direta é preferencialmente realizada na regiao abaxial da folha.

De acordo com a presente invengao, o método pode envolver a produgao de urn polipéptido H5 do virus influenza numa planta em que substancialmente a planta inteira é infiltrada com urn vetor adequado por meio de infiltragao a vacuo.

Também é descrito aqui um polipéptido H5 do virus da gripe sempre que produzido de acordo com um método como aqui descrito anteriormente.

De acordo com outro aspeto da presente invengao, é proporcionada a utilizagao de um vetor no qual um gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica um polipéptido H5 foi clonado, cujo vetor esta adaptado para atingir o polipéptido H5 no reticulo endoplasmatico numa planta, de modo que como para expressar de forma transitoria o polipéptido H5 do virus da gripe no citoplasma e, em seguida, importar o polipéptido H5 do virus da gripe para o reticulo endoplasmatico. Também é descrito aqui um vetor no qual um gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica um polipéptido H5 foi clonado, o que o vetor é adaptado para direcionar o polipéptido H5 para o reticulo endoplasmatico em uma planta de modo a expressar transitoriamente o polipéptido H5 do virus da gripe no citoplasma e, em seguida, importar o polipéptido H5 do virus influenza no reticulo endoplasmatico.

Também esta descrito aqui uma vacina profilatica ou terapêutica consistindo em um polipéptido H5 do virus influenza capaz de induzir uma resposta imunogénica em um hospedeiro adequado, sempre que seja produzido por um método como descrito anteriormente.

Também esta descrito aqui uma planta transgénica, parte ou sua progénie contendo uma célula capaz de expressar um polipéptido H5 do virus da gripe.

Nestes aspetos subsequentes a invengao, as opgöes e preferências do primeiro aspeto aplicam-se mutatis mutandis.

Existia uma necessidade de otimizar a expressao de proteinas comercialmente viaveis em plantas, a niveis que tornariam as plantas uma plataforma viavel. Um exemplo é a produgao da proteina principal da capside HPV Ll como capsómeros e/ou como particulas semelhantes a virus (VLPs) para vacina humana ou para fins de reagente.

Seguindo o ensinamento desta divulgagao, a expressao de uma série de proteinas antigênicas pode ser comparada, bem como o efeito da segmentagao do compartimento das células vegetais das proteinas por expressao transitoria por meio de agroinfiltragao. Este método envolve a infiltragao de recombinantes de Agrobacterium tumefaciens que transportam vetores de expressao para plantas por injegao direta ou criando um vacuo sobre folhas submersas ou embebidas na cultura de Agrobacterium. 0 otimizado com o codao humano ou o HPV Ll otimizado com codao BCG foi expresso em niveis significativamente maiores do que as outras sequências Ll e a otimizagao do codao humano também resultou em alta expressao da proteina H5 da gripe. 0 alvejamento de cloroplasto causou acumulagao significativamente maior do que o reticulo citoplasmatico ou endoplasmatico (ER) . A microscopia eletrónica de extratos inteiros de HPV Ll revelou que Ll estava se juntando em particulas semelhantes a virus (VLPs) nas plantas. A proteina produzida também reagiu com anticorpos monoclonais especificos de HPV Ll (MAbs) que reconhecem epitopos especificos de conformagao.

Ll obtido por expressao transitoria em plantas induziu niveis elevados de anticorpos especificos de Ll em ratinhos, e estes anticorpos encontraram-se neutralizando num ensaio de neutralizagao in vitro. Os vetores de expressao que facilitaram a expressao de Ll transitoria elevada em cloroplastos de plantas foram utilizados para gerar plantas transgénicas que também expressaram niveis elevados dos outros polipéptidos como anteriormente descrito. A infiltragao AgrobacteriumA a vacuo normalmente envolve infiltragao de folhas que foram removidas do caule. A presente invengao descreve nova infiltragao a vacuo de plantas intactas, ou plantas sem raizes intactas. Plantas intactas com sistemas radiculares pequenos podem ser removidas do solo, infiltradas e replantadas sem perda de viabilidade. Os sistemas radiculares grandes podem ser removidos, a planta foi infiltrada e depois replantada em espuma vegetal para ser cultivada durante pelo menos trés dias sem perda de viabilidade. As plantas com sistemas radiculares complexos também podem ser cultivadas hidroponicamente, o que permite infiltragao sem remogao de raizes. As plantas inteiras sao mais faceis de incubar do que folhas soltas após o processo de infiltragao, e sobrevivem por mais tempo, aumentando assim a expressao gênica externa. A presente descrigao também ensina o direcionamento da proteina Ll de HPV para subcontinentes de células vegetais especificas (ER e cloroplastos) por agroinfiltragao ou em plantas transgénicas. 0 alvejamento de cloroplasto aumentou significativamente a acumulagao de Ll em relagao ao aumento de ER e acumulagao citoplasmatica. A acumulagao de cloroplasto pode proteger a proteina Ll da degradagao por protéases presentes no citoplasma e/ou permitir que ele se acumule em maior concentragao sem afetar a fungao da célula vegetal. As mesmas consideragöes aplicam-se aos outros polipéptidos como anteriormente descrito.

EXEMPLOS A invengao sera agora descrita com referência aos seguintes exemplos nao limitativos.

Exemplo 1

Expressüo da proteina Ll de HPV para niveis elevados Construgoes de expressao

Trés vetores de Agrobacterium: pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP e pTRAkc-ERH (Figura 1) foram obtidos de Rainer Fischer (Fraunhofer Institute, Aachen, Alemanha). 0 vetor pTRAc consiste em um promotor 35S de Vulcao Mosaico de Couve-Flor (CaMV) (P35SS), com potenciador transcricional duplicado, regiao nao traduzida 5' nao traduzida (CHS) e sinal de poliadenilagao CaMV 35S (pA35S) , para expressao de genes estranhos; 2 regioes de fixagao do andaime (SAR) para o gene RB7 do tabaco; as fronteiras esquerda e direita para a integragao T-ADN; origens de replicagao de E. Coli e Agrobacterium tumefaciens; e a blagene para selegao de antibióticos. pTRAkc-rbcsl-cTP é um derivado de pTRAc com uma sequência rbcs-cTP adicional (sinal de direcionamento de cloroplasto da subunidade pequena de Rubisco de Solanum) , formando uma fusao 3' com o gene estranho. 0 pTRAkc-ERH também é derivado do pTRAc, e inclui as sequências KDEL e his6, formando uma fusao de 5' com o gene estranho. Os vetores pTRAkc-rbcsl-cTP e pTRAkc-ERH também incluem o gene npt II, para a resistência a canamicina nas plantas.

Quatro variantes do gene Ll de HPV-16 foram clonadas nos vetores de Agrobacterium acima mencionados: (1) um isolado sul-africano, SALl (numero de acesso GenBank AY177679); (2) Ll otimizado por codao humano (HLl, Figura 2); (3) Ll otimizado por codöes de plantas (SYNL1, Figura 3) e (4) sinal de localizagao nuclear deficiente, truncamento de 22 aminoacidos de HLl, HLl AC22.

Para facilitar a clonagem direcional, os locais de enzimas de restrigao foram adicionados aos terminals dos genes Ll por amplificagao por PCR. 0 SALl foi amplificado com iniciador de sentido: 5'-GGACGCGTTAGGT ACATGTCTCTTTGGCTGCCT (SEQ ID NO 1) e iniciador antessentido: 5'-TC TAGAC T C GAG T TACAGC T T ACGTTTITTGCGTTT (SEQ ID NO: 2), digerido com Afl III e Xho I e clonado no mesmos sitios de pTRAc, formando pTRA-SALl; ou digerido com Mlu I e Xho I e clonado nos mesmos sitios em pTRAkc-rbcsl-cTP, formando pTRACTP-SALl. 0 SALl também foi amplificado com o iniciador de sentido acima e o iniciador antessentido: 5'-AGCGGCCGC CAGCTTACGTTTTTTGCG (SEQ ID NO: 3), digerido com Afl III e Not I e clonado nos sitios Ncol and Not I de pTRAkc-ERH, formando pTRAERH-SALl. SYNLl foi amplificado com iniciador sensitivo: 5'-GGACGCGTGAGATTCATGAGCCTTTGGCTC CCT (SEQ ID NO: 4) e iniciador antessentido: 5'-ATCTAGACTCGAGTTAGAGTTCCTCTTCTTCCTCTT (SEQ ID NO: 5), digerido com Bsp HI e Xho I e clonado no Afl III e Xho I de pTRAc, formando pTRA-SYNLl; ou digerido com Mlu I e Xho I e clonado nos mesmos sitios em pTRAkc-rbcsl-cTP, formando pTRACTP-SYNLl. SYNLl também foi amplificado com o iniciador de sentido acima e o iniciador antessentido: 5'-AGCGGCCGCGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT (SEQ ID NO: 6), digerido com Bsp HI e Not I e clonado nos sitios Nco I e Not I de pTRAkc-ERH, formando pTRAERH-SYNLl. HLl foi amplificado com iniciador sensitivo: 5'-GGACGCGTGAGGTTCATGAGCCTGTGGCTGCC C (SEQ ID NO: 7) e iniciador antessentido: 5'-ATCTAGACTCGAGTCACAGCTTGCGCTTCTTCCG (SEQ ID NO: 8), digerido com Bsp HI e Xho I e clonado no Afl Sites III e Xho I de pTRAc, formando pTRA-HLl; ou digerido com Mlu I e Xho I e clonado nos mesmos sitios em pTRAkc-rbcsl-cTP, formando pTRACTP-HLl. HLl também foi amplificado com o iniciador de sentido acima e iniciador antessentido: 5'-AGCGGCCGCCAGCTTGCGCTTCTTCCGC (SEQ ID NO: 9), digerido com Bsp HI e Not I e clonado nos sitios Nco I e Not I de pTRAkc-ERH, formando pTRAERH -HL1. HL1AC22 foi formado por amplificagao por PCR de HLl, com o iniciador de sentido acima e o iniciador antessentido: 5'TCTAGACTCGAGTCAGCCCAGGGTGAACTTAGG (SEQ ID NO: 10), para facilitar a terminagao antes do NLS (Zhou et al., 1991). 0 produto de PCR foi digerido com Mlu I e Xho I e clonado nos mesmos sitios em pTRAkc-rbcsl-cTP, formando pTRACTP-HLlAC22. O mutante 30B-GFPC3 (n° de adesao GeneBank U62637) gene GFP foi amplificado a partir de pBSG1057 (Biosource Technologies Inc, Vacaville, EUA) com o iniciador de sentido direto: 5' GGACGCGTT AGGTCCATGGCTAGCAAAGGAGAAG, e o iniciador antessentido (SEQ ID NO 11) : 5' ATCTAGATTATTTGTA GAGCTCATCCATG (SEQ ID NO: 12), digerido com Nco I e Xba I e clonado nos mesmos sitios de pTRAc, formando pTRA-GFP.

Transformag&o de Agrobacterium

Agrobacterium GV31Q1: pMP90RK (obtido de Rainer Fischer, Fraunhofer Institute, Aachen) foi feito eletrocompetente como descrito por (Shen e Forde, 1989). 50-200ng dos vetores LI/AgrobacteriumU.FV-16 acima descritos foram misturados com 100 μΐ de células eletrocompetentes em uma cuvete electrogap de 0,1 cm (BioRad). As células foram transformadas em urn GenePulser (BioRad) ajustado a 1.8kV, 25pF e 200Ω.

As células electroporadas foram incubadas em 1 ml de LB durante 2 horas antes do revestimento em LB contendo 50 ug.ml-1 de carbenicilina, 50 pg.ml-1 de rifampicina e 30.ml-1 de canamicina. Os clones positivos foram verificados por isolamento de ADN plasmidico a partir de colónias de Agrobacterium recombinantes e re-transformagao de ADN de plasmideo em células de E. coli DH5a e selegao em 100 ug/ml de ampicilina.

Tabela A. Resumo dos recombinantes de Agrobacteriurn usados

PreparacSo de Agrobacterium para infiltrac&o

Agrobacterium LBA4404 (pBIN-NSs), contendo o gene de supressores de silenciamento NSs de TSWV, foi obtido por Marcel Prins (Laboratory of Virology, Wageningen, Holanda). As culturas de Agrobacterium GV3101 contendo plasmideos com base nos vetores pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP e pTRAkc-ERH foram suplementadas com 50 pg.ml-1 de carbenicilina e 50 pg.ml-1 de rifampicina.

Agrobacterium LBA4404 (pBIN-NSS), as culturas foram suplementadas com 50pg.ml_1 de rifampicina e 30pg.ml-1 de canamicina. As culturas de Agrobacterium cresceram agitando a 27°C até a fase logaritmica {OD βοο* 0,8) em caldo LB, contendo os antibióticos apropriados. As células foram recolhidas por centrifugagao a 4000g, ressuspensas em meio de indugao (caldo LB a pH 5,6 contendo 10 mM de acido 2-[N-morfolino] etanossulfónico [MES], 20 μΜ de acetosiringona, e 2 mM de MgSCU) com os antibióticos adequados, e cultivadas como acima. As células foram recolhidas por centrifugagao, como acima, e ressuspenderam-se em meio de infiltragao (10 mM de MgCl2, 10 mM de MES, 2% de sacarose e ISOpg.ml-1 de acetosiringona, pH 5,6). Por infiltragao por vacuo MgCl2 foi substituida com 4 g de sais MS. 1_1. As suspensóes de Agrobacterium foram diluidas em meio de infiltragao até OÜ6oo 1,0 e foram mantidas a 22°C durante 2-3 h.

Agrofinfiltrag&o

Injegao: As suspensöes Agrobacterium-Ll e Agrobacterium (pBIN-NSs) foram diluidas e combinadas em meio de infiltragao, tanto para uma DOeoo final de 0,25. Quando Agrobacterium (pTRA-GFP) foi co-infiltrado com a suspensao acima, utilizou-se no final de ODeoo de 0,0125. As folhas de plantas de N. benthamiana de 2-4 semanas de idade foram infiltradas pela injegao da suspensao de Agrobacteriumnos nos espagos aéreos abaxiais da parte inferior da folha. Seis folhas foram agroinfiltradas com cada mistura agrobacteriana (3 plantas, 2 folhas/ planta). As plantas foram cultivadas durante 3-6 dias sob condigöes de 16h de luz, 8h escuro, 22°C.

Vacuo: Agrobacterium (pTRA-HLl) e Agrobacterium (pBIN-NSs) foram cultivados durante a noite em meio de indugao. As células de cada cultura foram combinadas e ressuspensas em 1-8 litros de meio de infiltragao, até uma DOeoo final de 0,25 por cultura. Plantas inteiras de N. benthamiana ou inteiras (com raizes removidas) de N. tabacum L. cv. As plantas Petite Havana SRI foram submersas na suspensao de Agrobacterium e submetidas a um vacuo de -90kPa durante lOmin, com agitagao ocasional para liberar bolhas de ar presas. O vacuo foi libertado rapidamente (-“lOkPa.s-. As plantas de N. benthamiana foram replantadas no solo. Os talos de plantas de N. tabacum foram colocados em espuma floral saturada de agua. As plantas foram cultivadas durante 3 dias sob condigöes de 16h de luz, 8h escuro, 22°C.

ExtragSo e detegAo de proteinas

Os discos de folhas (tampao de um tubo Eppendorf) foram colhidos a partir de folhas agroinfiltradas e moidos em 250μ1 de sal elevado (0,5 M NaCl) PBS/disco de folha. O extrato foi centrifugado a 13 000 rpm durante 5 min numa centrifuga de mesa, o sobrenadante foi recolhido e a centrifugagao foi repetida. Extragoes em grande escala foram realizadas em plantas de N. tabacum infiltrado no vacuo: as plantas foram homogeneizadas com um liquidificador Waring em tampao de extragao de 2 ml (fosfato de sódio 0,25 M, metabissulfito de sódio 0,1 M, EDTA 10 mM, 4% de polivinilpolipirrolidona [PVPP], pH 7,4)/g de material vegetal. O extrato foi filtrado através de 2 camadas de cheesecloth, após o que o filtrado foi centrifugado a 10 000 g durante 20 min. O sobrenadante resultante foi ultracentrifugado a 30 000 rpm durante 3 h, e os granulos resultantes foram ressuspensos em PBS e liofilizados para reduzir o volume. A concentragao de proteina solüvel total (TSP) foi determinada com um ensaio de Bradford (Sigma).

Para a analise Western Blot, os extratos de plantas foram incubados a 85°C durante 2 min em tampao de carga (Sambrook et al., 198 9), separados em um gel de SDS-PAGE a 10%, e depois transferidos para membrana de nitrocelulose por electroblotagao semi-seca. A proteina Ll foi detetada com anticorpo monoclonal H16: J4 (1:3000) e depois com um conjugado de cabra anti-rato fosfatase alcalina (1:10000; Sigma). A detegao foi realizada com Tablets NBT/BCIP (Roche). A proteina Ll foi quantificada a partir de extratos de plantas por ELISA de captura, modificado a partir do método ELISA de Student e de alvase de alcool de polivinil (PVA) . (2002) . Uma placa de microtitulagao de 96 pogos foi revestida com anticorpos monoclonais H16.J4 (liga-se ao epitopo lineal de HPV-16 Ll) ou H16.V5 (liga o epitopo conformacional) durante 1 h a 37°C, lavado e bloqueado. O extrato de planta foi entao adicionado durante 1 h a 37°C, seguido de um passo de lavagem e adigao de soro policlonal VLP anti-HPV-16 de coelho (1: 1000) durante 1 h a 37 ° C. Este soro foi detetado com o conjugado suino anti-coelho-HRP (1:5000; DAKO, Dinamarca) e o substrato de dihidrocloreto de 1,2-fenilenodiamina (OPD, DAKO). A GFP foi detetada pelo ELISA de captura. Os extratos de plantas foram diluidos em solugao de leite a 1% (leite de Elite® em PBS com Tween 20 a 0,05% [PBS-T]) e incubados em uma placa revestida com Reacti-Bind Anti-GFP (Pierce) durante 1 h a 37°C. A placa foi lavada 4 vezes com PBS-T, seguida da adigao de conjugado de cabra anti-GFP HRP (1: 2000 em solugao de leite a 1%; Abeam), a placa foi incubada durante 30 minutos a 37°C e depois lavada 4 vezes com PBS-T. O substrato TMB (KPL) foi utilizado para detegao.

Microscópio eletrónico O extrato de plantas foi imunotratado com anticorpo H16.V5 (1:50) em grades de cobre revestidas de carbono. As grelhas foram coradas com 2% de acetato de uranilo e vistas usando um microscópio eletrónico de transmissao JEOL 200CX.

Imunizagao de ratos com extrato de planta e analise de soro

Aproximadamente 350 g de N. tabacum que foram infiltrados a vacuo com Agrobacterium (pTRA-HLl) e Agrobacterium (pBIN-NSs) foram extraidos como descrito acima e ressuspensos em 0,5 μΐ de PBS. Os ratinhos BALB/c foram imunizados subcutaneamente com 100 μΐ do extrato de planta (11 μg LI), quer com a adigao do adjuvante Incompleto de Freund (4 ratinhos) ou sem (5 ratinhos) . Os grupos de controlo foram imunizados duas vezes com 10 ug de VLP produzidas com baculovirus, ou uma vez com 1 ug de VLP produzidas com baculovirus. O soro foi recolhido da veia do olho 4 semanas após a imunizagao.

Um ELISA de bloqueio de PVA modificado (Studentsov et al., 2002) foi utilizado para detetar anticorpos contra Ll nos ratinhos. Uma placa de microtitulagao foi revestida com VLP Ll HPV-16 produzidas com baculovirus (2 μg.ml"1) , bloqueada por 2h a 4°C com 0,5% de PVA em PBS e depois lavada 6 vezes com PBS. Os soros foram diluidos em série em 0,5% de PVA (1:40 a 1:40960) e foram incubados na placa a 37°C durante 1 hora. Após a lavagem 6 vezes com PBS, adicionou-se um conjugado HRP anti-rato de coelho (1:2000; DAKO) durante 30 minutos a 37°C. A detegao foi realizada com o substrato OPD (DAKO). O ensaio de anticorpo neutralizante de pseudovirus HPV-16 foi realizado de acordo com o método de (Pastrana et al., 2004). Os plasmideos necessarios para o ensaio foram obtidos de John Schiller (Laboratório de Oncologia Celular, National Cancer Institute, Bethesda, EUA).

Transformacao e regeneragao de plantas

As folhas de N. tabacum L. cv. Petite Havana SRI foram cortadas em pedagos de + lcm2, esterilizadas em 10% de alvejantes e enxaguadas em agua estéril. Os discos foliares foram mergulhados na cultura de Agrobacterium recombinante relevante e crescido em meios de cultivo de co-cultivo (Tabela 2) sob luz constante durante dois dias. Os discos de folhas foram entao colocados em meios de regeneragao frescos (Tabela 2) a cada duas semanas até aparecer pequenos rebentos (4-6 semanas). Os rebentos de l,5-2cm foram transferidos para meios de enraizamento (Tabela 2) . Os rebentos foram incubados até que o forte crescimento das raizes fosse evidente e depois transplantado para uma mistura de solo/ vermiculita (2:1), coberto com sacos de plastico e mantidos longe da luz direta por trés dias antes de serem movidos para a luz direta. As plantas transgénicas foram rastreadas por PCR usando o kit de PCR da planta Extract-N-Amp (Sigma) e os iniciadores especificos de Ll.

Tabela B: Helos para a transformagAo e regeneragèo do tabaco. Todos os meios contlnham EM com vltamlnas (Highveld Biological, Africa do Sul), 1% de sacarose e 0,8% de agar.

0 método de injegao da infiltragao mostrou-se util para a comparagao rapida de iniimeras construgöes de Agrobacterium e para a otimizagao das concentragöes de cultura de infiltragao. A analise de transferência de Western das amostras de folhas de N. benthamiana (Figura 4) , após infiltragao com Agrobacterium que transportava o gene Ll HPV-16 humano otimizado com codao humano (HL1), demonstrou a expressao bem sucedida do monómero Ll de 55kDa. A expressao de HLl a partir do vetor pTRA-HLl (localizagao citoplasmatica de Ll) nao foi detetavel após 6 dias, a nao ser que a co-infiltragao de Agrobacterium (pBIN-NSs) tenha ocorrido. Por outro lado, o HLl direcionado ao cloroplasto (vetor pTRACTP-HLl) produziu niveis detetaveis de HLl sem Agrobacterium (pBIN-NSs), que foram impulsionados com co-infiltragao de Agrobacterium (pBIN-NSs).

Os resultados acima foram confirmados pelo ELISA de captura (Figura 5) . Além disso, o ELISA estabeleceu que Ll estava montando nas estruturas multiméricas necessarias para a geragao de anticorpos neutralizantes, uma vez que o mAb H16.V5 utilizado para este ELISA de captura é especifico para urn epitopo conformacional formado por pentameros e VLPs. A formagao de VLPs foi confirmada por microscopia eletrónica (Figura 6) de urn extrato bruto de uma folha de N. benthamiana infiltrada com Agrobacterium GV3101 (pTRACTP-HL1) . A otimizagao de codöes e a segmentagao de compartimentos de plantas afetaram significativamente a colheita de Ll (Figura 7) . Os niveis de acumulagao de SYNLl e SALl em folhas agroinfiltradas foram frequentemente baixos, ou indetetaveis, no entanto, HLl acumulado em niveis elevados (até ~600mg de Ll/kg de material foliar, -17% de TSP) . Foi surpreendente que Ll (SYNLl) otimizado por codöes de plantas foi expresso em niveis inferiores aos Ll nativos (SALl). A segmentagao de Ll aos cloroplastos aumentou significativamente sua acumulagao em relagao ao Ll citoplasmatico e ER-alvo, e pode ser o resultado da protegao contra protéases presentes no citoplasma. A expressao de Ll foi menor quando foi direcionada para o ER. Agrobacterium (PTRA-GFP) foi utilizado para medir os desvios da eficiência da infiltragao entre as folhas (que geralmente eram pequenas, com uma diferenga de 14% entre as infiltragöes mais e menos eficiente). Nós demonstramos o potencial de expressao média ou possivelmente em larga escala de HPV-L1 em N. benthamiana e N. tabacum L, cv. Petite Havana SRI por infiltragao a vacuo. A infiltragao de vacuo de plantas inteiras de N. benthamiana ocorreu prontamente sobre 90-100% da area foliar e sobre 70-90% da area foliar de N. tabacum. Por infiltragao a vacuo de plantas inteiras, em vez de folhas soltas como descrito por Kapila et al. (1997), foi relativamente facil expandir a infiltragao para 2 kg de material vegetal de N. tabacum.

Uma ünica imunizagao de ratinhos BALB/c com um extrato bruto de N. tabacum/HLl induziu titulos de anticorpos especificos de VLP HPV-16 elevados (40 960) (Figura 8), que eram equivalentes aos provocados em ratinhos após 2 imunizagöes com 10 pg de VLP produzidos com baculovirus. A adigao do adjuvante Incompleto de Freund ao extrato da planta nao pareceu aumentar a resposta humoral provocada pelo HLl, sugerindo que as proteinas vegetais que acompanham a amostra sem o adjuvante Incompleto de Freund podem ter propriedades adjuvantes. Um ensaio in vitro de neutralizagao de pseudovirus de HPV-16 foi realizado utilizando o soro de rato acima (Tabela 3). Este ensaio baseia-se na capacidade de neutralizar o soro para bloquear a entrada de pseudovirus SEAP HPV-16 nas células, interrompendo assim a transferência do gene reporter SEAP para as células. Os ratos que foram imunizados com o extrato bruto de N. tabacum/HLl, obtiveram com êxito niveis de anticorpos neutralizantes maiores do que aqueles provocados por 2 imunizagöes com 10 pg de VLPs produzidas com baculovirus. Foi surpreendente que os niveis de anticorpos neutralizantes induzidos para o extrato de N. tabacum/HLl foram menores quando o adjuvante Incompleto de Freund foi adicionado.

As plantas de N. tabacum L. cv. Petite Havana SRI foram transformadas com sucesso com Agrobacterium transportando o gene Ll HPV-16 otimizado para o codao humano. Como foi observado com a expressao transitoria, o Ll direcionado ao cloroplasto foi acumulado em niveis elevados nas plantas transgénicas (até 60mg de Ll/kg de material vegetal, 10,6% do TSP) (Figura 9). A observagao de que Ll foi detetada com o mAb H16.V5 especifico da conformagao dos extratos de folhas transgénicas sugere que a formagao de capsómeros e, possivelmente, a formagao de VLP esta a ocorrer nessas plantas.

Tabela C. Ensaio de neutralizagao de pseudovirus de SEAP HPV-16 testando a indugao de anticorpos neutralizantes em ratinhos, após imunizagao com extrato de planta/HLl em bruto. Tres dias após as plantas de N. tabacum L. cv. Petite Havana SRI serem infiltradas a vacuo com Agrobacterium (pTRA-HLl) e Agrobacterium (pBIN-NSs), extratos de plantas concentradas foram produzidos e utilizados para ratos imunizados. Os soros foram tornados 4 semanas após a imunizagao. Os titulos de neutralizagao foram definidos como o reciproco da maior diluigao do soro que provocou, pelo menos, uma redugao de 50% na atividade de SEAP. Os titulos abaixo de 25 foram considerados negativos.

Exemplo 2

Proteina H5 HA do virus da gripe eaqoressa em niveis elevados Construgéo de plasmideos 0 gene HA do gene de tamanho completo (H5, 17 04 pb, Figura 10) do virus Influenza A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) (nümero de acesso GenBank AY651333) e um gene HA de 23 aminoacidos truncado (H5tr, 1635 pb, Figura 11) eram codoes humanos otimizados e sintetizados por Geneart (Alemanha) . H5tr foi truncado do nucleótido 1597-1665 para remover o seu dominio de ancoragem da membrana (Figura 12): isso deve impedir que a proteina HA seja associada as membranas celulares e deve permitir que a proteina H5tr seja segregada das células da planta após o processamento apropriado no ER, o que pode ajudar muito a sua purificagao. As sequências de reconhecimento de enzimas foram adicionadas durante a sintese de genes para facilitar a clonagem.

Os genes H5 e H5tr foram cada um clonados nos trés vetores A. tumefaciens, no Exemplo 1. Os genes H5 e H5tr foram digeridos com Nco I e Xba I e clonados nos sitios Afl III e Xba I de pTRAc, formando OS Clones pTRA-H5 e pTRA-H5tr. Para a clonagem em pTRAkc-ERH, ambos os genes vetores e H5/H5tr foram digeridos com Nco I e Not I, formando pTRAERH-H5 e pTRAERH-H5tr. Os genes H5 e H5tr foram digeridos com Mlu I e Xba I e clonados em pTrakc-rbcsl-cTP, formando os clones pTRACTP-H5 e pTRACTP-H5tr. Um quarto conjunto de clones, pTRAa-H5 e pTRAa-H5tr, foi construido por clonagem dos genes H5 e H5tr (digerido com Nco I e Xba I) no vetor pTRAkc-ERH após a digestao Nco I e Xba I, removendo assim o sinal· de retengao ER (SEKDEL) para criar construgoes de segmentagao apoplastica.

Transformacg.o de Agrobacterium A transformagao de Agrobacterium foi realizada como no exemplo 1.

Agrofinfiltragao

As culturas de A. tumefaciens GV3101 recombinantes que contêm os clones vetoriais binarios H5 e H5tr, e A. tumefaciens GV3101 (pTRA-Pl9), contendo o gene supressor silenciador p 19 do virus de torgao de tomate, foram agitados a 27°C até a fase logaritmica (OD 600 * 0,8) em caldo LB suplementado com 50 pg.ml-1 de carbenicilina, 50 pg.ml-1 de rifampicina e 30 pg.ml-1 de canamicina. As células foram recolhidas por centrifugagao a 4000 g, ressuspenderam-se em meio de indugao (caldo LB a pH 5,6 contendo MES 10 mM, 20 μΜ de acetosiringona, e 2 mM de MgSOi) com os antibióticos apropriados e crescidos como acima. As células foram recolhidas por centrifugagao, como acima, e ressuspenderam-se em meio de infiltragao (10 mM de MgCl2, MES 10 mM, 2% de sacarose e 150 pg.ml-1 de acetosiringona, pH 5,6). As suspensöes de A. tumefaciens foram diluidas em meio de infiltragao até ODeoo 1,0 e foram mantidas a 22°C durante 2-3 h.

As suspensöes A. tumefaciens-Ïl5 ou A. tumefaciens-H5tr foram combinadas com A. tumefaciens (pTRA-Pl9) e diluidas com meio de infiltragao até uma ODeoo final de 0,25 para cada cultura. As folhas das plantas de N. benthamiana foram infiltradas pela injegao da suspensao bacteriana nos espagos aéreos abaxiais do lado de baixo da folha. Quatro folhas foram agroinfiltradas com cada mistura agrobacteriana. As plantas foram cultivadas durante 6 dias sob condigöes de 16h de luz, 8h escuro, 22°C.

Extrag&o de proteinas e deteg&o HA

Os discos de folhas de N. benthamiana (cortados usando a tampa de um tubo de microcentrifuga de 2 ml) foram colhidos a partir de folhas agroinf iltradas e moidos em 250 μΐ de tampao de fosfato de sal alto (0,5 M NaCl)/disco. O extrato foi centrifugado a 13 000 rpm durante 5 min, o sobrenadante foi recolhido e a centrifugagao foi repetida.

As amostras foram testadas quanto a presenga de HA por analise Western Blot. Os extratos de plantas foram incubados a 85°C durante 2 min no tampao de carga {Sambrook, 1989 33369/id.), separados em um gel de SDS-PAGE a 10%, e depois transferidos para membrana de nitrocelulose por electroblotagao semi-seca. A proteina HA foi detetada com soro de frango H5 positivo (1:000; James Kitching, Elsenburg, Western Dept of Agriculture), soro de coelho anti-frango (1: 1000; Ed Rybicki, UCT) e, em seguida, com suinos anti-coelho alcalino conjugado de fosfatase (1:10000; Sigma). A detegao foi realizada com Tablets NBT/BCIP (Roche). A agrofiltragao mostrou-se ütil para comparar rapidamente a expressao de numerosas construgöes de HA nas plantas. Os resultados preliminares mostram que a maior acumulagao de proteina HA foi obtida ao usar as construgöes pTRAERH-H5 e pTRAERH-H5tr, que visam a proteina para o ER (Figura 13). 0 HA nao pode ser detetado ao usar as outras construgöes.

Exemplo 3

Construgêo de plasmideos

Os vetores de Agrobacterium pTRAc, pTRAkc-ERH, pTRAkc-A e pTRAkc-rbcsl-cTP (Fig. 14) foram fornecidos por Rainer Fischer (Instituto Fraunhofer para Biologia Molecular e Ecologia Aplicada IME, Aachen, Alemanha). Os locais de enzimas de restrigao foram incluidos em qualquer extremidade da ORF L2 por reagao em cadeia da polimerase (PCR) , para facilitar a clonagem direcional nos trés vetores de Agrobacterium. 0 quadro de leitura aberto HPV-16 L2 1.4 kb de tipo selvagem (ORF) (saL2) , o codao HPL-16 L2 ORF otimizado para expressao em plantas (plantizado) e o ORF HP2-L2 HPV-16 otimizado com codao para expressao de mamiferos (humanizados) foram amplificados por PCR. A otimizagao de codao para Nicotiana de HPV-16 L2 (pL2) foi feita por GENEART® (Regensberg, Alemanha). 0 HPV-16 L2 humanizado (hL2) foi fornecido por Martin Müller (Alemanha).

Os vetores pTRA possuem uma série de caracteristicas que otimizam a expressao do gene estranho. 0 pTRAc contém as caracteristicas do esqueleto e é proficiente na expressao do transgene no citoplasma das células da planta (Fig. 14). 0 vetor pTRAkc-ERH inclui todas as caracteristicas de pTRAc com algumas adigöes (Fig. 14) . Urn gene de resistência a canamicina (nptJJ), isso permite que esses vetores sejam usados para a geragao de plantas transgénicas. Neste estudo, no entanto, a expressao transitoria foi utilizada. 0 pTRAkc-ERH também inclui sequências que resultam nas fusöes carboxi-terminais de um sinal de retengao de His e reticulo endoplasmatico (ER) (KDEL). Sabe-se que a sequência KDEL retarda as proteinas na ER, onde podem ser protegidas contra a degradagao. A sequência KDEL pode inferir a protegao contra a degradagao, uma vez que as proteinas que nao conseguem formar sua conformagao final permanecem no ER (1). As proteinas presentes no ER que nao possuem uma sequência KDEL sao degradadas (1) . 0 vetor pTRAkc-A é derivado do vetor pTRAkc-ERH, contém o sinal secretório 'LPH', mas falta o 'KDEL', assim a proteina é segregada para fora da célula para o espago apoplasico. 0 vetor pTRAkc-rbcsl-cTP que se baseia em pTRAc, também inclui a sequência de dominio de direcionamento estroma curto (STD), rbcsl-cTP, que forma uma fusao STD amino terminal com a proteina estranha. As proteinas provavelmente atravessam onde as membranas interna e externa se encontram, uma vez dentro do estroma a STD é processada por uma metaloprotease de 140 kDa (2).

As margens esquerda e direita flanqueiam a regiao do ADN que sera transferida para a célula da planta, o ADN-T. As regiöes de fixagao do andaime, também conhecidas como regiöes de fixagao da matriz, estao em ambos os lados do transgene. Acredita-se que essas regiöes interagem com proteinas da matriz nuclear que formam dominios de lago em ADN, o que mostrou aumentar a expressao com insergao em urn plasmideo (3). A expressao do transgene é controlada por urn promotor duplo de P35S CaMV, com urn intensificador de transcrigao duplicado. Este promotor mostrou aumentar a expressao sobre o linico P35S CaMV tradicional (4) . O sinal de poliadenilagao do gene P35S é fundido na extremidade do gene estranho; Isso estabiliza as transcrigöes de RNA. Replicagao do plasmideo em Agrobacteriumé iniciado na origem de replicagao RK2. Devido ao baixo nijmero de cópias do plasmideo em Agrobacterium, o vetor pode alternativamente ser replicado em Escherichia coli utilizando a origem de replicagao de ColEl (5) . 0 desenvolvimento da resistência por uma série de Agrobacterium a ampicilina conduziu a fusao da carbenicilina e a resistência a ampicilina no gene bla. A ampicilina é utilizada como marcador em E. coli com carbenicilina como marcador em Agrobacterium. A clonagem de todos os genes nos seus respetivos vetores foi feita usando o par de iniciadores aplicavel. 0 SaL2 ORF foi amplificado com o par de iniciadores F L2-ERH e R L2-pTRAc (Tabela 1) . 0 par de iniciadores Fp L2-pTRAc e RpO L2-pTRAc foi utilizado para amplificar o ORF pL2, e os pares F-hL2-pTRAc e R hL2-pTRAc foram utilizados para amplificar o ORF hL2 para facilitar a clonagem em pTRAc. Os fragmentos de 1,4 kb foram clonados em pGEM®-Teasy (PROMEGA) e sequenciados para confirmar a fidelidade da PCR. A saL2 foi excisada com as enzimas de restrigao BspHI e Xbal e subclonada nos locais Afllll e Xbal de pTRAc fazendo o plasmideo pTRA-saL2-C. As enzimas de restrigao BspHI e BamHI foram utilizadas para aplicar o pL2 que foi subclonado nos locais Afllll e BamHI de pTRAc que faz o plasmideo pTRA-pL2-C. HL2 foi clonado usando enzimas de restrigao BspHI e Xbal para produzir o plasmideo pTRA-hL2-C.

Para clonar saL2 em pTRAkc-ERH, o saL2 ORF foi amplificado com o par de iniciadores F L2-ERH e R L2-ERH {Tabela 1) e clonado nos sites Ncol e Notl de pTRAkc-ERH usando BspHI e Notl, fazendo o plasmideo pTRA-saL2-E. Da mesma forma, o ORF hL2 foi clonado em pTRAkc-ERH usando o par de iniciadores F hL2 pTRAc e R hL2-pTRA E. TABELA 1. Primers utilizados em PCR com sua sequência e os locais de restrig&o que eles fixam

Para a clonagem em pTRAkc-rbcsl-cTP, saL2, pL2 e hL2 foram amplificados por PCR com os pares de iniciadores F L2-Plast e R L2-pTRAc, FP L2-cTP e Rp L2-pTRAc e F hL2-pTRA-P e R hL2-pTRAc respetivamente (Tabela 1) . hL2 e saL2 foram maïs clonados usando enzimas Mlul e Xbal nos sitios Mlul e Xbal de pTRAkc-rbcsl-cTP, formando o plasmideo pTRA-saL2-P e pTRA-hL2-P. Mlul e BamHI foram utilizados para clonar pL2 nos locais Mlul e BamHI de pTRAkc-rbcsl-cTP, criando pTRA-pL2-P.

0 clone pTRA-hL2-A foi preparado por clonagem do mesmo fragmento BspHI e Xbal usado para produzir pTRA-hL-C e clonado no fragmento BspHI-Xbal de pTRAkc-ERH Geragao de Agrobacterium Recombinante

Agrobacterium tumefaciens GV3101 foi fornecido por Rainer Fischer (Fraunhofer Institute for Molecular Biology e Applied Ecology IME, Aachen, Alemanha). A estirpe GV3101 contém o plasmideo ajudante, pMP90RK, que contém os genes cruciais Vir (5). Os vetores pTRA, como mencionado anteriormente, podem ser replicados em E. coli, bem como em Agrobacterium. As construgöes de vetores foram primeiro clonadas em células DH5a, que sao mais faceis de cultivar e têm um maior nümero de cópias do plasmideo em comparagao com Agrobacterium (5). As células Agrobacterium GV3101 foram cultivadas até a fase logaritmica 0,8 Οϋεοο a 26°C com agitagao, em caldo Luria (LB) contendo antibióticos; 50 pg/ ml de rifampicina (Rif) e 30 pg/ml de kanamicina (Kan). As células foram feitas electrocompetentes por lavagem 3 vezes com agua Milli-Q e ressuspensas em 1/20 do volume de cultura com 10% de glicerol. A concentragao de ADN plasmidico isolada das células DH5a foi determinada por espectrometria UV a 260 nm. 0 ADN de plasmideo (400 ng) foi misturado com 100 μΐ de células GV3101 electro-competentes em uma cuvete de 0,1 cm (BIORAD®) e eletroporado usando os seguintes parametros 200Ω, 25pF e 1.5 kV (Gene Pulse, BIORAD®). Após incubagao a 2 6°C em caldo de Luria (LB) durante 1 hora, as células electroporadas foram plaqueadas em agar de Luria (LA) , contendo 50 pg/ml de Rif, 30 pg/ml de Kan e 50 pg/ml de carbenicilina (Carb) e crescido a 26°C durante 3-4 dias. A transformagao bem sucedida foi determinada por PCR de colönia ou por analise de enzimas de restrigao. Devido as plasmideo de baixo numero de cópias em Agrobacterium, o plasmideo a partir de colónias GV3101 electroporadas com sucesso foram extraidos e transformado em E. coli para obter ADN suficiente para analise de restrigao. Isto foi conseguido inoculando LB contendo Rif, Kan e Carb com colónias de Agrobacterium que cresceu a 26°C no agar de luria. As células DH5a competentes foram transformadas com ADN plasmidico isolado do Agrobacterium e plaqueadas em LA com 100 pg/ml de ampicilina incubadas a 37°C O/N. Cinco colónias DH5a para cada Agrobacterium viavel foram utilizadas colonia para inocular LB contendo 100 pg/ml de ampicilina cultivada a 37°C até a fase logaritmica. As culturas foram utilizadas para preparagao de ADN de plasmideo em pequena escala e analise de restrigao de restrigao foi realizada para determinar se a insergao estava presente. Foram feitas reservas de glicerol da colónia Agrobacterium adequada.

Foram preparadas nove estirpes de L2 Agrobacterium GV3101 contendo os plasmideos: pTRA-saL2-E, pTRA-saL2-C, pTRA-saL2- P, pTRA-pL2-C, pTRA-pL2-P, pTRA-hL2-A, pTRA-hL2 -C, pTRA-hL2-E e pTRA-hL2-P (Tabela 2).

Linhas de plantas O tipo selvagem Nicotiana benthamiana foi cultivado sob condigoes de 16h de luz, 8h escuro a 22°C. As plantas foram utilizadas 14-28 dias após serem transplantadas das bandejas de mudas para potes.

Preparagao de Agrobacteri mn para Infiltragao 0 protocolo de infiltragao Simula o processo natural de indugao de Agrobacterium por acetosiringona. 0 meio de indugao e infiltragao ambos contêm acetosiringona que ativa os varios genes vir (6) . As Jbestirpes de Agrobacterium foram cultivadas a partir de reservas de glicerol em LB com Rif, Kan e Carb para uma ODeoo entre 1 e 2 a 26°C. Agrobacterium foi centrifugado a 5,000xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT) e ressuspensas em meio de indugao (LB, 10 mM de acido 2-[N-morfolino] etanossulfónico [MES], 2 mM de MgSCU, 20 μΜ de acetosiringona, pH 5,6, com Rif, Carb e Kan) e cresceu para uma Οϋεοο entre 1 e 2 a 26°C. As células foram centrifugadas a 5,000xg durante 10 min a temperatura ambiente e ressuspensas em meio de infiltragao (MES 10 mM, 10 mM de MgCl2, 2,2105 g/1 de sais de Murashige Skoog [MS] , 35 g/1 de sacarose, 150 uM de acetosiringona, a pH 5,6). A densidade ótica das células foi medida e diluida para uma ODeoo entre 0,4 e 1,0. As células foram incubadas durante 3 h no meio de infiltragao antes da infiltragao. T ABE LA 2. Resumo das estirpes de Agrobacterium, os vetores que foram utilizados, os plasmideos feitos, as insergöes que contêm e onde a proteina heteróloga é alvo

Procedimento de inf iltragcLo

Um gene Ll HPV-16 otimizado de mamifero em GV3101 clonado no vetor alvo citoplasmicamente (pTRA-hLl) foi gentilmente administrado pelas estirpes de Agrobacterium GV31Q1 do Dr. James MacLean (UCT, Cape Town, Africa do Sul) que contêm construgöes L2 ou Ll foram infiltradas sozinhas ou misturadas com quantidades iguais de GV3101 (pTRA-pl9) que codifica um supressor de silenciamento pl9, esta estirpe também foi doada pelo Dr. James MacLean (UCT, Cape Town, Africa do Sul). Foram utilizados dois protocolos de infiltragao diferentes; infiltragao de injegao ou infiltragao sob vacuo. Para a infiltragao por injegao, utilizou-se uma seringa de 2 ml para injetar o Agrobacterium suspenso em meio de infiltragao nos espagos aéreos abaxiais das folhas de N. benthamiana.

Para infiltragao a vacuo, as plantas inteiras de N. benthamiana foram suspensas em meio de infiltragao contendo as estirpes de Agrobacterium e colocadas sob vacuo a 60 mbar durante 5 min. Agrobacterium foi infiltrado com a libertagao do vacuo. 0 protocolo difere do usado por Vaquero et al. (1999) (7) . Plantas inteiras foram desarraigadas, infiltradas a vacuo e replantadas. Vaquero et al. (1999) folhas infiltradas por vacuo de plantas de Petite Havanna. O uso de plantas inteiras nao é apenas maïs facil, mas podem ser administrados nutrientes adicionais as folhas para aumentar a expressao do transgene. As plantas sao subsequentemente incubadas a 28eC em uma sala com humidade controlada.

ExtragSo de proteinas e Western Blots A homogeneizagao foi feita molhando o material em azoto liquido. A amostra homogeneizada foi suspensa em 2 μΐ/mg de ureia 8M. Os detritos celulares e outras moléculas maiores foram separados por duas rodadas de centrifugagao (10 OOOxg, 10 min a TA). Adicionou-se tampao de carga de dodecilsulfato de sódio (SDS)-PAGE as amostras e cozido durante 10 min. A amostra foi carregada em uma SDS-PAGE de 10% e correu a 100 V por -2,5 h. A proteina foi transferida para a membrana de nylon (Nitrobind, Cast, Pure nitrocellulose, 0,45 micron, OSMONICS INC.) Por transferência semi-seca a 15 V, 400 mA, durante 2 h (Trans Blot® semi-seco, BIORAD® com eletroforese defonte de alimentagao, AMERSHAM®) . O sucesso da transferência foi medido pela coloragao com azul de coomassie do gel após a transferência. A membrana foi bloqueada O/N em 5% de leite desnatado suspenso em PBS com 0,05% de Tween-20. A membrana foi incubada durante mais 4 horas a TA com antissoro policlonal de coelho criado contra HPV-16 L2 (1: 3000), anticorpos monoclonais de ratinho contra HPV-16 LI (J4) (1:5000). As membranas foram incubadas com anticorpos de cabra anti-coelho ou anti-rato de cabra conjugados com fosfatase alcalina (SIGMA®-Aldrich) diluidos para 1:10000 durante 2 h a TA. A imunodetegao foi feita utilizando fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/Nitroblue tetrazolium (BCIP/ NBT) feito de acordo com as instrugöes do fabricante (ROCHE® Diagnostics).

Expresscto de L2 por expressao transitoria em plantas de N. benthami ana.

As plantas de N. benthamiana foram infiltradas com as nove estirpes de Agrobacterium contendo os diferentes ORFs L2. A expressao de L2 nao pöde ser detetada por western blot nenhuma das estirpes contendo o ORF pL2 ou o ORF saL2 (dados nao mostrados). Isso pode ser devido ao uso de codöes, como ja foi publicado anteriormente para Ll. (8). No entanto, a expressao foi expressa por qualquer dos clones que possuiam o gene hL2 (Fig. 15}. Expressou-se expressao semelhante de L2 no conjunto de vetores. Quantidades semelhantes de produtos de degradagao também foram observadas nos diferentes vetores. Isto possivelmente indica que a L2 esta localizada na mesma regiao da célula da planta, apesar das moléculas de sinalizagao dentro do vetor. Um certo grau de protegao, particularmente pelas proteinas direcionadas ao cloroplasto, seria esperado. Esses numeros contradizem outros achados feitos com esses vetores, por exemplo, A expressao de Ll é marcadamente menor com o vetor segmentado por ER do que o dos vetores direcionados ao cloroplasto ou ao citoplasma. (Dr. James MacLean, comunicagao pessoal) L2 parece ser altarnente expressado. 0 material vegetal de cada infiltragao foi pesado e, assim, foi adicionada a mesma quantidade de tampao (ureia 8M). Isso permite a possibilidade de determinar empiricamente o peso original do material vegetal que foi carregado no western (Fig. 3). Esta imunotransferência mostra que L2 ainda pode ser detetado até 0,4 mg de material vegetal original. Podemos apenas especular a quantidade de L2 que esta presente em relagao a proteina soluvel total, uma analise adicional por ELISA foi tentada, mas sem sucesso devido a apenas urn anticorpo policlonal estar disponivel.

Co-expressao de Ll e L2 na mesma regiao. L2 e Ll foram simultaneamente co-infiltrados em plantas de N. benthamiana. A expressao de Ll e L2 pode ser detetada nestas amostras de folhas, no entanto, a partir desses resultados nao é conclusivo se Ll e L2 estao a ser expressos na mesma célula. A literatura sugere que sao mais do que provaveis sendo expressos na mesma célula, com expressao de anticorpos com multiplas subunidades que se formam, tendo sido comprovadas. (29)

As respostas imunológicas contra Ll demonstraram produzir anticorpos especificos do tipo, com o advento das vacinas GSK e Merck HPV, o que abriu o caminho para vacinas de segunda geragao que provavelmente incorporarao L2 e suas propriedades de neutralizagao cruzada. A produgao de proteinas heterólogas e, em particular, de vacinas de subunidades em plantas mostrou ser mais rentavel que outros sistemas de expressao. Em conclusao, urn casamento desses dois ideais simples, mas importantes pode levar ao que mais se precisa na luta contra o cancro cervical: uma vacina barata e eficaz.

Exemplo 4

Proteina quimérica HPV Ll expressa em niveis elevados 0 método descrito em WO2003/097673, é utilizado para a expressao de alto nivel de proteinas quiméricas de HPV Ll como descrito anteriormente.

FIGURAS A especificagao deve ser lida com referência as seguintes figuras em que: A Figura 1 mostra os vetores de Agrobacterium pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP e pTRAkc-ERH. A Figura 2 mostra o HPV-16 Ll (HLl) otimizado com codao humano codificado (SEQ ID NO: 13). A Figura 3 mostra HPV-16 Ll (SYNLl) otimizado com codao de planta (SEQ ID NO 14). A Figura 4 mostra uma mancha de Western de amostras de folhas de N. benthamiana após infiltragao com Agrobacterium transportando o gene Ll de HPV-16. As folhas de N. benthamiana foram infiltradas por injegao com uma construgao Agrobacterium-Ll, ou co-infiltrado com Agrobacterium-Ll e Agrobacterium (pBIN- NSs). A transferência de Western foi realizada em extratos de folhas brutas 6 dias após a infiltragao, utilizando o anticorpo monoclonal H16.J4 anti-HPV-16 Ll. As amostras nas pistas 1-5 eram de folhas infiltradas com Agrobacterium portadoras dos seguintes vetores: 1, pTRACTP-GFP; 2, pTRA-HLl; 3, pBIN-NSs e pTRA-HLl; 4, pTRACTP-HLl; 5, pBIN-NSs e pTRACTP-HLl. A Figura 5 mostra a detegao de Ll em amostras de folhas de N. benthamiana após infiltragao com Agrobacterium carregando o gene Ll de HPV-16. As folhas de N. benthamiana foram infiltradas por injegao com uma construgao Agrobacterium-Ll, ou co-infiltrado com Agrobacterium-Ll e Agrobacterium (pBIN-NSs). Seis dias após a infiltragao de extratos de folhas brutas foram avaliados por um ELISA de captura H16.V5. A Figura 6 mostra micrografia eletrónica de extrato de planta de N. benthamiana em bruto após infiltragao com Agrobacterium GV3101 (pTRACTP-HLl). VLPs sao indicados pelas setas. A Figura 7 mostra miligramas de HPV-16 Ll produzidos em plantas por agroinfiltragao. As folhas de N. benthamiana foram infiltradas numa mistura de uma construgao Agrobacterium- Ll, Agrobacterium (pBIN-NSs) e Agrobacterium (pTRA-GFP) . Seis dias após a infiltragao, os extratos de folhas brutas foram avaliados por H16.V5 e H16.J4 mAb captura ELISAs. 0 nivel Ll expresso em% da proteina soluvel total (TSP) é exibido para construgöes especificas. A Figura 8 mostra os titulos de anticorpos sistémicos especificos de VLP de HPV-16 induzidos em ratinhos BALB/c após uma ünica imunizagao com um extrato de planta/HLl em bruto. Trés dias após as plantas N. tabacum L. cv. Petite Havana SRI foram infiltradas a vacuo com Agrobacterium (pTRA-HLl) e Agrobacterium (pBIN-NSs), extratos de plantas concentradas foram produzidos e utilizados para ratos imunizados. Os grupos de controlo foram imunizados duas vezes com 10 ug de VLP produzidas com baculovirus, ou uma vez com 1 ug de VLP produzidas com baculovirus. Os soros foram retirados 4 semanas após a imunizagao, diluidos em série (agrupados para cada grupo de ratinhos) e utilizados em um ELISA contra VLP HPV-16. Os valores de OD 492nm foram medidos e os resultados foram registados como o reciproco da diluigao maïs alta, onde a OD é> 2x a do pré-ajuste. A Figura 9 mostra miligramas de HPV-16 LI produzido por kg de material vegetal transgénico. As plantas de N. tabacum L. cv. Petite Havana SRI foram transformadas com Agrobacterium transportando o gene LI de HPV-16. LI foi detetado em extratos de folhas brutas por H16.V5 e H16.J4 mAb captura ELISAs. 0 nivel LI expresso em% do TSP é exibido para construgöes especificas. A Figura 10 mostra um gene de HA do gene completo de otimizado codao humano (H5, 1704 pb) do virus Influenza A/Viet Nam/ 1194/2004 (H5N1) (numero de acesso GenBank AY651333) (SEQ ID NO: 15). A Figura 11 mostra um gene HA otimizado com codao humano truncado com 23 aminoacidos (H5tr, 1635 pb). H5tr foi truncado do nucleótido 1597-1665 para remover o seu dominio de ancoragem da membrana (SEQ ID NO: 16). A Figura 12 mostra a predigao transmembranar para o gene H5 (CBS Prediction Servers, http://www.cbs.dtu.dk). A Figura 13 mostra a transferência de Western de amostras de folhas de N. benthamiana após infiltragao com Agrobacterium que transporta os genes H5 ou H5tr. As amostras de Agrobacterium foram as seguintes: 1, pTRA-H5; 2, pTRA-H5tr; 3, pTRACTP-H5; 4, pTRACTP-H5tr; 5, pTRAERH-H5; 6, pTRAERH-H5tr. A pista 7 continha o extrato de N. benthamiana nao infiltrado. A Figura 14 mostra os vetores de Agrobacterium utilizados neste estudo, nomeadamente pTRAc, pTRAkc-ERH, pTRAkc-rbcsl- cTP e pTRAkc-A. A barra azul claro indica o T-ADN que é transferido para a célula vegetal na transfecgao. 0 gene heterólogo é clonado nos vetores no sitio de clonagem multiplo (MCS). Os vetores compartilham uma série de caracteristicas comuns indicadas por regiöes em cinza. A regiao do T-ADN é flanqueada pela borda esquerda (LB) e pela borda direita (RB). Em qualquer extremidade do MCS sao regiöes de anexo de andaimes (SAR). A expressao do transgene é controlada por um promotor duplo do virus do mosaico da couve-flor 35S (P35SS CaMV) com ligagao do sinal de poliadenilagao do mesmo gene CaMV (pA35S). Replicagao do vetor em Agrobacteriumé iniciado no RK2 ori. Um sitio de iniciagao de replicagao separado, ColEl, é usado em E. colï. 0 vetor pTRAc contém apenas um marcador de resistência a antibióticos (bla) que permite a selegao com ampicilina/ carbenicilina. 0 pTRAkc-ERH, pTRAkc-A e pTRAkc-rbcsl-cTP contêm um segundo marcador antibiótico (nptll) permitindo a selegao com canamicina em plantas. 0 gene nptll é controlado pelo promotor do Agrobacteriumgene nopaline sintase (Pnos), a poladentagao do mesmo gene é anexada a nptll (pAnos). 0 pTRAkc-ERH inclui adicionalmente um sinal secretor (LPH), sua sequência de etiqueta (His6) e uma sequência de sinal de retengao de reticulo endoplasmatico (KDEL) a jusante da MCS. pTRAkc-rbcsl-cTP inclui uma sequência de péptido de sinalizagao de cloroplasto (rbcsl-cTP) a montante do MCS. A Fig. 15 mostra que a expressao de L2 pode ser detetada com cada um dos quatro vetores. N. benthamiana foi infiltrado transitoriamente com a mesma OD de Agrobacterium contendo os diferentes vetores que possuem o gene L2 humanizado. Estes sao pTRA-hL2-A (hL2-A), pTRA-hL2-C (hL2-C), pTRA-hL2-E (hL2-E) e pTRA-hL2-P (hL2-P) . Como um material de planta de controle negativo que nao tinha sido infiltrado com Agrobacterium também foi extraido (-ve). 0 L2 de HPV-16 com E. coli foi utilizado como controle positivo (+ ve). 0 material da planta foi extraido após dois dias (A) e cinco dias (B) e imunotransferido. Os westerns foram sondados usando o coelho pAb-aL2. A Fig. 16 mostra uma quantificagao em bruto da quantidade de L2 presente no material foliar após a infiltragao. N. benthamiana foi infiltrado com a estirpe de Agrobacterium contendo o vetor pTRA-hL2-C. 0 material vegetal foi extraido quatro dias após a infiltragao. Varias quantidades de material foliar (8 mg, 0,8 mg e 0,4 mg) foram determinadas empiricamente e carregadas no western. Os westerns foram sondados usando o coelho pAb-oiL2. A Figura 17 mostra LI e L2 sao co-expressos na mesma regiao. N. benthamiana foi infiltrado com a mesma OD de Agrobacterium contendo o gene Ll humanizado citoplasmicamente alvo misturado e co-infiltrado com Agrobacterium contendo o gene L2 humanizado no vetor também visando a proteina para o citoplasma. 0 material vegetal que foi co-infiltrado foi extraido após quatro dias e imunotransferido (L1/L2). 0 material vegetal nao-plastificado foi usado como negativo (-ve). 0 L2 expresso com E. coli foi carregado e executado como um controlo positivo. As imunotransferências foram testadas com mAb J4 de mouse (aLl) ou com Ab-aL2 (aL2) policlonal de coelho.

Nesta especificagao, onde qualquer sequência de acordo com a descrigao é descrita ou estabelecida de outra forma, a divulgagao pretende abranger sequências de, pelo menos, 75% de homologia, mais preferencialmente de, pelo menos, 77% de homologia, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 80% de homologia, mesmo mais preferencialmente, pelo menos, 82% de homologia, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 85% de homologia, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 87% de homologia, ainda mals preferencialmente, pelo menos, 90% de ί&οκιοίΐοίρΐ:®:,.. ain-da mals pel o amends* :p:2:%: && homologia, ainda mals preferencialmente, pelo menos, 95 % de ;teiiP:l;Qig:X:a:i: ;maAs:' /prefehestó .pelo: menbS:, Ill· -de hbmolbgiax

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Varias caracterlsticas e formas de realizac;ao preferidas da presente invencao sao descritas com referência aos seguintes paragrafos numerados ("paras"). 1. Om método para produsir polipéptidos HPV e/ou um polipéptido E5 do virus da gripe numa planta compreendendo os passos de: clonagem de um gene HPV e/ou de urn gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica os seus equivalentes funcionais num vetor adaptado aos componentes alvo presentes na planta; infiltrando, pelo menos, uma porgao da planta com o vetor ou transformando o tecido vegetal com o vetor de modo a expressar transitoriamente os polipéptidos HPV e/ou um polipéptido H5 do virus da gripe, e/ou para criar uma planta transgénica; e - recuperar os polipéptidos HPV e/ou um polipéptido H5 do virus da gripe expresso pela planta. 2. Um método de acordo com o paragraf o 1, em que os polipéptidos HPV sao selecionados do grupo que consiste em uma proteina Ll de HPV; um péptido quimico de HPV Ll fundido com outro péptido de antigénio HPV; um péptido quimérico de HPV Ll fundido a um péptido heterólogo derivado de qualquer epitopo antigénico, célula B ou célula especifica de células especificas e uma proteina LV de HPV ou seus equivalentes funcionais. 3. Um método de acordo com qualquer um dos paragrafos 1 e 2, em que os componentes da planta sao selecionados do grupo que consiste em plastidios, reticulos endoplasmaticos, citoplasma e apoplastos. 4. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que as sequências de segmentagao estao incluidas no vetor. 5. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que o vetor inclui promotores e outros reguladores ou semelhantes, operativamente ligados a sequência de codificagao do vetor. 6. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que os vetores sao vetores binarios. 7. Um método de acordo com o paragrafo 6 em que os vetores sao vetores binarios Agrobacterium tumefaciens. 8. Um método de acordo com o paragrafo 2, em que o gene LI de HPV; gene quimérico de HPV Ll fundido com outro gene de antigénio HPV; gene quimérico de HPV Ll fundido a um gene heterólogo derivado de qualquer epitopo antigénico, célula B ou célula especifica de células especificas; gene HPV L2; ou o gene H5 do virus da gripe é um gene otimizado. 9. Um método de acordo com o paragrafo 8, em que o gene otimizado é otimizado para o codao humano, o codao BCG otimizado ou o codao vegetal otimizado. 10. Um método de acordo com o paragrafo 2, em que o gene Ll de HPV ou os genes das quimeras de HPV Ll sao modificados para serem deficiënte em sinal de localizagao nuclear. 11. Um método de acordo com qualquer subsequente anterior incluindo o passo de co-infiltragao da planta com uma proteina supressora adaptada para inibir o silenciamento de genes pós-transcrigao em uma planta. 12. Um método de acordo com o paragrafo, em que a proteina supressora é a proteina NS do virus da toxina manchada de tomate ou o pl9 do virus do busto de tomate. 13. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que os plastidios sao selecionados a partir de cloroplastos, cromoplastos e leucoplastos. 14. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que a infiltragao é feita por injegao direta ou por vacuo. 15. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que a infiltragao e/ou transformagao da planta é conseguida com Agrobacterium tumefaciens que foi transformado para aceitar o vetor. 16. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que a planta é selecionada de Nicotiana benthamiana e N. tabacum. 17. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que a infiltragao é realizada nas folhas da planta. 18. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que a infiltragao por injegao direta é realizada na regiao abaxial da folha. 19. Um método de acordo com qualquer paragrafo anterior em que o gene HPV e/ou um gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica os seus equivalentes funcionais sao selecionados de SEQ ID NOS. 13, 14, 15 e 16. 20. Um método de produgao de polipéptido HPV e/ ou de um polipéptido H5 de virus da gripe numa planta em que substancialmente a planta inteira é infiltrada com um vetor adequado por meio de infiltragao a vacuo. 21. Um polipéptido HPV e/ou um polipéptido H5 do virus da gripe sempre que produzido de acordo com um método de qualquer um dos paragrafos 1 a 20. 22. Uso de um vetor no qual um gene de HPV e/ou um gene H5 de virus da gripe foi clonado, cujo vetor é adaptado para atingir os componentes presentes em uma planta, para produzir uma planta transgénica capaz de expressar polipéptidos de HPV e/ou virus polipéptidos da gripe H5. 23. Um vetor no qual um gene de HPV e/ou um gene H5 de virus da gripe tenha sido clonado, cujo vetor é adaptado para os componentes alvo presentes em uma planta, para produzir uma planta transgénica capaz de expressar polipéptidos HPV e/ou polipéptidos H5 do virus da gripe. 24. Uma vacina profilatica ou terapêutica constituida por um polipéptido HPV ou por um polipéptido H5 do virus da gripe capaz de induzir uma resposta imunogénica num hospedeiro adequado, quando produzido por um método de qualquer um dos paragrafos 1 a 20. 25. Uma planta transgénica, parte ou sua progénie contendo uma célula capaz de expressar um polipéptido HPV e/ou um polipéptido H5 do virus da gripe. 26. Um método substancialmente como aqui anteriormente descrito ou exemplificado. 27. Um polipéptido HPV e/ou um polipéptido H5 do virus da gripe substancialmente como aqui anteriormente descrito ou exemplificado. 28. Utilizagao de um vetor no qual um gene HPV e/ou um gene H5 do virus influenza foram clonados substancialmente como aqui anteriormente descrito ou exemplificado. 29. Um vetor no qual um gene HPV e/ou um gene H5 do virus da gripe foram clonados substancialmente como aqui anteriormente descrito ou exemplificado. 30. Uma vacina profilatica ou terapêutica substancialmente como aqui anteriormente descrito ou exemplificado. 31. Uma planta transgénica, parte ou sua progénie substancialmente como aqui anteriormente descrito ou exemplificado.

REIVINDICAQÖES 1. Método para produzir urn polipéptido H5 do virus da gripe numa planta compreendendo os passos de: i) clonar um gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica um polipéptido H5 num vetor adaptado para atingir um componente presente na planta, em que a planta componente é o reticulo endoplasmatico; ii) infiltragao de, pelo menos, uma porgao da planta com o vetor ou tecido de planta transformante com o vetor de modo a expressar transitoriamente o polipéptido H5 do virus da gripe; e iii) recuperagao do polipéptido H5 do virus da gripe expresso pela planta. 2. Método de acordo com a reivindicagao 1, em que uma ou mais sequências de direcionamento que codificam um polipéptido para dirigir o polipéptido H5 do virus da gripe do citoplasma para o componente da planta estao incluidas no vetor. 3. Método de acordo com a reivindicagao 1 ou a reivindicagao 2, em que o vetor inclui promotores e outros reguladores ou semelhantes, operativamente ligados a sequência de codificagao do vetor. 4. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, em que os vetores sao vetores binarios, de preferência vetores binarios de Agrobacterium tumefaciens. 5. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, em que o gene H5 do virus da gripe é um gene otimizado para

Claims (9)

1. o uso de codöes, de preferência um gene otimizado com uso de codao BCG ou usado pelo codao humano.
2. 6. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, incluindo ainda um passo de co-infiltragao da planta com uma proteina supressora adaptada para inibir o silenciamento de genes pós-transcrigao era uma planta, como a proteina NSs do virus da mancha do tomate ou a pl9 do virus duplo do tomate.
3. 7. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, em que a infiltragao é feita por injegao direta ou por vacuo.
4. 8. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior em que a infiltragao e/ou a transformagao da planta é conseguida com Agrobacterium tumefaciens que foi transformado para aceitar o vetor.
5. 9. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, em que a planta é selecionada de Nicotiana benthamiana e N. tabacum.
6. 10. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, em que o gene H5 do virus da gripe ou o acido nucleico que codifica um seu equivalente funcional é selecionado a partir das sequências conforme estabelecido nas Figuras 10 e 11.
7. 11. Método de acordo com qualquer reivindicagao anterior, em que a infiltragao é realizada nas folhas da planta, de preferência em que a infiltragao é realizada por injegao direta na regiao abaxial da folha.
8. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicagöes 1 a 10, em que substancialmente toda a planta é infiltrada com urn vetor adequado por meio de infiltragao a vacuo.
9. 13. Utilizagao de um vetor no qual um gene H5 do virus da gripe ou acido nucleico que codifica um polipéptido H5 foi clonado, cujo vetor esta adaptado para direcionar o polipéptido H5 para o reticulo endoplasmatico em uma planta de modo a expressar transitoriamente o polipéptido H5 do virus da gripe no citoplasma e, em seguida, importa o polipéptido H5 do virus da gripe no reticulo endoplasmatico.