KR20230109702A

KR20230109702A - 최적화된 보편적 인플루엔자 백신의 설계, 이들의 설계 및 용도

Info

Publication number: KR20230109702A
Application number: KR1020237020438A
Authority: KR
Inventors: 우베 디. 슈타어츠; 필립 씨. 스피어; 옌 치; 자내 컬
Original assignee: 그레펙스 인코포레이티드
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-07-20
Also published as: US20240000916A1; CN116963768A; JP2023549561A; EP4247421A1; WO2022109152A1

Abstract

본 발명의 개시는 보편적 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다. 보편적 인플루엔자 바이러스 백신을 위한 조성물은 적어도 2개, 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 유래 항원을 포함한다. 항원이 유래된 HA 단백질은 위치 52 및 277의 보존된 시스테인 사이에 위치한 과가변 영역을 가지며, 과가변 영역은 항원에서 결실된다. 적어도 2개의 항원은 각각 엠보스 익스플로러 콘스(emboss explorer cons) 프로그램에 의해 계산시 60, 또는 70, 또는 80을 초과하는 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는다.

Description

최적화된 보편적 인플루엔자 백신의 설계, 이들의 설계 및 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 11월 18일에 출원된 가출원 번호 63/115,459호의 우선권을 주장하고 이의 비-가출원이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.

서열 목록의 제출

[0001] 크기가 18 킬로바이트(MS-Windows에서 측정됨)이고 2021년 11월 18일에 생성된 Sequence_Listing으로 명명된 파일을 함유하는 서열 목록이 본원에 제공되고 그 전체가 참조로서 포함된다.

분야

[0002] 본 발명의 개시는 하나 초과의 인플루엔자 A 혈청형과 높은 유사성을 갖는 인플루엔자 HA 유래 항원을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 개시는 보편적 인플루엔자 백신을 위한 조성물에 관한 것이다.

[0003] 계절성 인플루엔자, 대유행 인플루엔자 및 고병리학적 조류 인플루엔자(HPAI)는 조류 및 포유동물의 대규모 병원소로부터 발생한다. 새로운 인플루엔자 변이체는 예측할 수 없는 순열로 빠르게 재조합될 수 있다. HPAI의 사소한 유전적 변화는 이의 감염성을 크게 증가시키고 효율적인 인간-대-인간 감염을 허용할 수 있기 때문에, 대유행 확산은 실제로 현실이 될 수 있다.

[0004] 예를 들어, H5N1 HPAI는 조류-대-인간 감염을 통해 2003년 아시아에서 분출되었다. 이는 이집트를 핫스팟으로 하여 전 세계로 퍼졌다. 아시아의 원래 H5N1 HPAI 균주는 클레이드 1인 반면, 보다 최근의 이집트 균주는 클레이드 2(클레이드 2.2.1)이다. 첫 번째 H7N9 HPAI는 2013년에 중국에서 나타났고, 2016년 및 2017년에 추가 변이체가 나타났다. 미국 연방 정부는 난(egg)-기반의 통상적인 H5N1 및 H7N9 백신의 비축을 유지하였다. 이들의 면역원성, 특히 Sanofi-Pasteur 클레이드 1 H5N1 백신의 면역원성은 표준 계절성 인플루엔자 백신의 면역원성보다 유의하게 낮았다. 백신은 프라임-부스트 요법으로 제공되고, 클레이드 2 H5N1 GSK 백신은 애쥬번트에 의해 향상된다. 다른 문제는 클레이드 1 및 클레이드 2 H5N1 백신 사이의 감소된 수준의 이종성 보호, 및 또한 6개월 이내에 효력이 상실될 수 있는 면역 반응의 일시적인 특성 둘 모두이다.

[0005] 인플루엔자 바이러스의 예측할 수 없는 특성을 광범위하게 반응성인 백신, 소위 "보편적" 인플루엔자 백신으로 처리하는 것이 제안되었다. 가장 강력한 항-인플루엔자 항체(Ab)는 헤마글루티닌(HA) 헤드에 결합하여 특정 세포 수용체와의 상호작용을 물리적으로 차단한다. 이러한 HA 도메인의 높은 가변성은 특이성을 제공하지만, 교차-반응성을 제한한다. 훨씬 더 희귀한 Ab는 고도로 보존된 HA 줄기 영역을 인지한다. 이들은 여러 인플루엔자 A 서브타입에 광범위하게 결합한다. 줄기 항체는 세포 수용체 결합을 억제함으로써가 아니라, 감염된 세포의 ADCC를 포함하여 바이러스-막 융합을 억제하고, 핵으로의 바이러스 진입을 방지함으로써 작용할 수 있다. 그러나, 현재의 2-항원 줄기 백신은 기본 면역만을 전달할 수 있다. 이러한 2-항원 줄기 백신은 상이한 혈청형의 인플루엔자로부터의 HA와 단지 비교적 낮은 유사성 또는 "서열-중첩"을 갖는 2개의 상이한 "보존된" 항원에 기반한다. 따라서, 특정 인플루엔자 균주에 기반한 백신으로 2-분자 보편적 항원에 의해 유도된 면역 반응을 부스팅하는 것이 필요할 수 있다. 일부 과학적 증거는 또한 광범위하게 반응성인 Ab가 후속 인플루엔자 감염을 악화시키는 질병-증진 Ab의 유도와 같은 문제를 가질 수 있음을 시사한다.

[0006] 계절성 및 대유행 인플루엔자 뿐만 아니라 HPAI(및 다른 새로 출현하는 감염성 위협)에 대한 면역 예방에 대한 이러한 현재의 접근은 다음 문제가 기존 해법에서 적절하게 해결되지 않았기 때문에 심각하게 부족하다:

(1) 역가: 비축된 HPAI 백신을 포함하는 현재의 인플루엔자 백신은 단지 중간 정도의 일시적인 면역 보호를 제공한다.

(2) 개발 속도: 인플루엔자 백신에 대한 현재의 개발 및 생산 계획은 느리고 빠르게 출현하는 인플루엔자(및 다른 감염성 위협)의 도전을 충족시키지 못한다.

(3) 인플루엔자 균주의 가변성: 인플루엔자는 이들의 항원 조성을 신속하게 변경하는 능력을 가지며, 새로운 균주를 설명하고 새로운 특이성을 다루기 위해 새로운 백신을 지속적으로 개발할 필요가 있다.

[0007] 인플루엔자 헤마글루티닌으로부터 유래된 보존된 항원을 사용하고, 상이한 혈청형의 인플루엔자에서 발견되는 단백질과 높은 유사성 또는 보존성을 유지하고, 강력한 면역 반응을 유도하는 보다 일관된 "보편적" 백신을 개발하는 것이 바람직하다.

[0008] 고전적인 바이러스 백신은 느리고 용량이 제한된 수정란 기술을 사용하여 약독화된, 불활성화된 바이러스 또는 바이러스 추출물로서 생산된다. 보다 최근의 조직 배양 접근법은 인플루엔자 및 또한 ZIKV (지카 바이러스) 백신의 경우에 세포 배양 브로쓰에서 바이러스 확장 및 특정 항원의 합성을 포함한다. 단백질-기반 백신의 본질적으로 낮은 면역원성은 애쥬번트의 첨가에 의해 향상될 수 있고 향상되어야 한다.

[0009] 완성된 백신을 전달하기보다는, 유전적 면역화 접근법은 숙주가 항원을 합성하여 면역계에 제시하도록 한다. 이러한 시스템은 자연 바이러스 감염을 보다 밀접하게 모방한다. 다양한 전략이 연구되고 있다. 네이키드 DNA 백신은 생산이 간단하고 빠르지만, 이들의 낮은 면역원성을 극복하기 위해 비교적 높은 용량 및 전문화된 전달 시스템을 필요로 한다. 유전적 백신은 종종 Ad, 백시니아 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 황열병 바이러스, 및 알파 바이러스와 같은 조작된 바이러스를 이용한다. 그러나, 이들의 기본 생물학은 이들의 유용성을 제한할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 드물지만 중증의 부작용과 관련이 있는 17D 황열병 바이러스 균주와 같이 병원성일 수 있다.

[0010] 유전자 전달 및 또한 백신 벡터 플랫폼의 기초로서 네이키드 DNA, AAV 및 또한 RNA-바이러스 외에도, 아데노바이러스(Ad)-기반 접근법이 이용 가능하다. Ad-유래된 벡터는 양성인 것으로 입증되었고, 숙주 유전체로의 통합을 피하고, 본질적으로 애쥬번트된다. 복제-결핍, 최소한으로 변형된 초기 세대(eg) Ad 벡터에 기초하여 다수의 백신이 조작되었다. 이들은 다른 백신 시스템과의 일대일 비교에서 더 높은 면역원성을 반복적으로 입증하였다. 또한, 이들은 또한 조류 인플루엔자 및 ZIKV에 대한 강력한 면역 반응을 일으키는 것으로 입증되었다. 중요하게는 그리고 다른 백신 시스템과 달리, 이들은 장기간에 걸쳐 지속적인 면역 보호를 제공한다. 따라서, 이들은 ZIKV, 에볼라, 결핵 및 말라리아에 대한 백신에 대한 새로운 관심을 보였다.

[0011] 초기 Ad 시스템의 한계를 극복하기 위해 상이한 전략을 통합한 Ad 벡터 시스템이 개발되었다. 완전히 결실된 (fd) Ad 벡터 플랫폼은 백신 유전체를 인간 혈청형 Ad6와 같은 낮은 유병률의 인간 혈청형으로 패키징한다. 이러한 백신은 모든 내인성 Ad 유전자가 완전히 결실(fd)된다. fdAd 벡터는 면역계를 백신 항원에 더 잘 집중시키고, 항-Ad 면역 반응에 의한 간섭을 최소화하고, 프라임-부스트 백신접종을 가능하게한다. 캡시드화를 위해 헬퍼 바이러스를 사용하는 fdAd 벡터 시스템은 헬퍼 바이러스 및 복제 적격 아데노바이러스(RCA)에 의한 오염과 관련이 있다. 이러한 불순물은 강력한 항-Ad 반응을 유도할 잠재성이 있다. 새로운 fdAd 구조는 헬퍼 바이러스와 독립적으로 fdAd를 패키징한 fdAd 벡터를 생성하였다(헬퍼 바이러스-비의존적, hi). 이들은 완전히 결실된 헬퍼 바이러스-비의존적 Ad 벡터(fdhiAd 벡터)이다.

[0012] fdhiAd 백신 플랫폼은 2개의 독립적으로 변형 가능한 성분: (i) 모든 내인성 Ad 유전자가 결실된 fdAd 벡터 유전체 모듈, 및 (ii) 필요한 Ad 후기 유전자를 트랜스로 전달하는 패키징 불가능한 원형 패키징 발현 플라스미드를 기반으로 한다.

[0013] 모든 내인성 Ad 유전자가 결실된 fdAd 벡터 유전체를 획득하기 위해, fdAd 벡터 기본 모듈이 최대 33kb의 상이한 트랜스진 작제물을 수용하도록 조립된다. 이들은 상이한 Ad의 좌측 및 우측 ITR 및 패키징 신호(ψ)를 운반한다.

[0014] 완성된 fdAd 벡터 유전체 모듈은 크기가 약 34kb이고, 패키징 불가능한 패키징 발현 플라스미드의 숙주 세포로의 공동-형질감염에 의해 캡시드화된다. 패키징 발현 플라스미드는 캡시드의 조립, fdAd 벡터 유전체 모듈의 복제 및 캡시드로의 이의 통합에 필요한 모든 Ad 유전자를 트랜스로 제공한다. 인간 Ad 종 C 및 B(혈청형 35)의 캡시드에 대해 변형된 pBR322 백본에서 상이한 원형 패키징 발현 플라스미드가 조작되었다. 이들은 초기 유전자 E2 및 E4와 함께 중요한 후기 유전자(L1, L2, L3, L4, L5)를 트랜스로 제공하고, 패키징 신호 ψ 및 적어도 하나의 ITR이 결실된다.

[0015] fdAd 기술은 큰 페이로드를 가지며, 이는 큰 트랜스진 작제물을 전달하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 단일 fdAd 벡터에서 면역 억제 유전자 CD8(조합된 12kb)과 함께 전장 인간 응고 인자 VIII cDNA를 전달하는 것이 가능하였다. 둘 모두의 트랜스진은 세포로의 형질도입시 효율적으로 발현되었다. 따라서, fdAd 벡터는 2개 초과의 보존된 인플루엔자 항원 작제물을 전달하는 최적화된 보편적 인플루엔자 백신의 생산을 위한 기초로서 사용될 수 있다.

[0016] 현재 보편적 인플루엔자 백신은 2개의 보존된 인플루엔자 헤마글루티닌 작제물을 기반으로 한다. 초기 보편적 인플루엔자 백신의 설계는 줄기 영역에서 알파 나선 구조의 에피토프에 결합하는 2개의 항체, CR6261 및 CR8020의 반응성 패턴을 따랐다. 이 영역에 대한 항체는 바이러스 입자를 중화시킨다. 이러한 항체는 전장 HA가 막에 융합하는데 필요한 pH 유도된 입체형태 변화를 겪는 것을 방지함으로써 HA 기능을 억제하는 것으로 보인다. CR6261 및 CR8020은 이들의 기능으로 인해 심하게 보존된 영역이기 때문에 광범위한 HA 표적을 중화시킨다. CR6261은 그룹 1, 서브타입 1, 2, 5, 6, 9, 13 및 16에서 HA를 중화시키는 것으로 나타났다. CR8020은 그룹 2 HA의 3, 4, 7, 10, 14 및 15에 결합하는 것으로 나타났다. 이들 2개의 그룹을 뒤따르는 2개의 보존된 헤마글루티닌 항원을 설계하면 대략 55%의 평균 서열 동일성이 초래된다. 헤드리스(headless) 작제물이 보편적 독감 백신에 대한 유망한 접근법이지만, 기술적인 문제로 인해 이 접근법의 광범위한 개발이 방해를 받았다. 2개의 항원 작제물 접근법의 낮은 동일성 스코어는 낮은 친화성 면역 반응을 야기한다. 또한, 낮은 서열 중첩을 극복하기 위해 항원 작제물의 수를 증가시키는 것은 접근을 어렵고 비용이 많이 들게 만들었다. 헤드리스 HA는 난(egg) 배양물에서 증식하여 백신에 대해 불활성화될 수 있는 생존 가능한 인플루엔자 바이러스를 형성할 수 없다. 따라서, 이들은 대체 수단에 의해 생산되어야 한다.

[0017] fdAd 벡터 시스템은 이러한 생산 문제를 극복한다. 헤드리스 HA는 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 유사 입자에서 기능할 필요가 없으며, 이들은 단지 생체내 형질도입된 세포에서 발현될 필요가 있다. 또한, fdAd는 이들의 큰 페이로드에 2개 초과의 HA 작제물을 용이하게 전달할 수 있다. fdAd 백신의 다가는 조작 또는 생산의 복잡성을 유의하게 증가시키지 않는다. 따라서, 다가 보편적 인플루엔자 백신은 비용 효율적으로 생산될 수 있다.

[0018] 구현예에서, 본 발명의 개시는 백신용 조성물을 제공한다. 본 발명의 개시의 구현예에 따르면, 백신용 조성물은 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 유래 항원을 포함하고, 여기서 항원이 유래된 HA 단백질은 과가변 영역을 포함하고, 과가변 영역은 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원으로부터 결실되고, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원 각각은 엠보스 익스플로러 콘스(emboss explorer cons) 프로그램에 의해 계산시 적어도 60 초과의 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는다.

[0019] 구현예에서, 유사성은 적어도 70, 또는 적어도 80이다.

[0020] 구현예에서, 과가변 영역은 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원에서 펩티드 링커로 대체된다.

[0021] 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원은 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원은 항원이 유래된 HA 단백질을 코딩하는 RNA 및 DNA 중 하나이다. 추가 구현예에서, RNA 및 DNA 중 하나는 바이러스 벡터에 있다.

[0022] 구현예에서, 과가변 영역은 혈청형 H3의 인플루엔자 HA의 아미노산 넘버링을 사용하여 위치 52 및 277의 보존된 시스테인 사이에 위치한다.

[0023] 또 다른 구현예에서, 조성물은 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원을 포함한다.

[0024] 구현예에서, 본 발명의 개시는 보편적 인플루엔자 바이러스 백신을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 개시의 구현예에 따르면, 보편적 인플루엔자 바이러스 백신을 생성하기 위한 방법은 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60을 초과하는 제1 복수의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 제1 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하고; 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60을 초과하는 제2 복수의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 제2 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하는 것을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 복수의 인플루엔자 혈청형은 상이한 혈청형으로 구성된다.

[0025] 구현예에서, 제1 및 제2 복수의 인플루엔자 혈청형은 상이한 비-중첩 혈청형으로 구성된다.

[0026] 구현예에서, 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원이 유래된 HA 단백질은 과가변 영역을 함유하고, 과가변 영역은 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원으로부터 결실된다.

[0027] 구현예에서, 유사성은 독립적으로 적어도 70, 또는 적어도 80이다.

[0028] 구현예에서, 과가변 영역은 펩티드 링커로 대체된다.

[0029] 구현예에서, 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원은 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원은 항원이 유래된 HA 단백질을 코딩하는 RNA 및 DNA 중 하나이다. 추가 구현예에서, 상기 방법은 HA 단백질을 코딩하는 RNA 및 DNA 중 하나를 바이러스 벡터로 캡시드화하는 것을 포함한다.

[0030] 구현예에서, 상기 방법은 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60을 초과하는 제3의 복수의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 적어도 제3의 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하는 것을 포함한다.

[0031] 구현예에서, 본 발명의 개시는 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 혈청형에 대해 동물을 백신접종하는 방법을 제공한다. 본 발명의 개시의 구현예에 따르면, 상기 방법은 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 유래 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하고; 백신 조성물을 동물에게 전달하는 것을 포함하며, 여기서 항원이 유래된 HA 단백질은 과가변 영역을 포함하고, 과가변 영역은 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원으로부터 결실되고, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원 각각은 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60 초과의 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는다.

서열 목록의 간단한 설명

[0032] SEQ ID NO:1은 도 1에 제시된 바와 같은 적색 인플루엔자 혈청형에 대한 컨센서스 서열을 제시한다.

[0033] SEQ ID NO:2는 도 1에 제시된 바와 같은 오렌지색 인플루엔자 혈청형에 대한 컨센서스 서열을 제시한다.

[0034] SEQ ID NO:3는 도 1에 제시된 바와 같은 황색 인플루엔자 혈청형에 대한 컨센서스 서열을 제시한다.

[0035] SEQ ID NO:4는 도 1에 제시된 바와 같은 녹색 인플루엔자 혈청형에 대한 컨센서스 서열을 제시한다.

[0036] SEQ ID NO:5는 도 1에 제시된 바와 같은 청색 인플루엔자 혈청형에 대한 컨센서스 서열을 제시한다.

[0037] SEQ ID NO:6는 도 1에 제시된 바와 같은 보라색 인플루엔자 혈청형에 대한 컨센서스 서열을 제시한다.

[0038] 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불에 따라 특허청에 의해 제공될 것이다.
[0039] 도 1은 6개의 상동성 그룹으로 그룹화된 대표적인 인플루엔자 A 헤마글루티닌 단백질의 서열 동일성을 나타낸 것이다.
[0040] 도 2는 헤마글루티닌 단백질 계통수를 나타낸 것이다.
[0041] 도 3은 단백질 서열로서 보존된 헤마글루티닌 줄기 트랜스진 작제물을 나타낸 것이다.
[0042] 도 4는 6개의 컨센서스의 보존된 줄기 단백질을 갖는 대표적인 인플루엔자 A 헤마글루티닌 단백질의 서열 유사성을 나타낸 것이다.
[0043] 도 5는 완전히 결실된 헬퍼 바이러스-비의존적 아데노바이러스 벡터 플랫폼의 도식적 표현이다.

[0044] 본 발명의 개시의 임의의 구현예가 상세히 설명되기 전에, 본 발명의 개시는 하기 설명에 제시되거나 도면에 예시된 구성요소의 작제 및 배열의 세부사항으로의 적용으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 개시는 다른 구현예가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되는 것으로 이해된다. 본원에서 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 이들의 등가물 뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 "필수적으로 포함하는" 및 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 뿐만 아니라 등가물 및 추가 항목을 포함하는 것을 의미하나, 단 이러한 등가물 및 추가 항목은 전체의 속성, 용도 또는 제조를 본질적으로 변경하지 않는다. 본원에서 "~로 구성된" 및 이의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 이러한 항목만을 포함하는 것을 의미한다.

[0045] 도면을 참조하여, 유사한 번호는 전체에 걸쳐 유사한 요소를 지칭한다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션을 설명하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 이러한 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션은 이러한 용어에 의해 제한되어서는 안 된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 용어는 하나의 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션을 다른 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션과 구별하기 위해서만 사용된다. 따라서, 제1 요소, 성분, 영역 또는 섹션은 본 발명의 개시로부터 벗어남 없이 제2 요소, 성분, 영역 또는 섹션으로 언급될 수 있다.

[0046] 본 발명의 개시의 수치 범위는 근사치이며, 따라서 달리 지시되지 않는 한 범위 밖의 값을 포함할 수 있다. 수치 범위는 임의의 더 낮은 값과 임의의 더 높은 값 사이에 적어도 2개의 단위의 분리가 존재하는 한, 하한 및 상한 값으로부터의 모든 값 및 이를 포함하는 모든 값(달리 구체적으로 언급되지 않는 한)을 1 단위의 증분으로 포함한다. 예로서, 조성, 물리적 또는 다른 특성, 예를 들어, 중량 기준 성분의 양 등과 같은 것이 10 내지 100인 경우, 10, 11, 12 등과 같은 모든 개별 값, 및 10 내지 44, 55 내지 70, 97 내지 100 등과 같은 하위 범위가 명시적으로 열거되는 것으로 의도된다. 명시적인 값을 함유하는 범위(예를 들어, 1, 또는 2, 또는 3 내지 5, 또는 6, 또는 7의 범위)의 경우, 임의의 2개의 명시적 값 사이의 임의의 하위 범위가 포함된다(예를 들어, 상기 범위 1-7은 하위 범위 1 내지 2; 2 내지 6; 5 내지 7; 3 내지 7; 5 내지 6 등을 포함한다). 1보다 작은 값을 함유하거나 1보다 큰 분수(예를 들어, 1.1, 1.5 등)를 함유하는 범위의 경우, 1 단위는 적절하게는 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1인 것으로 간주된다. 10 미만(예를 들어, 1 내지 5)의 한 자리 숫자를 포함하는 범위의 경우, 1 단위는 전형적으로 0.1로 간주된다. 이들은 구체적으로 의도된 것의 단지 예이며, 열거된 가장 낮은 값과 가장 높은 값 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합은 본 발명의 개시에서 명시적으로 언급되는 것으로 간주되어야 한다.

[0047] "밑", "아래", "하부", "위", "상부" 등과 같은 공간 용어는 도면에 예시된 바와 같이 본원에서 하나의 요소 또는 특징과 다른 요소(들) 또는 특징(들)의 관계를 설명하기 위해 설명의 편의를 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 사용 또는 예시에서의 배향에 따라 상이한 배향을 포함하는 것으로 의도되는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 도면에서 장치가 뒤집힌 경우, 다른 요소 또는 특징의 "아래" 또는 "밑"으로 설명된 요소는 다른 요소 또는 특징의 "위"로 배향될 것이다. 따라서, 예시적인 용어 "아래"는 위와 아래의 배향 둘 모두를 포함할 수 있다. 장치는 달리 배향될 수 있고(90°회전되거나 다른 배향으로) 본원에서 사용되는 공간적으로 상대적인 기술어가 이에 따라 해석될 수 있다.

[0048] 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용될 때, 어구 "및/또는"은 A 및 B 둘 모두; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 구현예 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독) 각각을 포함하는 것으로 의도된다.

[0049] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 하기에 설명된 세포 배양, 분자 유전학, 및 핵산 화학 및 하이브리드화에서의 실험실 절차는 당 분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오티드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계는 제조업체의 사양에 따라 수행된다. 기술 및 절차는 일반적으로 당 분야의 통상적인 방법 및 이 문서 전체에 걸쳐 제공되는 다양한 일반 참고문헌에 따라 수행된다(일반적으로, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조). 단위, 접두사, 및 기호는 이들의 SI 허용 형태로 표시될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록되고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복실 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 기록된다. 아미노산은 본원에서 이들의 일반적으로 알려진 3개의 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에 의해 권장되는 1개의 문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 이들의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다. 달리 제공되지 않는 한, 본원에서 사용되는 소프트웨어, 전기 및 전자 용어는 The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5.sup.th edition, 1993)에 정의된 바와 같다.

[0050] 본원에 개시된 구현예는 다가의 보편적 인플루엔자 A 백신의 설계, 작제 및 생성에 관한 것이다.

[0051] 본 발명의 개시의 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 하기 용어는 달리 지시되지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 하며, 명세서 전체를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.

[0052] 본원에서 사용되는 용어 "아데노바이러스", "아데노바이러스 비리온" 및 "아데노바이러스 입자"는 모든 그룹, 서브그룹, 종 및 혈청형을 포함하여 인간 또는 동물을 감염시키는 임의의 아데노바이러스를 포함하여 아데노바이러스로 분류될 수 있는 임의의 및 모든 바이러스를 포함한다.

[0053] 본원에서 사용되는 용어 "아데노바이러스 벡터"는 아데노바이러스에 기반하고 유전 물질을 전달하는데 사용되는 임의의 유전 작제물 또는 바이러스 작제물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "결실된 아데노바이러스" 또는 "결실된 아데노바이러스 벡터"는 하나 이상의 내인성 유전자 또는 이로부터 결실된 유전자 단편을 갖는 임의의 및 모든 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 대조적으로, 본원에서 사용되는 용어 "완전히 결실된 아데노바이러스" 및 "완전히 결실된 아데노바이러스 벡터"는 내부 말단 반복부(ITR) 및 패키징 신호(ψ)를 제외한 모든 내인성 아데노바이러스 유전자 및 유전 물질이 결실된 임의의 및 모든 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아데노바이러스 벡터 유전체"는 아데노바이러스 벡터에서 발견되는 유전 물질을 포함한다.

[0054] "항원"은 숙주의 면역계를 자극하여 세포 항원-특이적 면역 반응, 또는 체액성 항체 반응을 일으킬 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 의미한다. 따라서, 항원은 단백질, 폴리펩티드, 항원성 단백질 단편, 올리고당류, 다당류 등을 포함한다. 또한, 항원은 임의의 공지된 바이러스, 박테리아, 기생충, 식물, 원생동물, 또는 진균으로부터 유래될 수 있고, 전체 유기체일 수 있다. 상기 용어는 또한 종양 항원을 포함한다. 유사하게, DNA 면역화 적용에서와 같이 항원을 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 항원의 정의에 포함된다. 합성 항원은 또한, 예를 들어, 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성 유래 항원을 포함한다(Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. And Cell Biol. 75:402 408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998).

[0055] 선택된 폴리펩티드를 "인코딩하는" 서열 또는 "코딩 서열"은 적절한 조절 서열(또는 "제어 요소")의 제어 하에 놓일 때 생체 내에서 폴리펩티드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 시작 코돈 및 3'(카르복시) 말단에서 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다. 코딩 서열의 전사 및 번역은 전형적으로 전사 프로모터, 전사 인핸서 요소, 샤인 및 델라가모 서열(Shine and Delagamo sequences), 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열(번역 정지 코돈의 3'에 위치함), 번역 개시의 최적화를 위한 서열(코딩 서열의 5'에 위치함), 및 번역 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 "제어 요소"에 의해 조절된다.

[0056] 본원에서 사용되는 용어 "보존된 항원"은 하나 초과의 혈청형의 바이러스에서 발현되는 유전자 변이체와 유사성을 나타내는 항원을 지칭한다.

[0057] 본원에서 사용되는 용어 아미노산 잔기의 "보존적 변이체"는 전하, 소수성 및 크기와 같은 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산을 갖는 단백질에서 제공된 위치에서 아미노산의 변화를 반영한다.

[0058] 용어 "작제물"은 아데노바이러스 유전체 또는 패키징 작제물로서 본 발명의 개시에 따른 유전자 조성물 또는 조성물 중 적어도 하나를 지칭한다.

[0059] 본원에서 사용되는 용어 "결실" 또는 "결실된"은 말소, 소거, 또는 제거를 의미한다.

[0060] 본원에서 사용되는 용어 "결실된 Ad(바이러스) 벡터" 및 "거트된(gutted)-", "미니-", "결실된-", ".델타." 또는 "유사-벡터"는 ITR을 갖는 선형 벡터 모듈을 지칭한다. 이러한 벡터는 또한 일부 구조적 및/또는 비구조적 유전자 서열 및/또는 하나 이상의 관심 유전자 또는 트랜스진을 코딩할 수 있다.

[0061] 용어 "발현"은 세포에서 내인성 유전자, 트랜스진 또는 코딩 영역의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.

[0062] "유전자 전달(delivery) 벡터", "GDV", "유전자 전달(transfer) 벡터" 또는 "유전자 전달 비히클"은 본 발명의 개시의 패키징된 벡터 모듈을 포함하는 조성물이다.

[0063] 본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현 작제물"은 프로모터, 관심 유전자의 적어도 단편, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 지칭한다. 본 발명의 개시의 벡터 모듈은 유전자 발현 작제물을 포함할 수 있다.

[0064] 본원에서 사용되는 용어 "관심 유전자", "GOI" 및 "트랜스진"은 기능이 의학적 관심사이고 자연 플라비 바이러스 유전자가 아닐 수 있는 유전자를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 관심 유전자는 RNA 또는 단백질 수준에서 이의 효과를 발휘하는 것일 수 있다. 관심 유전자의 예는 치료 유전자, 면역조절 유전자, 바이러스 유전자, 박테리아 유전자, 단백질 생성 유전자, 억제 RNA 또는 단백질, 및 조절 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0065] "유전자 서열"은 뉴클레오티드의 순서를 지칭한다. 유전자 서열은 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 1) 유전자 구조의 변경: 부위-특이적 재조합효소(예를 들어, Cre-loxP 시스템에 기반한 Cre)는 프로모터와 유전자 사이에 삽입된 서열을 제거함으로써 유전자 발현을 활성화시킬 수 있음; 2) 유도(커버됨) 또는 억제 완화에 의한 전사의 변화; 3) mRNA에 혼입된 특정 서열 또는 siRNA에 의한 mRNA 안정성의 변화; 및 4) mRNA 내의 서열에 의한 번역의 변화 중 하나에 의해 달성될 수 있다. 결실된 아데노바이러스는 또한 "고-용량" 아데노바이러스로 지칭된다. 이러한 결실된 아데노바이러스는 최대 33kb의 유전 서열을 수용할 수 있다.

[0066] 용어 "헤드리스(headless) 헤마글루티닌"은 헤마글루티닌 줄기로 구성된 헤마글루티닌 작제물을 지칭한다.

[0067] 용어 "헤마글루티닌 줄기" 또는 "줄기 영역"은 비교적 불변이고 인플루엔자 헤마글루티닌의 유전적 과가변 영역을 함유하지 않는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 구조적 성분을 지칭한다.

[0068] 용어 "이종성"은 자연과 일반적으로 밀접하게 관련된 것으로 발견되지 않는 DNA 서열의 임의의 조합에 사용된다.

[0069] 용어 '상동성'은 한 쌍의 구조 또는 유전자들 사이에 공유 조상의 존재를 지칭한다.

[0070] "숙주 세포" 또는 "패키징 세포"는 바이러스 입자를 생성하기 위해 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 유전체 또는 변형된 유전체를 패키징할 수 있는 세포이다. 이는 누락된 유전자 생성물 또는 이의 등가물을 제공하도록 조작될 수 있다. 따라서, 패키징 세포는 아데노바이러스 유전체를 아데노바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 이러한 입자의 생성은 유전체가 복제되고 감염성 바이러스를 조립하는데 필요한 단백질이 생성되는 것을 필요로 한다. 입자는 또한 바이러스 입자의 성숙에 필요한 특정 단백질을 필요로 할 수 있다. 이러한 단백질은 벡터, 패키징 작제물 또는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 본 발명의 개시에 따른 패키징 세포주를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 숙주 세포(HC)는 숙주 세포가 아데노바이러스의 성장을 허용하는 한 A549, HeLa, MRC5, W138, CHO 세포, Vero 세포, 인간 배아 망막 세포, 또는 임의의 진핵 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 숙주 세포주는 지방세포, 연골세포, 상피, 섬유모세포, 아교모세포종, 간세포, 각질세포, 백혈병, 림프모구양, 단핵구, 대식세포, 근모세포, 및 뉴런을 포함한다. 다른 세포 유형은 일차 세포 배양물, 예를 들어, 인간 일차 전립선 세포, 인간 배아 망막 세포, 인간 줄기 세포로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 진핵생물 이배수체 및 홀배수체 세포주가 본 발명의 개시의 범위 내에 포함된다. 패키징 세포는 재조합 바이러스 벡터의 고역가 스톡을 생성하기 위해 이러한 생성물에 대해 적절한 수준으로 본원에 설명된 상이한 작제물의 생성물을 발현시킬 수 있는 세포여야 한다.

[0071] "면역 반응"은 세포성 또는 체액성 면역 반응과 같은 후천성 면역 반응이다.

[0072] 본 발명의 개시의 맥락에서, "면역조절 분자"는 항원-특이적 방식으로 표적 세포에 대한 세포 및/또는 체액 숙주 면역 반응을 조절, 즉, 증가 또는 감소시키고, 바람직하게는 숙주 면역 반응을 감소시키는 것인 폴리펩티드 분자이다. 일반적으로, 본 발명의 개시의 교시에 따르면, 면역조절 분자(들)는 본원에 설명된 GDV로부터의 발현 후, 표적 세포 표면 막과 회합되고, 예를 들어, 세포 표면 막에 삽입되거나 이에 공유 또는 비공유 결합될 것이다.

[0073] 본원에서 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스", "인플루엔자 비리온" 및 "인플루엔자 입자"는 모든 그룹, 서브그룹 및 혈청형을 포함하여 인간 또는 동물을 감염시키는 임의의 인플루엔자 바이러스를 포함하여 인플루엔자 바이러스로 분류될 수 있는 임의의 및 모든 바이러스를 포함한다.

[0074] 본원에서 사용되는 용어 "도입하는" 또는 "형질감염"은 발현 벡터를 숙주 세포로 전달하는 것을 지칭한다. 벡터는 형질감염에 의해 세포 내로 도입될 수 있으며, 이는 전형적으로 물리적 수단(예를 들어, 칼슘 포스페이트 형질감염, 전기천공, 미세주입 또는 리포펙션); 전형적으로 감염원, 즉, 바이러스를 통한 도입을 지칭하는 감염; 또는 전형적으로 바이러스에 의한 세포의 안정한 감염 또는 바이러스 제제(예를 들어, 박테리오파지)를 통해 한 미생물에서 다른 미생물로의 유전 물질의 전달을 의미하는 형질도입에 의해 이종성 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클일 수 있다.

[0075] 용어 "선형 DNA"는 비-원형화된 DNA 분자를 지칭한다. 용어 "선형 RNA"는 비-원형화된 RNA 분자를 지칭한다.

[0076] 본원에서 사용되는 용어 "자연적으로"는 자연에서 발견되거나; 야생형이거나; 선천적이거나 또는 본질적인 것을 지칭한다.

[0077] 용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭하고, 달리 제한되지 않는 한, 이들이 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산)와 유사한 방식으로 단일-가닥 핵산에 하이브리드화된다는 점에서 자연 뉴클레오티드의 본질적인 성질을 갖는 알려진 유사체를 포함한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행에 따라 사용된다.

[0078] 본원에서 사용되는 용어 "비-구조 유전자"는 아데노바이러스 유전체에 존재하는 유전자의 그룹을 지칭한다. 이러한 유전자는 "비구조 유전자"를 코딩한다.

[0079] 용어 "패키징 작제물" 또는 "패키징 발현 플라스미드"는 원형, 이중-가닥 DNA 분자의 조작된 플라스미드 작제물을 지칭하며, 여기서 DNA 분자는 프로모터의 제어 하에 있는 아데노바이러스 구조 또는 비구조 유전자의 적어도 서브셋을 포함한다. "패키징 작제물"은 독립적인 바이러스 복제를 가능하게 하여 감염, 바이러스 입자 및/또는 바이러스 입자로 패키징되는 이러한 유전 물질의 효율적인 패키징을 생성하는 하나 초과의 ITR 또는 유전 정보를 포함하지 않는다.

[0080] "허용되는" 세포는 바이러스의 복제를 지원한다.

[0081] 본원에서 사용되는 용어 "플라스미드"는 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자를 지칭한다. 많은 경우에, 이는 원형이고 이중 가닥이다.

[0082] 용어 "폴리링커"는 임의의 프로모터 또는 DNA 세그먼트의 용이한 삽입을 허용하는 다수의 독특한 제한 부위를 갖는 인공적으로 합성된 DNA의 짧은 스트레치를 지칭한다.

[0083] 용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 촉진하는 DNA의 조절 영역을 의미한다. 프로모터는 일반적으로 특정 코딩 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 RNA 중합효소 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 전사 개시 속도에 영향을 미치는 업스트림 프로모터 요소로 지칭되는, TATA 박스의 업스트림 또는 5'에 위치하는 다른 인식 서열을 추가로 포함할 수 있다. "항시적 프로모터"는 많은 세포 유형에서 이의 관련 유전자의 지속적인 전사를 허용하는 프로모터를 지칭한다. "유도성-프로모터 시스템"은 유전자를 유도하거나 침묵시키기 위해 조절제(소분자, 예를 들어, 테트라사이클린, 펩티드 및 스테로이드 호르몬, 신경전달물질, 및 환경 인자, 예를 들어, 열 및 삼투압)를 사용하는 시스템을 지칭한다. 이러한 시스템은 이들의 반응이 조절제의 농도에 따라 등급이 매겨진다는 점에서 "유사체"이다. 또한, 이러한 시스템은 조절제의 철회로 가역적이다. 이러한 프로모터의 활성은 생물적 또는 비생물적 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 유도성 프로모터는 이들에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현이 유기체의 특정 발달 단계 또는 특정 조직에서 켜지거나 꺼질 수 있기 때문에 유전 공학에서 강력한 도구이다.

[0084] 본원에서 사용되는 용어 "증식하다" 또는 "증식된"은 임의의 공정에 의한 수, 양 또는 정도의 번식, 배가, 또는 다른 증가를 지칭한다.

[0085] 본원에서 사용되는 용어 "정제"는 실질적으로 대부분의, 대부분의, 실질적으로 모든 또는 모든 외래의, 외부의, 또는 불쾌한 요소를 정제하거나 이들로부터 유리시키는 공정을 지칭한다.

[0086] "조절 서열", "조절 영역" 또는 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 또는 전사 인자와 같은 조절 단백질이 우선적으로 결합하는 DNA의 다른 세그먼트이다. 이들은 유전자 발현 및 이에 따른 단백질 발현을 제어한다.

[0087] 본원에서 사용되는 용어 "재조합효소"는 유전적 재조합을 촉매화하는 효소를 지칭한다. 재조합효소 효소는 2개의 긴 DNA 가닥 사이의 짧은 DNA 조각의 교환, 특히 짝을 이룬 모계 및 부계 염색체 사이의 상동성 영역의 교환을 촉매한다.

[0088] "제한 효소" 또는 "제한 엔도뉴클레아제"는 이중가닥 DNA를 절단하는 효소이다.

[0089] 용어 "제한 부위" 또는 "제한 인식 부위"는 DNA 분자를 절단하기 위한 부위로서 제한 효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드의 특정 서열을 지칭한다. 부위는 일반적으로, 그러나 반드시 그런 것은 아니지만, (제한 효소는 일반적으로 동종이량체로서 결합하기 때문에) 회문이며, 특정 효소는 이의 인식 부위 내의 또는 근처 어딘가에서 2개의 뉴클레오티드 사이를 절단할 수 있다.

[0090] 용어 "복제" 또는 "복제하는"은, 예를 들어, 비제한적으로 바이러스 입자와 같은 대상체의 동일한 사본을 만드는 것을 의미한다.

[0091] 본원에서 사용되는 용어 "복제 결핍"은 자연 환경에서 복제할 수 없는 바이러스의 특성을 지칭한다. 복제 결핍 바이러스는, 예를 들어, 비제한적으로 E1 유전자와 같은 이의 복제에 필수적인 하나 이상의 유전자가 결실된 바이러스이다. 복제 결핍 바이러스는 결실된 유전자를 발현하는 세포주에서 실험실에서 증식될 수 있다.

[0092] 본원에서 사용되는 용어 "유사성" 또는 "서열 유사성"은 단백질 서열 사이의 경험적 관계의 척도를 지칭한다. 본원에서 사용되는 유사성 스코어는 제공된 단백질 내의 아미노산 잔기 간의 진화적 거리 및 이에 따른 유사성 및/또는 동일성의 근사치를 설명한다.

[0093] 본원에서 사용되는 용어 "구조 유전자"는 아데노바이러스 캡시드를 형성하는 아데노바이러스 유전체에 존재하는 유전자의 그룹을 지칭한다.

[0094] 용어 "스터퍼(stuffer)"는 이의 크기를 증가시키기 위해 또 다른 DNA 또는 RNA 서열에 삽입되는 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 스터퍼 단편은 일반적으로 임의의 단백질을 코딩하지 않으며, 전사 인핸서 또는 프로모터와 같은 유전자 발현을 위한 조절 요소를 함유하지 않는다.

[0095] 본원에서 사용되는 용어 "표적" 또는 "표적화된"은 생물학적 개체, 예를 들어, 비제한적으로 단백질, 세포, 기관, 또는 핵산을 지칭하며, 이의 활성은 외부 자극에 의해 변형될 수 있다. 자극의 성질에 따라, 표적에 직접적인 변화가 없을 수 있거나, 표적의 입체형태적 변화가 유도될 수 있다.

[0096] 용어 "형질감염"은 DNA 또는 RNA로서 세포 유전 물질로의 도입(예를 들어, 본 발명의 개시의 분리된 핵산 분자 또는 작제물의 도입)을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "형질도입"은 DNA로서 또는 본 발명의 개시의 GDV에 의한 세포 DNA로의 도입을 지칭한다. 본 발명의 개시의 GDV는 표적 세포로 형질도입될 수 있다.

[0097] 본원에서 사용되는 용어 "보편적 인플루엔자 백신"은 하나 초과의 혈청형 또는 여러 인플루엔자 혈청형의 인플루엔자 바이러스에 대해 인간 및 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 운반하는 인플루엔자 백신을 지칭한다.

[0098] 본원에서 사용되는 용어 "비번역 영역"은 단백질을 코딩하지 않는 RNA 섹션을 지칭한다.

[0099] 용어 "벡터"는 숙주 세포의 감염에 사용되며 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산을 지칭한다. 벡터는 흔히 레플리콘이다. 발현 벡터는 내부에 삽입된 핵산의 전사를 가능하게 한다. 일부 보통의 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 재조합 발현 카세트, 및 트랜스포존을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "벡터"는 또한 한 위치에서 다른 위치로 유전자의 전달을 돕는 요소를 지칭할 수 있다.

[0100] 용어 "벡터 모듈"은 아데노바이러스 비리온에 패키징된 아데노바이러스 유전자 조성물을 지칭한다.

[0101] 본원에서 사용되는 용어 "바이러스 DNA" 또는 "바이러스 RNA"는 바이러스 입자에서 발견되는 DNA 또는 RNA의 서열을 지칭한다.

[0102] 본원에서 사용되는 "바이러스 유전체"는 바이러스 입자에서 발견되고 바이러스 복제에 필요한 모든 요소를 함유하는 DNA 또는 RNA의 전체이다. 유전체는 바이러스 복제의 각 사이클에서 복제되고 바이러스 자손으로 전달된다.

[0103] 본원에서 사용되는 용어 "비리온"은 바이러스 입자를 지칭한다. 각각의 비리온은 보호 단백질 캡시드 내의 유전 물질로 구성된다.

[0104] 본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자, 단백질, 핵산, 또는 특성의 전형적인 형태를 지칭한다. 야생형은 자연 집단에서 가장 흔한 표현형을 지칭한다. 용어 "야생형" 및 "자연 발생"은 상호교환적으로 사용된다.

[0105] 본 발명의 개시의 구현예에 따르면, 보편적 인플루엔자 백신이 제공된다.

[0106] 구현예에서, 보편적 인플루엔자 백신은 항원의 세트를 포함하는 다량체 백신이며, 항원의 세트는 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)-유래 항원을 함유한다. 헤마글루티닌은 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 당단백질이며 바이러스의 감염성에 필수적이다.

[0107] 인플루엔자 HA로부터 유래 항원은 인플루엔자 HA의 전부 또는 일부를 인코딩하는 DNA 서열 또는 RNA 서열 또는 인플루엔자 HA 자체의 전부 또는 일부에 대한 단백질 서열일 수 있다.

[0108] 인플루엔자 HA는 혈청형 H3의 인플루엔자 헤마글루티닌의 아미노산 넘버링을 사용하여 넘버링된 바와 같이, 위치 52 및 277의 보존된 시스테인 사이에 위치한 과가변 영역을 갖는다. 구현예에서, 과가변 영역에 상응하는 항원의 DNA, RNA 또는 단백질 서열은 결실된다.

[0109] 구현예에서, HA 과가변 영역은 헤드리스 헤마글루티닌 작제물의 안정성 및 세포 표면 발현을 증가시키기 위해 펩티드 링커(또는 펩티드 링커에 상응하는 DNA 또는 RNA 서열)로 대체된다. 예시적인 비제한적인 펩티드 링커는 GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS (또는 (GGGGS)₄)이다.

[0110] 구현예에서, 인플루엔자 HA 유래 항원은 헤드리스 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에 기반한다.

[0111] 구현예에서, 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원은 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 60, 또는 65, 또는 70, 또는 75, 또는 80, 또는 85, 또는 90의 유사성 스코어를 초과하는 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 서열(DNA, RNA 또는 단백질)과의 유사성을 갖는 서열(DNA, RNA 또는 단백질이거건 간에)로 구성된다. 유사성 스코어는 상이한 HA의 상응하는 위치에서의 동일한 아미노산 잔기(또는 각각의 코딩 DNA 또는 RNA)의 존재 및 상이한 HA의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기(또는 각각의 코딩 DNA 또는 RNA)의 보존적 변이체의 존재에 기반한다. 도 1은 HA 줄기 영역에서 서열 동일성에 따라 HA를 정렬하고 그룹화함으로써 인플루엔자 HA 및 유사성 스코어의 시각적 예시를 제공한다.

[0112] 구현예에서, 인플루엔자 A의 특정 혈청형의 대표적인 헤마글루티닌이 상이한 헤마글루티닌의 정렬에 사용된다. 예시적인 대표적인 인플루엔자 A 혈청형은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:

H1: A/Califomia/48/2017 (H1N1)

H2: A/Moscow/1019/1965(H2N2)

H3: A/Washington/16/2017(H3N2) No 8

H4: A/오리(duck)/Guangdong/DGQTSJ147P/2015(H4N8)

H5: A/혹고니(Cygnus olor)/Belgium/1567/2017(H5N8)

H6: A/미국쇠오리(green-winged teal)/Tennessee/17OS0651/2017(H6Nl)

H7: A/Guangdong/HP001/2017(H7N9)

H8: 미국오리(American black duck)/Illinois/4119/2009(H8N4)

H9: A/메추라기(Japanese Quail)/Vietnam/4/2009(H9N2)

H10: A/미국오리/Alberta/118/2016(H10N7)

H11: A/오리/Memphis/546/1974

H12: 미국오리/New Brunswick/00998/2010(H12N6)

H13: 아메리카흰펠리컨(American white pelican)/Minnesota/Sg-0611/2008(H13N9)

H14: A/넓적부리(Northern shoveler)/Missouri/16OS6248/2016(H14N7)

H15: A/오리/Bangladesh/24704/2015(H15N9)

H16: A/수리갈매기(glaucous-winged gull)/Southcentral Alaska/16MB03160/2016(H16N3)

H17: A|H17N10|09/2010|A/작은노랑어깨박쥐(little_yellow_shouldered_bat)/Guatemala/060/2010

H18: 4|HA|A|A/진한갈색과일먹는박쥐(dark_fruit_eating_bat)/Bolivia/PBV780_781/2011

[0113] 또 다른 구현예에서, 본원에서 사용되는 유사성 스코어는 제공된 단백질 사이의 진화적 거리(및 이에 따라, 제공된 단백질 내의 아미노산 잔기의 유사성 및/또는 동일성)의 근사치를 설명한다. 이러한 데이터에 기초하여, 계통수로서 상이한 헤마글루티닌의 진화적 연결 및 거리를 묘사하는 상이한 헤마글루틴 혈청형의 가계도가 생성된다(도 2).

[0114] 또 다른 구현예에서, 몇몇 보존된 헤드리스 헤마글루티닌 단백질 작제물은 이러한 유사성 스코어에 기초하여 설계된다. 보존된 작제물의 예시적인 펩티드 서열은 도 3에 제시되어 있고, 이는 도 4에 제시된 인플루엔자 A 헤마글루티닌에 대한 이들 서열의 서열 유사성을 갖는다.

[0115] 본원에 기재된 바와 같이, 보편적 인플루엔자 바이러스 백신은 적어도 2개, 또는 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 유래 항원으로 구성된 항원 세트를 포함한다. 구현예에서, 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원은 도 3에 제공된 서열로부터 선택되거나 서열 conHA1, conCHA2, conHA3, conH4, conH5 및 conH6으로부터 선택된 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 보존된 헤드리스 헤마글루티닌 단백질 작제물이다. 구현예에서, 적어도 2개, 또는 바람직하게는 2개 초과의 항원은 백신의 형태로 인간 및/또는 동물에게 제공된다.

[0116] 구현예에서, 적어도 2개, 또는 바람직하게는 2개 초과의 인플루엔자 HA 유래 항원은 단백질로서 제공되고, 바이러스 유사 입자에 조합되고, 나노입자로 전달되고, 에멀젼으로 전달되고, 이들의 서열은 DNA 또는 RNA 백신에 트랜스진으로서 통합되거나, 이들의 서열은 바이러스 벡터에 통합된다. 도 5는 바이러스 벡터 모델의 개략도이다.

[0117] 또 다른 구현예에서, 본 발명의 개시의 백신은 면역 강화 모이어티, 예를 들어, 비제한적으로, 백신 애쥬번트 및 인터루킨의 존재 또는 부재 하에 백신 제형의 표준 방법을 사용하여 제형화된 적합한 약학적 담체에서 인플루엔자 HA 유래 항원을 전달한다.

[0118] 또 다른 구현예에서, 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물 중 하나 이상은 근육내, 비강내, 피내, 피하, 경구, 직장내 또는 세기관지내를 포함하나 이에 제한되지 않는 상이한 적용 경로를 통해 인간 및 동물에게 백신으로서 전달된다.

[0119] 또 다른 구현예에서, 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물 중 하나 이상은 아데노바이러스 벡터에서 트랜스진 작제물로서 전달된다.

[0120] 또 다른 구현예에서, 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물 중 하나 이상은 완전히 결실된 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 비제한적으로 완전히 결실된 헬퍼 바이러스-비의존적 아데노바이러스 벡터에서 트랜스진 작제물로서 전달된다.

[0121] 또 다른 구현예에서, 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물 중 하나 이상은 프로모터 및 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 트랜스진 작제물은 내부 리보솜 진입 부위에 의해 연결된다. 또 다른 구현예에서, 트랜스진 작제물은 내부 리보솜 진입 부위에 의해 연결된 하나 초과의 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물을 코딩한다. 또 다른 구현예에서, 트랜스진 작제물은 링커 자가-소화 효소에 의해 연결되거나 단백질 소화 효소에 의해 소화 가능한 하나 초과의 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물을 코딩한다.

[0122] 또 다른 구현예에서, 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물의 트랜스진 작제물은 비제한적으로 알파 바이러스 레플리콘과 같은 복제 효율적인 RNA로서 비제한적으로 아데노바이러스 벡터와 같은 벡터 내에서 코딩된다.

[0123] 구현예에서, 보편적 인플루엔자 백신을 생성하는 방법이 제공된다. 구현예에서, 상기 방법은 적어도 60, 또는 65, 또는 70, 또는 75, 또는 80, 또는 85, 또는 90의 유사성 스코어를 초과하는 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하는 것을 포함한다. 이어서, 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원이 백신 조성물에 포함시키기 위한 HA 항원을 코딩하는 DNA 서열, HA 항원을 코딩하는 RNA 서열, 또는 단백질 서열로서 제공된다. 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 인플루엔자 HA 유래 항원은 본원에 제공된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따를 수 있다. 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원은 백신 조성물에 포함시키기 위한 바이러스 벡터의 형태로 제공될 수 있다.

[0124] 구현예에서, 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 인플루엔자 A 서브타입에 대해 동물(예를 들어, 인간 포함)을 백신접종하는 방법은 적어도 2개, 및 바람직하게는 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 단백질 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것을 포함한다.

실시예

실시예 1 - 인플루엔자 HA 유래 항원의 설계

[0125] 상이한 혈청형의 인플루엔자 HA의 단백질 서열의 예의 단백질 서열이 정렬된다. 실시예에 사용된 단백질 서열은 하기 인플루엔자 A 서브타입으로부터의 것이다:

H1: A/Califomia/48/2017 (H1N1)

H2: A/Moscow/1019/1965(H2N2)

H3: A/Washington/16/2017(H3N2) No 8

H4: A/오리/Guangdong/DGQTSJ147P/2015(H4N8)

H5: A/혹고니(Cygnus olor)/Belgium/1567/2017(H5N8)

H6: A/미국쇠오리(green-winged teal)/Tennessee/17OS0651/2017(H6Nl)

H7: A/Guangdong/HP001/2017(H7N9)

H8: 미국오리(American black duck)/Illinois/4119/2009(H8N4)

H9: A/메추라기(Japanese Quail)/Vietnam/4/2009(H9N2)

H10: A/미국오리/Alberta/118/2016(H10N7)

H11: A/오리/Memphis/546/1974

H12: 미국오리/New Brunswick/00998/2010(H12N6)

H14: A/넓적부리(Northern shoveler)/Missouri/16OS6248/2016(H14N7)

H15: A/오리/Bangladesh/24704/2015(H15N9)

H16: A/수리갈매기(glaucous-winged gull)/Southcentral Alaska /16MB03160/2016(H16N3)

[0126] 상이한 HA 혈청형의 유사성의 분석에 기초하여, 혈청형을 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 6개의 유사성 그룹으로 그룹화하였다. HA 서열은 fludg.org에서 다운로드된다. 불완전한 서열은 분석을 위해 제거된다. 나머지 서열은 MAFFT 온라인 서버 버전 7: https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/large.html?aug31을 사용하여 정렬된다. 다음 설정이 분석에 사용된다:

i. FFT-NS-2

ii. 메모리 사용량: 정상

iii. 아미노산 서열에 대한 스코어링 매트릭스: BLOSUM62

iv. 갭 개방 페널티: 5

[0127] 이러한 정렬에 기초하여, HA 혈청형을 하기 그룹으로 그룹화한다:

H-I(적색): HA 혈청형 H7, H10, H15를 가짐

H-II (오렌지색) HA 혈청형 H3, H4, H14를 가짐

H-III (황색) HA 혈청형 H1, H2, H5, H6을 가짐

H-IV (녹색) HA 혈청형 H8, H9, H12를 가짐

H-V (청색) HA 혈청형 H11, H13, H15를 가짐

H-VI (보라식) HA 혈청형 H17, H18을 가짐

[0128] 이러한 정렬로, 각각의 상이한 HA 그룹의 전체 HA 단백질 내의 아미노산 잔기의 동일성 비는 도 1에 도시된 바와 같이 분석된 HA 단백질에 대한 63.7% 동일성의 값을 초과한다.

실시예 2 - 인플루엔자 HA 유래 항원의 서열

[0129] 실시예 1의 분석에 기초하여, HA의 보존된 영역에 대해 상이한 HA 혈청형의 컨센서스 단백질이 개발된다. 각 HA 혈청형 그룹 H1 내지 H18에 대한 컨센서스 서열은 엠보스 익스플로러 콘스를 사용하여 유래된다: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cons. 하기 설정이 사용되었다:

i. 복수 검사가 1로 설정됨

ii. 위치에서 동일성의 필요한 수: 1

[0130] 단계 1에서, 18개의 HA 혈청형 각각에 대한 컨센서스 서열이 개발된다. 서열은 fludb.org에서 발견된다.

[0131] 각각의 HA 혈청형 컨센서스 서열을 유도하기 위해 하기 수의 서열이 사용된다:

H1: 22868

H2: 622

H3: 25600

H4: 1932

H5: 5694

H6: 1745

H7: 2743

H8: 150

H9: 3885

H10: 1236

H11: 670

H12: 210

H13: 6856

H14: 31

H15: 21

H16: 268

H17: 3

H18: 2

[0132] 단계 1: HA 컨센서스 서열이 확인되면, 6개 그룹 각각에 대한 컨센서스 서열의 헤드리스 버전은 하기 방식으로 결정된다:

(a) 18개의 대표적인 컨센서스 서열은 바이오에딧(bioedit)에서 clustal W와 정렬된다.

(b) 보편적으로 보존된 시스테인은 결실 직전의 잔기로서 위치 60에서 확인된다.

(c) 대략 위치 287-290(보편적으로 보존된 GLFGAIA 서열로부터 대략 100 aa)에서 보편적으로 보존된 CxxxC가 확인되고, 헤드리스 결실의 말단으로서 사용된다.

(d) (c)에서 2개의 시스테인 사이의 영역은 결실되고, GGGG 또는 (GGGGS)_n(n>1)으로 대체된다.

[0133] 도 3에서, 크기 단백질 컨센서스 서열은 단량체 펩티드 링커와 함께 나열된다.

실시예 3 - 보존된 HA 영역 컨센서스 서열의 유사성

[0134] 도 3에 제시된 6개의 단백질 컨센서스 서열은 각각의 컨센서스 서열에 할당된 HA 혈청형의 HA 단백질 서열과 정렬된다. 제공된 위치에서 아미노산 잔기의 보존적 아미노산 변화의 유사성 뿐만 아니라 아미노산 동일성을 고려하는 유사성 비를 계산한다. 스코어는 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램으로 계산되고 도 4에 제공된다. 특히, 스코어는 모든 경우에 83을 초과한다.

실시예 4 - 6개의 보존된 보편적 인플루엔자 HA 유래 항원 작제물에 대한 트랜스진을 운반하는 완전히 결실된 Ad 바이러스 벡터의 설계 및 작제

[0135] fdAd 벡터는 모든 내인성 ad 유전자가 결실된다. Ad 유전체의 공간은 최대 33 kb 길이의 트랜스진 작제물을 수용할 수 있다. fdAd 벡터 유전체는 아데노바이러스 역 말단 반복부(ITR) 및 Ad 패키징 신호, 예를 들어 아데노바이러스 ψ에 상응하는 아데노바이러스 서열만을 운반한다.

[0136] fdAd 바이러스 벡터 유전체는 제2 유전 작제물에 의한 캡시드화에 필요한 유전체에 필요한 결실된 아데노바이러스 유전자가 제공되는 숙주 또는 패키징 세포에서 아데노바이러스 캡시드로 패키징된다. 이러한 제2 유전 작제물은 헬퍼 바이러스 작제물 또는 패키징 발현 플라스미드에 의해 제공될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

[0137] 예에서, 일단 선형화되면 fdAd 벡터 유전체는 도 5에 도시된 바와 같이 인간 혈청형 6의 Ad 캡시드를 코딩하는 유전자를 보유하는 패키징 발현 플라스미드로 숙주 세포, 예를 들어, 비제한적으로 인간 배아 신장 세포주 HEK-293의 세포로 공동-형질감염된다. 캡시드화된 아데노바이러스 벡터는 세포로부터 일단 방출되면 정제되고, 예를 들어, 백신접종을 위해 사용된다.

[0138] 예에서, fdAd는 6개의 컨센서스 서열을 코딩하는 트랜스진 작제물을 운반한다. 3개의 트랜스진 발현 카세트는 하기 조성으로 생성된다:

번호 1: 사이토메갈로바이러스 프로모터 인핸서 서열, 이어서 H-I (적색) 컨센서스 단백질을 코딩하는 트랜스진, 이어서 내부 리보솜 진입 부위, 이어서 H-II (오렌지색) 컨센서스 단백질을 코딩하는 트랜스진, 이어서 폴리아데닐화 부위.

번호 2: 사이토메갈로바이러스 프로모터 인핸서 서열, 이어서 H-III (황색) 컨센서스 단백질을 코딩하는 트랜스진, 이어서 내부 리보솜 진입 부위, 이어서 H-IV (녹색) 컨센서스 단백질을 코딩하는 트랜스진, 이어서 폴리아데닐화 부위.

번호 3: 사이토메갈로바이러스 프로모터 인핸서 서열, 이어서 H-V (청색) 컨센서스 단백질을 코딩하는 트랜스진, 이어서 내부 리보솜 진입 부위, 이어서 H-VI (보라색) 컨센서스 단백질을 코딩하는 트랜스진, 이어서 폴리아데닐화 부위.

[0139] 3개의 트랜스진 작제물, 번호 1, 2 및 3은 완전히 결실된 아데노바이러스 벡터 유전체로 이동된다.

실시예 5: 6개의 보존된 보편적 헤드리스 HA 단백질 작제물에 대한 트랜스진을 운반하는 fdAd 벡터로 인간 또는 동물을 면역화하기 위한 프로토콜.

[0140] 6개의 컨센서스의 보존된 HA 단백질에 대한 트랜스진을 운반하는 fdAd 벡터는 실시예 4에 설명된 바와 같이 Ad 전사체로 캡시드화된다. 이는 생리학적 용액에 현탁되고, 인간 및/또는 동물을 면역화하는데 사용된다. 이러한 목적을 위해, 이는 비제한적으로 근육내, 피내, 피하 경로를 통한 주사 또는 비제한적으로 비강내 또는 경구 경로와 같은 다른 경로에 의해 수용자에게 전달된다.

[0141] 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 모두는 이 아데노바이러스 벡터에 노출된 인간 및 동물에서 유도된다. 이러한 면역 반응은 임의의 인플루엔자 A 혈청형의 구성원에 속하는 인플루엔자 바이러스의 공격에 대해 인간 및 동물을 보호한다.

[0142] 보편적 인플루엔자 백신 및 관련 방법의 다수의 구현예가 본원에 상세히 설명되었지만, 이에 대한 변형 및 변화가 가능한 것이 명백해야 하며, 이들 모두는 본 발명의 진정한 사상 및 범위에 속한다. 또한, 당업자는 다수의 변형 및 변경을 용이하게 할 수 있으므로, 본 발명을 제시되고 설명된 정확한 구성 및 작동으로 제한하는 것은 바람직하지 않으며, 따라서, 본 발명의 개시의 범위 내에 속하는 모든 적합한 변형 및 등가물이 사용될 수 있다.

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145 150 155 160 Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg 165 170 175 Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe 180 185 190 Ser Glu Val Glu Gln Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp 195 200 205 Ser Ile Thr Glu Ile Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met 210 215 220 Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu 225 230 235 240 Tyr Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly 245 250 255 Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asn Cys Met Glu 260 265 270 Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Thr Gln Tyr Arg Glu Glu Ala 275 280 285 Leu Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr 290 295 300 Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Val Leu 305 310 315 320 Leu Ala Ile Val Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn 325 330 335 Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile 340 <210> 2 <211> 355 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Met Leu Ser Ile Ile Val Leu Ser Leu Ile Leu Ala Glu Thr Ser Ala 1 5 10 15 Gln Lys Ile Ser Asn Asn Asp Thr Gly Asn Pro Val Ile Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Leu Thr Asn Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Val Ser Ala Gln Glu Leu Val Glu Ser Ser Asn Ile 50 55 60 Asp Glu Leu Cys Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ser Glu Cys Ile Thr Asp 65 70 75 80 Lys Gly Ser Ile Ser Ser Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Ile Gly Asp Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Ser Ser Leu Lys Leu 100 105 110 Ala Thr Gly Met Arg Asn Ile Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe 115 120 125 Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Gln Gly Leu Ile Asp 130 135 140 Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Glu Gly Thr Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys 165 170 175 Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Tyr His Gln Ile Glu 180 185 190 Lys Glu Phe Glu Gln Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr 195 200 205 Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 210 215 220 Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Val Thr Asp Ser Glu Met 225 230 235 240 Asn Lys Leu Phe Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu 245 250 255 Asp Gln Gly Asn Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asn Asn 260 265 270 Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Ile Tyr Arg 275 280 285 Asp Glu Ala Ile Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Thr 290 295 300 Gln Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ser Ile Ser Cys 305 310 315 320 Phe Leu Leu Val Ala Leu Leu Leu Gly Phe Ile Leu Trp Ala Cys Gln 325 330 335 Asn Gly Asn Ile Arg Cys Gln Ile Cys Ile Val His Leu Lys Thr Pro 340 345 350 Leu Phe Leu 355 <210> 3 <211> 347 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Met Met Met Ala Leu Val Ile Leu Leu Leu Leu Phe Thr Thr Val Lys 1 5 10 15 Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys 20 25 30 Val Asp Thr Ile Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Gly Gly Gly Gly Cys 50 55 60 Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Glu Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu Pro 65 70 75 80 Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val 85 90 95 Lys Ser Glu Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln 100 105 110 Ile Glu Ser Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 115 120 125 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 130 135 140 His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr 145 150 155 160 Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp 165 170 175 Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu 180 185 190 Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu 195 200 205 Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu 210 215 220 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys 225 230 235 240 Val Arg Met Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys 245 250 255 Phe Glu Phe Tyr Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn 260 265 270 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg 275 280 285 Glu Lys Ile Glu Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile 290 295 300 Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Met 305 310 315 320 Ile Ala Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 325 330 335 Arg Ile Cys Ile Ile Cys Glu Leu Arg Leu Leu 340 345 <210> 4 <211> 339 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Met Glu Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ile Leu Leu Ala Ala Thr Val Ala 1 5 10 15 Asn Tyr Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asn Thr Leu Ile Glu Gln Asn Val Pro Val Thr Gln Ala Lys 35 40 45 Glu Leu Val His Thr Glu Lys Asn Pro Val Leu Cys Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Cys Thr Thr Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Ala Leu Asn Thr Ser Lys 65 70 75 80 Pro Phe Gln Asn Val Ser Lys His Tyr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr 85 90 95 Ile Pro Ser Ala Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro 100 105 110 Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 115 120 125 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Phe Cys Ile <210> 5 <211> 340 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 5 Met Glu Val Lys Leu Leu Phe Ile Leu Ile Ile Val Tyr Gly Val Lys 1 5 10 15 Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Leu Ser Asn Asn Ser Thr Asp Lys 20 25 30 Val Asp Thr Leu Ile Glu Asn Asn Val Pro Val Thr Ser Ser Val Asp 35 40 45 Leu Val Glu Thr Asn His Thr Gly Thr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Cys 50 55 60 Asn Thr Lys Cys Gln Thr Ser Val Gly Gly Ile Asn Thr Asn Lys Thr 65 70 75 80 Phe Gln Asn Ile Glu Arg Asn Ala Ile Gly Asp Cys Pro Lys Tyr Ile 85 90 95 Lys Ser Gly Gln Leu Lys Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser 100 105 110 Ile Ala Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Phe Ile Glu 115 120 125 Gly Gly Trp Pro Gly Leu Ile Asn Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Gln 130 135 140 Asn Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys 145 150 155 160 Ala Ile Asp Gln Ile Thr Thr Lys Ile Asn Asn Ile Ile Glu Lys Met 165 170 175 Asn Gly Asn Tyr Asp Ser Ile Arg Gly Glu Phe Asn Gln Val Glu Glu 180 185 190 Arg Ile Asn Met Leu Ala 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Asp Asp Ile Lys Asn Gly 260 265 270 Thr Tyr Lys Tyr Met Asp Tyr Arg Glu Glu Ser His Ile Glu Lys Gln 275 280 285 Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Thr Asp Tyr Ser Arg Tyr Tyr Ile Met 290 295 300 Thr Leu Tyr Ser Thr Ile Ala Ser Ser Val Val Leu Gly Ser Leu Ile 305 310 315 320 Ile Ala Ala Phe Leu Trp Gly Cys Gln Lys Gly Ser Ile Gln Cys Lys 325 330 335 Ile Cys Ile

Claims

적어도 2개의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 유래 항원을 포함하는 백신용 조성물로서, 여기서 항원이 유래된 HA 단백질이 과가변 영역을 포함하고, 과가변 영역이 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원으로부터 결실되고, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원 각각이 엠보스 익스플로러 콘스(emboss explorer cons) 프로그램에 의해 계산시 적어도 60 초과의 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는, 조성물.
제1항에 있어서, 유사성이 적어도 70인 조성물.
제1항에 있어서, 유사성이 적어도 80인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 과가변 영역이 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원에서 펩티드 링커로 대체되는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원이 단백질인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원이 항원이 유래된 HA 단백질을 코딩하는 RNA 및 DNA 중 하나인 조성물.
제6항에 있어서, RNA 및 DNA 중 하나가 바이러스 벡터에 존재하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 과가변 영역이 혈청형 H3의 인플루엔자 HA의 아미노산 넘버링을 사용하여 위치 52 및 277의 보존된 시스테인 사이에 위치하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 초과의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원을 포함하는 조성물.
엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60을 초과하는 제1의 복수의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 제1 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하는 단계; 및
엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60을 초과하는 제2의 복수의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 제2 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하는 단계를 포함하는 보편적 인플루엔자 바이러스 백신을 생성하기 위한 방법으로서,
상기 제1 및 제2 복수의 인플루엔자 혈청형이 상이한 혈청형으로 구성되는, 방법.
제10항에 있어서, 제1 및 제2 복수의 인플루엔자 혈청형이 상이한 비-중첩 혈청형으로 구성되는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원이 유래된 HA 단백질이 과가변 영역을 함유하고, 과가변 영역이 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원으로부터 결실되는, 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유사성이 독립적으로 적어도 70인 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유사성이 독립적으로 적어도 80인 방법.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 과가변 영역이 펩티드 링커로 대체되는 방법.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원이 단백질인 방법.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인플루엔자 HA 유래 항원이 항원이 유래된 HA 단백질을 코딩하는 RNA 및 DNA 중 하나인 방법.
제17항에 있어서, HA 단백질을 코딩하는 RNA 및 DNA 중 하나를 바이러스 벡터로 캡시드화하는 단계를 포함하는 방법.
제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60을 초과하는 제3의 복수의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는 적어도 제3의 인플루엔자 HA 유래 항원을 획득하는 단계를 포함하는 방법.
적어도 2개의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 유래 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 항원이 유래된 HA 단백질이 과가변 영역을 포함하고, 과가변 영역이 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원으로부터 결실되고, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 HA 유래 항원 각각이 엠보스 익스플로러 콘스 프로그램에 의해 계산시 적어도 60 초과의 하나 초과의 인플루엔자 혈청형의 HA 분자와의 유사성을 갖는, 단계; 및
백신 조성물을 동물에게 전달하는 단계를 포함하는, 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 혈청형에 대해 동물을 백신접종하는 방법.