ES2842211T3

ES2842211T3 - Pseudovirión del virus del papiloma humano producido por plantas

Info

Publication number: ES2842211T3
Application number: ES14776902T
Authority: ES
Inventors: Edward Rybicki; Inga Isabel Hitzeroth
Original assignee: University of Cape Town
Current assignee: University of Cape Town
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2034-07-25
Also published as: WO2015011676A1; EP3024937A1; US20160168583A1; EP3024937B1; CA2918158C; CA2918158A1; US9994859B2; ZA201600098B

Abstract

Un metodo para producir un pseudovirion del virus del papiloma humano (VPH) en una celula vegetal, comprendiendo el metodo las etapas de: (i) introducir en la celula vegetal: (a) un primer acido nucleico que codifica un polipeptido L1 del VPH; y (b) un segundo acido nucleico que codifica un polipeptido L2 del VPH, en el que el primer y segundo acidos nucleicos estan contenidos en al menos un vector de expresion, (c) un vector de replicacion derivado de un geminivirus que comprende una secuencia de origen de replicacion (Ori) reconocida por una proteina asociada a replicacion viral (Rep), el vector de replicacion comprende ademas un tercer acido nucleico que codifica un polipeptido heterologo, en el que el vector de replicacion es capaz de experimentar la replicacion del circulo rodante, y (d) un cuarto acido nucleico que codifica una proteina Rep, en el que la replicacion del vector replicante es iniciada por la proteina Rep, y en el que el tercer acido nucleico esta operativamente unido a una secuencia reguladora que permite la expresion del polipeptido heterologo en una celula de mamifero; (ii) expresar el polipeptido L1 del VPH y el polipeptido L2 del VPH y la proteina Rep en la celula vegetal, y (iii) replicar el vector de replicacion de la secuencia de Ori reconocida por la proteina Rep en la celula vegetal, para producir un alto numero de copias de un pseudogenoma, en el que el pseudogenoma es mas pequeno que el vector de replicacion, es replicacionalmente inerte en celulas de mamifero en la ausencia de la proteina Rep, y comprende el tercer acido nucleico, en el que los polipeptidos L1 del VPH y L2 del VPH expresados se ensamblan, junto con una copia del pseudogenoma y encapsulan el pseudogenoma para producir un pseudovirion del VPH.

Description

DESCRIPCIÓN

Pseudovirión del virus del papiloma humano producido por plantas

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir pseudoviriones del virus del papiloma humano (VPH) en células vegetales, la planta produjo pseudoviriones por sí misma, un ensayo de neutralización que usa los pseudoviriones producidos por la planta y composiciones farmacéuticas que comprenden los pseudoviriones producidos por la planta.

Los solicitantes han utilizado nuevos vectores de replicación autónoma junto con vectores no replicantes previamente desarrollados para producir pseudoviriones (PsV) del VPH-16 in planta. Los ensayos de expresión preliminares establecieron condiciones y plazos óptimos para la producción de cada elemento individual necesario para el ensamblaje de los PsV del VPH. Los elementos estructurales necesarios para la producción de PsV son las proteínas L1 y L2 del VPH, producidas por los vectores de expresión de plantas no replicantes pTRAc-hL1 y pTRAc-hL2, respectivamente; y ADN circular de cadena doble a partir de uno de los tres replicones derivados de pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ o pRIC3-mluc+. Las supuestas partículas de PsV, así como las partículas similares a virus (VLP) de L1/L2 producidas en ausencia de los replicones, se recolectaron de las plantas y se purificaron mediante sucesivas etapas de ultracentrifugación en gradiente. Las fracciones de gradiente que contenían L1 se reunieron y dializaron contra PBS NaCl con alto contenido de sal (0,5 M), para obtener PsV purificados. Se confirmó mediante microscopía electrónica que eran conformacionalmente similares a las VLP y los PsV producidos en otros sistemas, y mediante PCR que contenían el correspondiente replicón de ADN encapsulado. Se utilizaron PsV purificados para demostrar su uso en un ensayo de neutralización. Dos de los tres PsV creados, a saber, mSEAP y PsV mluc+, demostraron una pseudoinfección y neutralización exitosa con un anticuerpo neutralizante común del VPH-16, mientras que los PsV mSEAP+ no mostraron expresión del gen informador después de la pseudoinfección de células de mamífero. Este es el primer informe conocido de la producción y purificación de PsV del VPH, así como VLP de L1/L2 in planta, así como la primera demostración de un ensayo de neutralización basado en pseudovirión (PBNA) utilizando PsV producidos por plantas.

Los cánceres de cuello uterino provocados por el VPH de alto riesgo son la segunda forma de cáncer más prevalente en las mujeres de los países en desarrollo. África en particular ha sido identificado como una región de alto riesgo para la enfermedad. Las vacunas de VLP de L1 desarrolladas recientemente, Cervarix® y GardasilMR, protegen contra la infección por VPH-16 y VPH-18, o VPH-6, VPH-11, VPH-16 y VPH-18, respectivamente. Ambas vacunas disponibles actualmente, Cervarix® y GardasilMR, provocan una respuesta de anticuerpos neutralizantes fuerte y prolongada, y se ha demostrado que tienen una eficacia sostenida hasta 5 años después de la administración. Si bien estas vacunas han demostrado ser muy prometedoras para reducir la carga de la enfermedad, el desarrollo y la producción de vacunas de VLP siguen siendo prohibitivamente costosos, particularmente en los países en desarrollo.

Un elemento clave de cualquier iniciativa de desarrollo de una vacuna contra el VPH es el ensayo de neutralización basado en pseudovirión (PBNA). La inducción de anticuerpos neutralizantes es actualmente la mejor estimación de la eficacia del candidato a vacuna para las pruebas de la vacuna contra el VPH de segunda generación. Hasta hace poco, la identificación de anticuerpos neutralizantes en suero se basaba en el uso de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o ensayos de neutralización con virus completo (Dessy et al., 2008). Sin embargo, las mejoras en la eficiencia de producción de PsV del VPH en la última década han permitido el desarrollo del PBNA. Desarrollado por el grupo de John Schiller en el Centro de Investigación del Cáncer, este ensayo utiliza células de mamíferos para la producción intracelular de PsV que expresan un gen informador de fosfatasa alcalina secretada (SEAP) (Buck et al., 2005a), y desde entonces se ha convertido en el estándar dorado para las pruebas de neutralización de las posibles vacunas contra el VPH, lo que permite una detección rápida y sin sesgos de anticuerpos y epítopos neutralizantes (Stanley et al., 2008). Si bien se ha demostrado que este método de producción es extremadamente eficaz para la producción de PsV, la producción de cultivos celulares es costosa y los kits de ensayo de SEAP son particularmente costosos en comparación con otros ensayos informadores de uso común, tales como luciferasa o GFP. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos de producción de PsV alternativos para permitir el desarrollo de una vacuna candidata asequible y, en particular, pruebas económicas de sueros inmunes.

Durante mucho tiempo se ha entendido que la producción de anticuerpos de IgG neutralizantes en respuesta a la vacunación es un aspecto clave de la inmunidad protectora (Robbins et al., 1995). Se ha sugerido que puede ser posible estimar con precisión el nivel requerido de anticuerpo neutralizante requerido para la protección, siempre que la concentración, el isotipo y la actividad biológica secundaria de estos anticuerpos puedan medirse con precisión (Robbins et al., 1995). Los ensayos de neutralización se desarrollaron como un método para cuantificar con precisión las capacidades neutralizantes de los sueros inmunes, generalmente en respuesta a una exposición a un virus vivo o candidato a vacuna, así como para identificar epítopos neutralizantes (Ochsenbauer y Kappes, 2009; Yeager et al., 2000).

La primera demostración de neutralización in vitro del virus del papiloma fue hecha por Dvoretzky et al. (1980), quienes demostraron la neutralización con antisueros del virus del papiloma bovino tipo 1 (VPB-1) producidos en conejos para confirmar el papel del VPB-1 en la formación de focos en líneas celulares de ratón. Los primeros esfuerzos para establecer un ensayo de neutralización in vitro robusto y sensible para los VPH se vieron obstaculizados por las dificultades en la producción de virus infeccioso. La producción de viriones infecciosos in vitro se logró por primera vez injertando material infectado con VPH-11 en ratones atímicos; los injertos se dejaron para que se convirtieran en quistes condilomatosos durante un período de 3-5 meses, antes de ser recolectados y purificados para viriones del VPH (Kreider et al., 1987). Este método se utilizó para producir viriones para su uso en el primer ensayo de neutralización de hecho. Se identificaron y aislaron anticuerpos monoclonales neutralizantes de los antisueros del VPH-11 o VPB-1. Estos anticuerpos se usaron luego para demostrar la neutralización de viriones intactos por ELISA, así como para identificar varios epítopos conformacionales neutralizantes (Christensen et al., 1990). El mismo grupo usó este método para identificar con éxito los anticuerpos neutralizantes del VPH en sueros humanos por primera vez, y además demostró que ELISA era un buen informador de la presencia de anticuerpos neutralizantes en sueros humanos (Christensen et al., 1992). Otro enfoque acopló la neutralización de la infección por VPH-11 con la detección por RT-PCR de las transcripciones de ARNm del VPH para crear un ensayo de neutralización semicuantitativo (Smith et al., 1995). Si bien estos enfoques fueron nominalmente exitosos en la identificación de anticuerpos neutralizantes, la detección permaneció limitada en el mejor de los casos y los procedimientos utilizados consumieron mucho tiempo y fueron costosos.

Un gran paso adelante en la tecnología del ensayo de neutralización llegó con el advenimiento de la producción de PsV, que anuló la necesidad del costoso y lento método de producción de xenoinjertos. Roden et al. (1996) utilizaron células BPHE-1 de hámster para generar PsV de VPB-1 o VPH-16. Estos se utilizaron para demostrar la formación de focos en células C127, utilizando la técnica demostrada por Dvoretzky et al. (1980). Estos investigadores demostraron además que los anticuerpos neutralizantes en los antisueros del VPH-16 impedían la formación de focos, demostrando un ensayo de neutralización cuantitativo de un tipo del VPH de alto riesgo utilizando PsV por primera vez (Roden et al., 1996). En este informe, los autores señalaron que el ensayo de transformación de foco requirió de 2 a 3 semanas y que la inclusión de un gen marcador o informador mejoraría en gran medida la velocidad del ensayo. Esto se intentó en primer lugar uniendo químicamente un plásmido informador de p-lactamasa (BLAM) a VLP o viriones infecciosos, e incubándolos con antisueros de VP antes de infectar varias líneas celulares de mamíferos. Los primeros intentos demostraron neutralización, pero resultaron en <1% de infección de las células con estos PsV (Muller et al., 1995). Yeager et al., (2000) y Bousarghin et al., (2002) demostraron este enfoque con más éxito, utilizando un plásmido informador BLAM o luc y un método alternativo para unir el plásmido a las VLP. Más importante aún, varios grupos generaron PsV con genes informadores encapsulados y demostraron su uso para ensayos de neutralización (Buck et al., 2005a; Fleury et al., 2008; Kawana et al., 1998; Rossi et al., 2000; Stauffer et al., 1998; Touze y Coursaget, 1998; Unckell et al., 1997). Si bien los primeros intentos fueron ineficaces debido a los bajos niveles de producción de PsV, esto se mejoró mediante la generación intracelular de altos rendimientos de PsV de L1/L2 y la incorporación de un plásmido informador SEAP (Buck et al., 2004). Estos PsV se utilizaron con un kit de detección s Ea P disponible comercialmente para demostrar un ensayo de neutralización basado en pseudoviriones que fue al menos tan sensible como, y potencialmente de tipo más específico, que el ensayo de neutralización estándar basado en ELISA (Pastrana et al., 2004).

Aunque el sistema desarrollado por Pastrana et al., (2004) se considera el ensayo de neutralización de "mejores prácticas" actual, queda margen de mejora. En particular, los costes de producción de PsV podrían disminuir considerablemente mediante el uso de un sistema de producción menos costoso (Brondyk, 2009). Se ha demostrado que la expresión de proteínas recombinantes en plantas tiene un coste de producción significativamente menor en comparación con la producción en células de mamíferos (Tiwari et al., 2009). Como tal, la expresión en plantas puede proporcionar una alternativa atractiva para la producción de PsV para su uso en el PBNA.

La expresión de proteínas recombinantes en plantas se ha desarrollado durante los últimos veinte años a partir de una curiosidad a finales de la década de 1980 hasta un sistema de producción de relevancia médica e industrial en la actualidad. Los primeros esfuerzos se basaron en la transformación de plantas para producir líneas transgénicas estables. Esto se logró mediante la administración biolística o, más recientemente, la agroinfiltración (Daniell et al., 2009). Si bien la producción de proteínas transgénicas sigue siendo un sistema útil y viable, los avances en los métodos y la tecnología de expresión transitoria han posicionado la expresión transitoria como el método preferido para la producción a escala industrial en plantas (Rybicki, 2010). Dos factores clave que han jugado un papel central en esta transición son los vectores de expresión virales, o derivados de virus, y el desarrollo de la tecnología de agroinfiltración.

La agroinfiltración se desarrolló originalmente como una alternativa al bombardeo biolístico para la transformación estable de plantas (Kapila et al., 1997). Este proceso se basa en la capacidad de transferencia de ADN de A. tumefaciens para introducir ADN foráneo en las células vegetales. A. tumefaciens se puede usar para transferir un transgén ubicado en el segmento de transferencia de ADN (ADN-T) del plásmido Ti a plantas infiltradas con una suspensión bacteriana de la bacteria transformada. El ADN-T se transporta al núcleo de la planta y esto permite la transformación de la planta mediante la integración del ADN-T en el genoma de la planta (Zupan et al., 2000). Sin embargo, es importante destacar que un transgén incorporado en el ADN-T también puede expresarse de forma transitoria, a partir de ADN-T no integrado o episomal, lo que da como resultado la expresión sistémica de una proteína recombinante sin la necesidad de una transformación estable (Kapila et al., 1997).

Los vectores virales fueron el primer método de expresión transitoria desarrollado para plantas. Los primeros esfuerzos simplemente insertaron un gen o epítopo recombinante en el genoma de virus tal como VMT, virus del mosaico del caupí (VMCP) o PVX, ya sea fusionado a la proteína de la cubierta viral o por separado, bajo el control de un promotor viral subgenómico duplicado (Durrani et al., 1998; Gleba et al., 2007; Turpen et al., 1995). Si bien esta aplicación produjo proteína inmunogénica, los niveles de expresión fueron más bajos que los encontrados en plantas transgénicas. Otros problemas con estos vectores virales de 'primera generación' incluyeron una tendencia a volver al virus natural, restricciones en el tamaño del inserto, dificultad de administración e incapacidad para formar VLP (Kohl et al., 2006; Rybicki, 2010; Varsani et al., 2006).

Estas limitaciones impulsaron un trabajo adicional para desarrollar vectores virales de "segunda generación" o deconstruidos. Este enfoque utilizó solo los elementos virales deseables, en particular la maquinaria replicativa, para fabricar vectores sintéticos capaces de inducir la expresión transgénica en plantas. Si bien estos vectores generalmente no son infecciosos por sí solos, cuando se combinan con la tecnología de agroinfiltración pueden dar como resultado una expresión transitoria sistémica de proteínas a niveles comparables a los de las plantas transgénicas (Tiwari et al., 2009). Este enfoque tiene las ventajas de marcos de tiempo cortos (3-7 días) en comparación con la transformación estable (6-9 meses), niveles de expresión significativos y un escalado y purificación rápidos y fáciles. Esto hace que la expresión transitoria mediada por agroinfiltración a través de vectores virales sea un enfoque ideal para la producción de proteínas y partículas médicamente relevantes en plantas. De particular interés es el uso de expresión transitoria para la producción de VLP y PsV en plantas, ya que existe la posibilidad de una reducción en el coste en comparación con los sistemas tradicionales (Santi et al., 2006).

Varios grupos en plantas han producido VLP de L1 de virus de papiloma. La mayoría ha utilizado plantas transgénicas (Biemelt et al., 2003; Warzecha et al., 2003) con bajos rendimientos resultantes. Los primeros intentos de expresión transitoria de L1 también produjeron bajos niveles de expresión, así como una aparente incapacidad para formar VLP (Varsani et al., 2006). Sin embargo, la agroinfiltración de un vector de Agrobacterium que codifica una proteína L1 optimizada para codones humanos proporcionó un rendimiento de proteína mucho mayor y demostró que la expresión transitoria de VLP del VPH-16 a niveles altos es un enfoque factible para la producción de vacunas candidatas inmunogénicas contra el VPH (Maclean et al., 2007).

El vector utilizado para producir L1 a niveles de expresión tan altos, pTRAc, se desarrolló en el Instituto Fraunhofer de Biología Molecular y Biología Aplicada. Este vector utilizó un promotor 35S del CaMV con potenciador transcripcional duplicado, región no traducida 5' de la chalcona sintasa y señal de poliadenilación de 35S del CaMV para la expresión de genes foráneos. Este vector también se ha utilizado para expresar la proteína de la cápside menor L2 en plantas (Pereira, 2008). Sin embargo, no se ha demostrado previamente de manera concluyente que la coexpresión de L1 y L2 forme VLP in planta.

Un desarrollo adicional en la tecnología de vectores ha sido el uso de geminivirus vegetales de ADN monocatenario del género Mastrevirus, familia Geminiviridae, para crear vectores de replicación. Estos vectores de replicación incorporan una secuencia de Ori (origen de replicación) viral que se duplica a cada lado de un casete de expresión génica. Los vectores de replicación además pueden incluir o no un gen de la proteína asociada a la replicación viral (Rep). La agroinfiltración de un único constructo de replicón que contiene Rep, o de una constructo de replicón más un constructo de Rep expresada en trans mediante técnicas estándar, da como resultado la liberación de un "replicón" similar a un plásmido que se multiplica bajo el control de la proteína Rep hasta un número de copias de varios miles por célula (Regnard et al., 2010). Esto puede resultar en un aumento significativo de la expresión de genes de interés en comparación con la expresión del vector no replicante. Aunque la expresión de un gen Rep de geminivirus y un constructo de replicón afín (por ejemplo: secuencia Ori del mismo virus) en una célula vegetal conduce a la replicación del replicón, no se sabe que esto ocurra en células de mamífero.

Se ha demostrado la encapsulación o unión covalente de ADN por VLP del VPH para formar PsV en sistemas de células de levadura, insectos, bacterias y mamíferos (Buck et al., 2005a; Roden et al., 1996; Rossi et al., 2000; Unckell et al., 1997). Buck et al., (2005a) demostraron que la encapsulación intracelular del pseudogenoma es más eficiente que los métodos de desmontaje y reensamblaje in vitro para la producción de PsV del VPH, probablemente debido a factores celulares que ayudan en el ensamblaje correcto de los viriones (Buck et al., 2008; Fleury et al., 2008; Peng et al., 2011). Actualmente, los pseudoviriones del VPH no se han expresado con éxito en sistemas de expresión de plantas. Como se discutió anteriormente, la expresión transitoria en plantas ofrece varias ventajas significativas para esta aplicación: se ha demostrado que la expresión de proteínas en plantas es segura, más barata que otros sistemas de expresión y potencialmente extremadamente rápida (Ma et al., 2005; Schillberg et al., 2005). Otra ventaja significativa es que no hay necesidad de procesamiento posterior de proteínas (por ejemplo, glicosilación), como ocurre con los sistemas de expresión de proteínas recombinantes bacterianas (Giorgi et al., 2010). Si bien se ha observado que la N-glicosilación puede diferir en las plantas (específicamente, las plantas no pueden sintetizar la p-1,4-galactosa y el ácido siálico), este problema puede superarse con los avances recientes en el tabaco transgénico para proporcionar una maquinaria de glicosilación 'humanizada' (Bakker et al., 2006; Gleba et al., 2007). Además, se ha sugerido que L1 o L2 glicosilados no son una parte importante del virión ensamblado (Zhou et al., 1993).

En esta solicitud, los inventores evaluaron la viabilidad de expresar pseudoviriones de L1/L2 del VPH con un casete informador de mamífero encapsulado, derivado de un vector derivado de geminivirus replicante, in planta. Para lograr esto, los plásmidos de pTRAc que expresan las proteínas L1 y L2 se infiltraron conjuntamente en plantas con plásmidos de replicación autónoma novedosos, desarrollados en este estudio, para crear PsV de L1/L2 del VPH. Además, se purificaron estas partículas mediante centrifugación basada en densidad, para pruebas posteriores en un sistema de mamíferos.

Esta invención describe, por primera vez, la producción satisfactoria de PsV del VPH en plantas y la prueba de PsV en un PBNA estándar. Las VLP de L1/L2 del VPH, así como los PsV que contienen un pseudogenoma de casete informador de mamífero derivado del virus de la enana amarilla del frijol de geminivirus (BeYDV), se produjeron en grandes cantidades in planta. Las partículas encapsularon fácilmente el ADN del pseudogenoma proporcionado por los vectores de replicación. Además, se purificaban fácilmente, eran estables a alta temperatura y eran conformacionalmente indistinguibles de los PsV producidos en otros sistemas. Lo más importante es que se utilizaron con éxito para realizar un PBNA en células de mamíferos. La producción transitoria de PsV del BPH basada en plantas es una estrategia factible y debe investigarse más a fondo como una alternativa de bajo coste al cultivo de células de mamíferos para la producción de PsV.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona pseudoviriones producidos en células vegetales, métodos para producir pseudoviriones en plantas, un ensayo de neutralización que usa los pseudoviriones producidos por plantas y composiciones farmacéuticas que comprenden los pseudoviriones producidos por plantas.

La presente invención enseña que la coexpresión transitoria de L1 del VPH y L2 del VPH en una célula vegetal junto con la replicación concurrente, a un alto número de copias, de un replicón derivado del virus ADNcs que contiene un gen que codifica un polipéptido heterólogo de interés, da como resultado el ensamblaje de L1 del VPH y L2 del VPH en partículas similares a virus que encapsulan el replicón para formar pseudoviriones. Además, los pseudoviriones y el método para producirlos descritos en esta invención proporcionan un avance significativo para la producción potencial de vacunas y vehículos de administración de ADN para su uso en terapia génica.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un pseudovirión del virus del papiloma humano (VPH) en una célula vegetal, comprendiendo el método las etapas de:

(i) introducir en la célula vegetal:

(a) un primer ácido nucleico que codifica un polipéptido L1 del VPH; y

(b) un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido L2 del VPH,

en el que el primer y segundo ácidos nucleicos están contenidos en al menos un vector de expresión,

(c) un vector de replicación derivado de un geminivirus que comprende una secuencia de origen de replicación (Ori) reconocida por una proteína asociada a replicación viral (Rep), el vector de replicación comprende además un tercer ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, en el que el vector de replicación es capaz de experimentar la replicación del círculo rodante, y

(d) un cuarto ácido nucleico que codifica una proteína Rep,

en el que la replicación del vector replicante es iniciada por la proteína Rep, y

en el que el tercer ácido nucleico está operativamente unido a una secuencia reguladora que permite la expresión del polipéptido heterólogo en una célula de mamífero;

(ii) expresar el polipéptido L1 del VPH y el polipéptido L2 del VPH y la proteína Rep en la célula vegetal, y

(iii) replicar el vector de replicación de la secuencia de Ori reconocida por la proteína Rep en la célula vegetal, para producir un alto número de copias de un pseudogenoma, en el que el pseudogenoma es más pequeño que el vector de replicación, es replicacionalmente inerte en células de mamífero en la ausencia de la proteína Rep, y comprende el tercer ácido nucleico,

en el que los polipéptidos L1 del VPH y L2 del VPH expresados se ensamblan, junto con una copia del pseudogenoma y encapsulan el pseudogenoma para producir un pseudovirión del VPH.

Se apreciará que el primer y segundo ácidos nucleicos están operativamente unidos a secuencias reguladoras que permiten la expresión de los polipéptidos L1 del VPH y L2 del VPH.

Se apreciará que la proteína Rep, codificada por un cuarto ácido nucleico, está unida operativamente a secuencias reguladoras, lo que permite la expresión de la proteína Rep. Se apreciará además que el cuarto ácido nucleico puede expresarse a partir de (i) una secuencia de ácido nucleico contenida en el vector de replicación, (ii) una secuencia de ácido nucleico contenida en al menos un vector de expresión, (iii) una secuencia de ácido nucleico contenida en un vector independiente, que no es el vector de (i) o (ii) anteriores; o (iv) una secuencia de ácido nucleico integrada en el ADN genómico de la célula vegetal.

En una realización preferida de la invención, el tercer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo, que incluye un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen informador, un gen terapéutico o un gen que codifica un polipéptido antigénico, tal como un gen que codifica constructos derivados de la oncoproteína E6 o E7 del VPH para el tratamiento de lesiones cervicales o carcinomas provocados por los VPH. Preferiblemente, el gen que codifica el polipéptido heterólogo es un gen informador seleccionado de un gen de luciferasa o un gen de fosfatasa alcalina secretada.

En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos L1 del VPH y L2 del VPH son del VPH 16. Sin embargo, una persona experta en la técnica apreciará que la presente invención funcionará con la misma eficacia para un tipo de VPH para el que se pueden producir partículas similares a virus, que incluyen pero no se limitan a VPH 6, VPH 11, VPH 18, VPH 31, VPH 33, VPH 45, VPH 48, VPH 52 y/o VPH 58, o combinaciones de los mismos.

En otra realización más de la invención, el método incluye una etapa de recuperación del pseudovirión del VPH de la célula vegetal.

De acuerdo a un segundo aspecto de la invención, se proporciona un ensayo para detectar la presencia de un anticuerpo neutralizante del VPH en un sujeto, incluyendo el ensayo las etapas de:

(i) combinar un pseudovirión del VPH producido de acuerdo con el método de la invención, con una muestra biológica del sujeto para formar una composición de la muestra biológica, en la que el polipéptido heterólogo es un polipéptido informador; y

(ii) combinar un pseudovirión del VPH producido de acuerdo con el método de la invención, con una muestra biológica de control, en la que la muestra biológica de control no contiene un anticuerpo neutralizante del VPH, para formar una composición de muestra de control, en la que el polipéptido heterólogo es un polipéptido informador;

(iii) poner en contacto e incubar una célula de mamífero capaz de infectarse con VPH con la composición de la muestra biológica de (i) o la composición de muestra de control de (ii); y

(iv) ensayar la expresión del polipéptido informador;

en el que la disminución de la expresión del polipéptido informador en las células de mamífero en contacto con la composición de la muestra biológica, en comparación con las células de mamífero en contacto con la composición de la muestra de control, es indicativa de la presencia de un anticuerpo neutralizante del VPH en la muestra biológica.

Preferiblemente, el polipéptido informador usado en el ensayo se selecciona de un polipéptido luciferasa (luc) o fosfatasa alcalina secretada (SEAP).

Más preferiblemente, el ensayo se realiza en una muestra biológica de un sujeto humano.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un pseudovirión del VPH producido de acuerdo con el método de la invención, comprendiendo el pseudovirión del VPH una cápside, en la que la cápside comprende los polipéptidos L1 del VPH y L2 del VPH, en la que la cápside encapsula el pseudogenoma que comprende el tercer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo, en el que el tercer ácido nucleico está operativamente unido a una secuencia reguladora que permite la expresión del polipéptido heterólogo en una célula de mamífero, en el que la replicación del vector replicante se inicia a partir de la secuencia de Ori reconocida por la proteína Rep, y en el que el pseudovirión del VPH se produce y se recupera de la célula vegetal.

En una realización preferida de la invención, se inicia la replicación del pseudogenoma, en una célula de mamífero infectada por el pseudovirión del VPH, en presencia de una proteína Rep. Preferiblemente, la proteína Rep está codificada por una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a una secuencia reguladora que permite la expresión de la proteína Rep en la célula de mamífero. Los expertos en la técnica apreciarán que la proteína Rep puede expresarse a partir de una secuencia de ácido nucleico contenida en el pseudogenoma, una secuencia de ácido nucleico contenida en un vector independiente; o de una secuencia de ácido nucleico integrada en el ADN genómico de la célula de mamífero. Se apreciará además que la expresión de la proteína Rep en la célula de mamífero en presencia del pseudogenoma dará como resultado la replicación del pseudogenoma.

Preferiblemente, el polipéptido heterólogo de esta realización de la invención se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido informador, un polipéptido terapéutico o un polipéptido antigénico, tal como un gen que codifica constructos derivados de la oncoproteína E6 o E7 del VPH para el tratamiento de lesiones cervicales o carcinomas causados por VPH.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un pseudovirión del virus del papiloma humano producido mediante el método de la invención o que contiene el pseudovirión del virus del papiloma humano de la invención y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Se apreciará que la composición farmacéutica puede ser una composición de vacuna o un vehículo de administración de ADN.

Breve descripción de las figuras

A continuación, se describirán realizaciones no limitantes de la invención a modo de ejemplo únicamente y con referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: Replicón y vector pRIC3 de segunda generación. ColE1 ori, origen de replicación para Escherichia coli; RK2 ori, origen de replicación para Agrobacterium tumefaciens; bla, gen bla de resistencia a ampicilina/carbenicilina; LB y RB, bordes izquierdo y derecho para la integración del ADN-T; P35SS, promotor 35S del CaMV con potenciador transcripcional duplicado; CHS, región no traducida 5' de la chalcona sintasa; MCS, sitio de clonación múltiple, pA35S, señal de poliadenilación 35S del CaMV; LIR, región intergénica larga del BeYDV; SIR, región intergénica corta del BeYDV; rep, gen rep del BeYDV. La barra curva dentro de los mapas de plásmidos indica el ADN-T transferido a la célula vegetal durante la transfección.

Figura 2: Construcción de pRIC3-mSEAP y replicón. Plásmido de replicación autónoma pRIC3-mSEAP. (A) Etapas finales de clonación para crear pRIC3-mSEAP. (B) EF-1a, promotor alfa del factor 1 de alargamiento; SEAP, gen de la fosfatasa alcalina secretada; PoliA del SV40, señal de poliadenilación del virus de simio 40. La barra curva dentro del mapa del plásmido indica ADN-T transfectado en células vegetales. (C) Replicón circularizado después de la liberación del ADN-T.

Figura 3: Construcción de pRIC3-mSEAP+ y replicón. pRIC3-mSEAP+ plásmido de replicación autónoma. (A) Etapas finales de clonación en la construcción de pRIC3-mSEAP+. (B) EF-1a, promotor alfa del factor 1 de alargamiento; SEAP, gen de la fosfatasa alcalina secretada; PoliA del SV40, señal de poliadenilación del virus de simio 40; 35S del CaMV, región promotora del virus del mosaico de la coliflor, EGFP, gen de la proteína fluorescente verde mejorado; pA35SS, señal de poliadenilación 35S del CaMV. La barra curva dentro del mapa del plásmido indica ADN-T transfectado en células vegetales. (C) Replicón circularizado después de la liberación del ADN-T.

Figura 4: Construcción de pRIC3-mluc+ y replicón. Plásmido de replicación autónoma pRIC3-mluc+. (A) Etapas finales de clonación para crear pRIC3-mluc+. (B) CMV I/E/P pCapR, región de intrón/potenciador/promotor de citomegalovirus con potenciador de pCapR; luc, gen informador de luciferasa de luciérnaga; poliA de BGH, señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. 35S del CaMV, región promotora del virus del mosaico de la coliflor, EGFP, proteína fluorescente verde mejorada; pA35SS, señal de poliadenilación 35S del CaMV. La barra curva dentro del mapa del plásmido indica ADN-T transfectado en células vegetales. (C) Replicón circularizado después de la liberación de ADN-T.

Figura 5: Vector de expresión de Agrobacterium pTRAc. P35SS, promotor 35S del CaMV con potenciador transcripcional duplicado; CHS, región no traducida 5' de la chalcona sintasa; pA35S, señal de poliadenilación 35S del CaMV; SAR, región de unión al andamio del gen Rb7 del tabaco; LB y RB, los bordes izquierdo y derecho para la integración de ADN-T; ColElori, origen de replicación para E. coli; RK2ori, origen de replicación de Agrobacterium; bla, gen de resistencia a ampicilina/carbenicilina.

Figura 6: Principio de PCR inversa. Diagrama que ilustra el principio de PCR inversa. Cebadores ( ^ ) diseñados para amplificar solo el replicón de ADN recircularizado, pero no el vector original. Vector recircularizado en el LIR duplicado. Figura 7: La amplificación por PCR de los replicones (A) pRIC3-mSEAP y pRIC3-mSEAP+ y (B) pRIC3-mluc+ muestra la liberación replicativa de ADN-T. MW, marcador de peso molecular; mSEAP, pRIC3-mSEAP; mSEAP+, pRIC3-mSEAP+, mluc+, pRIC3-mluc+, planta, ADN vegetal no infiltrado (control negativo).

Figura 8: Optimización de la expresión de L1 y L2. Prueba contrarreloj de los niveles de expresión de (A) hL1 y (B) hL2 en varios OD de infiltración, a 1-7 y 1-5 dpi, respectivamente. La proteína está indicada ( ^ ) a 55 kDa (hLl) y aproximadamente 65 kDa (hL2). MW, marcador de peso molecular, con tamaños indicados en kDa; , hL1 crudo producido por plantas (A) y hL2 producido por bacterias (B).

Figura 9: Prueba contrarreloj de qPCR de vectores de replicación. Análisis de qPCR de ADN extraído de plantas infiltradas con (A) pRIC3-mSEAP, (B) pRIC3-mSEAP+ y (C) pRIC3-mluc+, 1-7 dpi. El número de copias se muestra como escala log10. Las barras de error indican el error estándar de la media (N = 3).

Figura 10: Expresión de elementos estructurales de PsV. Se utilizó PCR para confirmar la presencia de replicones (A) pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ y (B) pRIC3-mluc+ 3dpi, en plantas co-infiltradas con pTRAc-hL1, pTRAc-hL2 y pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ o pRIC3-mluc+, respectivamente. Una banda de aproximadamente 2,1 Kpb ( ^ ) indica liberación replicativa. MW, marcador de peso molecular, tamaños mostrados a la izquierda; PsV, extracto vegetal crudo; , ADN únicamente (control positivo); -, ADN vegetal (control negativo). La transferencia Western para L1 (C) y L2 (D) confirma la presencia de ambas proteínas estructurales del VPH 4 dpi en el extracto crudo de plantas co-infiltradas con pTRAc-hL1, pTRAc-hL2 y pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ o pRIC3-mluc+. VLP, pTRAc-hL1 y pTRAc-hL2 solamente; mSEAP, PsV pRIC3-mSEAP, mSEAP+, PsV pRIC3-mSEAP+; mluc+, PsV pRIC3-mluc+; , hL1 crudo producido por plantas (C) o L2 producido por bacterias (D); MW, marcador de peso molecular, tamaños indicados en kDa.

Figura 11: Ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio de VLP y PsV. El análisis de densitometría de las transferencias de puntos de L1 muestra la distribución de L1 después de la ultracentrifugación y el fraccionamiento en cloruro de cesio. Las transferencias de puntos (paneles de la izquierda) de las fracciones 1-19 de CsCI se sondearon con anticuerpo anti-L1 de CamVir-1. * en las transferencias de puntos y el panel gris en los gráficos, indican las fracciones agrupadas para diálisis; , extracto vegetal crudo (control positivo). La densidad de las fracciones de CsCI (♦ ) se comparó con la intensidad relativa (□, unidades arbitrarias) de L1 (paneles de la derecha) para estimar la densidad de las partículas purificadas. (A) VLP de L1/L2, (B) pRIC3-mSEAP, (C) pRIC3-mSEAP+, (D) pRIC3-mluc+. Figura 12: Purificación de PsV. Tinción de Coomassie (A, B) y transferencia Western para L1 (C, D) de varias etapas de purificación de PsV, separadas por SDS-PAGE. Las transferencias Western se sondearon para L1 usando el anticuerpo comercial anti-L1 CamVir-1. MW, marcador de peso molecular, tamaños mostrados a la derecha; C, extracto vegetal crudo; CsCl, fracciones de gradiente de cloruro de cesio agrupadas; dial., fracciones combinadas dializadas, , extracto crudo de hL1 (control positivo).

Figura 13: Micrografías electrónicas de PsV purificados. (A) y (E) pRIC3-mSEAP, (B) y (F) pRIC3-mSEAP+, (C) y (G) PsV pRIC3 mluc+ (página anterior) y (D) y (H) VLP de L1/L2 fueron purificados por ultracentrifugación en gradiente de CsCI. El tamaño de los PsV purificados varió entre 30 y 120 nm de diámetro. Las flechas blancas indican partículas pequeñas (30-40 nm), las flechas grises indican partículas de PsV del VPH de tamaño estándar (50-60 nm) y las flechas negras indican partículas grandes (100-120 nm). (I) El extracto vegetal crudo sirve como control negativo. Se indican las barras de escala (panel izquierdo, 0,5 |jm; panel derecho y (D), 200 nm, (I), 100 nm).

Figura 14: Presencia de ADN en PsV purificados. La amplificación por PCR del replicón (A) pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ y (B) pRIC3-mluc+ (2,1 Kpb, ^ ) indica la presencia de ADN en partículas de PsV purificados después de la digestión con proteinasa K (PrK). MW, marcador de peso molecular; PrK /-, digestión con PrK; PsV , fracciones que contienen L1 agrupadas, PsV -, fracción que no contiene L1 (fracción 18); ADN, extracto de ADN de replicón (control positivo), V, VLP de L1/L2 purificadas digeridas con PrK (control negativo); P, ADN vegetal (control negativo).

Figura 15: Expresión del gen informador en células de mamífero pseudoinfectadas con PsV. (A) Expresión de SEAP 72 horas después de la transfección de pRIC3-mSEAP (plásmido) o pseudoinfección con mSEAP-PsV (PsV) en unidades de luz relativas (RLU), expresada en escala logarítmica (log10). (B) Expresión de SEAP para pRIC3-mSEAP+, como anteriormente. (C) expresión de luc para pRIC3-mluc+, como anteriormente. -ve, control negativo (solo medios). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Las barras de error muestran la desviación estándar entre triplicados.

Figura 16: Casete de expresión de mamíferos mSEAP (SEQ ID NO: 8).

Figura 17: casete mSEAP+: casete de expresión que comprende un casete SEAP de mamífero y un casete EGFP de plantas (SEQ ID NO: 9).

Figura 18: casete de mluc+: casete de expresión que comprende un casete mluc de mamífero y un casete EGFP de plantas (SEQ ID NO: 10).

Figura 19: Estrategia de clonación para la inserción del origen de replicación de SV40 (SV40ori) en los vectores pRIC3-mSEAP y pRIC3-mSEAP+.

Figura 20: Expresión de SEAP en células de mamífero infectadas con PsV de mSEAP+ o mSEAP+ SV40ori. El control negativo son las células no infectadas. Los valores de SEAP están en unidades de luz relativas (RLU) y las diluciones de pseudovirión se dan en el eje X.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con más detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran algunas, pero no todas, las realizaciones de la invención.

Aunque en el presente documento se emplean términos específicos, se utilizan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con fines de limitación.

Como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen la forma plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

La terminología y fraseología utilizadas en este documento tienen el propósito de describir y no deben considerarse limitantes. El uso de los términos "que comprende", "que contiene", "que tiene" y "que incluye" y las variaciones de los mismos utilizados en este documento, pretende abarcar los elementos enumerados a continuación y sus equivalentes, así como elementos adicionales.

En el presente documento se proporciona un método para producir un pseudovirión del virus del papiloma humano (VPH) en una célula vegetal. Los "virus de papiloma" son virus de ADN de la familia Papillomaviridae que infectan la piel y las membranas mucosas de animales, preferiblemente mamíferos, e incluso más preferiblemente humanos. Una "VLP" o "partícula similar a virus" se refiere a la estructura similar a una cápside que resulta del ensamblaje de la proteína L1 del VPH sola o con la proteína de la cápside L2 del VPH. Estas estructuras son antigénica y morfológicamente similares a las partículas o viriones reales del virus del VPH. Las partículas similares a virus no incluyen material genético viral; en consecuencia, estas partículas no son infecciosas.

El término "pseudovirión" o "PsV" se refiere a una partícula similar al virus del papiloma que incluye las proteínas de la cápside del virus del papiloma en la que se ha encapsulado un plásmido o vector que contiene un gen heterólogo de interés. Los pseudoviriones de la invención contienen material genético no nativo que puede ser transferido por el virus a una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero, y lo más preferiblemente a una célula humana. El material genético no nativo puede incluir un plásmido que codifica un gen terapéutico, un gen informador, un gen que codifica un polipéptido antigénico, tal como un gen que codifica constructos derivados de la oncoproteína E6 o E7 del VPH para tratar lesiones o carcinomas cervicales causados por los VPH, y o cualquier otro gen heterólogo de interés bajo el control de un promotor de mamífero, que se puede administrar a una célula de mamífero por el pseudovirión. En esta memoria descriptiva "encapsulado" se refiere al plásmido o vector que está encerrado dentro de la cápside de la partícula similar a virus.

Se debe leer que el término "proteína" incluye "péptido" y "polipéptido" y viceversa.

El método de la invención incluye las etapas de introducir un primer polinucleótido que codifica un polipéptido L1 del VPH y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido L2 del VPH en una célula vegetal. Se apreciará que el primer y segundo polinucleótidos pueden estar contenidos en un solo vector o en dos.

El término "vector" se refiere a algunos medios mediante los cuales se pueden introducir polinucleótidos o secuencias de genes en una célula. Hay varios tipos de vectores conocidos en la técnica que incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos y cósmidos. Generalmente, los polinucleótidos o secuencias de genes se introducen en un vector mediante un casete. El término "casete" se refiere a un polinucleótido o secuencias de genes que se expresa a partir de un vector, por ejemplo, el polinucleótido o secuencias de genes que codifican las proteínas L1 del VPH y L2 del VPH. Un casete generalmente comprende una secuencia de genes insertada en un vector, que en algunas realizaciones, proporciona secuencias reguladoras para expresar el polinucleótido o secuencias de genes. En otras realizaciones, el polinucleótido o la secuencia de genes proporciona las secuencias reguladoras para su expresión. En realizaciones adicionales, el vector proporciona algunas secuencias reguladoras y la secuencia de nucleótidos o de genes proporciona otras secuencias reguladoras. Las "secuencias reguladoras" incluyen, pero no se limitan a, promotores, secuencias de terminación de la transcripción, potenciadores, aceptores de empalme, secuencias donantes, intrones, secuencias de unión a ribosomas, secuencias de adición de poli(A) y/o orígenes de replicación.

El método incluye además la etapa de introducir una tercera secuencia de polinucleótidos en una célula vegetal. La tercera secuencia de polinucleótidos está en forma de replicón que está contenido dentro de un vector más grande. El replicón mismo contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo de interés. Para que prosiga la amplificación del replicón que codifica el polipéptido heterólogo de interés, la liberación replicativa del replicón del vector más grande debe ocurrir en una célula vegetal. Una vez que se libera del vector más grande, el replicón, junto con un casete de expresión que comprende un polinucleótido o secuencias de genes que codifica el polipéptido heterólogo de interés, se replica adicionalmente hasta un alto número de copias en la célula vegetal. Debido a que los elementos estructurales de su polinucleótido forman el replicón que se libera del vector más grande, se recirculariza para formar un plásmido más pequeño que contiene el polinucleótido o secuencias de genes que codifica el polipéptido heterólogo de interés.

La coexpresión de los polipéptidos L1 del VPH y L2 del VPH en la célula vegetal da como resultado que los polipéptidos L1 y L2 se autoensamblen en partículas similares a virus en la célula. Como resultado del alto número de copias del replicón en la célula, las copias del replicón se encapsulan directamente en las partículas similares a virus durante el ensamblaje en la célula para formar pseudoviriones. Esto contrasta con los métodos indirectos de incorporar un polinucleótido de interés en un pseudovirión separando química o mecánicamente las partículas similares a virus e introduciendo un polinucleótido de interés en la partícula similar a virus para formar un pseudovirión.

Se considera que el vector de replicación es incapaz de replicarse en una célula de mamífero, esto se debe al hecho de que, si bien la proteína Rep derivada del virus vegetal puede ser capaz de iniciar la replicación del replicón en una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero, y lo más preferiblemente en una célula humana, en el sistema de vector descrito, la proteína Rep se expresa a partir de una secuencia promotora específica de planta que es muy poco probable que se reconozca en una célula de mamífero. Por otro lado, el gen que codifica el polipéptido heterólogo es, sin embargo, capaz de expresarse en una célula de mamífero porque está bajo el control de un promotor de mamífero bien caracterizado como parte del casete de expresión.

Una persona experta en la técnica apreciará que el gen que codifica la proteína Rep puede estar contenido en el vector de replicación, en otro vector (tal como un vector que contiene un casete que codifica el polipéptido L1 del VPH y/o L2 del VPH), puede integrarse además en el ADN de la célula vegetal en la que se producen los pseudoviriones, o puede integrarse, junto con un promotor adecuado, en el ADN de una célula de mamífero en la que el pseudovirión introduce el vector portador. La presencia de la proteína Rep en la célula vegetal o de mamífero puede dar como resultado el inicio de la replicación del vector de replicación y la producción del replicón con un alto número de copias.

El gen que codifica el polipéptido heterólogo contenido en el replicón puede incluir un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen informador, un gen terapéutico y posiblemente otros genes relacionados con proteínas de vacunas humanas o animales deseables, tales como L1 o L2 del VPH, Gag o Env del VIH y otros.

Se apreciará que un "gen informador" puede seleccionarse de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido o proteína cuya actividad de transcripción, traducción y/o postraducción se pueda detectar. Los ejemplos de genes informadores incluyen genes para luciferasa, fosfatasa alcalina secretada, proteína fluorescente verde, betagalactosidasa y similares. La expresión del polipéptido informador se usa en la presente invención como indicador de la presencia de anticuerpos neutralizantes del VPH en una muestra. Por lo tanto, los pseudoviriones de la invención pueden usarse en un ensayo de neutralización para la detección de anticuerpos neutralizantes del VPH en un sujeto.

Se describe en el presente documento que el replicón puede derivarse de cualquier virus de ADN monocatenario de plantas, incluidos geminivirus y nanovirus, así como de circovirus de aves y mamíferos, o de parvovirus, y/o virus de ADNcs bacterianos o plásmidos bacterianos que se replican a través de una estrategia similar de replicación de ADN en círculo rodante. Todo lo que se requiere es una proteína Rep o equivalente, expresada en presencia de un constructo de ADN transportado en un plásmido más grande, que incorpora al menos un origen de secuencia de replicación (Ori) reconocido por Rep para permitir el inicio de la replicación en círculo rodante.

El ensayo de neutralización de pseudoviriones de la invención podría usarse para el desarrollo de un kit de neutralización de pseudovirus del VPH que podría usarse para probar la eficacia de posibles candidatos a vacunas del VPH.

El suministro del replicón desde el pseudovirión a una célula de mamífero es un indicador claro de que los pseudoviriones de la invención son capaces de usarse como vehículos de suministro de ADN con fines de terapia génica.

La producción de los pseudoviriones de la invención en plantas tiene ciertos beneficios sobre los métodos actuales de producción de células de mamíferos. Entre otros, el coste de producción de pseudoviriones derivados de plantas es sustancialmente más bajo que el coste de producción en células de mamífero. Actualmente, los pseudoviriones solo se producen en células cultivadas derivadas de cáncer de mamíferos: este método de producción plantea ciertos problemas de seguridad en el sentido de que los pseudoviriones podrían encapsular oncogenes de las líneas celulares. Esto podría resultar en que un sujeto que es tratado con estos pseudoviriones se "infecte" con genes causantes de cáncer. Además, la propagación de pseudoviriones en líneas celulares de mamíferos podría dar como resultado que otros virus y/o contaminantes queden encapsulados en la cápside.

El método de producción de los pseudoviriones de la invención en plantas es un proceso simple y elimina la posibilidad de contaminación por oncogén o virus de mamíferos. El proceso también es altamente escalable. Además, si el ADN de replicación derivado de virus de plantas se encapsula en los pseudoviriones de la invención, este ADN derivado de virus de plantas no será capaz de replicarse en células de mamíferos o de combinarse con otros virus de mamíferos o secuencias de tipo transposón.

Los siguientes ejemplos se ofrecen ahora a modo de ilustración y no a modo de limitación de la invención descrita en el presente documento.

Ejemplo 1

Producción de replicones en plantas

Vectores de expresión en plantas

Para expresar pseudoviriones (PsV) en plantas de N. benthamiana, se utilizaron varios vectores de expresión de plantas. Se construyeron vectores de replicación que se replicarían in planta para formar replicones o pseudogenomas para el empaquetamiento por las proteínas de la cápside L1 y L2 del VPH en PsV. Los vectores de replicación se construyeron adaptando el vector pRIC3 derivado de geminivirus desarrollado previamente (Figura 1) para producir los vectores de replicación. Se utilizaron dos casetes de expresión de mamíferos diferentes que codifican genes para los productos del gen informador SEAP (casete de mSEAP) y luc (casete de mluc) para crear los vectores de replicación. Ambos casetes de mamíferos se incorporaron en pRIC3 con el casete de plantas EGFP existente (+), en lo sucesivo denominado mSEAP+ (SEQ ID NO: 9; Figura 17) y mluc+ (SEQ ID NO: 10; Figura 18) que sirven para aumentar el tamaño total del replicón (pRIC3-mSEAP+ y pRIC3-mluc+), mientras que el casete de SEAP (SEQ ID NO: 8; Figura 16) también se incorporó en lugar del casete de la planta para crear un replicón más pequeño (pRIC3-mSEAP). Se ha informado que las VLP del VPH empaquetan pseudogenomas de aproximadamente 5-8 Kpb de tamaño, mientras que los pseudogenomas más grandes o más pequeños no están empaquetados en absoluto (Buck et al., 2004; Touze y Coursaget, 1998). Para adaptarse a estas limitaciones de tamaño, se crearon tres vectores con diferentes genes informadores que dieron como resultado, replicones de diferentes tamaños, a saber:

a) pRIC3-mSEAP: pRIC3 con un casete de mamífero que codifica el gen informador de SEAP en lugar del casete de la planta actual (replicón/pseudogenoma de 4,8 Kpb) (Figura 2)

b) pRIC3-mSEAP+: pRIC3 con la adición de un casete de SEAP de mamífero, insertado secuencia arriba del casete de la planta (replicón/pseudogenoma de 6,6 Kpb) (Figura 3)

c) pRIC3-mluc+: pRIC3 con la adición de un casete de mamífero alternativo que codifica el gen informador luc, insertado secuencia arriba del casete de la planta (replicón/pseudogenoma de 7,6 Kpb) (Figura 4).

Además de estos, el vector de expresión vegetal pTRAc (donado por el Prof. Dr. Rainer Fischer; Instituto Fraunhofer de Biología Molecular y Ecología Aplicada, Alemania) que expresa genes de codón optimizado humanos L1 de VPH-16 (SEQ ID NO: 13) o L2 de VPH 16 (SEQ ID NO: 14) (pTRAc-hL1 y pTRAc-hL2, respectivamente) se usaron para la producción de proteínas de la cápside L1 y L2. Este vector, que se muestra en la Figura 5, se dirige a la expresión de L1 y L2 al citoplasma, y pTRAc-hL1 ha demostrado altos niveles de expresión para L1 in planta (Maclean et al., 2007).

Transformación de Agrobacterium tumefaciens

Se aislaron plásmidos de E. coli usando un kit Miniprep de plásmidos QIAGEN®. A continuación, se introdujeron en la cepa GV3101:: pMP90RK de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación, como lo describen Maclean et al.

(2007). Las células de A. tumefaciens se hicieron electrocompetentes mediante el método descrito por Shen y Forde (1989). Se añadieron 200 ng de ADN plasmídico a una cubeta de electroporación enfriada (Molecular BioProducts, Inc.), junto con 100 |jl de células electrocompetentes. Después de 5 minutos de incubación en hielo, las células se electroporaron usando un GenePulserMR de Bio-Rad en las siguientes condiciones: 1,8 kV, 25 jF , 200 Q. Se añadieron 900 j l de caldo Luria sin antibióticos a las células electroporadas, que se incubaron durante 2 horas a 27 °C. Los clones recombinantes se cribaron mediante selección de antibióticos con rifampicina (50 jg/ml), carbenicilina (50 jg/m l) y kanamicina (30 jg/ml). Las placas se incubaron a 27 °C durante 48 horas para permitir la formación de colonias y se seleccionaron para detectar clones positivos mediante PCR de colonias.

Agroinfiltración de N. benthamiana

La agroinfiltración de plantas de N. benthamiana se realizó como lo describen Maclean et al. (2007). Las plantas de Nicotiana benthamiana se cultivaron a partir de semillas en una sala de crecimiento de plantas controlado. Las plantas se cultivaron a 22 °C, con 16 horas de luz al día durante 6 semanas. Las plantas se agroinfiltraron mediante jeringa o al vacío con una suspensión bacteriana de A. tumefaciens recombinante a una densidad óptica (OD) de 0,25, 0,5, 0,75 o 1. Brevemente, se utilizó una jeringa para forzar la suspensión bacteriana de A. tumefaciens en los espacios de aire abaxiales en varias hojas por planta. Se permitió que las plantas crecieran normalmente y se recolectaron muestras de hojas a los 1-7 días después de la infiltración (dpi). Para la infiltración al vacío, las plantas enteras se sumergieron en 500 ml de suspensión bacteriana y se colocaron en una cámara de vacío. Se mantuvo un vacío de -90 kilopascales (kPa) durante 5 segundos, luego se liberó rápidamente (10-15 kPa.seg-1). Las plantas se cultivaron normalmente y se recolectaron a 4 dpi.

PCR cuantitativa

Se realizó un análisis de qPCR para determinar si estaba ocurriendo la replicación del replicón en las plantas. Se incubó un solo disco de hoja de 0,5 cm a 95 °C durante 10 minutos con 100 j l de tampón de extracción del kit de PCR para plantas Extract-N-Amp (Sigma Aldrich). Este se diluyó con 100 j l de tampón de dilución y se almacenó a -20 °C hasta que se necesitó. La qPCR se realizó usando la mezcla lista SybrGREEN 2x del mismo kit. Se usaron los cebadores lucQ-F (5'-CAA CTG CAT AAG GCT ATG AAG AGA-3' (SEQ ID NO: 1)) y lucQ-R (5'-ATT TGT ATT CAG CCC ATA TCG TTT-3' (SEQ ID NO : 2)) para amplificar un fragmento de 153 pb del gen de la luciferasa y se usaron los cebadores SEAPQ-F (5'-CCT TGA CCC CGC ACA GGT A-3'(SEQ ID NO: 3)) y SEAPQ-R (5'-GGC TCT GTC CAA GAC ATA CAA TGT A-3' (SEQ ID NO: 4)) para amplificar un fragmento de 83 pb del gen de SEAP. Todos los cebadores se utilizaron a una concentración final de 0,4 mM. El ciclado de qPCR se realizó en un Corbett RotorGene 6000 (Corbett), usando los parámetros de ciclado como sigue: para la reacción con luciferasa 95 °C durante 2 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos, 57 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 5 segundos; y análisis de la curva de fusión desde 72-95 °C durante 5 segundos por grado y para la reacción de SEAPQ 95 °C durante 2 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos, 54 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 5 segundos; y el análisis de la curva de fusión desde 72-95 °C durante 5 segundos por grado. La qPCR se realizó con tres repeticiones técnicas por muestra, con un tamaño de población de muestra de tres (N = 3). Los datos se analizaron utilizando el software RotorGene Q Series 2.0.2 (Corbett). Los valores de Ct se normalizaron a la concentración total de ADN para cada muestra.

PCR inversa

El constructo del replicón de la presente invención se derivó del genoma del Mastrevirus del enano amarillo del frijol (BeYDV). Esto incluye dos copias de la región intergénica larga (LIR) de BeYDV, que flanquean un constructo que comprende un promotor de mamífero en el lado 5' de un gen informador, una región intergénica corta (SIR) derivada de BeYDV y el gen de Rep de BeYDV bajo el control de su promotor nativo en la secuencia LIR. La introducción del plásmido portador en células vegetales da como resultado la transcripción del promotor Rep de BeYDV del ARNm de Rep y la traducción de la proteína Rep. Esta proteína se une al BeYDV Ori dentro de las secuencias de LIR y provoca una muesca de una sola cadena en la secuencia 5-TAATATT/AC-3'; las polimerasas reparadoras del huésped extienden el extremo 3' libre hasta la segunda secuencia TAATATTAC de LIR. La liberación de un ADN del replicón monocatenario de longitud unitaria permite la recircularización a través de una secuencia de tallo-bucle codificada en la LIR, con la ligación a una molécula circular por las moléculas de ADNcs circulares de proteína Rep se convierten en ADNcd por polimerasas huésped y Rep puede entonces transcribirse a partir de estas para amplificar su presencia como replicones autónomos, al igual que el virus nativo se replica. Alternativamente, se puede generar un replicón mediante la expresión en trans de una proteína Rep a partir de otro constructo coagroinfiltrado, y la replicación continuaría sólo mientras se coexpresara Rep.

Este proceso ocurre en células vegetales porque el promotor Rep nativo es reconocido por factores de transcripción de plantas: esto no parece suceder en células de mamíferos, lo que significa que el replicón sería replicacionalmente inerte y solo se transcribiría para permitir la expresión del transgén.

Una variación de la PCR inversa, como describen Regnard et al. (2010), se utilizó para confirmar la recircularización del replicón (Figura 6). Los cebadores se diseñaron para amplificar un fragmento de ADN (aproximadamente 2,1 Kpb) que abarca el sitio de recircularización de cada replicón. Las reacciones de PCR para confirmar la recircularización del replicón pRIC3mluc+ se realizaron con el kit GoTaq (Promega), Mg2+ 2,5 mM, cebadores poliA35SS-F (5'-AGG GTT CTT ATA GGG TTT CGC TC-3' (SEQ ID NO: 5)) y CMV-R (5'-CCC TGT AAC GTA TGT GAG A-3' (SEQ ID NO: 6)), en las siguientes condiciones: 95 °C durante 3 minutos; 25 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1-3 minutos; y 72 °C durante 5 minutos. Las reacciones de PCR para confirmar la recircularización del replicón pRIC3mSEAP y el replicón pRIC3mSEAP+ se realizaron con el kit GoTaq (Promega), Mg2+ 2,5 mM, cebadores Rep-F (5'-TCC ATC GTG CGT CAG ATT TGC G-3' (SEQ ID NO: 7)) y SEAPQ-R (SEQ ID NO: 4), en las siguientes condiciones: 95 °C durante 3 minutos; 25 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 54 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1-3 minutos; y 72 °C durante 5 minutos.

Los vectores replicantes experimentan liberación replicativa en plantas

Los tres nuevos vectores, pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ y pRIC3-mluc+ se diseñaron y probaron en N. benthamiana. Los tres vectores se clonaron en A. tumefaciens Gv3l01::pMP90RK y las plantas se infiltraron a una OD600 de 0,5. El ADN se recogió de las plantas a los 3 dpi y se analizó la liberación replicativa mediante PCR. Los cebadores se diseñaron para amplificar un fragmento de 2,1 Kpb del replicón, incorporando la LIR (véase las Figuras 2C, 3C y 4C) usando las reacciones de PCR inversa descritas anteriormente para pRIC3mluc+, pRIC3-mSEAP y pRIC3-mSEAP+. De acuerdo con el diseño de este experimento, el producto de amplificación por PCR solo se produciría en presencia de replicón recircularizado. La amplificación por PCR (Figura 7) de un producto de aproximadamente 2,1 Kpb confirmó que el replicón se formó en plantas infiltradas individualmente con pRIC3-mSEAP y pRIC3-mSEAP+ (Figura 7A) y pRIC3-mluc+ (Figura 7B). Esto confirma que estos vectores forman un replicón recircularizado en las células vegetales y son vectores adecuados para la producción del pseudogenoma.

Se ha demostrado previamente que el esqueleto del vector pRIC3 forma replicones que se replican hasta un alto número de copias dentro de la célula vegetal, en relación con el vector pTRAc no replicante (Regnard et al., 2010). Las plantas se infiltraron individualmente con cada vector de replicación hasta una o D 0,5 y el ADN se recogió a los 1, 3, 5 y 7 dpi. Se usó qPCR para determinar el aumento en el número de copias del replicón desde 1 a 7 dpi con cada uno de los vectores de replicación usando las reacciones y condiciones de reacción descritas anteriormente para pRIC3-mluc+, y pRIC3-mSEAP y pRIC3-mSEAP+, respectivamente. El análisis mostró un aumento de 100-1000 veces en el número de copias de genes para los tres vectores a los 1 a 3 dpi, con mantenimiento en un número de copias similar hasta de 7 dpi (Figura 9). pRIC3-mSEAP (Figura 9A), pRIC3-mSEAP+ (Figura 9B) y pRIC3-mluc+ (Figura 9C) muestran todos aumentos muy similares en el número de copias. Esto es consistente con observaciones previas para pRIC y pRIC3 (Ogle, 2008; Regnard et al., 2010).

Se ensayó la capacidad de los tres vectores para replicarse de forma autónoma en plantas. El análisis de PCR confirmó que se formaron los replicones apropiados como se esperaba. Para dilucidar si los vectores de replicación autónoma estaban, de hecho, produciendo un alto número de copias de los replicones in planta, se empleó el análisis de qPCR. El análisis de qPCR de muestras de ADN recolectadas hasta 7 dpi mostró que el número de copias del replicón para todos los plásmidos se amplificó entre 100 y 1000 veces entre 1 y 3 dpi, y que este alto número de copias se mantuvo hasta 7 dpi. Esto es similar a los resultados obtenidos por Regnard et al. (2010), quienes mostraron un aumento casi idéntico en los vectores pRIC utilizados para generar replicones que codifican el gen p24 del VIH o EGFP. Los vectores de replicación desarrollados por otros grupos han demostrado aumentos similares en el número de copias del replicón (Huang et al., 2009; Zhang y Mason, 2006). Nuestro resultado demuestra que el uso de estos vectores de replicación para la generación de altas cantidades de ADN del replicón en plantas es una estrategia factible para producir suficiente ADN de pseudogenoma en células huésped de plantas para la producción de PsV.

Ejemplo 2

Producción de PsV in planta

SDS-PAGE y transferencia Western

Se realizó SDS-PAGE para analizar la producción de proteínas hL1 y hL2 del VPH-16 en plantas. La proteína se extrajo de plantas agroinfiltradas con pTRAc-hL1 y/o pTRAc-hL2 de A. tumefaciens GV3101::pMP90RK. Brevemente, se recolectaron tres discos de hojas de 0,5 cm a 1, 3, 5 y 7 dpi, se congelaron en N2 líquido y se molieron en un tubo de microcentrífuga usando un mortero de plástico. Se añadieron 100 |jl de NaCl 0,5 M en PBS con un cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo 1x (Roche) (hL1) o urea 8 M en H2O (hL2) al material de la hoja molida y se mezcló completamente. Las muestras se centrifugaron a 13000 rpm durante 5 minutos y se reservó el sobrenadante. Se repitió esta etapa de centrifugación y se almacenó el sobrenadante a -20 °C. Para el análisis SDS-PAGE, se añadieron 8 j l de colorante de carga 5x que contenía p-mercaptoetanol a 32 j l de proteína soluble, y las muestras se incubaron a 95 °C durante 7 minutos. A continuación, se cargaron en geles de poliacrilamida-SDS al 10% utilizando el sistema de SDS-PAGE Mini-PROTEAN® Tetra (Bio-Rad) y se sometieron a electroforesis a 130 V durante aproximadamente 120 minutos. Estos geles y membranas de nitrocelulosa se equilibraron durante 10 minutos en tampón de transferencia antes de ser transferidos a una membrana de nitrocelulosa a 15 V durante 90 minutos usando una celda de transferencia electroforética semiseca Trans-Blot® SD de Bio-Rad. Las membranas se incubaron con tampón de bloqueo durante 60 minutos, luego se sondearon para L1 durante la noche, usando anticuerpo monoclonal primario CamVir-1 comercialmente disponible (Abcam, ab69) diluido 1 en 10000 en tampón de bloqueo.

Las membranas se lavaron durante 4x10 minutos en tampón de bloqueo, se sondearon con anticuerpo secundario de cabra conjugado con anti-AP de ratón (Sigma, A3562) diluido 1 en 5000 en tampón de bloqueo durante dos horas, se lavaron 4x10 minutos en tampón de bloqueo sin leche desnatada en polvo y se visualizaron utilizando sustrato de fosfatasa BCIP/NBT (KPL). Para L2, se utilizó un protocolo similar. El anticuerpo primario fue suero policlonal primario anti-L2 producido en conejo producido en nuestro laboratorio y usado a una dilución de 1 en 5000, y el anticuerpo secundario fue anticuerpo de cabra conjugado con anti-AP de conejo (Sigma, A3687).

Optimización de la expresión de proteína en plantas.

La expresión de hL1 y hL2 se optimizó mediante una prueba de tiempo de 1-7 dpi. Las plantas se agroinfiltraron con un intervalo de valores de OD600 (0,25-1,0) en suspensión bacteriana. La proteína se recogió a 1, 3, 5 y 7 dpi y se separó mediante SDS-PAGE. La expresión de hL1 y hL2 se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal CamVir-1 anti-L1 y un anticuerpo policlonal anti-L2 producido en conejos (Figura 8), respectivamente. Se detectó la expresión de proteína recombinante en todos los valores de OD600 probados, desde 3 dpi, tanto para hL1 como para hL2, en el tamaño esperado. Si bien L2 es una proteína de aproximadamente 50 kDa, se ha observado ampliamente que migra a aproximadamente 80 kDa (Muller et al., 1995). La expresión más alta detectada para hL1 fue a OD6000,25, de 3-7 dpi (Figura 8A). La expresión más alta de hL2 también se observó en aquellas plantas infiltradas a una OD600 de 0,25, a 3 dpi (Figura 8B). Como tal, se eligieron parámetros de agroinfiltración de OD6000,25 a 4 dpi para la expresión óptima de hL1 y hL2 en experimentos adicionales.

Producción de PsV en plantas

Para producir PsV del VPH, se coinfiltraron plantas de N. benthamiana con pTRAc-hL1, pTRAc-hL2, junto con cada uno de pRIC3-mSEAP, pRIC3-mSEAP+ y pRIC3-mluc+, por separado. De acuerdo con los datos demostrados anteriormente, la agroinfiltración con vectores pTRAc tuvo una OD600 de 0,25, mientras que los vectores replicantes se agroinfiltraron a una OD600 de 0,5 y las partículas se recolectaron a los 4 dpi. pTRAc-hL1 y pTRAc-hL2 también se infiltraron conjuntamente sin un vector de replicación, con la intención de producir VLP de L1/L2 del VPH. Esto se realizó mediante infiltración al vacío para la producción de grandes volúmenes de biomasa. El ADN y la proteína cruda se extrajeron a los 4 dpi, con el fin de confirmar la presencia de todos los componentes necesarios para la formación de PsV mediante PCR y transferencia Western (Figura 10). La amplificación por PCR de un fragmento de 2,1 Kpb confirmó que se estaba produciendo la formación de replicones para los tres constructos de replicación a los 4 dpi (Figura 10, paneles A y B). Los carriles demarcados 'PsV' indican la formación de replicones en plantas coinfiltradas con pTRAc-hL1 y pTRAc-hL2, mientras que las marcadas con '+' son de plantas infiltradas con solo vector de replicación, y sirven como control positivo. El análisis de transferencia Western con CamVir-1 (hL1) y un anticuerpo policlonal de conejo (hL2) confirmó la expresión de L1 (Figura 10C) y L2 (Figura 10D) a los 4 dpi, en plantas infiltradas con solo L1 y L2 ('VLP'), o L1 y L2 coinfiltrados con un vector de replicación ('mSEAP', 'mSEAP+' y 'mluc+'). Esto se confirmó de forma independiente en al menos tres experimentos de coinfiltración separados. En particular, la intensidad de la banda correspondiente a L2 (Figura 10D) mostró una marcada variabilidad entre las repeticiones en todos los constructos.

La producción de PsV del VPH-16 en plantas fue satisfactoria para cada uno de los tres vectores de replicación construidos. Este trabajo se basó en los hallazgos de varios artículos anteriores, en particular el de Maclean et al., (2007). Ese estudio demostró que la L1 humanizada se expresaba a niveles altos y se ensamblaba espontáneamente en VLP in planta utilizando el vector pTRAc. Esto, junto con los resultados no publicados para pTRAc-hL2 del mismo grupo, demostró la viabilidad de estos vectores para la producción de partículas del VPH en plantas.

Se ha demostrado ampliamente que tanto L1 como el L2 del VPH son necesarios para el empaquetamiento eficaz del ADN en el virión del VPH, tanto en viriones naturales como en PsV (Ma et al., 2011; Okun et al., 2001; Stauffer et al., 1998). Además, se estableció recientemente que la presencia de L2 en la cápside de PsV aumenta diez veces la eficiencia de empaquetamiento del ADN (Holmgren et al., 2005). En este estudio, tanto L1 como L2 se expresaron conjuntamente para permitir la máxima encapsulación de ADN potencial. No se realizaron investigaciones sobre empaquetamiento diferencial en presencia y ausencia de L2; sin embargo, se observó poca o ninguna señal de L1 en las fracciones 14-16 (densidad de flotación 1,26-1,28 g/ml, correspondiente a la densidad de las VLP sin ADN encapsulado). Esta falta de partículas "ligeras" sugiere que el empaquetamiento del ADN por las partículas del VPH en las plantas es realmente muy eficiente, lo que da como resultado pocas o ninguna partícula sin ADN encapsulado. Esto contrasta con otros métodos de producción de PsV, todos los cuales muestran un pico correspondiente a partículas "ligeras" o VLP. Esto es particularmente cierto para el método de desmontaje-reensamblaje de VLP (como lo demuestran Touze y Coursaget (1998)), que generalmente tiene una eficiencia de empaquetamiento muy por debajo del 50% (Touze y Coursaget, 1998; Unckell et al., 1997).

Este empaquetamiento eficiente es una clara ventaja para el enfoque de producción de plantas, aunque esto debe moderarse con la observación de que no todo el ADN empaquetado es necesariamente ADN de pseudogenoma. Esto se demuestra claramente por las VLP de L1/L2 producidas en el presente documento, que se consideró que eran en su mayoría partículas "pesadas", lo que indica ADN encapsulado. Como estos se produjeron en ausencia de un vector de replicación, el ADN empaquetado fueron o bien los plásmidos pTRAc usados para producir VLP o ADN vegetal misceláneo. Tanto pTRAc-hL1 como pTRAc-hL2 (7,7 Kpb y 7,5 Kpb, respectivamente) caen por debajo del tamaño máximo de 7,9-8 Kpb para pseudogenomas que pueden empaquetarse eficazmente en PsV de L1/L2 del VPH (Buck et al., 2005b; Touze y Coursaget, 1998). Es posible que estos plásmidos, o ADN misceláneo, estuvieran empaquetados para ensamblar partículas del VPH en lugar del ADN del replicón pretendido; se ha sugerido que las VLP producidas en células de mamíferos encapsulan ADN celular misceláneo (Roden et al., 1996). En cualquier caso, la replicación extremadamente eficiente observada en los tres vectores de replicación utilizados en el presente documento, así como aquella observada cuando se comparó pRIC con pTRAc en un estudio anterior (Regnard et al., 2010), sugieren que la gran mayoría de plásmidos presentes en la planta durante el ensamblaje de PsV serían los pseudogenomas informadores. Como tal, la posibilidad de empaquetar plásmidos pTRAc puede no tener ninguna relevancia para el resultado de este estudio. El trabajo futuro para dilucidar todas las especies de ADN encapsuladas en PsV producidas en plantas es importante para una comprensión completa del proceso de ensamblaje de PsV in planta, así como para su uso en ensayos de neutralización.

Los análisis estructurales de L1 y L2 sugieren que el ADN se asocia de manera inespecífica, basándose en el pH general y la carga de los motivos estructurales internos (Fay et al., 2004; Garcea y Gissmann, 2004; Li et al., 1997; Pereira et al., 2009). Presumiblemente, esto permite el ensamblaje de PsV in vitro, demostrado por varios investigadores, en ausencia de factores celulares de mamíferos (Oh et al., 2004; Shi et al., 2001; Touze y Coursaget, 1998). En células de mamíferos, existe evidencia que sugiere que las chaperonas (particularmente las carioferinas) juegan un papel en el ensamblaje y empaquetamiento del ADN de los viriones naturales del VPH, y parece probable que estos sean responsables de la producción intracelular eficiente de PsV (Bird et al., 2008; Chromy et al., 2006). Se ha demostrado que las chaperonas, en particular la proteína 70 de choque térmico (Hsp70) y las carioferinas, desempeñan un papel en el ensamblaje de varios virus, incluidos virus de plantas (Kunik et al., 1999; Sullivan y Pipas, 2001). Curiosamente, se ha demostrado que la proteína de unión (BiP) de la chaperona asociada al ER participa en el plegado y ensamblaje de anticuerpos recombinantes en plantas transgénicas (Nuttall et al., 2002). Estos datos sugieren que la maquinaria molecular requerida para el ensamblaje del virus del papiloma y la encapsulación del ADN se conserva en todos los sistemas eucariotas y es responsable del ensamblaje eficaz de PsV observado en el presente documento.

Ejemplo 3

Purificación de pseudoviriones

Extracción y purificación de partículas

Para producir partículas, las plantas se infiltraron al vacío con A. tumefaciens GMV3101::pMP90RK que contenía pTRAc-hL1, pTRAc-hL2 y pRIC3luc, pRIC3mSEAP o pRIC3mSEAP+. La proteína y el ADN se recogieron a los 4 dpi, como se describió anteriormente. Se usó transferencia Western, como se describió anteriormente, para confirmar la presencia de proteína L1 y L2, y se usó PCR inversa, como se describió anteriormente, para confirmar que había tenido lugar la liberación replicativa. Las plantas enteras se recolectaron a los 4 dpi. Las partículas se purificaron siguiendo una variación del protocolo descrito por Varsani et al. (2003), con algunas modificaciones. Las hojas enteras se pesaron y se molieron con nitrógeno líquido en un mortero con pistilo o se maceraron completamente a temperatura ambiente. Se añadió NaCl 0,5 M en PBS frío al material de la hoja en una proporción de 1:2 (p:v) y las muestras se homogeneizaron en un mezclador de alto cizallamiento T25 Ultra-Turrax (IICa ®) a 13000 rpm durante 10 minutos en hielo. El homogeneizado se mantuvo sobre hielo durante 2 horas más antes de centrifugarlo a 8000 g durante 20 minutos a 4 °C en una centrífuga Beckman Coulter Avanti J25i con un rotor Beckman JA-14. El sobrenadante se filtró a través de 4 capas de Miracloth (Calbiochem) y se colocó en capas sobre una almohadilla de 7 ml de sacarosa al 40% (p/v). Las muestras se centrifugaron a 100000 g durante 3 horas a 4 °C en una centrífuga OptimaMR L-100 XP (Beckman Coulter) con un rotor Beckman Coulter SW32Ti. Se eliminaron el sobrenadante y la almohadilla de sacarosa, el sedimento se resuspendió en 1 ml de CsCl 0,4 g/ml en PBS y se aclaró en una centrífuga de mesa Eppendorf 5424 a 13000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se diluyó en 5 ml de CsCl 0,4 g/ml en PBS y se sometió a centrifugación a 100000 g durante 24 horas en una ultracentrífuga L-100 XP con un rotor Beckman SW55Ti a 10 °C.

Identificación de las VLP y pseudoviriones en gradiente de CsCI

Después de la centrifugación, el gradiente de CsCI se fraccionó manualmente o usando un fraccionador Foxy Jr. (ISCO). La densidad de cada fracción se determinó usando un refractómetro de mano (ATAGO) para leer el índice de refracción a 25 °C, y se usaron tablas críticas internacionales (Kellogg, 1927) para convertir el índice de refracción en densidad de flotación.

Se realizó una transferencia de puntos para confirmar la presencia de L1 en las fracciones de CsCI. Brevemente, se dejó caer 1 |jl de cada fracción sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó durante 30 minutos en tampón de bloqueo, luego se sondeó L1 como se describió anteriormente. Las membranas se escanearon y analizaron utilizando el software de densitometría GeneTools (SynGene), y la intensidad relativa del punto se normalizó a la presencia de L1 en el extracto crudo de la planta. Las fracciones positivas para L1 se combinaron y se dializaron durante la noche contra NaCl 0,5 M en PBS para eliminar el CsCl.

Para confirmar la presencia del replicón de ADN en los PsV, se añadió Proteinasa K a las fracciones, que se incubaron a 55 °C durante 3 horas para permitir la digestión completa de la cubierta de la proteína del PsV, antes de someterse a inactivación a 95 °C durante 10 minutos. Se utilizó PCR inversa para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 2,1 Kpb de las muestras, para las reacciones del replicón pRIC3mluc+ se realizaron con el kit GoTaq (Promega), Mg2+ 2,5 mM, cebadores polyA35SS-F (5'-AGG GTT CTT ATA GGG TTT CGC TC-3' (SEQ ID NO: 5)) y CMV-R (5'-CCC TGT AAC GTA TGT g Ag A-3' (s Eq ID NO: 6)), bajo las siguientes condiciones: 95 °C durante 3 minutos; 25 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1-3 minutos; y 72 °C durante 5 minutos. Las reacciones de PCR para confirmar la recircularización del replicón pRIC3mSEAP y el replicón pRIC3mSEAP+ se realizaron con el kit GoTaq (Promega), Mg2+ 2,5 mM, cebadores Rep-F (5'-TCC ATC GTG CGT CAG ATT TGC G-3' (SEQ ID NO: 7)) y SEAp Q-R (SEQ ID NO: 4), bajo las siguientes condiciones: 95 °C durante 3 minutos; 25 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 54 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1-3 minutos; y 72 °C durante 5 minutos.

Microscopía electrónica

Para confirmar la presencia de VLP y PsV, se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las rejillas de cobre se hicieron hidrófilas mediante descarga luminiscente usando un controlador de etapa fría SmartSet Modelo 900 (Electron Microscopy Sciences) a 25 mA durante 30 segundos. Las rejillas se incubaron durante 1-30 minutos con muestras de VLP o PsV, se lavaron tres veces con dH2O y las partículas se tiñeron con acetato de uranilo al 2% (p/v). Las rejillas se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Tecnai F20 (FEI) o un microscopio electrónico de transmisión LEO912 (Zeiss) con un aumento de 14500X, 19000X o 50000X. Se capturaron 10 campos de visión con un aumento de 50000X para todas las muestras, y se capturaron tres campos de visión con un aumento de 19000X para las muestras de VLP de L1/L2 y 14500X para las muestras de PsV.

Purificación e identificación de PsV producidos por plantas

Una vez confirmada la presencia de todos los elementos necesarios que comprenden los PsV en plantas infiltradas (proteína L1, proteína L2, así como los replicones mSEAP, mSEAP+ y mluc+), se aislaron las VLP y los PsV a partir del extracto de planta crudo utilizando variaciones del método descrito por Varsani et al., (2003). Brevemente, el material vegetal homogeneizado que contiene PsV se sometió a ultracentrifugación en una almohadilla de sacarosa al 40%. El sedimento resultante se resuspendió en 0,4 g/ml de CsCl en PBS y se sometió a ultracentrifugación isopícnica para separar las partículas sobre la base de la densidad de flotación.

Después de la centrifugación, las muestras se fraccionaron y analizaron para detectar la presencia de L1 mediante transferencia de puntos, utilizando CamVir-1 anti-L1, ya que se pensó que esto indicaría la presencia de las VLP y los PsV como resultado de su asociación con L1, un componente vital de estas partículas. El análisis de densitometría de la señal de L1 en las transferencias de puntos indicó la presencia de VLP o PsV putativos del VPH, y se comparó con la densidad de flotación de cada fracción del gradiente, calculada como una función del índice de refracción (Figura 11). Trabajos anteriores han informado que las VLP de L1/L2 del VPH con ADN encapsulado (PsV) tienen una densidad de flotación de 1,32-1,34 g/ml, mientras que las VLP (sin ADN) tienen una densidad de flotación de 1,26 1,28 g/ml (Rossi et al., 2000; Touze y Coursaget, 1998). Se observó que L1 estaba presente en todas las fracciones, con un pico distinto en la señal correspondiente a una densidad de flotación de 1,33 g/ml, lo que sugiere que estas partículas contienen ADN encapsulado (Figura 11). Curiosamente, las VLP de L1/L2 demostraron un pico de L1 a una densidad de flotación de 1,30 a 1,33 g/ml, que corresponde a una partícula "pesada" (Figura 11A). Esto sugiere que estas partículas encapsularon el ADN con una eficacia similar a las que se infiltraron conjuntamente con los vectores de replicación. Se observó un pico secundario a una densidad de 1,25 g/ml en las VLP de L1/L2 (Figura 11B) y a una densidad de 1,27 g/ml en partículas purificadas de plantas infiltradas con pRIC3-mSEAP (Figura 11B). Esto sugiere que en estas dos muestras, se formaron pequeñas cantidades de partículas sin ADN encapsulado. Cada uno de estos resultados es representativo de al menos tres procedimientos de purificación separados. Las fracciones 8-11 se combinaron y dializaron contra PBS con alto contenido de sal para obtener PsV purificados, y las fracciones 17-18 se combinaron y dializaron como un control sin PsV. Estos se utilizaron para análisis adicionales mediante microscopía electrónica, transferencia Western y PCR.

La Figura 12 muestra varias etapas clave en el proceso de purificación, separadas en un gel de SDS-PAGE. La tinción de Coomassie revela la eliminación de la mayoría de los contaminantes proteicos de las muestras purificadas (Figura 12A y 12B). Una banda de proteína está presente a aproximadamente 55 kDa en muestras purificadas tanto en la Figura 12A como en la 12B, que probablemente sea L1 purificada. L2, que migra a aproximadamente 90 kDa, no es visible en los geles teñidos con Coomassie. Esto es de esperar, ya que L2 está presente en las VLP y los PsV del VPH en cantidades mucho más pequeñas que L1 (una relación máxima de L1:L2 se estima en 5:1). El análisis de transferencia Western con CamVir-1 muestra un claro aumento en la concentración y pureza de L1 en todas las muestras (Figura 12C y 12D).

Para confirmar adicionalmente la presencia de las VLP y los PsV de L1/L2, se examinaron muestras dializadas mediante microscopía electrónica de transmisión (Figura 13). Todas las muestras mostraron la presencia de abundantes partículas, de tamaños que iban desde 30-120 nm. 54% de los mSEAP-PsV (Figura 13A y 13E) tenían 40-70 nm de diámetro, mientras que 47% de los mSEAP+ -PsV (Figura 13B y 13F) y 50% de los mluc+ -PsV (Figura 13C y 13G) 73% de las VLP de L1/L2 (Figura 13D y 13H) eran de un tamaño similar. Los viriones infecciosos del VPH suelen tener entre 50 y 60 nm de diámetro. Estas partículas mostraron una morfología similar a otros ejemplos de partículas del VPH producidas por plantas (Maclean et al., 2007; Warzecha et al., 2003).

Para confirmar que el ADN del replicón estaba encapsulado para formar PsV, las fracciones agrupadas que contenían L1 se digirieron con proteinasa K para liberar el pseudogenoma encapsulado, seguido de PCR inversa con cebadores específicos del replicón como se describió anteriormente para confirmar la presencia de ADN del replicón (Figura 14). La amplificación por PCR confirmó que los PsV de mSEAP, mSEAP+ (Figura 14A) y mluc+ (Figura 14B) contenían el replicón de ADN esperado. No se amplificó ningún replicón de ADN en muestras no tratadas con proteinasa K, lo que indica que el ADN estaba encapsulado y no se encontró fuera de la capa del virión. Las fracciones 17 y 18 de cada muestra se combinaron y dializaron. La amplificación por PCR de estas fracciones, antes o después de la digestión con proteinasa K, así como la amplificación de las VLP de L1/L2 tratadas con proteinasa K, no produjo productos de amplificación.

Como medida preliminar de la cantidad de PsV en cada muestra, se leyó la concentración de ADN de las muestras tratadas con proteinasa K usando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). La Tabla 1 muestra las lecturas de NanoDrop para los tres tipos de PsV. Como una primera estimación amplia a la concentración de partículas para cada tipo, se utilizó la concentración de ADN para calcular el número de pseudogenomas presentes por microlitro, utilizando la fórmula:

ADN total (ng)

^{N o} de moléculas

66^{O . p b . N}4^{/ l O}- 9

en la que ng es nanogramos de ADN en 1 pl, pb es el tamaño del pseudogenoma en pares de bases y N^aes la constante de Avogadro. Los resultados se pueden ver en la Tabla 1. La concentración de moléculas para los tres tipos de PsV fue de miles de millones de partículas por mililitro. Estos datos asumen que todo el ADN presente era ADN de pseudogenoma y que cada PsV empaquetaba exactamente una copia del pseudogenoma. Tomados en conjunto, estos resultados indican la producción exitosa in planta de los PsV que contienen un gen informador por primera vez.

T l 1: n n r i n im ADN rí l P V rifi

Purificación de PsV producidos por plantas

El método de purificación desarrollado para extraer VLP del VPH de Varsani et al., 2003 (con las modificaciones descritas anteriormente) demostró ser exitoso para la purificación de los PsV. Una preocupación fue el uso de N2 líquido para la molienda preliminar del material vegetal. Si bien esta etapa no fue, en sí mismo, un problema, los ciclos de congelación y descongelación, así como la congelación del material vegetal para almacenamiento a largo plazo a -70 °C, resultaron en la degradación de las partículas de PsV (datos no mostrados). Como tal, el protocolo se modificó ligeramente para reemplazar la molienda del material de la hoja congelada con picar finamente el material de la hoja en PBS con alto contenido de sal antes de pasar directamente a la etapa de homogeneización. Esta alteración disminuyó notablemente la degradación de los PsV: la amplificación por PCR del replicón antes de la purificación de los PsV mostró mucho más producto de amplificación en el material vegetal fresco en comparación con el congelado (datos no mostrados).

Las micrografías electrónicas demuestran claramente el ensamblaje y aislamiento exitosos de las VLP y los PsV de L1/L2 del VPH en plantas. Los PsV producidos demostraron una variabilidad inusual en tamaño, en comparación con otros métodos de producción de v Lp y PsV (Buck et al., 2004; Maclean et al., 2007; Touze y Coursaget, 1998). El amplio intervalo de tamaños, de 30 nm a 120 nm de diámetro, puede deberse a la combinación de fracciones correspondientes a una densidad de CsCl de 1,30-1,33 g/ml. Los PsV de L1/L2 del VPH deben encontrarse a una densidad de 1,32-1,34 g/ml y, como tales, algunos PsV más pequeños y más grandes que el intervalo de tamaño esperado de 50-60 nm pueden haberse agrupado, lo que da como resultado la variabilidad que se muestra. Otros investigadores han visto resultados similares en plantas transgénicas y sugieren que las partículas de menor tamaño pueden ser intermedios de ensamblaje (Biemelt et al., 2003). También es posible que los tamaños diferenciales que se observan en este documento se deban a un proceso de ensamblaje que difiere sustancialmente del de los viriones del VPH en células de mamíferos.

En informes anteriores sobre la producción de PsV del VPH se ha utilizado el tratamiento con benzonasa junto con la PCR para demostrar que el ADN está encapsulado dentro de la capa del virión y no simplemente asociado con el virión (Rossi et al., 2000; Unckell et al., 1997). Los PsV producidos en este estudio no se degradaron por la etapa de desnaturalización por PCR a 95 °C, como lo demuestra la ausencia de amplificación del ADN del pseudogenoma en muestras de PsV no digeridas con proteinasa K. Como tal, la capa de proteína necesitaba ser digerida antes de la amplificación del pseudogenoma por PCR para para demostrar la presencia de ADN de pseudogenoma. El significado de esto es doble. En primer lugar, no se requirió el tratamiento con benzonasa para demostrar la encapsulación del ADN y, posteriormente, no se utilizó. En segundo lugar, y posiblemente más importante, esto demuestra que estos PsV son notablemente estables, incluso en condiciones de desnaturalización leve. Esta es una observación importante. Las VLP son generalmente relativamente inestables y deben tratarse con cierto cuidado para evitar el colapso de la partícula (Mach et al., 2006). Si bien los PsV son generalmente más estables, la mayoría de los que se han producido en otros sistemas no son tan estables como se ha demostrado que son estos PsV producidos por plantas. En consecuencia, esto sugiere una ventaja importante sobre los sistemas tradicionales de producción de PsV.

Los datos presentados en el presente documento son la primera evidencia clara de una producción y purificación con éxito de VLP de L1/L2 producidas por plantas. Si bien este no era el objetivo principal del proyecto, la producción de VLP de L1/L2 fue útil, ya que permitió una comparación de VLP y PsV producidos en plantas. Las micrografías electrónicas muestran claramente partículas regulares de 40-70 nm de diámetro. El bajo número de VLP que se muestra en relación con el número de PsV es el resultado de menos material de partida: las VLP se purificaron a partir de aproximadamente el 25% (por peso de hoja fresca) del material vegetal crudo utilizado para la producción de PsV. Las transferencias Western observadas en (Figura 9C y 9D) muestran claramente la presencia tanto de L1 como de L2 en plantas coinfiltradas con pTRAc-L1 y pTRAc-L2. Los niveles de L2 variaron notablemente entre los diferentes experimentos de coinfiltración, incluidas las coinfiltraciones para la producción de PsV. Esto no es sorprendente, ya que se ha demostrado que la proporción de L1:L2 varía entre 5:1 y 30:1 en viriones del VPH y VLP de L1/L2. Esta primera evidencia de producción de VLP de L1/L2 en plantas es un nuevo hito alentador en la producción con base en plantas de vacunas de VLP contra el VPH.

Una primera estimación de la concentración final de los PsV arrojó cifras de miles de millones por microlitro. Esta estimación es intrínsecamente aproximada: se hacen varias suposiciones y los datos de partida, la concentración de ADN obtenida por espectrofotometría, está lejos de ser precisa. Estas suposiciones son 1) que todo el ADN presente era ADN del pseudogenoma encapsulado, y 2) que cada PsV empaquetaba exactamente una copia del pseudogenoma. Sin embargo, es seguro asumir que estas estimaciones no se alejarían en más de dos órdenes de magnitud. Varios otros investigadores han intentado cuantificar la concentración de PsV de varios sistemas, generalmente usando cuantificación de L1 por ELISA (Fleury et al., 2008), ELISA de L1 en combinación con PCR (Unckell et al., 1997) o estimando unidades transductoras a partir de datos del ensayo informador (Buck et al., 2004). Las mejoras futuras de este sistema requerirán una estimación precisa de la concentración de PsV, como la proporcionada por la cuantificación por ELISA.

No se determinaron el rendimiento total ni el factor de concentración. A partir de las micrografías electrónicas y las transferencias Western se desprende claramente que había una concentración marcada de partículas. La transferencia Western de varias etapas de purificación (Figura 12) muestra claramente un aumento en la señal de L1, lo que sugiere una duplicación aproximada de la concentración de la muestra cruda de la planta con respecto a los PsV dializados. Sin embargo, este no es de ninguna manera un ensayo cuantitativo y, como tal, no se pueden llegar a conclusiones firmes sobre esa base. El trabajo adicional para determinar la concentración de PsV es una próxima etapa importante en la evaluación de la eficiencia de la producción de PsV en la planta.

Este estudio demostró con éxito la viabilidad de producir PsV en plantas. Sin embargo, queda mucho trabajo por dilucidar por completo el método de producción y la eficiencia de producción de los PsV producidos por plantas para que sean una alternativa viable a los métodos actuales. Lo más importante es que la cuantificación de los PsV producidos es la siguiente etapa necesaria. Esto podría lograrse con relativa sencillez, mediante ELISA de L1, como demostraron Touze y Coursaget (1998). Otra etapa importante es la investigación de todas las especies de ADN incorporadas a los viriones, para evitar problemas de contaminación al usar estos PsV. Por último, una posibilidad interesante es un protocolo de purificación simplificado. La complejidad del protocolo actual fue necesaria por la inestabilidad de las VLP. Sin embargo, la estabilidad demostrada de estos PsV sugiere que un protocolo de extracción de virus mucho más "severo", como los que se utilizan para la extracción de virus de plantas (EP Rybicki, comunicación personal), podría tener el mismo éxito en la purificación de PsV en una fracción del tiempo y el coste.

Ejemplo 4

Neutralización de la infección por pseudovirión

Ensayo de neutralización de pseudovirión

Para determinar si los PsV producidas por plantas eran útiles para PBNA, se pseudoinfectaron células de mamífero con PsV producidos por plantas. Se tripsinizaron células HEK293TT y se resuspendieron en medio de neutralización (medio de crecimiento estándar, usando DMEM que carece de rojo fenol) a una densidad de 0,3 x 106 células/ml y se sembraron en placas a razón de 100 |jl/pozo en una placa de 96 pozos. Las células se cultivaron a 37 °C durante 3-4 horas. Se añadieron 60 j l de cada PsV por pozo, por triplicado, y se cultivaron durante 72 horas. Para los PsV que contienen un replicón s Ea P, se recogió medio de cultivo celular. Para los que contenían el replicón de luciferasa, se eliminó el medio, las células se lavaron una vez con PBS y se añadió un volumen apropiado de tampón de lisis de cultivo celular (Promega, 20 j l para placas de 96 pozos, 400 j l para placas de 6 pozos) a las células. Las células se agitaron en un agitador orbital durante 15 minutos y se almacenaron a -20 °C durante la noche.

Para medir la producción de luciferasa en células de mamíferos, se utilizó el kit del sistema de ensayo de luciferasa (Promega), de acuerdo con las instrucciones del kit. Se añadieron 100 |jl de sustrato de luciferasa luciferina a 20 |jl de lisado celular. La luminiscencia se leyó en un lector de microplacas Modulus (Turner BioSystems).

Se utilizó transferencia Western para confirmar la expresión de SEAP después de la transfección. Se usaron 32 j l de medio de cultivo celular de células transfectadas con el casete de SEAP para SDS-PAGE, como se describió anteriormente. Las transferencias se sondearon con un anticuerpo primario policlonal anti-fosfatasa alcalina intestinal de ternera (anticiAP) producido por ovejas (Abcam, ab7330) y un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina anti-oveja de ratón (Sigma, A8062). La actividad de SEAp se ensayó usando el kit de quimioluminiscencia de SEAP Great EscAPe (Clontech Laboratories, Inc.), a razón de 0,6 volúmenes de los descritos en las instrucciones del kit. Brevemente, se recogieron 50 j l de medio de cultivo celular a las 72 horas después de la transfección. Se añadieron 15 j l a 45 j l de tampón de dilución y se incubaron a 65 °C durante 30 minutos. Las muestras se colocaron en hielo durante 5 minutos, antes de agregar 60 j l de solución de sustrato de SEAP, y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30-60 minutos. Se detectó luminiscencia en un lector de microplacas Modulus (Turner BioSystems) durante 10 segundos. Todas las muestras se analizaron por triplicado y se calculó la desviación estándar para todas las muestras.

Para confirmar que los PsV producidos por plantas se podían usar para el PBNA, se ensayó la neutralización de los PsV usando un anticuerpo neutralizante del VPH-16 conocido, siguiendo el protocolo descrito por Buck et al., (2005a). Las células HEK293TT se prepararon como describen Pastrana et al., (2004). Se incubaron 60 j l de PsV con 15 j l de anticuerpo neutralizante VPH-16.V5 (desarrollado por Christensen et al., (1996)) a una dilución de 1 en 4000 (para una dilución final 1 en 20000) en hielo durante 60 minutos. Se añadieron gota a gota 75 j l de PsV a las células por triplicado y las células se incubaron durante 72 horas. Se ensayaron la actividad de luciferasa y SEAP como se describió previamente. Se calculó la desviación estándar para todas las muestras.

Ensayo de neutralización con base en pseudovirión utilizando PsV producidos por plantas

Para demostrar que los PsV del VPH-16 producidos en plantas son una herramienta biológica eficaz para su uso en el PBNA, se probaron los PsV para determinar la expresión del informador en células de mamíferos, así como para la neutralización con un anticuerpo neutralizante del VPH-16 de uso común, VPH-16.V5. Se cultivaron células HEK293TT en placas de 96 pozos y se pseudoinfectaron con 60 j l de PsV purificados y sin diluir en NaCl 0,5 M en PBS, con o sin incubación previa con anticuerpos monoclonales VPH-16.V5 diluidos 1:20000 en medio de neutralización. La infección exitosa de células de mamíferos con PsV, así como la neutralización de PsV, se demostró mediante la expresión del gen informador luc o SEAP en estas células. La Figura 15 muestra la expresión del gen informador para las células 72 horas después de la infección con PsV, mSEAP (Figura 15A), mSEAP+ (Figura 15B) y mluc+ (3.12C) con o sin la presencia de anticuerpos neutralizantes (PsV o PsV NAb, respectivamente). El control negativo (-ve) de cada experimento (células de mamífero con 60 j l de medio de neutralización añadido) proporciona una lectura de referencia en RLU, mientras que la transfección con el ADN plasmídico libre de endotoxina correspondiente se utiliza para el control positivo. La pseudoinfección con PsV mSEAP provocó una clara respuesta positiva de SEAP (Figura 15A), aunque no tan fuerte como la de las células transfectadas con ADN plasmídico por lipofección. La incubación con anticuerpo neutralizante neutralizó parcialmente la infección, como lo demuestra una disminución en la señal de SEAP. La pseudoinfección con PsV mSEAP+ no mostró una señal de SEAP fuerte por encima del nivel de línea base proporcionado por el control negativo (Figura 15B). Como tal, no se observó neutralización de PsV mSEAP+. La pseudoinfección con PsV mluc+ provocó una señal de luciferasa débil, aunque claramente por encima de la del control negativo. La incubación con NAb VPH-16.V5 neutralizó completamente la expresión de luciferasa, dando como resultado una expresión idéntica a la del control negativo.

Prueba de PsV y PBNA en células de mamíferos

Para que los PsV producidos por plantas sean una herramienta útil para la prueba de vacunas, es vital demostrar su uso en el ensayo de neutralización con base en pseudoviriones. Los PsV se analizaron para determinar la expresión del gen informador del pseudogenoma y la actividad de PBNA usando el kit de quimioluminiscencia de SEAP Great EscAPe (Clontech Laboratories, Inc.) o el sistema de ensayo de luciferasa (Sigma). El kit Great EscAPe se utiliza para el protocolo de PBNA ampliamente aceptado desarrollado por los laboratorios Schiller, por su sensibilidad y facilidad de uso (Buck et al., 2005a). La luciferasa ha mostrado una amplia utilidad como un ensayo informador fácil y sensible, y se eligió debido a su sistema Great EscAPe de bajo coste, así como para probar un tamaño de pseudogenoma alternativo y un sistema informador.

De los tres tipos de PsV producidos, dos (PsV mSEAP y PsV mluc+) mostraron actividad informadora de bajo nivel después de la pseudoinfección de células de mamíferos, mientras que un (mSEAP+) mostró poca o ninguna actividad informadora. Un ensayo de neutralización preliminar usando un anticuerpo neutralizante de VPH-16 monoclonal de ratón bien establecido VPH-16.V5 (Christensen et al., 1996), demostró la neutralización parcial de la infección por PsV mSEAP y la neutralización completa de la infección por PsV mluc+. No está claro por qué los PsV mSEAP+ no logró inducir la expresión del gen informador en células de mamíferos. El casete de SEAP es claramente funcional, como lo demuestra la expresión exitosa del gen informador por PsV mSEAP. Es poco probable que el casete de la planta incorporado en el pseudogenoma sea la causa; PsV mluc+ también incorporaron un casete de expresión de la planta idéntico sin afectar la expresión. Es posible que se deba a la baja concentración de partículas en comparación con los otros dos tipos de PsV; mientras que las estimaciones de concentración basadas en la presencia de ADN no revelaron diferencias importantes, las micrografías electrónicas mostraron menos partículas en las muestras de PsV mSEAP+ en comparación con las otros dos tipos de PsV. Si bien son preliminares, estos datos proporcionan una prueba de concepto inicial para la producción de PsV in planta para su uso en el PBNA.

La expresión del gen informador después de la pseudoinfección fue considerablemente más baja de lo esperado. La mayoría de los estudios de PBNA anteriores han necesitado diluir PsV hasta 1000000 de veces para estar dentro del intervalo lineal del ensayo de SEAP. Los cálculos preliminares determinaron que la concentración de partículas de PsV era similar a la obtenida por Buck et al., (2005a). En consecuencia, se esperaría que la infectividad fuera similar. Sin embargo, este no fue el caso: los PsV probados en el presente documento mostraron una expresión del gen informador limitada, a pesar de que se agregaron sin diluir a las células. La expresión por pseudoinfección fue menor que la del ADN transfectado por lipofección. El ADN total agregado por transfección de FuGene a cada pozo de una placa de 96 pozos fue de aproximadamente 200 ng por pozo, mientras que el ADN total en una muestra de PsV de 60 |jl, de acuerdo con lo determinado por espectrofotometría NanoDrop, fue de 500-900 ng, dependiendo de la muestra. Trabajos anteriores han demostrado que la infectividad de los PsV puede ser bastante baja; Roden et al., (1996) estimaron una infectividad de 1 en 10000 células, mientras que Unckell et al., (1997) y Touze y Coursaget (1998) estimaron proporciones de 1:2000, 1:1000, respectivamente. Sin embargo, esto no explica completamente la mala expresión que sigue a la pseudoinfección. Es probable que la causa de esta discrepancia sea el tampón en el que se dializaron los PsV después de la purificación, a saber, NaCl 0,5 M en PBS. Los cambios en la osmolalidad de los medios de cultivo celular (una medida de la concentración de partículas en solución) tienen un efecto marcado en las células de mamíferos. La osmolalidad fisiológica se estima en 290-320 mOsm/kg para tejidos de mamíferos (Waymouth, 1970). Es probable que cualquier desviación importante de esto, como la introducción de grandes cantidades de NaCl en los medios de cultivo celular, afecte seriamente el crecimiento de las células, así como su capacidad para producir proteínas recombinantes. Es probable que este sea el caso en el presente documento, y una prioridad para el trabajo futuro es repetir estos experimentos con PsV en un tampón con menos sal. Se eligió este tampón porque se ha demostrado que ayuda a la estabilidad de las VLP producidas en las plantas (Varsani et al., 2003). Sin embargo, estos PsV han demostrado una marcada estabilidad a las condiciones de desnaturalización y es probable que sean estables en PBS.

Ejemplo 5

Mejora del plásmido informador y PBNA utilizando el plásmido mejorado

Introducción del origen de replicación del SV40

Para evaluar si se podía mejorar la expresión del gen informador, se clonó el origen de replicación de SV40 (SV40ori) en los vectores pRIC3-mSEAP, pRIc3-mSEAP+ y pRIC3-mluc (Figura 19). Los inventores plantearon la hipótesis de que la inclusión de SV40ori en el plásmido aumentaría la amplificación de SEAP en células HEK293TT y mejoraría los rendimientos de la proteína informadora. Los vectores que contenían SV40ori (pRIC3-mSEAP-SV40ori (SEQ ID NO: 15), pRIC3-mSEAP+ -SV40ori (SEQ ID NO: 16) y pRIC3-mLuc+ -SV40ori (SEQ ID NO: 17)) se probaron en cultivo de tejido añadiendo el ADN a las células HEK293TT y comparando los niveles de expresión con los obtenidos con los vectores de ADN originales.

Producción de PsV mSEAP-SV40ori

Se infiltraron pRIC3-mSEAP-SV40ori, pTRAc-hL1 y pTRAc-hL2 en plantas como se describió anteriormente. Se produjeron PsV que contenían un vector de replicación que codifica un polipéptido para SEAP utilizando constructos mSEAP+ y mSEAP+ -SV40ori. Los extractos crudos de plantas se agregaron directamente a gradientes Optiprep continuos (vertidos el día anterior) o discontinuos (recién vertidos) (20%, 33%, 40%, 50%). Los gradientes se centrifugaron durante 6 horas a 32000 rpm. Las fracciones que produjeron las transferencias más oscuras en una transferencia de puntos de los gradientes discontinuos tanto para mSEAP+ como para mSEAP+ -SV40ori se combinaron y se usaron para pseudoinfectar células HEK293TT. Los PsV se diluyeron en medio DMEM, se añadieron 5 x 105 células a placas de 6 pozos, se incubaron a 37 °C durante 3 horas y se vertieron 400 j l de los PsV (diluidos 1:1, 1:10, 1:100 y 1:1000 en DMEM) en las células. Las placas se incubaron a 37 °C durante 3 días. La actividad de SEAP se evaluó en las células HEK293TT evaluando la actividad de la fosfatasa alcalina usando transferencias de puntos. Los inventores pudieron detectar AP en el sobrenadante de células infectadas con mSEAP+ y mSEAP+ -SV40 ori. A continuación, se utilizó un kit de SEAP para determinar la cantidad de SEAP en el sobrenadante (Tabla 2, Figura 20). No se detectó un aumento significativo de la actividad en los PsV mSEAP+ -SV40ori.

a a : e ermnac n e os nvees e en un a es e uz rea vas por uc n e s pro uc os po r la planta agregados a las células HEK293TT. El control negativo es sin ADN y el control positivo es solo mSEAP+ADN.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un pseudovirión del virus del papiloma humano (VPH) en una célula vegetal, comprendiendo el método las etapas de:

(i) introducir en la célula vegetal:

(a) un primer ácido nucleico que codifica un polipéptido L1 del VPH; y

(b) un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido L2 del VPH,

(d) un cuarto ácido nucleico que codifica una proteína Rep,

2. El método de la reivindicación 1, en el que el primer y segundo ácidos nucleicos están operativamente unidos a secuencias reguladoras que permiten la expresión de los polipéptidos L1 del VPH y L2 del v Ph .

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína Rep se expresa a partir de al menos uno del grupo seleccionado entre:

(i) una secuencia de ácido nucleico contenida en el vector de replicación;

(ii) una secuencia de ácido nucleico contenida en al menos un vector de expresión;

(iii) una secuencia de ácido nucleico contenida en un vector independiente, que no es el vector de (i) o (ii) anteriores; o

(iv) una secuencia de ácido nucleico integrada en el ADN genómico de la célula vegetal;

en el que la expresión de la proteína Rep en presencia del vector replicante da como resultado la replicación del vector replicante para producir un número elevado de copias del pseudogenoma en la célula vegetal.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tercer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo, comprende un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen informador, un gen terapéutico o un gen que codifica un polipéptido antigénico.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el gen que codifica un polipéptido heterólogo es un gen informador seleccionado de un gen de luciferasa o un gen de fosfatasa alcalina secretada.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una etapa de recuperar el pseudovirión del VPH de la célula vegetal.

7. Un ensayo para detectar la presencia de un anticuerpo neutralizante del VPH en un sujeto, incluyendo el ensayo las etapas de:

(iv) ensayar la expresión del polipéptido informador;

8. El ensayo de la reivindicación 7, en el que el polipéptido informador se selecciona entre un polipéptido luciferasa o fosfatasa alcalina secretada.

9. El ensayo de la reivindicación 7 u 8, en el que el sujeto es un ser humano.

10. Un pseudovirión del VPH producido de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el pseudovirión del VPH una cápside, donde en la que la cápside comprende los polipéptidos de L1 del VPH y L2 del VPH, en la que la cápside encapsula el pseudogenoma que comprende el tercer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo, en el que el tercer ácido nucleico está operativamente unido a una secuencia reguladora que permite la expresión del polipéptido heterólogo en una célula de mamífero, en el que la replicación del vector de replicación se inicia a partir de la secuencia Ori reconocida por la proteína Rep, y en el que el pseudovirión del VPH se produce y se recupera de la célula vegetal.

11. El pseudovirión del VPH de la reivindicación 10, en el que la replicación del pseudogenoma puede iniciarse, en una célula de mamífero infectada por el pseudovirión del VPH en presencia de una proteína Rep, en la que la proteína Rep está codificada por una secuencia de ácido nucleico operativamente unida a una secuencia reguladora que permite la expresión de la proteína reguladora en la célula de mamífero, en la que la proteína Rep puede expresarse a partir de uno cualquiera del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de ácido nucleico contenida en el pseudogenoma;

(ii) una secuencia de ácido nucleico contenida en un vector independiente; o

(iii) una secuencia de ácido nucleico integrada en el ADN genómico de la célula de mamífero,

en el que la expresión de la proteína Rep en la célula de mamífero da como resultado la replicación del pseudogenoma.

12. El pseudovirión del VPH de la reivindicación 10, en el que el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido informador, un polipéptido terapéutico o un polipéptido antigénico.

13. Una composición farmacéutica que comprende un pseudovirión del VPH producido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el pseudovirión del VPH de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.