JP7239725B2 - ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents

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Description

相互参照
本出願は、２０１９年３月７日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，１７３号、２０１９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／８５５，７３９号、２０１９年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９０７，４２２号、及び２０１９年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９４８，４７０号の利益を主張するものであり、これらの出願のそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
緒言
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、外来ＤＮＡまたはＲＮＡの獲得、標的化、及び切断に関与しているＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質と結合するセグメント及び標的核酸に結合するセグメントを含むガイドＲＮＡ（複数可）を含む。例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡに結合された単一のＣａｓタンパク質を含み、Ｃａｓタンパク質は、標的化された核酸に結合し、それを切断する。これらのシステムのプログラム可能な性質は、標的核酸の改変に使用するための汎用性の高い技術としてのそれらの使用を容易にしている。
概要
本開示は、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、それをコードする核酸、及びそれを含む組成物を提供する。本開示は、本開示のＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質と、ガイドＲＮＡと、を含む、リボ核タンパク質複合体を提供する。本開示は、本開示のＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡを使用して、標的核酸を改変する方法を提供する。本開示は、標的核酸の転写を調節する方法を提供する。
この研究からの完全なバクテリオファージゲノム、同じ試料のサブセットから最近報告されたＬａｋファージ、及び参照源（ＲｅｆＳｅｑ ｖ９２からの全てのｄｓＤＮＡゲノム及び（Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５３６：４２５）からの２００ｋｂ超の非人工物アセンブリ）のサイズ分布を示す。 本研究、Ｌａｋ、及び参照ゲノムからの、２００ｋｂ超のゲノムを有するファージのゲノムサイズ分布のヒストグラムを示す。ゲノムサイズの関数としてのゲノムあたりのｔＲＮＡ計数の箱ひげ図である。 本研究の巨大なファージゲノムからのターミナーゼ配列及び関連データベース配列を使用して構築された系統樹を示す。木の着色領域は、ファージの大きな分岐群を示し、これらの全ては巨大なゲノムを有する。 ファージにコードされた能力が、宿主の翻訳システムを再配向してファージタンパク質を産生するためにどのように機能し得るかのモデルを示す。これらの遺伝子の全てを有する巨大なファージはないが、多くは、ｔＲＮＡ（クローバー葉形状）及びｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）を有する。最大６個のリボソームタンパク質Ｓ１ドメインを有するファージタンパク質は、いくつかのゲノムにおいて生じる。Ｓ１は、ｍＲＮＡと結合して、ｍＲＮＡがデコードされるリボソーム上の部位にｍＲＮＡをもたらす。リボソームタンパク質Ｓ２１（Ｓ２１）は、ファージｍＲＮＡの翻訳を選択的に開始し得、多くの配列は、ＲＮＡとの結合に関与し得るＮ末端伸長（リボソーム挿入図における破線、これは、リボソーム及びＳ１構造モデルのＰＤＢコード６ｂｕ８及びｐｍｉｄ：２９２４７７５７に基づく）を有する。いくつかのファージは、開始因子（ＩＦ）及び延長因子Ｇ（ＥＦ Ｇ）を有し、いくつかは、効率的なリボソーム結合を媒介し得るｒｐＬ７／Ｌ１２を有する。略称：ＲＮＡ ｐｏｌ、ＲＮＡポリメラーゼ。 ＣＲＩＳＰＲ標的化を伴う細菌－ファージ相互作用（細胞図）を示す。 細菌の（上から下：配列番号１６３～１６４）及びファージにコードされた（上から下：配列番号１６３～１６４）ＣＲＩＳＰＲスペーサーの標的化を示す相互作用ネットワークを示す。 サンプリング場所のタイプ別に群化された、２００ｋｂｐ超であるゲノムを有するファージ及びいくつかのプラスミドを有するエコシステムを示す。各箱は、ファージゲノムを表し、ゲノムサイズが減少する順に箱が配置され、各場所のタイプのサイズ範囲が右に列記される。色は、ＣＲＩＳＰＲ標的化（Ｘ）または情報システム遺伝子系統発生分析（Ｔ）による確認を伴う、ゲノム系統発生プロファイルに基づく推定宿主門を示す。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドの例のアミノ酸配列を提供する。 Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（ＲＮＡをコードするＤＮＡとして示される）の定常領域部分のヌクレオチド配列を提供する。太字の配列は、使用される及び／または実施例から推定される配向である（例えば、実施例３で「使用されるｃｒＲＮＡ配列」を参照されたい）。「または」で分離される配列は、互いの逆相補体である。 図７－１の説明を参照のこと。 Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのコンセンサス配列を示す。 置換されると、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの存在下で標的核酸と結合するが、それを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチドをもたらす、Ｃａｓ１２ＪポリペプチドのＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインにおけるアミノ酸の位置を提供する。 様々なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質ファミリーを示す系統樹を提供する。 形質転換プラスミド干渉アッセイの効率を示す。 形質転換プラスミド干渉アッセイの効率を示す。 形質転換プラスミド干渉アッセイの効率を示す。 Ｃａｓ１２Ｊ（例えば、Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０）が、ｃｒＲＮＡスペーサー配列によって誘導される線状ｄｓＤＮＡ断片を切断することができることを示す。 Ｃａｓ１２Ｊ（例えば、Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０）が、ｃｒＲＮＡスペーサー配列によって誘導される線状ｄｓＤＮＡ断片を切断することができることを示す。 ＰＡＭ配列の解明を示す結果を示す。 ＲＮＡ配列を、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０からのＣａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ座位にマッピングした結果を図示する。 ＲＮＡ配列を、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０からのＣａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ座位にマッピングした結果を図示する。 ＲＮＡ配列を、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０からのＣａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ座位にマッピングした結果を図示する。 ヒト細胞におけるＣａｓ１２ｊ－２－及びＣａｓ１２ｊ－３媒介遺伝子編集を示す。 ｐＣａｓ１２Ｊ－３－ｈｓ構築物のマップを提供する。 ｐＣａｓ１２Ｊ－２－ｈｓ構築物のマップを提供する。 図１７Ａ～図１７Ｇは、ｐＣａｓ１２Ｊ－２－ｈｓ及びｐＣａｓ１２Ｊ－３－ｈｓ構築物のヌクレオチド配列（上から下：配列番号１６１～１６２）を提供する表１を示す。 図１７－１の説明を参照のこと。 図１７－１の説明を参照のこと。 図１７－１の説明を参照のこと。 図１７－１の説明を参照のこと。 図１７－１の説明を参照のこと。 図１７－１の説明を参照のこと。 ＤＮＡへの結合によって活性化されたＣａｓ１２ＪによるｓｓＤＮＡのトランス切断を示す。 図１９Ａ～図１９Ｆは、Ｃａｓ１２Ｊ（ＣａｓΦ）が真のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであることを示すデータを示す。 Ｖ型サブタイプａ～ｋの最尤系統樹を示す。 図２１Ａ～図２１Ｂは、様々なＣａｓ１２Ｊ ｃｒＲＮＡ間のｃｒＲＮＡ反復類似性（Ａ）及び様々なＣａｓ１２Ｊタンパク質間のＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列同一性（Ｂ）を示す。 図２２Ａ～図２２Ｃは、プラスミド形質転換に対するＣａｓΦ－３媒介保護を示す。 図２３Ａ～図２３Ｄは、ＣａｓΦによるＤＮＡの切断を示す。 図２４Ａ～図２４Ｄは、アポＣａｓΦ（ガイドＲＮＡを含まないＣａｓΦタンパク質）の精製を示す。 図２５Ａ～図２５Cは、ＣａｓΦによる互い違いの切断をもたらすことを示す。 図２６Ａ～図２６Ｂは、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡのＣａｓΦ媒介切断を示す。 図２７Ａ～図２７Ｂは、ＣａｓΦによる標的鎖（ＴＳ）及び非標的鎖（ＮＴＳ）切断効率を比較する切断アッセイの結果を示す。 図２８Ａ～図２８Ｂは、ＣａｓΦが、シスで活性化されると、ＲＮＡは切断しないが、ｓｓＤＮＡをトランスで切断することを示すデータを示す。 図２９Ａ～図２９Ｄは、ＲｕｖＣ活性部位内のＣａｓΦによるプレｃｒＲＮＡのプロセシングを示す。 図３０Ａ～図３０Ｃは、ＣａｓΦ－１及びＣａｓΦ－２によるプレｃｒＲＮＡのプロセシングを示す。 図３１Ａ～図３１Ｂは、ａ）プレｃｒＲＮＡとのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形成を示す。 図３２Ａ～図３２Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａｓΦ媒介増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）破壊を示す。 図３３Ａ～図３３Ｂは、ヒト細胞におけるＣａｓΦ媒介ゲノム編集を示すデータを示す。 実施例７で使用されるプラスミドのうちのいくつかの説明を提供する、表３を示す。 図３４－１の説明を参照のこと。 図３４－１の説明を参照のこと。 図３４－１の説明を参照のこと。 図３４－１の説明を参照のこと。 図３４－１の説明を参照のこと。 図３４－１の説明を参照のこと。 図３４－１の説明を参照のこと。 実施例７に記載される実験のためのガイド配列を提供する、表４を示す。 図３５－１の説明を参照のこと。 実施例７に記載されるインビトロ実験のための基質配列を提供する、表５を示す。 図３６－１の説明を参照のこと。 図３６－１の説明を参照のこと。 図３６－１の説明を参照のこと。 実施例７に記載されるインビトロ実験のためのｃｒＲＮＡ配列を提供する、表６を示す。
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
「ハイブリダイゼーション可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、適切なインビトロ及び／またはインビボの温度及び溶液イオン強度条件下で、配列特異的、反平行な方法で別の核酸に非共有結合すること、すなわち、ワトソン－クリック塩基対及び／またはＧ／Ｕ塩基対を形成するか、「アニール」する」か、または「ハイブリダイズする」ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。標準的なワトソン－クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）と対合するアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）と対合するアデニン（Ａ）、及びシトシン（Ｃ）と対合するグアニン（Ｇ）［ＤＮＡ、ＲＮＡ］が含まれる。加えて、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションに関して、及びＲＮＡ分子とのＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションに関して（例えば、ＤＮＡ標的核酸塩基がガイドＲＮＡと対合するとき等）、グアニン（Ｇ）もまた、ウラシル（Ｕ）と塩基対合することができる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡ抗コドン塩基対合との関連で、遺伝子コードの縮退（すなわち冗長性）に少なくとも部分的に関与する。したがって、本開示の文脈において、グアニン（Ｇ）（例えば、ガイドＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ二重鎖の、標的核酸と対合するガイドＲＮＡ塩基のＧ）は、ウラシル（Ｕ）及びアデニン（Ａ）の両方に相補的であると見なされる。例えば、ガイドＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ二重鎖の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製することができる場合、その位置は非相補的であると見なされず、代わりに相補的であると見なされる。
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章及び表１１．１、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示される。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、塩基間のミスマッチは可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、核酸の長さ及び相補性の程度に依存し、これらは当該技術分野において周知の変数である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対する融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。短いストレッチの相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関して、ミスマッチの位置は重要になり得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１１．７－１１．８を参照されたい）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、８ヌクレオチド以上（例えば、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上、または３０ヌクレオチド以上）である。温度、洗浄溶液塩濃度、及び他の条件は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因により、必要に応じて調整され得る。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能またはハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことが理解される。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（例えば、バルジ、ループ構造、またはヘアピン構造等）。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸配列内の標的領域に対して６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドのうち１８が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする、アンチセンス核酸は、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか、または相補的ヌクレオチドが点在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、任意の簡便な方法を使用して決定することができる。例示的な方法としては、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用する、ギャッププログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）が挙げられる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードされた、及び非コードのアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変された、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。
本明細書で使用される場合、「結合」（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメイン、標的核酸への結合等に関して）は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド／ガイドＲＮＡ複合体と標的核酸との間等）の非共有相互作用を指す。非共有相互作用の状態にある間、巨大分子は、「会合」または「相互作用」または「結合」であると言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘが非共有様式で分子Ｙに結合することを意味する）。結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）である必要はないが、結合相互作用のいくつかの部分は、配列特異的であり得る。結合相互作用は、一般に、１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満、または１０－１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫＤと相関する。
「結合ドメイン」とは、別の分子に非共有結合することができるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合ドメイン）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合ドメイン）、及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合ドメイン）に結合することができる。タンパク質結合ドメインを有するタンパク質の場合、タンパク質は、場合によっては、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するため）、及び／またはタンパク質は、異なるタンパク質（複数可）の１つ以上の領域に結合することができる。
「保存アミノ酸置換」という用語は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタメート及びアスパルテートからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン－グリシン、及びアスパラギン－グルタミンである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」のパーセントを有し、整列したときに、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが、それら２つの配列を比較したときに同一であり、同じ相対位置にあることを意味する。配列同一性はいくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ，ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ／，ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／，ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／を含むサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能な様々な簡便な方法及びコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ等）を使用して整列することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．２１５：４０３－１０を参照されたい。
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡヌクレオチド配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得る（したがって、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの両方がタンパク質をコードする）か、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、「非コード」ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ等）をコードし得る。
「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれると、インビトロまたはインビボで、ｍＲＮＡ（ＤＮＡの場合）に転写され、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）ヌクレオチド配列である。
本明細書で互換的に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）またはコード配列（例えば、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、ＧｅｏＣａｓ９ポリペプチド、ＧｅｏＣａｓ９融合ポリペプチド等）の転写を提供及び／または調節する、及び／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、転写及び翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等を指す。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコードまたは非コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本開示の目的のために、プロモーター配列は、転写開始部位が３’末端で接しており、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンド上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有するが、必ずしもそうではない。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本開示の様々なベクターによって発現を駆動することができる。
本明細書で使用される場合、「天然型」または「未改変」または「野生型」という用語は、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される場合、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、天然の供給源から単離され得る生物中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然型である。
本明細書で使用される場合、「融合」という用語は、核酸またはポリペプチドに適用される場合、異なる供給源に由来する構造によって定義される２つの構成要素を指す。例えば、「融合」が融合ポリペプチド（例えば、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質）の文脈で使用される場合、融合ポリペプチドは、異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。融合ポリペプチドは、改変または天然型ポリペプチド配列（例えば、改変または未改変Ｃａｓ１２Ｊタンパク質からの第１のアミノ酸配列、ならびにＣａｓ１２Ｊタンパク質以外の改変または未改変タンパク質からの第２のアミノ酸配列等）のいずれかを含み得る。同様に、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈における「融合」は、異なるコード領域（例えば、改変または未改変Ｃａｓ１２Ｊタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＣａｓ１２Ｊタンパク質以外のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列）に由来するヌクレオチド配列を含む。
「融合ポリペプチド」という用語は、通常、ヒト介入を通して、アミノ酸配列の２つの、そうでなければ分離されたセグメントの組み合わせ（すなわち、「融合」）によって作製されるポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「異種」は、それぞれ、天然の核酸またはタンパク質に見出されないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。例えば、場合によって、本開示のバリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質において、天然型Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（またはそのバリアント）の一部は、異種ポリペプチド（すなわち、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド以外のタンパク質からのアミノ酸配列または別の生物からのアミノ酸配列）に融合され得る。別の例として、融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、異種ポリペプチド、すなわちＣａｓ１２Ｊポリペプチド以外のタンパク質からのポリペプチド、または別の生物からのポリペプチドと融合した天然型Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（またはそのバリアント）の全てまたは一部分を含み得る。異種ポリペプチドは、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質または融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質によっても示される（例えば、ビオチンリガーゼ活性、核局在化等）活性（例えば、酵素活性）を示し得る。異種核酸配列は、天然型核酸配列（またはそのバリアント）と連結して（例えば、遺伝子操作によって）、融合ポリペプチド（融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
本明細書で使用される場合、「組み換え」は、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然分類において見出される内因性核酸から区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築物をもたらすクローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産生物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片から、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞または無細胞転写及び翻訳システムに含まれる組み換え転写単位から発現が可能である合成核酸を提供することができる。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子または転写単位の形成において使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、そのような配列がコード領域の操作または発現に干渉しない、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在してもよく、実際に様々な機序による所望の産生物の産生を調節するように作用してもよい（「ＤＮＡ調節配列」を参照されたい）。あるいは、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列も、組み換えとみなされ得る。したがって、例えば、「組み換え」核酸という用語は、天然型ではない、例えば、ヒト介入を通して、配列の２つの、そうでなければ分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技法のいずれかによって達成される。これは、通常、コドンを、同じアミノ酸、保存アミノ酸、または非保存アミノ酸をコードするコドンと置換するために行われる。あるいは、機能の所望の組み合わせを生成するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に接合するために実施される。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技法のいずれかによって達成される。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされたポリペプチドの配列は、天然型（「野生型」）であり得るか、または天然型配列のバリアント（例えば、変異体）であり得る。そのような場合の一例は、タンパク質が天然に見出されない細胞（例えば、真核細胞）中のタンパク質の発現（例えば、真核細胞中のＣａｓ１２Ｊ（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊ、バリアントＣａｓ１２Ｊ、融合Ｃａｓ１２Ｊ等）などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ポリペプチドの発現）のために、ＤＮＡ配列がコドン最適化される、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ（組み換え）である。したがって、コドン最適化ＤＮＡは、組み換えであり得、非天然型であり得る一方で、ＤＮＡによってコードされるタンパク質は、野生型アミノ酸配列を有し得る。
したがって、「組み換え」ポリペプチドという用語は、アミノ酸配列が天然に存在しないポリペプチドを必ずしも指すものではない。代わりに、「組み換え」ポリペプチドは、組み換えの非天然型ＤＮＡ配列によってコードされるが、ポリペプチドのアミノ酸配列は、天然型（「野生型」）または非天然型であり得る（例えば、バリアント、変異体等）。したがって、「組み換え」ポリペプチドは、ヒト介入の結果であるが、天然型アミノ酸配列を有し得る。
「ベクター」または「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入物」が、細胞内で結合したセグメントの複製をもたらすように結合され得るプラスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体、またはコスミドなどのレプリコンである。
「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結しているＤＮＡコード配列を含む。「作動可能に連結している」は、並立を指し、そのように説明される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している（またはコード配列は、プロモーターに作動可能に連結しているとも言われ得る）。
「組み換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ベクター及び挿入物を含むＤＮＡ分子を指す。組み換え発現ベクターは、通常、挿入物（複数可）を発現及び／または増殖させる目的、または他の組み換えヌクレオチド配列の構築のために生成される。挿入物（複数可）は、プロモーター配列と作動可能に連結していてもしていなくてもよく、ＤＮＡ調節配列と作動可能に連結していてもしていなくてもよい。
外因性ＤＮＡまたは外因性ＲＮＡ、例えば、組み換え発現ベクターによって、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入される場合、細胞は「遺伝子改変されている」または「形質転換されている」または「形質移入されている」。外因性ＤＮＡの存在により、永続的または一過性の遺伝的変化がもたらされる。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれても（共有結合している）いなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞において、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム要素上に維持され得る。真核細胞に関して、安定して形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体複製を通して娘細胞によって遺伝するように染色体に組み込まれる細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞集団を含む細胞株またはクローンを確立する能力によって示される。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定して成長することができる初代細胞のクローンである。
遺伝的改変の好適な方法（「形質転換」とも称される）としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンユゲート、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）等が挙げられる。
遺伝的改変方法の選択は、一般に、形質転換される細胞型、及び形質転換が起こる状況（例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法の一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊ、バリアントＣａｓ１２Ｊ、融合Ｃａｓ１２Ｊ等）によって標的化される部位（「標的部位」または「標的配列」）を含むポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ）である。標的配列は、対象のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡのガイド配列（例えば、二重Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡまたは単一分子Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ）がハイブリダイズする配列である。例えば、標的核酸内の標的部位（または標的配列）５’－ＧＡＧＣＡＵＡＵＣ－３’は、配列５’－ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ－３’によって標的とされる（またはそれによって結合される、もしくはそれとハイブリダイズする、またはそれに相補的である）。好適なハイブリダイゼーション条件は、細胞中に通常存在する生理学的条件を含む。二本鎖標的核酸に関して、ガイドＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的核酸の鎖は、「相補鎖」または「標的鎖」と称され、一方、「標的鎖」に相補的である（したがって、ガイドＲＮＡに相補的ではない）標的核酸の鎖は、「非標的鎖」または「非相補鎖」と称される。
「切断」とは、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）の共有結合骨格の切断を意味する。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。
「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書において、核酸切断のための触媒活性（例えば、リボヌクレアーゼ活性（リボ核酸切断）、デオキシリボヌクレアーゼ活性（デオキシリボ核酸切断）等）を有する酵素を意味するために互換的に使用される。
ヌクレアーゼの「切断ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイン」とは、核酸切断のための触媒活性を有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列またはドメインを意味する。切断ドメインは単一のポリペプチド鎖に含有され得るか、または切断活性は２つ（以上）のポリペプチドの会合から生じ得る。単一のヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の２つ以上の単離されたアミノ酸ストレッチからなり得る。
「幹細胞」という用語は、本明細書において、自己更新及び分化細胞型を生成する能力の両方を有する細胞（例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指すように使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２８７－２９８を参照されたい）。細胞発生の文脈において、「分化した」または「分化する」という形容詞は相対用語である。「分化細胞」は、それが比較されている細胞よりも発達経路のさらに下方に進行した細胞である。したがって、多能性幹細胞（以下に記載）は、系統制限された前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化することができ、それは、末期細胞（すなわち、高分化細胞、例えば、ニューロン、心筋細胞等）に分化することができる、さらに制限された細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）に分化することができ、これらは、ある特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持してもしなくてもよい。幹細胞は、特異的マーカー（例えば、タンパク質、ＲＮＡ等）の存在及び特異的マーカーの不在の両方によって特徴付けられ得る。幹細胞は、インビトロ及びインビボの両方の機能アッセイ、特に、複数の分化子孫を生じる幹細胞の能力に関するアッセイによって特定することもできる。
関心対象の幹細胞としては、多能性幹細胞（ＰＳＣ）が挙げられる。「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」という用語は、本明細書において、生物の全ての細胞型を産生することができる幹細胞を意味するために使用される。したがって、ＰＳＣは、生物の全ての生殖層（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞を生じ得る。多能性細胞は、奇形腫を形成し、生体内の外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織に寄与することができる。植物の多能性幹細胞は、植物の全ての細胞型（例えば、根、幹、葉等の細胞）を生じることができる。
動物のＰＳＣはいくつかの異なる方法で誘導することができる。例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）は、胚の内部細胞塊に由来する（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８ Ｎｏｖ ６；２８２（５３９１）：１１４５－７）が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞に由来する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ，Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１－７２、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１－９、Ｙｕ ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７ Ｄｅｃ ２１；３１８（５８５８）：１９１７－２０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｎｏｖ ２０）。ＰＳＣという用語は、それらの誘導にかかわらず多能性幹細胞を指すため、ＰＳＣという用語は、ＥＳＣ及びｉＰＳＣという用語、ならびにＰＳＣの別の例である胚生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）という用語を包含する。ＰＳＣは、確立された細胞株の形態であってもよく、それらは、一次胚組織から直接得ることができるか、またはそれらは体細胞に由来し得る。ＰＳＣは、本明細書に記載の方法の標的細胞であり得る。
「胚幹細胞」（ＥＳＣ）とは、胚、典型的には胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ株は、ＮＩＨヒト胚幹細胞レジストリ、例えば、ｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）、ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＨＳＦ－１、ＨＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、及びＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））に列記される。関心対象の幹細胞は、アカゲザル幹細胞及びマーモセット幹細胞などの他の霊長類からの胚幹細胞も含む。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類等から得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７８４４、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。培養では、ＥＳＣは、典型的には、大きな核細胞質比、定義された境界、及び顕著な核小体を有する平坦なコロニーとして成長する。加えて、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、及びアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ－１は発現しない。ＥＳＣを生成し、特徴付ける方法の例は、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、及び米国特許第６，２００，８０６号に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。未分化形態でｈＥＳＣを増殖させる方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、及びＷＯ０３／０２０９２０に記載される。
「胚生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胚生殖細胞」または「ＥＧ細胞」とは、生殖細胞及び／または生殖細胞前駆細胞、例えば、原始生殖細胞、すなわち、精子及び卵となるものに由来するＰＳＣを意味する。胚生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上述のように、胚幹細胞に類似の特性を有すると考えられる。ＥＧ細胞を生成し、特徴付ける方法の例は、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号、Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：８４１、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１３、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３７２６、及びＫｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：１２３５に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、ＰＳＣではない細胞に由来する（すなわち、ＰＳＣに対して分化される細胞に由来する）ＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、高分化細胞を含む複数の異なる細胞型に由来し得る。ｉＰＳＣは、ＥＳ細胞様形態を有し、大きな核細胞質比、定義された境界、及び顕著な核小体を有する平坦なコロニーとして成長する。加えて、ｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の１つ以上の主要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳＣを生成し、特徴付ける方法の例は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２００９／００４７２６３号、ＵＳ２００９／００６８７４２号、ＵＳ２００９／０１９１１５９号、ＵＳ２００９／０２２７０３２号、ＵＳ２００９／０２４６８７５号、及びＵＳ２００９／０３０４６４６号に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ｉＰＳＣを生成するために、体細胞には、体細胞が多能性幹細胞になるように再プログラムするために当該技術分野において既知のリプログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８等）が提供される。
「体細胞」とは、実験的操作の不在下で、通常、生物において全ての細胞型を生じない、生物における任意の細胞を意味する。換言すれば、体細胞は、体の３つ全ての生殖層、すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の細胞を自然に生成しないように十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、ニューロン及び神経前駆体の両方を含み、後者は、中枢神経系の全てまたはいくつかの細胞型を自然に生じることが可能であり得るが、中胚葉または内胚葉系統の細胞を生じることはできない。
「有糸分裂細胞」とは、有糸分裂を受ける細胞を意味する。有糸分裂は、真核細胞がその核内の染色体を、２つの別個の核内の２つの同一のセットに分離するプロセスである。一般に、直後に細胞質分裂が続き、これは、核、細胞質、細胞小器官、及び細胞膜を、これらの細胞構成要素のほぼ等分を含有する２つの細胞に分割する。
「有糸分裂後細胞」とは、有糸分裂から脱出した細胞、すなわち、「静止した」、すなわち、分裂をもはや受けていない細胞を意味する。この静止状態は、一時的、すなわち、可逆であり得るか、または永続的であり得る。
「減数分裂細胞」とは、減数分裂を受けている細胞を意味する。減数分裂は、細胞が配偶子または胞子を産生する目的のためにその核物質を分割するプロセスである。有糸分裂とは異なり、減数分裂では、染色体は、染色体間で遺伝物質をシャッフルする組み換えステップを受ける。加えて、減数分裂の結果は、有糸分裂から産生される２つの（遺伝学的に同一の）二倍体細胞と比較して、４つの（遺伝学的に固有の）一倍体細胞である。
場合によっては、構成要素（例えば、核酸構成要素（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ）、タンパク質構成要素（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、バリアントＣａｓ１２Ｊポリペプチド、融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド等）は、標識部分を含む。本明細書で使用される場合、「標識」、「検出可能な標識」、または「標識部分」という用語は、シグナル検出を提供し、アッセイの特定の性質に広く依存し得る任意の部分を指す。関心対象の標識部分には、直接検出可能な標識（直接標識；例えば、蛍光標識）及び間接的に検出可能な標識（間接標識；例えば、結合対メンバー）の両方が含まれる。蛍光標識は、任意の蛍光標識（例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）標識等）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、チェリー、トマト、タンジェリン、及びそれらの任意の蛍光誘導体）等）であり得る。本方法で使用するのに好適な検出可能な（直接的または間接的）標識部分には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、または他の手段によって検出可能な任意の部分が含まれる。例えば、好適な間接標識には、ビオチン（結合対メンバー）が含まれ、これはストレプトアビジンによって結合され得る（それ自体が直接的または間接的に標識され得る）。標識はまた、放射標識（直接標識）（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（間接的標識）（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ等）、蛍光タンパク質（直接標識）（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びこれらの任意の簡便な誘導体）、金属標識（直接標識）、比色標識、結合対メンバー等を含み得る。「結合対のパートナー」または「結合対メンバー」とは、第１及び第２の部分のうちの１つを意味し、第１及び第２の部分は、互いに特異的結合親和性を有する。好適な結合対としては、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル－Ｘ－抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、及びローダミン抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）、及びカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられるが、これらに限定されない。任意の結合対メンバーは、間接的に検出可能な標識部分としての使用に好適であり得る。
任意の所与の構成要素、または構成要素の組み合わせは、非標識であり得るか、または標識部分で検出可能に標識され得る。場合によっては、２つ以上の構成要素が標識される場合、それらは、互いに区別可能な標識部分で標識され得る。
分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教本に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は、薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれに罹患していると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
本明細書で互換的に使用される場合、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、個々の生物、例えば、マウス、サル、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技用動物、及び哺乳動物の愛玩動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとして意図されないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本明細書にも包含される。表示範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び材料は、これから説明される。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が別途明らかに規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「Ｃａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターポリペプチド」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「ガイドＲＮＡ」への言及は、１つ以上のガイドＲＮＡ及び当業者に既知のそれらの同等物などへの言及を含む。特許請求の範囲があらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として役立つことが意図される。
明確化のために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認される必要があり得る。
詳細な説明
本開示は、本明細書で「Ｃａｓ１２Ｊ」ポリペプチド、「ＣａｓΦ」ポリペプチド、または「ＣａｓＸＳ」ポリペプチドと称されるＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、それをコードする核酸、及びそれを含む組成物を提供する。本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びガイドＲＮＡを含む、リボ核タンパク質複合体を提供する。本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びガイドＲＮＡを使用して、標的核酸を改変する方法を提供する。本開示は、標的核酸の転写を調節する方法を提供する。
本開示は、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質に結合し、それに配列特異性を提供するガイドＲＮＡ（本明細書において「Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ」と称される）、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはそれをコードする核酸を含む改変された宿主細胞を提供する。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、提供される様々な用途において有用である。
組成物
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ１２Ｊタンパク質及びガイドＲＮＡ
Ｃａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、「ＣａｓＸＳポリペプチド」または「ＣａｓΦポリペプチド」とも称される）は、対応するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ）と相互作用（結合）して、ガイドＲＮＡと標的核酸分子内の標的配列との間の塩基対合を介して標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）中の特定の部位に標的化される、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。したがって、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡは、ガイド配列を介してＲＮＰ複合体に配列特異性を提供する。複合体のＣａｓ１２Ｊタンパク質は、部位特異的活性を提供する。換言すれば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、ガイドＲＮＡとのその会合によって、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、緑葉体配列等）内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位において安定化される）。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ガイドＲＮＡと複合体化されると、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを切断するが、一本鎖ＲＮＡは切断しない。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、マグネシウム依存様式でプレｃｒＲＮＡのプロセシングを触媒する。
本開示は、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（及び／またはＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）（例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、天然に存在するタンパク質、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊタンパク質、触媒的に不活性（「死活」Ｃａｓ１２Ｊ、本明細書において「ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質」とも称される）、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質等であり得る場合）を含む組成物を提供する。本開示は、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（及び／または Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）を含む組成物を提供する。本開示は、（ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（及び／またはＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする核酸）（例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、天然に存在するタンパク質、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊタンパク質、ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質等であり得る）、ならびに（ｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（及び／またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする核酸）を含む組成物を提供する。本開示は、（ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、天然に存在するタンパク質、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊタンパク質、Ｃｄａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質等であり得る）、ならびに（ｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡを含む、核酸／タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）を提供する。
Ｃａｓ１２Ｊタンパク質
Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（この用語は、「Ｃａｓ１２Ｊタンパク質」、「ＣａｓΦポリペプチド」、及び「ＣａｓΦタンパク質」という用語と互換的に使用される）は、標的核酸及び／または標的核酸と会合したポリペプチドに結合し、及び／またはそれを改変（例えば、切断、ニック、メチル化、脱メチル化等）することができる（例えば、ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）（例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は活性を有する融合パートナーを含み、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質はヌクレアーゼ活性を提供する）。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、天然型（例えば、バクテリオファージにおいて天然に生じる）タンパク質である。他の場合では、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、天然に生じるポリペプチドではない（例えば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、触媒的に不活性なＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合タンパク質等）である。
Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、いずれの異種融合パートナーとも融合していない）は、約６５キロダルトン（ｋＤａ）～約８５ｋＤａの分子量を有し得る。例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、約６５ｋＤａ～約７０ｋＤａ、約７０ｋＤａ～約７５ｋＤａ、または約７５ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有し得る。例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、約７０ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有し得る。
所与のタンパク質がＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡと相互作用するかどうかを決定するためのアッセイは、タンパク質と核酸との間の結合を試験する任意の簡便な結合アッセイであり得る。適切な結合アッセイ（例えば、ゲルシフトアッセイ）は当業者に既知であろう（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及びタンパク質を標的核酸に付加することを含むアッセイ）。タンパク質が活性を有するかどうかを決定するための（例えば、タンパク質が標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性及び／またはいくつかの異種活性を有するかどうかを決定するための）アッセイは、任意の簡便なアッセイ（例えば、核酸切断を試験する任意の簡便な核酸切断アッセイ）であり得る。好適なアッセイ（例えば、切断アッセイ）は当業者に既知であろう。
天然型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、標的化二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）において特定の配列で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。配列特異性は、標的ＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする、会合したガイドＲＮＡによって提供される。天然型Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（ｉｉ）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質に結合するステム－ループ（ヘアピン－ｄｓＲＮＡ二重鎖）を含むタンパク質結合セグメントを含む。
場合によっては、本開示のＣ１２Ｊポリペプチドは、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡと複合体化されると、標的核酸の部位特異的切断後に５’オーバーハングを含む産生物核酸を生成する。５’オーバーハングは、８～１２ヌクレオチド（ｎｔ）オーバーハングであり得る。例えば、５’オーバーハングは、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、または１２ｎｔの長さであり得る。
いくつかの実施形態では、対象の方法及び／または組成物のＣａｓ１２Ｊタンパク質は、天然型（野生型）タンパク質である（またはそれに由来する）。天然型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質の例を図６Ａ～６Ｒに示す。場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６に示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列のいずれか１つ（例えば、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つ）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６（例えば、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つ）に示されるアミノ酸配列を含む。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、以下、Ｃａｓ１２ａタンパク質、Ｃａｓ１２ｂタンパク質、Ｃａｓ１２ｃタンパク質、Ｃａｓ１２ｄタンパク質、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、Ｃａｓ１２ｇタンパク質、Ｃａｓ１２ｈタンパク質、及びＣａｓ１２ｉタンパク質のいずれよりも図６に示されるアミノ酸配列（例えば、図６に示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列のいずれか）とより多くの配列同一性を有する。場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、以下、Ｃａｓ１２ａタンパク質、Ｃａｓ１２ｂタンパク質、Ｃａｓ１２ｃタンパク質、Ｃａｓ１２ｄタンパク質、Ｃａｓ１２ｅタンパク質、Ｃａｓ１２ｇタンパク質、Ｃａｓ１２ｈタンパク質、及びＣａｓ１２ｉタンパク質のいずれのＲｕｖＣドメインよりも図６に示されるアミノ酸配列のＲｕｖＣドメイン（例えば、図６に示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列のいずれかのＲｕｖＣドメイン）とより多くの配列同一性を有するＲｕｖＣドメインを有する（ＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインを含む）アミノ酸配列を含む。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６に示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列のいずれか１つ（例えば、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つ）のＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインを含む）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６に示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列のいずれか１つ（例えば、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つ）のＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインを含む）と７０％以上の配列同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６に示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列のいずれか１つ（例えば、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つ）のＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩドメインを含む）を含む。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと結合するガイドＲＮＡは、図７に示されるヌクレオチド配列（または場合によっては、その逆相補体）を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列（Ｎ）ｎＸまたはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０（例えば、１５～２０、１７～２５，１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０）の整数であり、Ｘは図７に示されるヌクレオチド配列（または場合によっては、その逆相補体）のいずれか１つである。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと結合するガイドＲＮＡは、図７に示される配列（または場合によっては、その逆相補体）のいずれか１つと２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列（Ｎ）ｎＸまたはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０（例えば、１５～２０、１７～２５，１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０）の整数であり、Ｘは図７に示される配列のいずれか１つと２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列である。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと結合するガイドＲＮＡは、図７に示される配列（または場合によっては、その逆相補体）のいずれか１つと８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列（Ｎ）ｎＸまたはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０（例えば、１５～２０、１７～２５，１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０）の整数であり、Ｘは図７に示される配列のいずれか１つと８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列である。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと結合するガイドＲＮＡは、図７に示されるヌクレオチド配列（または場合によっては、その逆相補体）を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｘ（Ｎ）ｎを含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０（例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０）の整数であり、Ｘは図７に示されるヌクレオチド配列（または場合によっては、その逆相補体）のいずれか１つである。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと結合するガイドＲＮＡは、図７に示される配列（または場合によっては、その逆相補体）のいずれか１つと２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｘ（Ｎ）ｎを含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎが、１５～３０（例えば、１５～２０、１７～２５，１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０）の整数であり、Ｘは図７に示される配列のいずれか１つと２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列である。
Ｃａｓ１２Ｊタンパク質の例を図６Ａ～６Ｒに示す。上述のように、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦポリペプチド」とも称される。例えば、以下の通りである：
１）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５」（または図９の「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５＿１１」）と称され、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－１」とも称される。
２）「Ｃａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２」と称され、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－２」とも称される。
３）「Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０」（または図９の「Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０＿１２」）と称され、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－３」とも称される。
４）「Ｃａｓ１２Ｊ＿３８７７１０３＿１６」と称され、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－４」とも称される。
５）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００００２＿４７」または「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００２＿１１２」）と称され、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－５」とも称される。
６）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０１００７６３＿４」と称され、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－６」とも称される。
７）Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００７＿１４３」または「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００１＿２６７」）と称され、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－７」とも称される。
８）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００２８６＿５３」と称され、図６Ｌに示される（または「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００５０６＿８」と称され、図６Ｏに示される）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－８」とも称される。
９）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００１２８３＿７」と称され、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－９」とも称される。
１０）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３」と称され、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、本明細書において「ＣａｓΦ－１０」とも称される。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ａに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、６８０アミノ酸（ａａ）～７２０ａａ、例えば、６８０ａａ～６９０ａａ、６９０ａａ～７００ａａ、７００ａａ～７１０ａａ、または７１０ａａ～７２０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７０７アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000001
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000002
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５（または図９の「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５＿１１」）と称され、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質は、本明細書において「オルソログ＃１」または「Ｃａｓ１２Φ－１」とも称される。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｂに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿０７１２４２」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７４０アミノ酸（ａａ）～７８０ａａ、例えば、７４０ａａ～７５０ａａ、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、または７７０ａａ～７８０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７５７アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000003
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000004
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。Ｃａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２と称され、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質は、本明細書において「オルソログ＃２」または「Ｃａｓ１２Φ－２」とも称される。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｃに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９７３６４０」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｃに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｃに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｃに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｃに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｃに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７４０アミノ酸（ａａ）～７８０ａａ、例えば、７４０ａａ～７５０ａａ、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、または７７０ａａ～７８０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７６５アミノ酸の長さを有する。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｄに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７４０アミノ酸（ａａ）～７８０ａａ、例えば、７４０ａａ～７５０ａａ、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、または７７０ａａ～７８０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７６６アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000005
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000006
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０と称され、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質は、本明細書において「オルソログ＃３」または「Ｃａｓ１２Φ－３」とも称される。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｅに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７８０アミノ酸（ａａ）～８２０ａａ、例えば、７８０ａａ～７９０ａａ、７９０ａａ～８００ａａ、８００ａａ～８１０ａａ、または８１０ａａ～８２０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、８１２アミノ酸の長さを有する。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｆに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００２０９２１＿９」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｆに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｆに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｆに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｆに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｆに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７８０アミノ酸（ａａ）～８２０ａａ、例えば、７８０ａａ～７９０ａａ、７９０ａａ～８００ａａ、８００ａａ～８１０ａａ、または８１０ａａ～８２０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、８１２アミノ酸の長さを有する。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｇに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００００２＿４７」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７７０アミノ酸（ａａ）～８１０ａａ、例えば、７７０ａａ～７８０ａａ、７８０ａａ～７９０ａａ、７９０ａａ～８００ａａ、または８００ａａ～８１０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７９３アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000007
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000008
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｈに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０１００７６３＿４」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、４２０アミノ酸（ａａ）～４６０ａａ、例えば、４２０ａａ～４３０ａａ、４３０ａａ～４４０ａａ、４４０ａａ～４５０ａａ、または４５０ａａ～４６０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、４４１アミノ酸の長さを有する。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｉに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００４１４９＿１０」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｉに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｉに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｉに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｉに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｉに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７９０アミノ酸（ａａ）～８３０ａａ、例えば、７９０ａａ～８００ａａ、８００ａａ～８１０ａａ、８１０ａａ～８２０ａａ、または８２０ａａ～８３０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、８１２アミノ酸の長さを有する。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｊに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００７２４＿７１」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７９０アミノ酸（ａａ）～８３０ａａ、例えば、７９０ａａ～８００ａａ、８００ａａ～８１０ａａ、８１０ａａ～８２０ａａ、または８２０ａａ～８３０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、８１２アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000009
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000010
またはその逆相補体を含み、Ｎが、任意のヌクレオチドであり、ｎが、１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｊに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）に結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000011
またはそれらの逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000012
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｋに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００１＿２６７」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｋに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｋに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｋに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｋに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｋに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７５０アミノ酸（ａａ）～７９０ａａ、例えば、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、７７０ａａ～７８０ａａ、または７８０ａａ～７９０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７７２アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｋに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000013
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000014
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｌに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００２８６＿５３」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｌに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｌに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｌに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｌに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｌに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７００アミノ酸（ａａ）～７４０ａａ、例えば、７００ａａ～７１０ａａ、７１０ａａ～７２０ａａ、７２０ａａ～７３０ａａ、または７３０ａａ～７４０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７１７アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｌに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000015
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000016
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｍに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００１２８３＿７」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７７０アミノ酸（ａａ）～８１０ａａ、例えば、７７０ａａ～７８０ａａ、７８０ａａ～７９０ａａ、７９０ａａ～８００ａａ、または８００ａａ～８１０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７９３アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000017
またはそれらの逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000018
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｎに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００２＿１１２」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｎに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｎに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｎに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｎに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｎに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７７０アミノ酸（ａａ）～８１０ａａ、例えば、７７０ａａ～７８０ａａ、７８０ａａ～７９０ａａ、７９０ａａ～８００ａａ、または８００ａａ～８１０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７９３アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｎに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000019
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000020
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｏに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００５０６＿８」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｏに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｏに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｏに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｏに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｏに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７００アミノ酸（ａａ）～７４０ａａ、例えば、７００ａａ～７１０ａａ、７１０ａａ～７２０ａａ、７２０ａａ～７３０ａａ、または７３０ａａ～７４０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７１７アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｏに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000021
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000022
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｐに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００７＿１４３」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７５０アミノ酸（ａａ）～７９０ａａ、例えば、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、７７０ａａ～７８０ａａ、または７８０ａａ～７９０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７７２アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000023
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000024
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｑに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿３８７７１０３＿１６」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７５０アミノ酸（ａａ）～７９０ａａ、例えば、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、７７０ａａ～７８０ａａ、または７８０ａａ～７９０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７６５アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000025
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000026
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
場合によっては、（対象の組成物及び／または方法の）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｒに示され、「Ｃａｓ１２Ｊ＿８７７６３６＿１２」と称されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、図６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、配列が、タンパク質の天然型触媒活性を低下させるアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含むことを除き、図６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７５０アミノ酸（ａａ）～７９０ａａ、例えば、７５０ａａ～７６０ａａ、７６０ａａ～７７０ａａ、７７０ａａ～７８０ａａ、または７８０ａａ～７９０ａａの長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、７６６アミノ酸の長さを有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、図６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２Ｊポリペプチド）と結合するガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000027
またはその逆相補体を含む。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列
Figure 0007239725000028
またはその逆相補体を含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～３０、例えば、１５～２０、１７～２５、１７～２２、１８～２２、１８～２０、２０～２５、または２５～３０の整数である。
Ｃａｓ１２Ｊバリアント
バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質は、対応する野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質のアミノ酸配列と比較したときに、例えば、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と比較したときに、少なくとも１つのアミノ酸が異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊバリアントは、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と比較して１つのアミノ酸置換～１０のアミノ酸置換を含む。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊバリアントは、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるＣａｓ１２Ｊアミノ酸配列と比較して、ＲｕｖＣドメインに１つのアミノ酸置換～１０のアミノ酸置換を含む。
バリアント－触媒活性
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、例えば、天然型の触媒的に活性な配列に対して変異されたバリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質であり、対応する天然型の配列と比較したときに、低下した切断活性を示す（例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、または３０％以下の切断活性を示す）。場合によっては、そのようなバリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質は、触媒的に「死活」タンパク質であり（実質的に切断活性を有しない）、「ｄＣａｓ１２Ｊ」と称され得る。場合によっては、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質は、ニッカーゼ（二本鎖標的核酸、例えば、二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖のみ切断する）である。本明細書でより詳細に説明されるように、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質（場合によっては、野生型切断活性を有するＣａｓ１２Ｊタンパク質、場合によっては、低下した切断活性を有するバリアントＣａｓ１２Ｊ、例えば、ｄＣａｓ１２ＪまたはニッカーゼＣａｓ１２Ｊ）は、関心対象の活性（例えば、関心対象の触媒活性）を有する異種ポリペプチドと融合（コンジュゲート）して、融合タンパク質（融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質）を形成する。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸と結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチドをもたらすアミノ酸置換を図９に示す。例えば、Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３の４６４位、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置におけるＡｓｐの置換は、ｄＣａｓ１２Ｊをもたらす。別の例として、Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３の６７８位、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置におけるＧｌｕの置換は、ｄＣａｓ１２Ｊをもたらす。別の例として、Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３の７６９位、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置におけるＡｓｐの置換は、ｄＣａｓ１２Ｊをもたらす。
ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド（すなわち、ガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸と結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチド）をもたらすアミノ酸置換は、Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０（図６Ｄ）の４１３位におけるＡｓｐの置換、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置における、Ａｓｐ以外のアミノ酸との置換を含む。一例として、ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド（すなわち、ガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸と結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチド）をもたらすアミノ酸置換は、Ｄ４１３Ａ置換をＣａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０（図６Ｄ）の４１３位に、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置において含む。
ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド（すなわち、ガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸と結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチド）をもたらすアミノ酸置換は、Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５（図６Ａ）の３７１位におけるＡｓｐの置換、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置における、Ａｓｐ以外のアミノ酸との置換を含む。一例として、ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド（すなわち、ガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸と結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチド）をもたらすアミノ酸置換は、Ｄ３７１Ａ置換をＣａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５（図６Ａ）の３７１位、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置において含む。
ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド（すなわち、ガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸と結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチド）をもたらすアミノ酸置換は、Ｃａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２（図６Ｂ）の３９４位におけるＡｓｐの置換、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置における、Ａｓｐ以外のアミノ酸との置換を含む。一例として、ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド（すなわち、ガイドＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸に結合するがそれを切断しないＣａｓ１２Ｊポリペプチド）をもたらすアミノ酸置換は、Ｄ３９４Ａ置換をＣａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２（図６Ｂ）の３９４位、または別のＣａｓ１２Ｊの対応する位置において含む。
Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０（図６Ｄ）の４１３位におけるＡｓｐ（ＣａｓΦ－３）、Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５（図６Ａ）の３７１位におけるＡｓｐ（ＣａｓΦ－１）、及びＣａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２（図６Ｂ）の３９４位（ＣａｓΦ－２）のＡｓｐに対応するアミノ酸位置は、例えば、図６Ａ～６Ｒに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチドのアミノ酸配列を整列させることによって容易に決定することができる。例えば、Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０（図６Ｄ）の４１３位のＡｓｐ、Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５（図６Ａ）の３７１位のＡｓｐ、及びＣａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２（図６Ｂ）の３９４位のＡｓｐに対応するアミノ酸位置が、図９に示される。例えば、Ａｓｐ以外のアミノ酸で置換される場合、ｄＣａｓ１２Ｊポリペプチド中に存在し得るＲｕｖ－ＣＩのＡｓｐには、以下が含まれる：
１）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５」（または図９の「Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５＿１１」）と称され、図６Ａに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－１」）のＡｓｐ－３７１、
２）「Ｃａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２」と称され、図６Ｂに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－２」）のＡｓｐ－３９４、
３）「Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０」（または図９の「Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０＿１２」）と称され、図６Ｄに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－３」）のＡｓｐ－４１３、
４）「Ｃａｓ１２Ｊ＿３８７７１０３＿１６」と称され、図６Ｑに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－４」）のＡｓｐ－４１９、
５）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００００２＿４７」または「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００２＿１１２」と称され、図６Ｇに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－５」）のＡｓｐ－４１６、
６）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０１００７６３＿４」と称され、図６Ｈに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－６」）のＡｓｐ－３８４、
７）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００７＿１４３」または「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００１＿２６７」と称され、図６Ｐに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－７」）のＡｓｐ－４２３、
８）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００２８６＿５３」と称され、図６Ｌに示される（または「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００５０６＿８」と称され、図６Ｏに示される）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－８」）のＡｓｐ－３６９、
９）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００１２８３＿７」と称され、図６Ｍに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－９」）のＡｓｐ－４２６、
１０）「Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３」と称され、図６Ｅに示されるＣａｓ１２Ｊポリペプチド（「ＣａｓΦ－１０」）のＡｓｐ－４６４。
バリアント－融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド
上記のように、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質（場合によっては、野生型切断活性を有するＣａｓ１２Ｊタンパク質、場合によっては、低下した切断活性を有するバリアントＣａｓ１２Ｊ、例えば、ｄＣａｓ１２ＪまたはニッカーゼＣａｓ１２Ｊ）は、関心対象の活性（例えば、関心対象の触媒活性）を有する異種ポリペプチド（すなわち、１つ以上の異種ポリペプチド）と融合（コンジュゲート）して、融合タンパク質を形成する。Ｃａｓ１２Ｊタンパク質が融合され得る異種ポリペプチドは、本明細書において「融合パートナー」と称される。
場合によっては、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加する）ことができる。例えば、場合によっては、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質（例えば、転写リプレッサー、転写インヒビタータンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員等を介して機能するタンパク質）（またはタンパク質由来のドメイン）である。場合によっては、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（例えば、転写アクティベーター、転写アクティベータータンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員等を介して機能するタンパク質）（またはタンパク質由来のドメイン）である。場合によっては、融合パートナーは、逆転写酵素である。場合によっては、融合パートナーは、塩基エディターである。場合によっては、融合パートナーは、デアミナーゼである。
場合によっては、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、標的核酸を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
場合によっては、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
転写の増加に使用され得るタンパク質（またはその断片）の例としては、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢから）、ならびにＥＤＬＬの活性化ドメイン、及び／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物における活性のため）などの転写アクティベーター；ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３などのヒストンリジンデメチラーゼ；ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼ；ならびにＴｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１などのＤＮＡデメチラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
転写の減少に使用され得るタンパク質（またはその断片）の例としては、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写リプレッサー；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のため）等；Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなどのヒストンリジンデメチラーゼ；ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などのヒストンリジンデアセチラーゼ；ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などのＤＮＡメチラーゼ；及びＬａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなどの末梢動員要素が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）等）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのシトシンデアミナーゼ酵素）によって提供されるものなどの脱アミン化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ及び／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異体、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼ等）によって提供されるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）と会合したタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る（標的核酸と会合したタンパク質を修飾する）酵素活性の例としては、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、斑入り３～９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１等、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢＯ１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫ等の触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１等によって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な融合パートナーの追加の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能な融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質を生成するため）、及び葉緑体輸送ペプチドである。好適な葉緑体輸送ペプチドには、
Figure 0007239725000029
が含まれるが、これらに限定されない。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｂ）葉緑体輸送ペプチドを含む。したがって、例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド／ガイドＲＮＡ複合体は、葉緑体に対して標的化され得る。場合によっては、この標的化は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド輸送ペプチドと呼ばれるＮ末端伸長の存在によって達成され得る。細菌源からの染色体導入遺伝子は、発現されたポリペプチドが、植物プラスチド（例えば、葉緑体）内で区画化される場合、発現されたポリペプチドをコードする配列と融合したＣＴＰ配列をコードする配列を有していなければならない。したがって、葉緑体に対する外因性ポリペプチドの局在は、多くの場合、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、その外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５′領域に作動可能に連結することによって達成される。ＣＴＰは、プラスチドへの転位中のプロセシングステップにおいて除去される。しかしながら、プロセシング効率は、ＣＴＰのアミノ酸配列及びペプチドのアミノ末端（ＮＨ２末端）における付近の配列によって影響され得る。記載されている葉緑体に標的化するための他のオプションは、トウモロコシｃａｂ－ｍ７シグナル配列（米国特許第７，０２２，８９６号、ＷＯ９７／４１２２８）、エンドウグルタチオン還元酵素シグナル配列（ＷＯ９７／４１２２８）及びＵＳ２００９／０２９８６１に記載されるＣＴＰである。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｂ）エンドソーム脱出ペプチドを含み得る。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列
Figure 0007239725000030
を含み、各Ｘが、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列
Figure 0007239725000031
を含む。
Ｃａｓ９、亜鉛フィンガー、及び／またはＴＡＬＥタンパク質との融合の文脈において（部位特異的標的核酸改変、転写の調節、及び／または標的タンパク質改変、例えば、ヒストン修飾のために）使用される上記の融合パートナー（及びその他）のうちのいくつかの例については、例えば、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００７ Ｊｕｌ １８；１２９（２８）：８６７６－７、Ｒｉｖｅｎｂａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１２ Ａｐｒ；７（４）：３５０－６０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊｕｌ ８；４４（１２）：５６１５－２８、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｊｕｌ １８；１５４（２）：４４２－５１、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｍａｙ；１２（５）：４０１－３、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；３１（１２）：１１３３－６、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｍａｙ；３３（５）：５１０－７、Ｇｏｒｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９ Ｍａｒ ３１；１０６（１３）：５０５３－８、Ａｋｏｐｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｊｕｌ ２２；１００（１５）：８６８８－９１、Ｔａｎ ｅｔ．，ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；８０（４）：１９３９－４８、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｏｃｔ １４；１００（２１）：１１９９７－２００２、Ｐａｐｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｆｅｂ １８；１００（４）：１６２１－６、Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｊａｎ ５；７（１）：１７１－９２、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９８ Ｄｅｃ ８；９５（２５）：１４６２８－３３、Ｓｎｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃ ２３；１２（２４）：２１５９－６６、Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６ Ｍａｙ ３；２：１６００９、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ａｐｒ ２０；５３３（７６０３）：４２０－４、Ｃｈａｉｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ａｕｇ １１、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ａｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｊｕｎ ２３、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６ Ｊａｎ ４、Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１３５８：４３－５７、Ｂａｌｂｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５ Ｓｅｐ ８；５（３）：４４８－５９、Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｎ ９；５：１１２２１、Ｐｉａｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１５ Ｍａｙ；１３（４）：５７８－８９、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ；４２（７）：４３７５－９０、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３－７１、及びＭａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９７７－９を参照されたい。
追加の好適な異種ポリペプチドとしては、標的核酸の転写及び／または翻訳の増加または減少を直接的及び／または間接的に提供するポリペプチド（例えば、転写アクティベーターもしくはその断片、転写アクティベーターを動員するタンパク質もしくはその断片、小分子／薬物応答性転写及び／または翻訳調節因子、翻訳調節タンパク質等）が挙げられるが、これらに限定されない。転写の増加または減少を達成する異種ポリペプチドの非限定的な例としては、転写アクティベーター及び転写リプレッサードメインが挙げられる。そのようないくつかの場合には、融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、ガイド核酸（ガイドＲＮＡ）によって標的核酸中の特定の位置（すなわち、配列）に標的化され、プロモーター（転写アクティベーターの機能を選択的に阻害する）へのＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断する、及び／または局所クロマチン状態を改変する（例えば、標的核酸を修飾する、もしくは標的核酸と会合したポリペプチドを修飾する融合配列が使用される場合）などの座位特異的調節をもたらす。場合によっては、変化は、一過性である（例えば、転写抑制または活性化）。場合によっては、変化は、遺伝性である（例えば、標的核酸に対して、または標的核酸と会合したタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに対して後成的修飾が行われる場合）。
ｓｓＲＮＡ標的核酸を標的化するときに使用するための異種ポリペプチドの非限定的な例としては、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳構成要素（例えば、翻訳開始、延長、及び／または放出因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＡからＩへの、及び／またはＣからＵへの編集酵素を含む、ＲＮＡデアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ））；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質等が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。異種ポリペプチドは、タンパク質全体を含み得るか、または場合によっては、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含み得ることが理解される。
対象の融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドの異種ポリペプチドは、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメイン（本開示の目的のために、分子内及び／または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループ等の二本鎖ＲＮＡ二重鎖を含む）であり得、一過性または不可逆的、直接的または間接的にかかわらず、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＭＧ５及びＳＭＧ６などのタンパク質由来のＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、及びＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、及びＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ－１またはエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ Ｓ１、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、及びＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２及びＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、調節することができる）タンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、延長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ－２、及びＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジン化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＩ Ｄ１及び末端ウリジレートトランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、及びＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄ由来）；ＲＮＡの核保持に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外搬出に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、及びＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、及びｈｎＲＮＰ Ａ１）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低減に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ））；ならびに転写の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７及びＨＩＶ Ｔａｔ）を含む群から選択されるエフェクタードメインを含むが、これらに限定されない。あるいは、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、延長因子、放出因子等の翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジン化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ局在活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡの核保持が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外搬出活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；転写効率を低減することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ならびに転写を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメインを含む群から選択されてもよい。別の好適な異種ポリペプチドは、ＷＯ２０１２／０６８６２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に説明されるＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインである。
融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドの異種ポリペプチドとして（全体でまたはその断片として）使用され得るいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的ＲＮＡ結合モジュール及びスプライシングエフェクタードメインとともに、モジュール機構を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、エクソン封入を促進するプレｍＲＮＡ及びＣ末端ＲＳドメインにおいてエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含有する。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａｌは、そのＲＲＭドメインを通してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを通してエクソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの代替部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（ｓｓ）の代替使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、ｈｎＲＮＰ Ａｌは、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠位部位の使用に変更することができる。そのような因子の１つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の代替スプライシングを調節するＥＳＦを生成することである。例えば、Ｂｃｌ－ｘプレｍＲＮＡは、２つの代替５′スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生して、反対の機能のタンパク質をコードする。長いスプライシングアイソフォームＢｃｌ－ｘＬは、長命の分裂終了細胞中で発現された強力なアポトーシスインヒビターであり、多くのがん細胞中で上方調節され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高いターンオーバー率で細胞中に高レベルで発現される（例えば、リンパ球を発達させる）。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか（すなわち、２つの代替５′スプライス部位の間）に位置する複数の要素によって調節される。さらなる例については、ＷＯ２０１００７５３０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
さらに好適な融合パートナーとしては、境界要素（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（またはその断片）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ，Ｌａｍｉｎ Ｂ等）、タンパク質ドッキング要素（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１等）が挙げられるが、これらに限定されない。
ヌクレアーゼ
場合によっては、対象の融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｉｉ）異種ポリペプチド（「融合パートナー」）を含み、異種ポリペプチドはヌクレアーゼである。好適なヌクレアーゼとしては、ホーミングヌクレアーゼポリペプチド、ＦｏｋＩポリペプチド、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチド、ＭｅｇａＴＡＬポリペプチド、メガヌクレアーゼポリペプチド、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。メガヌクレアーゼは、ＬＡＤＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から操作することができる。メガＴＡＬポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び操作されたメガヌクレアーゼを含み得る。例えば、ＷＯ２００４／０６７７３６（ホーミングエンドヌクレアーゼ）、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６（ＺＦＮ）、Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：９２８３（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：２５９１（ＭｅｇａＴＡＬ）を参照されたい。
逆転写酵素
場合によっては、対象の融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｉｉ）異種ポリペプチド（「融合パートナー」）を含み、異種ポリペプチドは、逆転写酵素ポリペプチドである。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、触媒的に不活性である。好適な逆転写酵素としては、例えば、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルスＩ型逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素等が挙げられる。
塩基エディター
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｉｉ）異種ポリペプチド（「融合パートナー」）を含み、異種ポリペプチドは、塩基エディターである。好適な塩基エディターとしては、例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ等が挙げられる。
好適なアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することができる任意の酵素である。場合によっては、デアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007239725000032
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007239725000033
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下の黄色ブドウ球菌ＴａｄＡアミノ酸配列：
Figure 0007239725000034
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴａｄＡアミノ酸配列：
Figure 0007239725000035
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＴａｄＡ：
Figure 0007239725000036
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＴａｄＡアミノ酸配列：
Figure 0007239725000037
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｆ３０３１ ＴａｄＡアミノ酸配列：
Figure 0007239725000038
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ＴａｄＡアミノ酸配列：
Figure 0007239725000039
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なアデノシンデアミナーゼは、以下のＧｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ ＴａｄＡアミノ酸配列：
Figure 0007239725000040
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド融合ポリペプチドに含めるのに好適なシチジンデアミナーゼには、ＤＮＡ中のシチジンを脱アミノ化することができる任意の酵素が含まれる。
場合によっては、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー由来のデアミナーゼである。場合によっては、ＡＰＯＢＥＣファミリーデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、及びＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される。場合によっては、シチジンデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。
場合によっては、好適なシチジンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007239725000041
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なシチジンデアミナーゼは、ＡＩＤであり、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007239725000042
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、好適なシチジンデアミナーゼは、ＡＩＤであり、以下のアミノ酸配列：
Figure 0007239725000043
に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
転写因子
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｉｉ）異種ポリペプチド（「融合パートナー」）を含み、異種ポリペプチドは、転写因子である。転写因子は、ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、及びｉｉ）転写アクティベーターを含み得る。転写因子は、ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、及びｉｉ）転写リプレッサーを含み得る。好適な転写因子は、転写アクティベーターまたは転写リプレッサードメイン（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）等）、亜鉛フィンガーベースの人工転写因子（例えば、Ｓｅｒａ（２００９）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．６１：５１３を参照されたい）、ＴＡＬＥベースの人工転写因子（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：７８１を参照されたい）等を含むポリペプチドを含む。場合によっては、転写因子は、ＶＰ６４ポリペプチド（転写活性化）を含む。場合によっては、転写因子は、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ポリペプチド（転写抑制）を含む。場合によっては、転写因子は、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）ポリペプチド（転写抑制）を含む。場合によっては、転写因子は、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）ポリペプチド（転写抑制）を含む。例えば、場合によっては、転写因子は、転写アクティベーターであり、転写アクティベーターは、ＧＡＬ４－ＶＰ１６である。
リコンビナーゼ
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及びｉｉ）異種ポリペプチド（「融合パートナー」）を含み、異種ポリペプチドは、リコンビナーゼである。好適なリコンビナーゼとしては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ等が挙げられる。
対象の融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドに好適な様々なさらなる異種ポリペプチド（またはその断片）の例は、限定されないが、以下の出願（これらの公開は、Ｃａｓ９などの他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに関連するが、記載の融合パートナーは、代わりにＣａｓ１２Ｊと使用することもできる）：ＰＣＴ特許出願：ＷＯ２０１０／０７５３０３、ＷＯ２０１２／０６８６２７、及びＷＯ２０１３／１５５５５５に記載されるものを含み、例えば、米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４／００６８７９７号、第２０１４／０１７０７５３号、第２０１４／０１７９００６号、第２０１４／０１７９７７０号、第２０１４／０１８６８４３号、第２０１４／０１８６９１９号、第２０１４／０１８６９５８号、第２０１４／０１８９８９６号、第２０１４／０２２７７８７号、第２０１４／０２３４９７２号、第２０１４／０２４２６６４号、第２０１４／０２４２６９９号、第２０１４／０２４２７００号、第２０１４／０２４２７０２号、第２０１４／０２４８７０２号、第２０１４／０２５６０４６号、第２０１４／０２７３０３７号、第２０１４／０２７３２２６号、第２０１４／０２７３２３０号、第２０１４／０２７３２３１号、第２０１４／０２７３２３２号、第２０１４／０２７３２３３号、第２０１４／０２７３２３４号、第２０１４／０２７３２３５号、第２０１４／０２８７９３８号、第２０１４／０２９５５５６号、第２０１４／０２９５５５７号、第２０１４／０２９８５４７号、第２０１４／０３０４８５３号、第２０１４／０３０９４８７号、第２０１４／０３１０８２８号、第２０１４／０３１０８３０号、第２０１４／０３１５９８５号、第２０１４／０３３５０６３号、第２０１４／０３３５６２０号、第２０１４／０３４２４５６号、第２０１４／０３４２４５７号、第２０１４／０３４２４５８号、第２０１４／０３４９４００号、第２０１４／０３４９４０５号、第２０１４／０３５６８６７号、第２０１４／０３５６９５６号、第２０１４／０３５６９５８号、第２０１４／０３５６９５９号、第２０１４／０３５７５２３号、第２０１４／０３５７５３０号、第２０１４／０３６４３３３号、及び第２０１４／０３７７８６８号に見出すことができ、それらの全てが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
場合によっては、異種ポリペプチド（融合パートナー）は、亜細胞性局在を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、亜細胞性局在化配列（例えば、核に対して標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持する配列、例えば、核外搬出配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質中に保持したままにする配列、ミトコンドリアに対して標的化するためのミトコンドリア局在シグナル、葉緑体に対して標的化するための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナル等）を含有する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドはＮＬＳを含まないため、タンパク質は核に対して標的化されない（これは、例えば、標的核酸が、サイトゾル中に存在するＲＮＡである場合に、有利であり得る）。場合によっては、異種ポリペプチドは、追跡及び／または精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）を提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能な標識である）。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質等）は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、場合によっては、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む（と融合している）。したがって、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及び／またはＣ末端またはそれらの付近（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に位置付けられる。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端またはその付近（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられる。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｃ末端またはその付近（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられる。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及びＣ末端の両方またはそれらの付近（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に位置付けられる。場合によっては、ＮＬＳは、Ｎ末端に位置付けられ、ＮＬＳは、Ｃ末端に位置付けられる。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質等）は、１～１０のＮＬＳ（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、または２～５のＮＬＳ）を含む（と融合している）。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質等）は、２～５のＮＬＳ（例えば、２～４または２～３のＮＬＳ）を含む（と融合している）。
ＮＬＳの非限定な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４９）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列
Figure 0007239725000044
を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５１）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号５２）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列
Figure 0007239725000045
を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列
Figure 0007239725000046
；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号５５）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９８）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号５６）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号５７）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号５８）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号５９）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号６０）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号６１）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列
Figure 0007239725000047
；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列
Figure 0007239725000048
に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般的に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核中で検出可能な量のＣａｓ１２Ｊタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度のものである。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質と融合してもよく、それにより細胞内の位置が可視化され得る。細胞核はまた、細胞から単離されてもよく、次いで、その内容物を、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば免疫組織化学、ウェスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析することができる。核中の蓄積はまた、間接的に決定されてもよい。
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ－細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含み、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子及び／またはナノ粒子に結合されたＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、またはサイトゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ酸末端と共有結合している（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊと連結して融合タンパク質を生成するか、またはバリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質、例えば、ｄＣａｓ１２Ｊ、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊ、もしくは融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質と連結して融合タンパク質を生成する）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端と共有結合している（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊと連結して融合タンパク質を生成するか、またはバリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質、例えば、ｄＣａｓ１２Ｊ、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊ、もしくは融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質と連結して融合タンパク質を生成する）。場合によっては、ＰＴＤは、好適な挿入部位でＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドに内的に挿入される（すなわち、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてではない）。場合によっては、対象のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（とコンジュゲートしている、と融合している）。場合によっては、ＰＴＤは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、場合によっては、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。したがって、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、核酸（例えば、Ｃａｓ１２Ｊガイド核酸、Ｃａｓ１２Ｊガイド核酸をコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド等）と共有結合している。ＰＴＤの例としては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６４）を含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応する）；細胞中への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１０～５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号６５））；トランスポータン
Figure 0007239725000049
が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、
Figure 0007239725000050
、３アルギニン残基～５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、
Figure 0007239725000051
のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これは正味電荷をほぼ０に低減し、それによって細胞への付着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその本来の付着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断するようにする。
リンカー（例えば、融合パートナーのための）
いくつかの実施形態では、対象のＣａｓ１２Ｊタンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して融合パートナーと融合し得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。タンパク質は、一般に可撓性のスペーサーペプチドによって接合され得るが、他の化学連結は除外されない。好適なリンカーとしては、４アミノ酸～４０アミノ酸長、または４アミノ酸～２５アミノ酸長のポリペプチドが挙げられる。これらのリンカーは、合成の、リンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質を結合することによって産生され得るか、または融合タンパク質をコードする核酸配列によってコードされ得る。ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーを使用することができる。好ましいリンカーが、一般に可撓性のペプチドをもたらす配列を有することを念頭において、連結ペプチドは、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン及びアラニンなどの小アミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを作製する際に有用である。そのような配列の作製は、当業者にとって慣例である。様々な異なるリンカーが商業的に入手可能であり、使用に好適であると考えられる。
リンカーポリペプチドの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、
Figure 0007239725000052
を含み、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマーが挙げられる。例示的なリンカーは、
Figure 0007239725000053
等を含むが、これらに限定されない、アミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、任意の所望の要素とコンジュゲートしたペプチドの設計が、全てまたは部分的に可撓性であるリンカーを含むことができ、それによりリンカーが、可撓性リンカーならびに低可撓性構造を付与する１つ以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
検出可能な標識
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、検出可能な標識を含む。検出可能なシグナルを提供することができる好適な検出可能な標識及び／または部分としては、酵素、放射性同位体、特異的結合対のメンバー、フルオロフォア、蛍光タンパク質、量子ドット等を挙げることができるが、これらに限定されない。
好適な蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはそのバリアント、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、Ｊ－Ｒｅｄ、二量体２、ｔ－二量体２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質及びキンドリングタンパク質、フィコビリンタンパク質、ならびにＢ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５－９０９）等が挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９－９７３に記載されるような、花虫類種由来の様々な蛍光及び染色タンパク質のうちのいずれかが使用に好適である。
好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、転化酵素、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の相補性の領域によって定義される標的配列において、標的ＤＮＡに結合する。多くのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合と同様に、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的結合（及び／または切断）は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される］の両方によって決定される位置において生じる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質のＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖（相補鎖、（ｉ）ガイドＲＮＡのガイド配列にハイブリダイズし、一方、非相補鎖はガイドＲＮＡに直接ハイブリダイズせず、かつ（ｉｉ）非相補鎖の逆相補体である）の標的配列の５′の直近である。
場合によっては（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃１」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－１９４７４５５が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＶＴＴＲ－３’である（Ｖは、Ｇ、Ａ、またはＣであり、ＲはＡまたはＧである）。例えば、図１３Ａを参照されたい。したがって、場合によっては、好適なＰＡＭは、ＧＴＴＡ、ＧＴＴＧ、ＡＴＴＡ、ＡＴＴＧ、ＣＴＴＡ、及びＣＴＴＧを含み得る。
場合によっては（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃２」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－２０７１２４２が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＴＢＮ－３’である（Ｂは、Ｔ、Ｃ、またはＧである）。例えば、図１３Ａを参照されたい。したがって、場合によっては、好適なＰＡＭは、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＴ、ＴＴＧ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＴ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＴ、及びＴＧＧを含み得る。いくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃２」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－２０７１２４２が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＴＮＮ－３’である。
場合によっては（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃３」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＶＴＴＢ－３’である（Ｖは、Ｇ、Ａ、またはＣであり、Ｂは、Ｔ、Ｃ、またはＧである）。例えば、図１３Ａを参照されたい。したがって、場合によっては、好適なＰＡＭは、ＧＴＴＴ、ＧＴＴＣ、ＧＴＴＧ、ＡＴＴＴ、ＡＴＴＣ、ＡＴＴＧ、ＣＴＴＴ、ＣＴＴＣ、ＣＴＴＧを含み得る。場合によっては（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃３」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＮＴＴＮ－３’である。場合によっては（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃３」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＶＴＴＮ－３’である（Ｖは、Ｇ、Ａ、またはＣである）。いくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載されるように、本明細書において「オルソログ＃３」とも称されるＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＶＴＴＣ－３’である。
場合によっては、異なるＣａｓ１２Ｊタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓ１２Ｊタンパク質）は、異なるＣａｓ１２Ｊタンパク質の様々な酵素的特徴を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列選好性のため；増加または減少した酵素活性のため；増加または減少したレベルの細胞毒性のため；ＮＨＥＪ、ホモロジー配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断等の間の均衡を変更するため；短い全配列を利用するため、等）、様々な提供される方法における使用に有利であり得る。異なる種に由来するＣａｓ１２Ｊタンパク質は、標的ＤＮＡ中に異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。したがって、選択した特定のＣａｓ１２Ｊタンパク質の場合、ＰＡＭ配列選好性は、上記の配列とは異なり得る。適切なＰＡＭ配列の特定のための様々な方法（インシリコ及び／またはウェットラボ法を含む）が当該技術分野において既知かつ慣例であり、任意の簡便な方法を使用することができる。例えば、本明細書に記載のＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイを使用して特定されたが（例えば、以下の実施例を参照されたい）、様々な異なる方法（当該技術分野で既知の配列決定データの計算分析を含む）を使用しても特定され得たであろう。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ
Ｃａｓ１２Ｊタンパク質に結合して、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、かつその複合体を標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）内の特定の位置に標的化する核酸子は、本明細書において「Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ」または単に「ガイドＲＮＡ」と称される。場合によっては、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡは、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡがＲＮＡ塩基に加えてＤＮＡ塩基を含むように作製され得るが、「Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ」という用語は、依然として本明細書においてそのような分子を包含するように使用されることを理解されたい。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントの２つのセグメントを含むと言うことができる。タンパク質結合セグメントは、本明細書において、ガイドＲＮＡの「定常領域」とも称される。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸（例えば、標的ｄｓＤＮＡ、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖等）内の特定の配列（標的部位）に相補的な（かつ、したがってそれとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと相互作用する（に結合する）。対象のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補性ストレッチを含み得る。標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ等）の部位特異的結合及び／または切断は、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのガイド配列）と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決定される位置（例えば、標的座位の標的配列）において生じ得る。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及びＣａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、バリアントＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド等）は、複合体を形成する（例えば、非共有結合相互作用を介して結合する）。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、ガイド配列（標的核酸の配列に対して相補的なヌクレオチド配列）を含む、標的化セグメントを含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。複合体のＣａｓ１２Ｊタンパク質は、部位特異的活性（例えば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質によって提供される切断活性及び／または融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質の場合には融合パートナーによって提供される活性）を提供する。換言すれば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡとのその会合によって、標的核酸配列（例えば、標的配列）に誘導される。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの「標的化配列」とも称される「ガイド配列」は、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡがＣａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、天然型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド等）を、任意の所望の標的核酸の任意の所望の配列に標的化することができるように改変され得るが、ただし、（例えば、本明細書に記載されるように）ＰＡＭ配列が考慮され得ることを例外とする。したがって、例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、真核細胞中の核酸、例えば、ウイルス核酸、真核細胞核酸（例えば、真核細胞染色体、染色体配列、真核細胞ＲＮＡ等）において、配列に対する相補性を有するガイド配列を有することができる（例えば、ハイブリダイズすることができる）。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのガイド配列
対象のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、標的核酸中の配列（標的部位）に対して相補的なヌクレオチド配列である、ガイド配列（すなわち、標的化配列）を含む。換言すれば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのガイド配列は、ハイブリダイゼーションによる配列特異的な様式（すなわち、塩基対合）で標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））と相互作用し得る。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのガイド配列は、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡなどの真核細胞標的核酸）内で任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように改変（例えば、遺伝子操作によって）／設計され得る（例えば、ＰＡＭを考慮に入れて、例えば、ｄｓＤＮＡ標的を標的化するとき）。
場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１００％である。
場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、標的核酸の標的部位の７つの連続する３′最端ヌクレオチドにわたって１００％である。
場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７～２５の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７～２５の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７～２５の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１７～２５の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９～２５の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９～２５の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９～２５の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。場合によっては、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、１９～２５の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
場合によっては、ガイド配列は、１７～３０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７～２５、１７～２２、１７～２０、１９～３０、１９～２５、１９～２２、１９～２０、２０～３０、２０～２５、または２０～２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、１７～２５ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７～２２、１７～２０、１９～２５、１９～２２、１９～２０、２０～２５、または２０～２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、１７ｎｔ以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、または２２ｎｔ以上；１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ等）の長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、１９ｎｔ以上（例えば、２０以上、２１以上、または２２ｎｔ以上；１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、等）の長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、１７ｎｔの長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、１８ｎｔの長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。場合によっては、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。
場合によっては、ガイド配列（「スペーサー配列」とも称される）は、１５～５０ヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔ、２０ｎｔ～２５ｎｔ、２５ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～３５ｎｔ、３５ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～４５ｎｔ、または４５ｎｔ～５０ｎｔ）の長さを有する。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント
対象のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント（「定常領域」）は、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質と相互作用する。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、結合したＣａｓ１２Ｊタンパク質を、上述のガイド配列を介して標的核酸内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに対して相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。したがって、場合によっては、タンパク質結合セグメントは、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。
場合によっては、ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、５～２５塩基対（ｂｐ）（例えば、５～２２、５～２０、５～１８、５～１５、５～１２、５～１０、５～８、８～２５、８～２２、８～１８、８～１５、８～１２、１２～２５、１２～２２、１２～１８、１２～１５、１３～２５、１３～２２、１３～１８、１３～１５、１４～２５、１４～２２、１４～１８、１４～１５、１５～２５、１５～２２、１５～１８、１７～２５、１７～２２、または１７～１８ｂｐ、例えば、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ等）の範囲を含む。場合によっては、ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、６～１５塩基対（ｂｐ）（例えば、６～１２、６～１０、または６～８ｂｐ、例えば、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ等）の範囲を含む。場合によっては、二重鎖領域は、５以上のｂｐ（例えば、６以上、７以上、または８以上のｂｐ）を含む。場合によっては、二重鎖領域は、６以上のｂｐ（例えば、７以上、または８以上のｂｐ）を含む。場合によっては、二重鎖領域の全てのヌクレオチドが対合されるわけではなく、したがって、二重鎖形成領域は、バルジを含み得る。本明細書において、「バルジ」という用語は、二本鎖二重鎖に寄与せず、寄与するヌクレオチドによって５′及び３′を囲まれているヌクレオチド（１つのヌクレオチドであり得る）のストレッチを意味するように使用され、そのようなものとしてバルジは、二重鎖領域の一部と見なされる。場合によっては、ｄｓＲＮＡは、１つの以上のバルジ（例えば、２以上、３以上、４以上のバルジ）を含む。場合によっては、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、２つ以上のバルジ（例えば、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。場合によっては、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、１～５つのバルジ（例えば、１～４つ、１～３つ、２～５つ、２～４つ、または２～３つのバルジ）を含む。
したがって、場合によっては、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに７０％～１００％の相補性（例えば、７５％～１００％、８０％～１０％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％の相補性）を有する。場合によっては、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに７０％～１００％の相補性（例えば、７５％～１００％、８０％～１０％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％の相補性）を有する。場合によっては、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに８５％～１００％の相補性（例えば、９０％～１００％、９５％～１００％の相補性）を有する。場合によっては、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに７０％～９５％の相補性（例えば、７５％～９５％、８０％～９５％、８５％～９５％、９０％～９５％の相補性）を有する。
換言すれば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの２つのストレッチを含むｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに７０％～１００％の相補性（例えば、７５％～１００％、８０％～１０％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％の相補性）を有する。場合によっては、ヌクレオチドの２つのストレッチを含むｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに８５％～１００％の相補性（例えば、９０％～１００％、９５％～１００％の相補性）を有する。場合によっては、ヌクレオチドの２つのストレッチを含むｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに７０％～９５％の相補性（例えば、７５％～９５％、８０％～９５％、８５％～９５％、９０％～９５％の相補性）を有する。
対象のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡの二重鎖領域は、天然型二重鎖領域に対して１つ以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ等）の変異を含み得る。例えば、場合によっては、塩基対は維持され得るが、各セグメントからの塩基対に寄与するヌクレオチドは異なり得る。場合によっては、対象のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡの二重鎖領域は、（天然型Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの）天然型二重鎖領域と比較して、より多くの塩基対、より少ない塩基対、より小さなバルジ、より大きなバルジ、より少ないバルジ、より多いバルジ、またはそれらの任意の簡便な組み合わせを含む。
様々なＣａｓ９ガイドＲＮＡの例は、当該技術分野において見出すことができ、場合によっては、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに導入されたものと同様の変形も、本開示のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡに導入され得る（例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖領域に対する変異、別のタンパク質との相互作用を提供するために安定化を追加するための５’または３’末端の伸長等）。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６－３７、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９－４３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３－８３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８、Ａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３－７１、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７－８０、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６－４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８－３４、Ｅｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２－５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０－９６、Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７－６３、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５－４３、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０－９、Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３－８、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４－５、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０－９、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２３；５６（２）：３３３－９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４／００６８７９７号、第２０１４／０１７０７５３号、第２０１４／０１７９００６号、第２０１４／０１７９７７０号、第２０１４／０１８６８４３号、第２０１４／０１８６９１９号、第２０１４／０１８６９５８号、第２０１４／０１８９８９６号、第２０１４／０２２７７８７号、第２０１４／０２３４９７２号、第２０１４／０２４２６６４号、第２０１４／０２４２６９９号、第２０１４／０２４２７００号、第２０１４／０２４２７０２号、第２０１４／０２４８７０２号、第２０１４／０２５６０４６号、第２０１４／０２７３０３７号、第２０１４／０２７３２２６号、第２０１４／０２７３２３０号、第２０１４／０２７３２３１号、第２０１４／０２７３２３２号、第２０１４／０２７３２３３号、第２０１４／０２７３２３４号、第２０１４／０２７３２３５号、第２０１４／０２８７９３８号、第２０１４／０２９５５５６号、第２０１４／０２９５５５７号、第２０１４／０２９８５４７号、第２０１４／０３０４８５３号、第２０１４／０３０９４８７号、第２０１４／０３１０８２８号、第２０１４／０３１０８３０号、第２０１４／０３１５９８５号、第２０１４／０３３５０６３号、第２０１４／０３３５６２０号、第２０１４／０３４２４５６号、第２０１４／０３４２４５７号、第２０１４／０３４２４５８号、第２０１４／０３４９４００号、第２０１４／０３４９４０５号、第２０１４／０３５６８６７号、第２０１４／０３５６９５６号、第２０１４／０３５６９５８号、第２０１４／０３５６９５９号、第２０１４／０３５７５２３号、第２０１４／０３５７５３０号、第２０１４／０３６４３３３号、及び第２０１４／０３７７８６８号（これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡに含めるのに好適な定常領域の例を図７（例えば、ＴがＵで置換される）に提供する。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、図７に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと比較して、１～５つのヌクレオチド置換を有する定常領域を含むことができる。一例として、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの定常領域は、ヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000054
を含むことができる。別の例として、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの定常領域は、ヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000055
を含むことができる。別の例として、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの定常領域は、ヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000056
を含むことができる。別の例として、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの定常領域は、ヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000057
を含むことができる。別の例として、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの定常領域は、ヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000058
を含むことができる。別の例として、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡの定常領域は、ヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000059
を含むことができる。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ定常領域は、図８に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含むことができる。Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ定常領域は、図８に示されるコンセンサス配列（複数可）内にヌクレオチド配列を含むことができる。
ヌクレオチド配列（ＴがＵで置換されている）は、１５～５０ヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔ、２０ｎｔ～２５ｎｔ、２５ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～３５ｎｔ、３５ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～４５ｎｔ、または４５ｎｔ～５０ｎｔの長さ）の選択したスペーサー配列（スペーサー配列が標的核酸結合配列（「ガイド配列」）を含む）と組み合わせることができる。場合によっては、スペーサー配列は、３５～３８ヌクレオチドの長さである。例えば、図７に示される（ＴがＵで置換されている）ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つが、（Ｎ）ｎ定常領域を含むガイドＲＮＡに含まれ得、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～５０（例えば、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～３８、３５～４０、４０～４５、または４５～５０）の整数である。図７に示される（ただし、ＴがＵで置換されている）ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの逆相補体が、定常領域（Ｎ）ｎを含むガイドＲＮＡに含まれ得、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは１５～５０（例えば、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～３８、３５～４０、４０～４５、または４５～５０）の整数である。
一例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000060
、または場合によっては逆相補体を有することができ、Ｎは任意のヌクレオチドであり、例えば、Ｎのストレッチが標的核酸結合配列を含む。別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000061
、または場合によっては逆相補体を有することができ、Ｎは任意のヌクレオチドであり、例えば、Ｎのストレッチが、標的核酸結合配列を含む。
一例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000062
（例えば、
Figure 0007239725000063
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000064
（例えば、
Figure 0007239725000065
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。
別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000066
（例えば、
Figure 0007239725000067
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000068
（例えば、
Figure 0007239725000069
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。
別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000070
（例えば、
Figure 0007239725000071
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000072
（例えば、
Figure 0007239725000073
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。別の例として、ガイドＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
Figure 0007239725000074
（例えば、
Figure 0007239725000075
、ここで、Ｎのストレッチがガイド配列／標的化配列を表し、Ｎは任意のヌクレオチドである）を有することができる。
Ｃａｓ１２Ｊガイドポリヌクレオチド
場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質に結合して、核酸／Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド複合体を形成する、及びその複合体を標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）内の特定の位置に標的化する核酸は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみを含み、本明細書において「ガイドＲＮＡ」と称される。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドのみを含み、本明細書において「ガイドＤＮＡ」と称される。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方を含む。ガイドポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド塩基、デオキシリボヌクレオチド塩基、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド等の組み合わせを含み得、さらに、天然型骨格残基及び／または連結及び／または非天然型骨格残基及び／または連結を含み得る。
ＣＡＳ１２Ｊシステム
本開示は、Ｃａｓ１２Ｊシステムを提供する。本開示のＣａｓ１２Ｊシステムは、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｂ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｃ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｄ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｅ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｆ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｇ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｈ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｊ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｋ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｌ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｍ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え発現ベクター、ｎ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナー鋳型核酸、ｏ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ｐ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ならびにドナー鋳型核酸、ｑ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、もしくはｒ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、または（ａ）～（ｒ）のうちの１つのある変形を含むことができる。
核酸
本開示は、ドナーポリヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊタンパク質、ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質等）をコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、１つ以上の核酸を提供する。本開示は、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、ａ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを提供する。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、選択した細胞型（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞等）において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結している。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化される。この種類の最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図した宿主生物または細胞のコドン選好性を模倣するように、Ｃａｓ１２Ｊコードヌクレオチド配列の変異を伴い得る。したがって、コドンは変更され得るが、コードされたタンパク質は、変更されないままである。例えば、意図した標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドン最適化Ｃａｓ１２Ｊコードヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、意図した宿主細胞がマウス細胞であった場合、マウスコドン最適化Ｃａｓ１２Ｊコードヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、意図した宿主細胞が植物細胞であった場合、植物コドン最適化Ｃａｓ１２Ｊコードヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、意図した宿主細胞が昆虫細胞であった場合、昆虫コドン最適化Ｃａｓ１２Ｊコードヌクレオチド配列を生成することができる。
コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｋａｚｕｓａ［ｄｏｔ］または［ｄｏｔ］ｊｐ［ｆｏｒｗａｒｄｓｌａｓｈ］ｃｏｄｏｎで入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。場合によっては、本開示の核酸は、真核細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、動物細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、真菌細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、単子葉植物種における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、双子葉植物種における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、裸子植物種における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、被子植物種における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、トウモロコシ細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、大豆細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、米細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、小麦細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、綿細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、モロコシ細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、アルファルファ細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、サトウキビ細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、トマト細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、キュウリ細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、ジャガイモ細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本開示の核酸は、藻類細胞における発現のためにコドン最適化されているＣａｓ１２Ｊポリペプチドコードヌクレオチド配列を含む。
本開示は、（場合によっては異なる組み換え発現ベクターにおいて、場合によっては同じ組み換え発現ベクターにおいて）（ｉ）ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列（ドナー鋳型は、標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む）、（ｉｉ）標的化ゲノムの標的座位の標的配列にハイブリダイズするＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結している）、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結している）を含む１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、（場合によっては異なる組み換え発現ベクターにおいて、場合によっては同じ組み換え発現ベクターにおいて）（ｉ）ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列（ドナー鋳型は、標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む）、及び（ｉｉ）標的化ゲノムの標的座位の標的配列にハイブリダイズするＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結している）を含む１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、（場合によっては異なる組み換え発現ベクターにおいて、場合によっては同じ組み換え発現ベクターにおいて）（ｉ）標的化ゲノムの標的座位の標的配列にハイブリダイズするＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結している）、及び（ｉｉ）Ｃａｓ１２Ｊタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結している）を含む１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。
好適な発現ベクターとしては、ウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）；等が挙げられる。場合によっては、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。場合によっては、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えレンチウイルスベクターである。場合によっては、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えレトロウイルスベクターである。
植物用途に関して、トバモウイルス、ポテックスウイルス、ポティウイルス、トブラウイルス、トンブスウイルス、ジェミニウイルス、ブロモウイルス、カーモウイルス、アルファモウイルス、またはククモウイルスに基づくウイルスベクターを使用することができる。例えば、Ｐｅｙｒｅｔ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２０１５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１３：１１２１を参照されたい。好適なトバモウイルスベクターとしては、例えば、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）ベクター、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス（ＴＭＧＭＶ）ベクター、トウガラシ微斑ウイルス（ＰＭＭｏＶ）ベクター、パプリカ微斑ウイルス（ＰａＭＭＶ）ベクター、キュウリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ）緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）ベクター、キュウリ（ｋｙｕｒｉ）緑斑モザイクウイルス（ＫＧＭＭＶ）ベクター、ハイビスカス潜在フォートピアスウイルス（ＨＬＦＰＶ）ベクター、オドントグロッサム輪点ウイルス（ＯＲＳＶ）ベクター、ジオウモザイクウイルス
（ＲｅＭＶ）ベクター、ウチワサボテンサモンズウイルス（ＳＯＶ）ベクター、ワサビ斑紋ウイルス（ＷＭｏＶ）ベクター、アブラナモザイクウイルス（ＹｏＭＶ）ベクター、サンヘンプモザイクウイルス（ＳＨＭＶ）ベクター等が挙げられる。好適なポテックスウイルスベクターとしては、例えば、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ベクター、ジャガイモ黄斑モザイクウイルス（ＰＡＭＶ）ベクター、ＡｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａウイルスＸ（ＡｌｓＶＸ）ベクター、サボテンウイルスＸ（ＣＶＸ）ベクター、Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍモザイクウイルス（ＣｙｍＭＶ）ベクター、ギボウシウイルスＸ（ＨＶＸ）ベクター、ユリウイルスＸ（ＬＶＸ）ベクター、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓモザイクウイルス（ＮＭＶ）ベクター、ＮｅｒｉｎｅウイルスＸ（ＮＶＸ）ベクター、Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａモザイクウイルス（ＰｌＡＭＶ）ベクター、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（ＳＭＹＥＶ）ベクター、チューリップウイルスＸ（ＴＶＸ）ベクター、シロクローバーモザイクウイルス（ＷＣｌＭＶ）ベクター、タケモザイクウイルス（ＢａＭＶ）ベクター等が挙げられる。好適なポティウイルスベクターとしては、例えば、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）ベクター、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＣＭＶ）ベクター、クローバーバ葉脈黄化ウイルス（ＣｌＹＶＶ）ベクター、トケイソウ東アジアウイルス（ＥＡＰＶ）ベクター、フリージアモザイクウイルス（ＦｒｅＭＶ）ベクター、ヤマノイモモザイクウイルス（ＪＹＭＶ）ベクター、レタスモザイクウイルス（ＬＭＶ）ベクター、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）ベクター、タマネギ萎縮ウイルス（ＯＹＤＶ）ベクター、パパイア輪点ウイルス（ＰＲＳＶ）ベクター、トウガラシ斑紋ウイルス（ＰｅｐＭｏＶ）ベクター、Ｐｅｒｉｌｌａ斑紋ウイルス（ＰｅｒＭｏＶ）ベクター、ウメ輪紋ウイルス（ＰＰＶ）ベクター、ジャガイモウイルスＡ（ＰＶＡ）ベクター、モロコシモザイクウイルス（ＳｒＭＶ）ベクター、大豆モザイクウイルス（ＳＭＶ）ベクター、サトウキビモザイクウイルス（ＳＣＭＶ）ベクター、チューリップモザイクウイルス（ＴｕｌＭＶ）ベクター、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）ベクター、スイカモザイクウイルス（ＷＭＶ）ベクター、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）ベクター、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）ベクター等が挙げられる。好適なトブラウイルスベクターとしては、例えば、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）ベクター等が挙げられる。好適なトンブスウイルスベクターとしては、例えば、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）ベクター、ナス斑紋クリンクルウイルス（ＥＭＣＶ）ベクター、ブドウアルジェリア潜在ウイルス（ＧＡＬＶ）ベクター等が挙げられる。好適なククモウイルスベクターとしては、例えば、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクター、ラッカセイ矮化ウイルス（ＰＳＶ）ベクター、トマトアスペルミーウイルス（ＴＡＶ）ベクター等が挙げられる。好適なブロモウイルスベクターとしては、例えば、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）ベクター、ササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）ベクター等が挙げられる。好適なカーモウイルスベクターとしては、例えば、カーネーション斑紋ウイルス（ＣａｒＭＶ）ベクター、メロンえそ斑点ウイルス（ＭＮＳＶ）ベクター、エンドウ茎えそウイルス（ＰＳＮＶ）ベクター、カブリンクルウイルス（ＴＣＶ）ベクター等が挙げられる。好適なアルファモウイルスベクターとしては、例えば、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）ベクター等が挙げられる。
利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む、いくつかの好適な転写及び翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素と作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質またはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写抑制要素と作動可能に連結している。
転写制御要素は、プロモーターであり得る。場合によっては、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、誘導性プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。場合によっては、転写制御要素（例えば、プロモーター）は、標的化細胞型または標的化細胞集団において機能的である。例えば、場合によっては、転写制御要素は、真核細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、動員された末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４（＋）細胞、骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４（＋）細胞等）において機能的であり得る。
真核細胞プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、ＥＦ１α、最初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、早期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有し得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含むことができる。発現ベクターはまた、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質と融合し、したがって融合Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをもたらすことができる、タンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。
プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（すなわち、構成的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得、誘導性プロモーターであってもよく（すなわち、その活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」状態が外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、転写制御要素、エンハンサー等）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であってもよく、時間的制約のあるプロモーターであってもよい（すなわち、プロモーターは、胚発達の特定段階中、または生物学的プロセスの特定段階、例えば、マウスにおける毛包サイクル中に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態である）。
適切なプロモーターは、ウイルスに由来し得、したがって、ウイルスプロモーターと称されるか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む、任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）等が挙げられるが、これらに限定されない。
場合よっては、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、真核細胞において作動可能なプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター、強化Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等）と作動可能に連結している（その制御下にある）。当業者によって理解されるように、（例えば、真核細胞中の）Ｕ６プロモーター、または別のＰｏｌＩＩＩプロモーターを使用して核酸（例えば、発現ベクター）からＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）を発現するときに、いくつかのＴが一列に並んでいる（ＲＮＡ中にＵをコードする）場合には、ＲＮＡは変異される必要がある場合がある。ＤＮＡ中のＴの文字列（例えば、５つのＴが）ポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のターミネーターとして作用することができるためである。したがって、真核細胞のガイドＲＮＡの転写を確実にするために、時折、ＴＳの実行を排除するために、ガイドＲＮＡをコードする配列を改変する必要がある場合がある。場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、ニッカーゼＣａｓ１２Ｊタンパク質、ｄＣａｓ１２Ｊタンパク質、融合Ｃａｓ１２Ｊタンパク質等）をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞において作動可能なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等）と作動可能に連結している。
誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節型プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン、エストロゲン、及び／またはエストロゲン類似体、ＩＰＴＧ等を含むがこれらに限定されない分子によって、調節することができる。
使用に好適な誘導性プロモーターとしては、本明細書に記載の、または当業者に既知の任意の誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、ならびにテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む、他のテトラサイクリン応答性プロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウス、及びヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質）に由来するプロモーター）、病因調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、及び光調節型プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）などの化学的／生化学的調節型及び物理的調節型プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、プロモーターは、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター等）であり、それにより多細胞生物において、プロモーターは、特異的細胞のサブセットにおいて活性（すなわち、「ＯＮ」）である。空間的制約のあるプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御要素、制御配列等とも称され得る。任意の簡便な空間的制約のあるプロモーターは、そのプロモーターが標的化宿主細胞（例えば、真核細胞、原核細胞）において機能的である限り、使用することができる。
場合によっては、プロモーターは、可逆的プロモーターである。可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野において既知である。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物及び原核生物から単離され、それに由来し得る。第２の生物において使用するための第１の生物（例えば、第１の生物が原核生物で第２の生物が真核生物、第１の生物が真核生物で第２の生物が原核生物等）に由来する可逆的プロモーターの改変は、当該技術分野において周知である。そのような可逆的プロモーター、及びそのような可逆的プロモーターに基づくだけでなく追加の制御タンパク質も含むシステムとしては、アルコール調節型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクティベータータンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーター等）、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーターシステム）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステム等）、金属調節型プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターシステム等）、病原体関連調節型プロモーター（例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーター等）、温度調節型プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、大豆ヒートショックプロモーター等）、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを使用して、非タンパク質コードＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）の発現を駆動することができる。場合によっては、好適なプロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。場合によっては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している。場合によっては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している。場合によっては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している。場合によっては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している。
Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６プロモーター、Ｈｌプロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターが挙げられる。例えば、Ｓｃｈｒａｍｍ ａｎｄ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ（２００２）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６：２５９３－２６２０を参照されたい。場合によっては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈｌプロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群から選択される。場合によっては、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーター、Ｈｌプロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。場合によっては、単一ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーター、Ｈｌプロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。
植物、植物組織、及び植物細胞における発現と関連して本明細書で使用され得るプロモーターを記載する例としては、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第５，６４１，８７６号（米アクチンプロモーター）、米国特許第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ－ｌプロモーター）、米国特許第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）、米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、及び同第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）、米国特許第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）、米国特許第６，４２９，３５７号（米アクチン２プロモーターならびに米アクチン２イントロン）、米国特許第５，８３７，８４８号（根特異的プロモーター）、米国特許第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）、米国特許第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）、米国特許第６，２５２，１３８号（病原性誘導性プロモーター）、米国特許第６，１７５，０６０号（リン欠損誘導性プロモーター）、米国特許第６，６３５，８０６号（ガンマ－コイキシン（ｃｏｉｘｉｎ）プロモーター）、及び米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）に記載されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。利用することができるさらなるプロモーターとしては、ノーパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ｅｂｅｒｔら、１９８７）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導プラスミド上に担持される）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）９：３１５－３２４）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：８１０－８１２）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ－プロモーター（米国特許第６，０５１，７５３号、同第５，３７８，６１９号）、スクロースシンターゼプロモーター（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ（１９９０）８７：４１４４－４１４８）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１１７５－１１８３）、及び葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター、ＰＣ１ＳＶ（米国特許第５，８５０，０１９号）、及びＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｖ０００８７、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８２）１：５６１－５７３、Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）プロモーターが挙げられる。
核酸（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質及び／またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸等）を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を細胞に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達等が挙げられる。
組み換え発現ベクターを細胞に導入することは、任意の培養培地中で、及び細胞の生存を促進する任意の培養条件下で起こり得る。組み換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビボまたはエクスビボで実行され得る。組み換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビトロで実行され得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、ＲＮＡとして提供され得る。ＲＮＡは、直接化学合成によって提供され得るか、または（例えば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質をコードする）ＤＮＡからインビトロで転写され得る。一度合成されると、ＲＮＡは、核酸を細胞に導入するための周知の技法（例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、形質移入等）のうちのいずれかによって細胞に導入され得る。
核酸は、十分に開発された形質移入技法（例えば、Ａｎｇｅｌ ａｎｄ Ｙａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ１１７５６を参照されたい）、ならびにＱｉａｇｅｎから市販されているＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡ形質移入キット、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡ形質移入キットを使用して、細胞に提供され得る。また、Ｂｅｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５（５０）：１９８２１－１９８２６も参照されたい。
ベクターは、標的宿主細胞に直接提供され得る。換言すれば、細胞を、対象の核酸を含むベクター（例えば、ドナー鋳型配列を有し、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする組み換え発現ベクター、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質をコードする組み換え発現ベクター等）と接触させ、それによってベクターが細胞によって取り込まれる。細胞を、プラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法としては、当該技術分野において周知の電気穿孔、塩化カルシウム形質移入、マイクロインジェクション、及びリポフェクションが挙げられる。ウイルスベクター送達の場合、細胞を、対象のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子と接触させることができる。
レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示の方法における使用に好適である。一般に使用されるレトロウイルスベクターは「欠陥がある」、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における成長を必要とする。関心対象の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によりウイルスカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（エコトロピック、アンホトロピック、またはゼノトロピック）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットに対してはエコトロピック、ヒト、イヌ、及びマウスを含む大部分の哺乳動物細胞型に対してはアンホトロピック、ならびにマウス細胞を除く大部分の哺乳動物細胞型に対してはゼノトロピック）。適切なパッケージング細胞株は、細胞がパッケージウイルス粒子によって標的化されることを確実にするために使用され得る。対象のベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法及びパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当該技術分野において周知である。核酸はまた、直接マイクロインジェクション（例えば、ＲＮＡのインジェクション）によって導入することもできる。
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする核酸を標的宿主細胞に提供するために使用されるベクターは、関心対象の核酸の発現、つまり転写活性化を駆動するための好適なプロモーターを含むことができる。換言すれば、場合によっては、関心対象の核酸は、プロモーターに作動可能に連結している。これは、偏在的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ－β－アクチンプロモーター、または誘導性プロモーター、例えば、特定の細胞集団において活性であるか、もしくはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターを含み得る。転写活性化によって、転写が、標的細胞中の基底レベルよりも１０倍、１００倍、より通常は１０００倍増加されることが意図される。加えて、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊタンパク質をコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊタンパク質を取り込んだ細胞を特定するように、標的細胞において選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含み得る。
Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、またはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、場合によってはＲＮＡである。したがって、Ｃａｓ１２Ｊ融合タンパク質は、ＲＮＡとして細胞に導入することができる。ＲＮＡを細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、直接注入、形質移入、またはＤＮＡの導入のために使用される任意の他の方法を含み得る。Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、ポリペプチドとして代わりに細胞に提供されてもよい。そのようなポリペプチドは、任意選択で産生物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合させることができる。このドメインは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断される、定義されたプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶ配列を通して、ポリペプチドと連結することができる。リンカーはまた、１つ以上の可撓性配列、例えば、１～１０個のグリシン残基も含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の切断は、産生物の溶解性を維持する緩衝液中、例えば、０．５～２Ｍの尿素の存在下、溶解性を増加させるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在下等で行われる。関心対象のドメインには、エンドソーム分解性（Ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン、及び産生を助ける他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメイン等が含まれる。ポリペプチドは、改善された安定性のために配合され得る。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化されてもよく、ポリエチレンオキシ基は、血流中の寿命の向上を提供する。
加えて、または代替的に、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインと融合して、細胞による取り込みを促進することができる。いくつかの浸透性ドメインが、当該技術分野において既知であり、ペプチド、ペプチド模倣体、及び非ペプチド担体を含む、本開示の非組み込みポリペプチドにおいて使用され得る。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６８）を含む、ペネトラチンと称される、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディアの第３のアルファヘリックスに由来し得る。別の例としては、浸透性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは、例えば、天然型ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９～５７を含み得る。他の浸透性ドメインには、ポリ－アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ－１ ｒｅｖタンパク質、ノナ－アルギニン、オクタ－アルギニン等のアミノ酸３４～５６の領域を含む。（例えば、転位ペプチド及びペプトイドの教示について参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ａｐｒ；４（２）：８７－９ ａｎｄ ４４６及びＷｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２０００ Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３－８、米国特許出願第２００３／０２２０３３４号、同第２００３／００８３２５６号、同第２００３／００３２５９３号、及び同第２００３／００２２８３１号を参照されたい）。ノナ－アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けられているより効率的なＰＴＤのうちの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２）。融合が行われる部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌、または結合特徴を最適化するために選択され得る。最適な部位は、慣例の実験によって決定される。
上述のように、場合によっては、標的細胞は、植物細胞である。植物細胞における染色体またはプラスチドを組み換え核酸で形質転換するための多数の方法が、当該技術分野において既知であり、これらは、遺伝子導入の植物細胞及び／または遺伝子導入の植物を産生するために、本出願の方法に従って使用され得る。当該技術分野において既知の植物細胞の形質転換のための任意の好適な方法または技法を使用することができる。植物の形質転換のための効果的な方法としては、細菌媒介型形質転換、例えば、アグロバクテリウム媒介型またはリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）媒介型形質転換、及び微粒子銃ボンバードメント媒介型形質転換が挙げられる。細菌媒介型形質転換または微粒子銃ボンバードメントを介して形質転換ベクターで外植体を形質転換し、その後、それらの外植体を培養等して遺伝子導入植物を再生または開発するための様々な方法が当該技術分野において既知である。マイクロインジェクション、電気穿孔、真空浸潤、圧力、超音波処理、炭化ケイ素繊維撹拌、ＰＥＧ媒介型形質転換などの植物形質転換のための他の方法もまた、当該技術分野において既知である。これらの形質転換方法によって産生される遺伝子導入の植物は、使用される方法及び外植体に応じて、形質転換事象のためのキメラまたは非キメラであり得る。
植物細胞を形質転換する方法は、当業者に周知である。例えば、組み換えＤＮＡで被覆された粒子を用いた微粒子銃ボンバードメントによる植物細胞の形質転換（例えば、生物学的形質転換）に関する具体的な手順説明は、米国特許第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、及び同第６，１５３，８１２号に見出され、アグロバクテリウム媒介型形質転換は、米国特許第５，１５９，１３５号、同第５，８２４，８７７号、同第５，５９１，６１６号、同第６，３８４，３０１号、同第５，７５０，８７１号、同第５，４６３，１７４号、及び同第５，１８８，９５８号に記載されている。植物を形質転換するためのさらなる方法は、例えば、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ（２００９）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに見出すことができる。本明細書に提供される核酸のうちのいずれかで植物細胞を形質転換するために、当業者に既知の任意の適切な方法を使用することができる。
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、インビトロで、または真核細胞によって、または原核細胞によって産生することができ、それは、アンフォールディング、例えば、熱変性、ジチオスレイトール還元等によってさらにプロセシングされてもよく、当該技術分野において既知の方法を使用して、さらにリフォールディングされ得る。
一次配列を変化させない関心対象の改変には、ポリペプチドの化学誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等が含まれる。また、グリコシル化の改変、例えば、その合成中及びプロセシング中またはさらなるプロセシングステップ中にポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって、例えば、ポリペプチドを、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素に曝露することによって行われるものも含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も包含される。
また、核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする、Ｃａｓ１２Ｊ融合タンパク質をコードする等）、ならびにタンパク質分解に対するそれらの耐性を改善するか、標的配列特異性を変更するか、溶解特性を最適化するか、タンパク質活性（例えば、転写調節活性、酵素活性等）を変化させるか、またはそれらをより好適にするように、通常の分子生物学的技法及び合成化学を使用して改変されているタンパク質（例えば、野生型タンパク質またはバリアントタンパク質に由来するＣａｓ１２Ｊ融合タンパク質）も、本開示の実施形態に包含するのに好適である。そのようなポリペプチドの類似体としては、天然型Ｌ－アミノ酸以外、例えば、Ｄ－アミノ酸または非天然型合成アミノ酸の残基を含有するものが挙げられる。Ｄ－アミノ酸をいくつかの、または全てのアミノ酸残基について置換することができる。
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、当該技術分野において既知の従来方法を使用して、インビトロ合成によって調製することができる。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動合成装置が入手可能である。合成装置を使用することによって、天然型アミノ酸を、非天然のアミノ酸で置換してもよい。特定の配列及び調製方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度等によって決定される。
必要に応じて、合成中または発現中に、様々な基をペプチドに導入してもよく、これにより他の分子または表面との連結が可能となる。したがって、例えば、システインを使用して、チオエーテル、金属イオン錯体と連結するためのヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基等を作製することができる。
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドはまた、組み換え合成の従来方法に従って単離及び精製されてもよい。発現宿主の溶解物が調製され、溶解物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、排除クロマトグラフィー、ゲル電気穿孔、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技法を使用して精製され得る。大部分は、使用される組成物は、産生物の調製及びその精製の方法に関連した汚染物質に対して、所望の産生物の２０重量％以上、より通常は７５重量％以上、好ましくは９５重量％以上、治療目的の場合は通常９９．５重量％を占める。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。したがって、場合によっては、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、少なくとも８０％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である（例えば、汚染物質、非Ｃａｓ１２Ｊタンパク質、または他の高分子等を含まない）。
切断もしくは任意の所望の改変を標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に誘導するため、または任意の所望の改変を標的核酸と会合したポリペプチドに誘導するために、本開示のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊポリペプチド及び／またはドナー鋳型配列は、それらが核酸としてまたはポリペプチドとして導入されるかにかかわらず、約３０分～約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分～約２４時間の任意の他の期間にわたって細胞に提供され、これはほぼ毎日～約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、またはほぼ毎日～約４日毎の任意の他の頻度で繰り返されてもよい。薬剤（複数可）は、対象の細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または４回以上提供されてもよく、細胞を、各接触事象の後にある程度の時間、例えば、１６～２４時間にわたって、薬剤（複数可）とともにインキュベートし、この時間の後に培地を新鮮な培地で置き換え、細胞をさらに培養する。
２つ以上の異なる標的化複合体（例えば、同じまたは異なる標的核酸内の異なる配列に対して相補的である２つの異なるＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ）が細胞に提供される場合には、複合体は、同時に提供されるか（例えば、２つのポリペプチド及び／または核酸として）、または同時に送達され得る。あるいは、それらは連続して提供されてもよく、例えば、標的化複合体が最初に提供され、続いて第２の標的化複合体が提供される等、またはその逆も同様である。
標的細胞へのＤＮＡベクターの送達を改善するために、ＤＮＡは、例えば、リポプレックス及びポリプレックスを使用することによって促進される損傷及びその細胞への侵入から保護され得る。したがって、場合によっては、本開示の核酸（例えば、本開示の組み換え発現ベクター）は、ミセルまたはリポソームのような組織的構造において脂質で被覆され得る。組織的構造がＤＮＡと複合体化される場合、それはリポプレックスと呼ばれる。アニオン性（負荷電）、中性、またはカチオン性（正荷電）の、３種類の脂質が存在する。カチオン性脂質を利用するリポプレックスは、遺伝子導入に対する有用性が証明されている。カチオン性脂質は、それらの正電荷により、負荷電ＤＮＡと天然に複合体化する。また、それらの電荷の結果として、それらは細胞膜と相互作用する。次いで、リポプレックスのエンドサイトーシスが起こり、ＤＮＡが細胞質中に放出される。カチオン性脂質は、細胞によるＤＮＡの分解を保護する。
ポリマーとＤＮＡとの複合体は、ポリプレックスと呼ばれる。ほとんどのポリプレックスは、カチオン性ポリマーからなり、それらの産生はイオンの相互作用によって調節される。ポリプレックスとリポプレックスの作用方法の１つの大きな相違は、ポリプレックスが、それらのＤＮＡ負荷を細胞質中に放出できないことであり、このため、不活性化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤との同時形質移入（エンドサイトーシス中に作製されるエンドソームを溶解する）が必ず起こる。しかしながら、これは常にそうであるとは限らず、ポリエチレンイミンなどのポリマーは、キトサン及びトリメチルキトサンと同様に、それら独自のエンドソーム崩壊方法を有する。
また、球形状を有する高度に分岐した高分子であるデンドリマーを使用して、幹細胞を遺伝子改変することもできる。デンドリマー粒子の表面を官能化して、その特性を変化させてもよい。特に、カチオン性デンドリマー（すなわち、正の表面電荷を有するもの）を構築することが可能である。ＤＮＡプラスミドなどの遺伝子材料の存在下にある場合、電荷相補性は、核酸とカチオン性デンドリマーとの一時的会合をもたらす。その目的地に到達したとき、デンドリマー－核酸複合体は、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ得る。
場合によっては、本開示の核酸（例えば、発現ベクター）は、関心対象のガイド配列のための挿入部位を含む。例えば、核酸は、関心対象のガイド配列のための挿入部位を含むことができ、挿入部位は、ガイド配列が変化して所望の標的配列にハイブリダイズしても変化しないＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列のすぐ隣にある（例えば、ガイドＲＮＡのＣａｓ１２Ｊ結合態様に寄与する配列、例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖（複数可）に寄与する配列であり、ガイドＲＮＡのこの部分はまた、ガイドＲＮＡの「足場」または「定常領域」とも称され得る）。したがって、場合によっては、対象の核酸（例えば、発現ベクター）は、ガイドＲＮＡのガイド配列部分をコードする部分が挿入配列（挿入部位）であることを除いて、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。挿入部位は、所望の配列の挿入のために使用される任意のヌクレオチド配列である。様々な技法で使用するための「挿入部位」は、当業者に既知であり、任意の簡便な挿入部位を使用することができる。挿入部位は、核酸配列を操作するための任意の方法のためのものであり得る。例えば、場合によっては、挿入部位は、複数クローニング部位（ＭＣＳ）（例えば、１つ以上の制限酵素認識配列を含む部位）、ライゲーション非依存性クローニングのための部位、組み換えに基づくクローニングのための部位（例えば、ａｔｔ部位に基づく組み換え）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）に基づく技術によって認識されるヌクレオチド配列等である。
挿入部位は、任意の所望の長さであってよく、挿入部位の種類に依存し得る（例えば、その部位が１つ以上の制限酵素認識配列を含むかどうか（またその数）、その部位がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に対する標的部位を含むかどうか等に依存し得る）。場合によっては、対象の核酸の挿入部位は、３以上のヌクレオチド（ｎｔ）長（例えば、５以上、８以上、１０以上、１５以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、もしくは２５以上、または３０以上のｎｔ長）である。場合によっては、対象の核酸の挿入部位の長さは、２～５０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、２～４０ｎｔ、２～３０ｎｔ、２～２５ｎｔ、２～２０ｎｔ、５～５０ｎｔ、５～４０ｎｔ、５～３０ｎｔ、５～２５ｎｔ、５～２０ｎｔ、１０～５０ｎｔ、１０～４０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１０～２０ｎｔ、１７～５０ｎｔ、１７～４０ｎｔ、１７～３０ｎｔ、１７～２５ｎｔ）の範囲の長さを有する。場合によっては、対象の核酸の挿入部位の長さは、５～４０ｎｔの範囲の長さを有する。
核酸の改変
いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ）は、核酸に新たなまたは強化された特徴（例えば、改善された安定性）を提供するために、１つ以上の改変、例えば、塩基修飾、骨格修飾等を有する。ヌクレオシドは塩基－糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分と連結し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、線状ポリマー化合物を形成する。次に、この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端は、さらに接合して環状化合物を形成することができるが、線状化合物が好適である。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得るため、完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を産生するような方法で折り畳むことができる。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成していると見なされている。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結または骨格は、３′～５′ホスホジエステル連結である。
好適な核酸修飾としては、２′Ｏメチル修飾ヌクレオチド、２′フルオロ修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート連結を有するヌクレオチド、及び５′キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる詳細及び追加の修飾は、以下に記載される。
２′－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（２′－Ｏ－メチルＲＮＡとも称される）は、ｔＲＮＡ中に見出されるＲＮＡ及び転写後修飾として生じる他の小分子ＲＮＡの天然型修飾である。２′－Ｏ－メチルＲＮＡを含有するオリゴヌクレオチドは、直接合成することができる。この修飾は、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＴｍを増加させるが、ＲＮＡ：ＤＮＡ安定性においてはわずかな変化をもたらすにすぎない。これは一本鎖リボヌクレアーゼによる攻撃に対して安定しており、典型的にはＤＮＡよりもＤＮａｓｅの影響を５～１０倍受けにくい。これは一般に、標的メッセージに対する安定性及び結合親和性を増加させる手段として、アンチセンスオリゴにおいて使用される。
２′フルオロ修飾ヌクレオチド（例えば、２′フルオロ塩基）は、結合親和性（Ｔｍ）を増加させ、また天然のＲＮＡと比較したときに、いくらかの相対的ヌクレアーゼ耐性も付与する、フルオリン修飾リボースを有する。これらの修飾は、一般に、血清または他の生物流体中の安定性を改善するために、リボザイム及びｓｉＲＮＡにおいて用いられる。
ＬＮＡ塩基は、ＲＮＡ Ａ型ヘリックス二重鎖幾何形状を好む、Ｃ３′末端位置にある塩基をロックするリボース骨格に対する修飾を有する。この修飾は、Ｔｍを有意に増加させ、また非常にヌクレアーゼ耐性がある。複数のＬＮＡ挿入は、３′末端を除く任意の位置にあるオリゴに配置することができる。アンチセンスオリゴからＳＮＰ検出及び対立遺伝子特異的ＰＣＲに対するハイブリダイゼーションプローブに及ぶ用途が記載されている。ＬＮＡによって付与されるＴｍの大幅な増加に起因して、それらはまた、プライマー二量体形成ならびに自己ヘアピン形成の増加も引き起こすことができる。場合によっては、単一のオリゴに組み込まれるＬＮＡの数は、１０塩基以下である。
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合（すなわち、ホスホロチオエート連結）は、核酸（例えば、オリゴ）のリン酸骨格中の非架橋酸素の代わりに、硫黄原子を用いる。この修飾は、ヌクレアーゼ変性に対する耐性をヌクレオチド間連結に付与する。ホスホロチオエート結合は、エキソヌクレアーゼ変性を阻害するために、オリゴの５′または３′末端における最後の３～５ヌクレオチド間に導入することができる。ホスホロチオエート結合をオリゴ内（例えば、オリゴ全体を通して）に含めることは、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減することにも役立つ。
いくつかの実施形態では、対象の核酸は、２′－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである１つ以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、１つ以上の２′フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、１つ以上のＬＮＡ塩基を有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、ホスホロチオエート結合によって連結している１つ以上のヌクレオチドを有する（すなわち、対象の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート連結を有する）。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、５′キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））を有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、修飾ヌクレオチドの組み合わせを有する。例えば、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、他の修飾（例えば、２′－Ｏ－メチルヌクレオチド及び／または２′フルオロ修飾ヌクレオチド及び／またはＬＮＡ塩基及び／またはホスホロチオエート連結）を有する１つ以上のヌクレオチドを有することに加えて、５′キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））を有することができる。
修飾骨格及び修飾ヌクレオシド間連結
修飾を含有する好適な核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ）の例としては、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含有する核酸が挙げられる。修飾骨格を有する核酸は、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有しないものを含む。
リン酸原子を中に含有する好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３′－アルキレンホスホネート、５′－アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミダート（３′－アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、ホスホロジアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び通常３′－５′連結を有するボラノホスフェート、それらの２′－５′連結類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間連結が、３′－３′、５′－５′、または２′－２′連結である、反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、３′最端ヌクレオチド間連結において単一の３′－３′連結を含む、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を含む（核酸塩基が欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩、及び遊離酸形態もまた含まれる。
いくつかの実施形態では、対象の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、特に－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、及び－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む（天然のホスホジエステルヌクレオチド間連結は、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ２－として表される）。ＭＭＩ型ヌクレオシド間連結は、上記で参照された米国特許第５，４８９，６７７号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好適なアミドヌクレオシド間連結は、米国特許第５，６０２，２４０号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、米国特許第５，０３４，５０６号で記載されるような、モルホリノ骨格構造を有する核酸もまた好適である。例えば、いくつかの実施形態では、対象の核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結に置き換わる。
リン原子を中に含まない好適な修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分からの部分において形成される）を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
模倣物
対象の核酸は、核酸模倣物であり得る。「模倣物」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみまたはフラノース環及びヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられ、フラノース環のみの置換はまた、当該技術分野において代理糖であると称される。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのような核酸、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含有するアミドで置き換えられる。ヌクレオチドは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合する。
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告された１つのポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位である。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を記載する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号（それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
研究されているポリヌクレオチド模倣物の別のクラスは、モルホリノ環に結合された複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体単位を連結する、いくつかの連結基が報告されている。連結基の１つのクラスを選択して、非イオン性オリゴマー化合物を得た。非イオン性モルホリノベースのオリゴマー化合物が、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を有する可能性は低い。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物である（Ｄｗａｉｎｅ Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３－４５１０）。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。単量体サブユニットを接合する様々な異なる連結基を有する、ポリヌクレオチドのモルホリノクラス内の様々な化合物が調製されている。
ポリヌクレオチド模倣物のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置き換えられる。ＣｅＮＡ ＤＭＴ保護ホスホルアミダイト単量体が調製され、古典的ホスホルアミダイト化学に従うオリゴマー化合物合成のために使用されている。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物及びＣｅＮＡで修飾された特定の位置を有するオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５－８６０２（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡ単量体の組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのその安定性を増加させる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に対する同様の安定性を有するＲＮＡ及びＤＮＡ相補体との複合体を形成した。ＣｅＮＡ構造を天然の核酸構造に組み込む研究は、ＮＭＲ及び円二色性によって示され、容易な立体構造適応とともに進められた。
さらなる改変は、２′－ヒドロキシル基が糖環の４′炭素原子と連結し、それによって２′－Ｃ、４′－Ｃ－オキシメチレン連結を形成し、それによって二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。連結は、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ２－）基であり得、式中、ｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５－４５６、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３～＋１０℃）、３’－エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、ならびに良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３－５６３８、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
オリゴマー化及び核酸認識特性とともに、ＬＮＡ単量体のアデニン、シトシン、グアニン、５－メチル－シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製が記載されている（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７－３６３０、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＮＡ及びその調製物はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６、ならびに米国出願第２０１２／０１６５５１４号、同第２０１０／０２１６９８３号、同第２００９／００４１８０９号、同第２００６／０１１７４１０号、同第２００４／００１４９５９号、同第２００２／００９４５５５号、及び同第２００２／００８６９９８号に記載されており、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
修飾糖部分
対象の核酸はまた、１つ以上の置換された糖部分も含むことができる。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルから選択される糖置換基を含み、それらのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ．ｓｕｂ．１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が特に好適であり、ｎ及びｍは、１～約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の下記の実施例において説明される、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では、２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
他の好適な糖置換基としては、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－－Ｏ－－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、及びフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’－糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってもよい。好適な２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物上の他の位置で、特に３′末端ヌクレオシド上のまたは２′－５′連結オリゴヌクレオチド内の糖の３′位、及び５′末端ヌクレオチドの５′位でなされもよい。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
塩基修飾及び置換
対象の核酸はまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシル及びシトシンならびに他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３′，２′：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）が挙げられる。
複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、及び２－ピリドンで置換されるものも含まれ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９－３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられ、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの核酸塩基の一部は、オリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、例えば、２′－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされたとき、好適な塩基置換である。
コンジュゲート
対象の核酸の別の可能な改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上させる１つ以上の部分またはコンジュゲートを、ポリヌクレオチドと化学的に連結することを伴う。このような部分またはコンジュゲートは、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基と共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物力学特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。薬力学的特性を向上させる基としては、取り込みを改善する、分解に対する耐性を向上させる、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を向上させる基としては、対象の核酸の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が挙げられる。
コンジュゲート部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７－３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３－９３７）などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。
コンジュゲートは、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ－細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含んでよく、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指し得る。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子及び／またはナノ粒子に付着したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、またはサイトゾルから細胞小器官（例えば、核）内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリヌクレオチドの３′末端と共有結合している。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリヌクレオチドの５′末端と共有結合している。例示的なＰＴＤとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６４）を含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応する）；細胞中への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号６５）；トランスポータン
Figure 0007239725000076
が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、
Figure 0007239725000077
、３アルギニン残基～５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、
Figure 0007239725000078
のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これは正味電荷をほぼ０に低減し、それによって細胞への付着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその本来の付着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断するようにする。
標的細胞への構成要素の導入
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／または本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／または本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド（もしくは本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはドナーポリヌクレオチド（ドナー鋳型）は、様々な周知の方法のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得る。
様々な化合物及び方法のいずれかを使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊシステム（例えば、Ｃａｓ１２Ｊシステムが、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｂ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｃ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｄ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｅ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｆ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｇ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｈ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｊ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｋ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｌ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｍ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え発現ベクター、ｎ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナー鋳型核酸、ｏ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ｐ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ならびにドナー鋳型核酸、ｑ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、もしくはｒ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、または（ａ）～（ｒ）のうちの１つのある変形を含む）を標的細胞に送達することができる。非限定的な例としては、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムは、脂質と組み合わせることができる。別の非限定的な例としては、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムは、粒子と組み合わせることができるか、または粒子に配合することができる。
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、対象の核酸（例えば、発現構築物／ベクター）を標的細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞等）に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、コンジュゲート、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）等が挙げられる。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクター等）として提供される。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、タンパク質として（例えば、関連ガイドＲＮＡなしで、または関連ガイドＲＮＡとともに、すなわち、リボ核タンパク質複合体として）直接提供される。本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、任意の簡便な方法によって細胞に導入する（細胞に提供する）ことができ、そのような方法は、当業者に既知である。例示的な例として、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、細胞内に直接注入することができる（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡまたはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする核酸の有無にかかわらず、及びドナーポリヌクレオチドの有無にかかわらず）。別の例としては、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドとＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）との予め形成された複合体は、細胞（例えば、真核細胞）に導入することができる（例えば、注入を介して、ヌクレオフェクションを介して、１つ以上の構成要素とコンジュゲートした、例えば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質とコンジュゲートした、ガイドＲＮＡとコンジュゲートした、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びガイドＲＮＡとコンジュゲートした、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を介して等）。
場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド（例えば、融合パートナーに融合されたｄＣａｓ１２Ｊ、融合パートナーに融合されたニッカーゼＣａｓ１２Ｊ等）は、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクター等）として提供される。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、タンパク質として（例えば、関連ガイドＲＮＡなしで、または関連ガイドＲＮＡとともに、すなわち、リボ核タンパク質複合体として）直接提供される。本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、任意の簡便な方法によって細胞に導入する（細胞に提供する）ことができ、そのような方法は、当業者に既知である。例示的な例として、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、細胞内に（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする核酸を伴い、または伴わず、及びドナーポリヌクレオチドを伴い、または伴わず）直接注入することができる。別の例としては、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドとＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）との予め形成された複合体は、（例えば、注入を介して、ヌクレオフェクションを介して、１つ以上の構成要素とコンジュゲートした、例えば、Ｃａｓ１２Ｊ融合タンパク質とコンジュゲートした、ガイドＲＮＡとコンジュゲートした、本開示のＣａｓ１２Ｊ癒合ポリペプチド及びガイドＲＮＡとコンジュゲートした、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を介して等）細胞に導入することができる。
場合によっては、核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）は、細胞（例えば、標的宿主細胞）及び／またはポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド）に粒子中で送達されるか、または粒子と会合される。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムは、粒子中の細胞に送達されるか、または粒子と会合される。「粒子」及び「ナノ粒子」という用語は、適切である場合、互換的に使用することができる。本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及び／またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、例えば、複合体（例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体）として、粒子、例えば、脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー、例えば、カチオン性脂質及び親水性ポリマーを含む送達粒子を介して送達され得、例えば、カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）もしくは１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含み、及び／または親水性ポリマーは、エチレングリコールもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、及び／または粒子は、コレステロールをさらに含む（例えば、配合物１からの粒子＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール０；配合物番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール０；配合物番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール５）。例えば、粒子は、多段階プロセスを使用して形成することができ、ここでＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、例えば、１：１モル比で、例えば、室温で、例えば、３０分間にわたって、例えば、無菌のヌクレアーゼ不含の１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で一緒に混合され、別個に、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールを、配合物に適用できるようにアルコール、例えば、１００％のエタノールに溶解し、これら２つの溶液を一緒に混合して、複合体を含有する粒子を形成する。
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド（もしくは本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、または本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター）及び／またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（もしくはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現ベクターなどの核酸）は、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、リン脂質二層シェルによって封入されたポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子を使用することができる。場合によっては、自己集合生体付着性ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が使用され、そのような粒子／ナノ粒子は、例えば、脳へのペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用され得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達などの他の実施形態もまた企図される。保護され、疾患の部位に送達される操作されたポリマーエンベロープを必要とする分子エンベロープ技術を使用することができる。約５ｍｇ／ｋｇの用量は、様々な因子、例えば、標的組織に応じて、単一または複数の用量で使用され得る。
リピドイド化合物（例えば、米国特許出願第２０１１／０２９３７０３号に記載される）は、ポリヌクレオチドの投与にも有用であり、それを使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステム（例えば、Ｃａｓ１２Ｊシステムが、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｂ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｃ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｄ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｅ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｆ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｇ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｈ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｊ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列、ｋ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｌ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｍ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え発現ベクター、ｎ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナー鋳型核酸、ｏ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ｐ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ならびにドナー鋳型核酸、ｑ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、もしくはｒ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、または（ａ）～（ｒ）のうちの１つのある変形を含む）を送達することができる。一態様では、アミノアルコールリピドイド化合物は、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて、粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子は、任意選択で、薬学的賦形剤と組み合わされて、医薬組成物を形成することができる。
ポリ（ベータ－アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。米国特許公開第２０１３／０３０２４０１号は、コンビナトリアル重合を使用して調製されているポリ（ベータ－アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。
糖系粒子、例えば、ＧａｌＮＡｃは、ＷＯ２０１４／１１８２７２（参照により本明細書に組み込まれる）及びＮａｉｒ，Ｊ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３６（４９），１６９５８－１６９６１）を参照して説明されるように使用することができ、それを使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。
場合によっては、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する。ＲＮＡなどの負荷電ポリマーは、ＬＮＰ中に低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）で負荷され得、イオン化脂質は、正電荷を示す。しかしながら、生理学的ｐＨ値において、ＬＮＰは、より長い循環時間に対応した低表面電荷を示す。４種のイオン化カチオン脂質、すなわち１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）に焦点が当てられている。ＬＮＰの調製は、例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：１２８６－－２２００）に記載されている。カチオン性脂質１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２’‘－（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、及びＲ－３－［（．オメガ．－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリストイルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）を使用してもよい。核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、本開示の核酸等）は、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを（カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧを４０：１０：４０：１０モル比で）含有するＬＮＰにカプセル化され得る。場合によっては、０．２％のＳＰ－ＤｉＯＣ１８が組み込まれる。
球形核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４－９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８－３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２－６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６－１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７－７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５－８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５－６３８、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８－１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４－Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５－７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６－１９２を参照されたい。
ＲＮＡを有する自己集合ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合されたＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で構築され得る。
一般に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適なナノ粒子は、５００ｎｍ以下、例えば、２５ｎｍ～３５ｎｍ、３５ｎｍ～５０ｎｍ、５０ｎｍ～７５ｎｍ、７５ｎｍ～１００ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、２００ｎｍ～３００ｎｍ、３００ｎｍ～４００ｎｍ、または４００ｎｍ～５００ｎｍの直径を有する。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適なナノ粒子は、２５ｎｍ～２００ｎｍの直径を有する。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適なナノ粒子は、１００ｎｍ以下の直径を有する。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適なナノ粒子は、３５ｎｍ～６０ｎｍの直径を有する。
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適なナノ粒子は、異なる形態で、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはそれらの組み合わせで提供され得る。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、ならびにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）が調製され得る。半導体材料で作製されたナノ粒子はまた、それらが電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい場合（典型的に、１０ｎｍ以下）、標識化量子ドットであり得る。そのようなナノ粒子は、薬剤担体または造影剤などの生物医学的用途に使用され、本開示において同様の目的に適合させることができる。
半固体かつ軟質のナノ粒子はまた、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適である。半固体性質のプロトタイプナノ粒子は、リポソームである。
場合によっては、エキソソームを使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる、内因性ナノベシクルである。
場合によっては、リポソームを使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達する。リポソームは内部水性区画を取り囲む単層または多層脂質二層、及び比較的不透過性の外側親油性リン脂質二層で構成される球形ベシクル構造である。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から作製され得るが、リポソームを生成するために、リン脂質が最も一般に使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されたときに自然に起こるが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出装置を使用することによる振盪の形態で力を適用することによって促進することができる。それらの構造及び特性を改変するために、いくつかの他の添加剤がリポソームに添加されてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソーム内部カーゴの漏出を防止するために、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかがリポソーム混合物に添加されてもよい。リポソーム配合物は、主に、天然のリン脂質、ならびに１，２－ジステアロリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドなどの脂質で構成され得る。
安定した核酸－脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。ＳＮＡＬＰ配合物は、脂質３－Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリストイルオキシ－プロピルアミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを、２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含有し得る。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと配合することによって、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡを使用して調製され得る。結果として得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０～１００ｎｍのサイズであり得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．，ＵＳＡ）、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリストイルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、及び１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る。
アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。以下の脂質組成物、アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ－脂質）をそれぞれ４０／１０／４０／１０モル比、及びおよそ０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比で有する予め形成されたベシクルが企図され得る。７０～９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数を確実にするために、粒子は、ガイドＲＮＡを付加する前に８０ｎｍ膜を通して最大３回押し出され得る。非常に強力なアミノ脂質１６を含有する粒子が使用されてもよく、脂質構成要素１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－脂質（５０／１０／３８．５／１．５）の４つのモル比は、インビボ活性を増強するようにさらに最適化され得る。
脂質は、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムもしくはその構成要素（複数可）またはそれをコードする核酸と配合され、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。好適な脂質としては、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールが挙げられるが、これらに限定されず、ＰＥＧ－ＤＭＧは、自発的なベシクル形成手順を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムまたはその構成要素と配合され得る。構成要素モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）であり得る。
本開示のＣａｓ１２Ｊシステムまたはその構成要素は、米国公開出願第２０１３／０２５２２８１号及び同第２０１３／０２４５１０７号及び同第２０１３／０２４４２７９号にさらに記載されるように、ＰＬＧＡ微小球にカプセル化されて送達され得る。
超荷電タンパク質を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。超荷電タンパク質は、異常に高い正または負の正味理論的電荷を有する操作されたまたは天然型タンパク質のクラスである。超負荷電及び超正荷電のタンパク質の両方は、熱的または化学的に誘導された凝集に耐える能力を示す。超正荷電タンパク質はまた、哺乳動物細胞を透過することができる。カーゴをこれらのタンパク質、例えば、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質と会合させることは、インビトロ及びインビボの両方で、哺乳動物細胞へのこれらの高分子の機能的送達を可能にすることができる。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞に送達することができる。ＣＰＰは、典型的に、リジンもしくはアルギニンなどの高い相対的存在量の正荷電アミノ酸を含有するか、または極性／荷電アミノ酸及び非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成物を有する。
埋め込み型デバイスを使用して、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする核酸、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする核酸、ドナー鋳型等）、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞（例えば、インビボの標的細胞、標的細胞は、循環中の標的細胞、組織中の標的細胞、器官内の標的細胞等である）に送達することができる。本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを標的細胞（例えば、インビボの標的細胞、標的細胞は、循環中の標的細胞、組織中の標的細胞、器官内の標的細胞等である）に送達する際に使用するのに好適な埋め込み型デバイスとしては、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、ＲＮＰ、またはＣａｓ１２Ｊシステム（もしくはその構成要素、例えば、本開示の核酸）を含む容器（例えば、リザーバ、マトリックス等）を挙げることができる。
好適な埋め込み型デバイスは、例えば、デバイス本体として使用されるマトリックスなどのポリマー基質、及び場合によっては、金属または追加のポリマーなどの追加の足場材料、ならびに可視性及び撮像を向上させる材料を含み得る。埋め込み型送達デバイスは、局所的かつ長期間にわたる放出を提供する際に有利であり得、送達されるポリペプチド及び／または核酸は、標的部位、例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、腫瘍を取り囲む血管系、罹患組織等に直接放出される。好適な埋め込み型送達デバイスとしては、腹腔などの空洞への送達及び／または薬物送達系が係留もしくは取り付けられていない任意の他の種類の投与における使用に好適なデバイスが挙げられ、生安定性及び／または生分解性及び／または生体吸収性ポリマー基質（例えば、任意選択でマトリックスであり得る）を含む。場合によっては、好適な埋め込み型薬物送達デバイスは、分解性ポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食である。場合によっては、好適な埋め込み型薬物送達デバイスは、非分解性または分解の遅いポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食ではなく拡散であり、それにより外側部分は膜として機能し、その内側部分は、薬物リザーバとして機能し、これは実際には長期間（例えば、約１週間～約数ヶ月間）にわたって周囲に影響されない。異なる放出機序を有する異なるポリマーの組み合わせを、任意選択で使用してもよい。濃度勾配は、総放出期間の有意な期間中、効果的に一定に維持され得るため、拡散速度は効果的に一定である（「ゼロモード」拡散と称される）。「一定」という用語は、治療効果の低い閾値より上で維持されるが、依然として任意選択で初期バーストを特徴とし得る、及び／または変動し得る（例えば、ある特定の程度に増加及び減少する）拡散速度を意味する。拡散速度は、長期間にわたってそのように維持することができ、治療有効期間、例えば、有効サイレンシング期間を最適化するために、ある特定のレベルで一定であると見なすことができる。
場合によっては、埋め込み型送達系は、化学的性質か、または対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃に起因して、ヌクレオチドベースの治療剤を分解から遮断するように設計される。
デバイスの埋め込みのための部位、または標的部位を、最大治療効果のために選択することができる。例えば、送達デバイスは、腫瘍環境または腫瘍に関連した血液供給内、またはその近位に埋め込むことができる。標的位置は、例えば、１）基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病またはアルツハイマー病のような変性部位での脳、２）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎、３）子宮頸部、４）活性及び慢性炎症性関節、５）乾癬の場合のような真皮、７）鎮痛効果のための交感及び感覚神経部位、７）骨、８）急性または慢性感染の部位、９）膣内、１０）内耳－聴覚系、内耳の膜迷路、前庭系、１１）気管内、１２）心臓内、環状部、心外膜、１３）尿路または膀胱、１４）胆道系、１５）腎臓、肝臓、脾臓を含むが、これらに限定されない実質組織、１６）リンパ節、１７）唾液腺、１８）歯肉、１９）関節内（関節中）、２０）眼内、２１）脳組織、２２）脳室、２３）腹腔を含む空洞（例えば、限定されないが、卵巣癌の場合）、２４）食道内、及び２５）直腸内、ならびに２６）血管系中であり得る。
埋め込みなどの挿入の方法は、任意選択で、他の種類の組織埋め込みのため、及び／または挿入のため、及び／または組織サンプリングのため、任意選択で修正なしに、あるいは任意選択でそのような方法において主要でない修正のみで、既に使用されている場合がある。そのような方法としては、任意選択で、近接照射療法、生検、超音波を伴う及び／または伴わない内視鏡検査、例えば、脳組織への定位放射線法、関節、腹部器官、膀胱壁、及び体腔中への腹腔鏡の埋め込みを含む腹腔鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。
改変された宿主細胞
本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及び／または本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、改変された細胞を提供する。本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドを含む改変された細胞を提供し、改変された細胞は、通常は本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドを含まない細胞である。本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、改変された細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）を提供する。本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡで遺伝子改変される、遺伝子改変された細胞を提供する。本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子改変される、遺伝子改変された細胞を提供する。本開示は、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）本開示のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子改変される、遺伝子改変された細胞を提供する。本開示は、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｂ）本開示のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｃ）ドナー鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子改変される、遺伝子改変された細胞を提供する。
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及び／または本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸及び／または本開示のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡのレシピエントとして機能する細胞は、例えば、インビトロ細胞、インビボ細胞、エクスビボ細胞、一次細胞、がん細胞、動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞等を含む様々な細胞のうちのいずれかであり得る。本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及び／または本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸及び／または本開示のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡのレシピエントとして機能する細胞は、「宿主細胞」または「標的細胞」と称される。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムのレシピエントであり得る。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓ１２Ｊ ＲＮＰのレシピエントであり得る。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓ１２Ｊシステムの単一構成要素のレシピエントであり得る。
細胞（標的細胞）の非限定的な例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類、蘚類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞）、藻類細胞（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・レインハルドチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッサム・パテンス（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．アガード（Ｃ．ａｇａｒｄｈ）等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、マッシュルーム由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。場合によっては、細胞は、天然の生物に由来しない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得、人工細胞とも称される）。
細胞は、インビトロ細胞（例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体由来の培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体内の細胞）であり得る。細胞は、単離された細胞であり得る。細胞は、生物の内部の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。細胞は、細胞培養内の細胞（例えば、インビトロ細胞培養）であり得る。細胞は、細胞の集団のうちの１つであり得る。細胞は、原核細胞であり得るか、または原核細胞に由来し得る。細胞は、細菌細胞であり得るか、または細菌細胞に由来し得る。細胞は、古細菌細胞であり得るか、または古細菌細胞に由来し得る。細胞は、真核細胞であり得るか、または真核細胞に由来し得る。細胞は、植物細胞であり得るか、または植物細胞に由来し得る。細胞は、動物細胞であり得るか、または動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物に由来し得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得るか、または哺乳動物細胞に由来し得る。細胞は、齧歯類細胞であり得るか、または齧歯類細胞に由来し得る。細胞は、ヒト細胞であり得るか、またはヒト細胞に由来し得る。細胞は、微生物細胞であり得るか、または微生物細胞に由来し得る。細胞は、真菌細胞であり得るか、または真菌細胞に由来し得る。細胞は、昆虫細胞であり得る。細胞は、節足動物細胞であり得る。細胞は、原生動物細胞である得る。細胞は、蠕虫細胞であり得る。
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
場合によっては、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。場合によっては、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。場合によっては、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
場合によっては、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞とも称される。
成体幹細胞は、分化組織中に常駐するが、自己再生の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例は、当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉幹細胞、内皮幹細胞、嗅覚幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。場合によっては、幹細胞は、ヒト幹細胞である。場合によっては、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。場合によっては、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３－として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球－マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統をインビボで再配置させることができる。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己再生細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。したがって、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球様細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
他の場合では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化することが可能である。神経幹細胞は、多分裂が可能である多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように傾倒した細胞を産生することができる。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において既知である。
他の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されたＭＳＣは、分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の既知の方法を使用して、ＭＳＣを得ることができる。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
細胞は、場合によっては、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であり得る。細胞は、双子葉植物の細胞であり得る。
場合によっては、細胞は、植物細胞である。例えば、細胞は、主要な農業植物、例えば、大麦、豆（乾燥食用）、キャノーラ、トウモロコシ、綿（ピマ）、綿（陸地）、アマニ、乾草（アルファルファ）、乾草（非アルファルファ）、オート麦、ラッカセイ、米、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ（油）、ヒマワリ（非油）、サツマイモ、タバコ（バーレー）、タバコ（黄色種）、トマト、小麦（デュラム）、小麦（春）、小麦（冬）等の細胞であり得る。別の例としては、細胞は、例えば、アルファルファスプラウト、アロエの葉、クズウコン、オモダカ、アーティチョーク、アスパラガス、筍、バナナの花、豆もやし、豆、ビーツの葉茎、ビーツ、ゴーヤ、チンゲンサイ、ブロッコリー、ブロッコリーレイブ（ラピーニ）、芽キャベツ、キャベツ、キャベツスプラウト、カクタスリーフ（ノパル）、カボチャ、カルドン、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハヤトウリ、チョロギ（クローヌ）、ハクサイ、キンサイ、ニラ、サイシン、シュンギク（ｔｕｎｇ ｈｏ）、カラードグリーン、トウモロコシの茎、スイートコーン、キュウリ、ダイコン、食用タンポポの葉、タロイモ、豆苗（エンドウの葉）、トウキ（冬瓜）、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ゼンマイ、グンバイナズナ、フリゼ、カラシナ（チャイニーズマスタード）、カイラン、ガランガル（サイアム、タイ生ショウガ）、ニンニク、ショウガ、ゴボウ、グリーン、ハノーバーサラダグリーン、ウアウソントレ、エルサレムアーティチョーク、ヒカマ、ケールグリーン、コールラビ、アカザ（クェライト）、レタス（ビッブ）、レタス（ボストン）、レタス（ボストンレッド）、レタス（グリーンリーフ）、レタス（アイスバーグ）、レタス（サニーレタス）、レタス（オークリーフ・グリーン）、レタス（オークリーフ・レッド）、レタス（加工）、レタス（レッドリーフ）、レタス（ロメイン）、レタス（ルビーロメイン）、レタス（ロシアンレッドマスタード）、ｌｉｎｋｏｋ、ロボック、ササゲ、レンコン、マーシュ、マゲイ（アガベ）リーフ、ヤムイモ、メスクランミックス、水菜、ｍｏａｐ（ヘチマ）、ｍｏｏ、モクア（ファジースクオッシュ）、マッシュルーム、マスタード、長芋、オクラ、空芯菜、ネギ、ｏｐｏ（ロングスクオッシュ）、装飾トウモロコシ、装飾ヒョウタン、パセリ、パースニップ、豆、トウガラシ（ベルタイプ）、トウガラシ、カボチャ、ラディッキオ、ラディッシュの芽、ラディッシュ、レイプグリーン、レイプグリーン、ルバーブ、ロメイン（ベビーレッド）、ルタバガ、アッケシソウ（シービーン）、ヘチマ（トカド／トカドヘチマ）、ホウレンソウ、スクオッシュ、ストローベイル、サトウキビ、サツマイモ、スイスチャード、タマリンド、タロ、タロの葉、タロの芽、ターサイ、ｔｅｐｅｇｕａｊｅ（ギンネム）、ティンドラ、トマティーヨ、トマト、トマト（チェリー）、トマト（グレープタイプ）、トマト（プラムタイプ）、ターメリック、カブの葉、カブ、ヒシの実、ｙａｍｐｉ、ヤム（ｎａｍｅｓ）、アブラナ、ユカ（キャッサバ）等を含むが、これらに限定されない野菜作物の細胞である。
場合によっては、植物細胞は、葉、幹、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、鞘、胚、胚乳、外植片、カルス、または苗条などの植物構成要素の細胞である。
細胞は、場合によっては、節足動物細胞である。例えば、細胞は、例えば、きょう角類（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）、多足類（Ｍｙｒｉａｐｏｄｉａ）、六脚類（Ｈｅｘｉｐｏｄｉａ）、クモ類（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）、昆虫類（Ｉｎｓｅｃｔａ）、イシノミ目（Ａｒｃｈａｅｏｇｎａｔｈａ）、シミ類（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）、旧翅下綱（Ｐａｌａｅｏｐｔｅｒａ）、カゲロウ類（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ）、トンボ類（Ｏｄｏｎａｔａ）、不均翅亜目（Ａｎｉｓｏｐｔｅｒａ）、近翅亜目（Ｚｙｇｏｐｔｅｒａ）、新翅類（Ｎｅｏｐｔｅｒａ）、外翅類（Ｅｘｏｐｔｅｒｙｇｏｔａ）、カワゲラ類（Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）、シロアリモドキ目（Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ）、直翅類（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、絶翅目（Ｚｏｒａｐｔｅｒａ）、ハサミムシ類（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、網翅類（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、ガロアムシ目（Ｎｏｔｏｐｔｅｒａ）、コオロギモドキ科（Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｔｉｄａｅ）、マントファスマ科（Ｍａｎｔｏｐｈａｓｍａｔｉｄａｅ）、ナナフシ（Ｐｈａｓｍａｔｏｄｅａ）、ゴキブリ（Ｂｌａｔｔａｒｉａ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、カマキリ類（Ｍａｎｔｏｄｅａ）、パラプネウロプテラ（Ｐａｒａｐｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、チャタテムシ類（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）、アザミウマ類（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、内翅類（Ｅｎｄｏｐｔｅｒｙｇｏｔａ）もしくは完全変態類（Ｈｏｌｏｍｅｔａｂｏｌａ）、膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、ネジレバネ目（Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ）、ラフィディオプテラ（Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｔｅｒａ）、広翅亜目（Ｍｅｇａｌｏｐｔｅｒａ）、脈翅目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、シリアゲムシ目（Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ）、ノミ類（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）、トビケラ類（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）、または鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）である亜目、科、亜科、群、下位群、または種の細胞であり得る。
細胞は、場合によっては、昆虫動物細胞である。例えば、場合によっては、細胞は、蚊、バッタ、ナンキンムシ、ハエ、ノミ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、シラミ、蛾、または甲虫の細胞である。
キット
本開示は、本開示のＣａｓ１２Ｊシステム、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムの構成要素を含むキットを提供する。
本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｂ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｃ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｄ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｅ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｆ）本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｇ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ｈ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナー鋳型核酸、ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｊ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｋ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｌ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナー鋳型核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、ｍ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え発現ベクター、ｎ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナー鋳型核酸、ｏ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ｐ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、ならびにドナー鋳型核酸、ｑ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、もしくはｒ）本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、または（ａ）～（ｒ）のうちの１つのある変形を含むことができる。
本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊシステムの上述の構成要素、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを含み得る構成要素、ならびにｂ）１つ以上の追加の試薬、例えば、ｉ）緩衝液、ｉｉ）プロテアーゼインヒビター、ｉｉｉ）ヌクレアーゼインヒビター、ｉｖ）検出可能な標識を現像または可視化するために必要な試薬、ｖ）陽性及び／または陰性対照の標的ＤＮＡ、ｖｉ）陽性及び／または陰性対照のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ等を含むことができる。本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊシステムの上述の構成要素、または本開示のＣａｓ１２Ｊシステムを含み得る構成要素、及びｂ）治療剤を含むことができる。
本開示のキットは、ａ）標的核酸中の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入するための挿入部位、及びｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのＣａｓ１２Ｊ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを含むことができる。本開示のキットは、ａ）標的核酸中の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入するための挿入部位、ｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのＣａｓ１２Ｊ結合部分をコードするヌクレオチド配列、及びｃ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを含むことができる。
有用性
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、または本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、様々な方法において（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡと組み合わせて、場合によってはドナー鋳型とさらに組み合わせて）利用される。例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドを使用して、（ｉ）標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖）を改変する（例えば、切断、例えば、ニック、メチル化等）、（ｉｉ）標的核酸の転写を調節する、（ｉｉｉ）標的核酸を標識する、（ｉｖ）標的核酸に（例えば、単離、標識化、撮像、追跡等の目的で）結合する、（ｖ）標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾することができる。したがって、本開示は、標的核酸を改変する方法を提供する。場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的核酸を（ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及び（ｂ）１つ以上（例えば、２つ）のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡと接触させることを含む。場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的核酸を、（ａ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、（ｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及び（ｃ）ドナー核酸（例えば、ドナー鋳型）と接触させることを含む。場合によっては、接触ステップは、インビトロ細胞で実行される。場合によっては、接触ステップは、インビボ細胞で実行される。場合によっては、接触ステップは、エクスビボ細胞で実行される。
Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドを使用する方法は、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドを標的核酸中の特定の領域に（会合したＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡによってそこで標的化されることによって）結合することを含むため、これらの方法は、一般に本明細書において、結合方法（例えば、標的核酸の結合方法）と称される。しかしながら、場合によっては、結合方法は、標的核酸の結合以外は何ももたらさない場合があるが、他の場合では、この方法は、異なる最終結果を有し得る（例えば、この方法は、標的核酸の改変、例えば、切断／メチル化等；標的核酸からの転写の調節；標的核酸の翻訳の調節；ゲノム編集；標的核酸と会合したタンパク質の調節；標的核酸の単離等をもたらし得る）ことを理解されたい。
好適な方法例に関しては、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６－３７、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９－４３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３－８３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８、Ａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３－７１、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７－８０、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６－４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８－３４、Ｅｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２－５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０－９６、Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７－６３、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５－４３、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０－９、Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３－８、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４－５、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０－９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４／００６８７９７号、第２０１４／０１７０７５３号、第２０１４／０１７９００６号、第２０１４／０１７９７７０号、第２０１４／０１８６８４３号、第２０１４／０１８６９１９号、第２０１４／０１８６９５８号、第２０１４／０１８９８９６号、第２０１４／０２２７７８７号、第２０１４／０２３４９７２号、第２０１４／０２４２６６４号、第２０１４／０２４２６９９号、第２０１４／０２４２７００号、第２０１４／０２４２７０２号、第２０１４／０２４８７０２号、第２０１４／０２５６０４６号、第２０１４／０２７３０３７号、第２０１４／０２７３２２６号、第２０１４／０２７３２３０号、第２０１４／０２７３２３１号、第２０１４／０２７３２３２号、第２０１４／０２７３２３３号、第２０１４／０２７３２３４号、第２０１４／０２７３２３５号、第２０１４／０２８７９３８号、第２０１４／０２９５５５６号、第２０１４／０２９５５５７号、第２０１４／０２９８５４７号、第２０１４／０３０４８５３号、第２０１４／０３０９４８７号、第２０１４／０３１０８２８号、第２０１４／０３１０８３０号、第２０１４／０３１５９８５号、第２０１４／０３３５０６３号、第２０１４／０３３５６２０号、第２０１４／０３４２４５６号、第２０１４／０３４２４５７号、第２０１４／０３４２４５８号、第２０１４／０３４９４００号、第２０１４／０３４９４０５号、第２０１４／０３５６８６７号、第２０１４／０３５６９５６号、第２０１４／０３５６９５８号、第２０１４／０３５６９５９号、第２０１４／０３５７５２３号、第２０１４／０３５７５３０号、第２０１４／０３６４３３３号、及び第２０１４／０３７７８６８号（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
例えば、本開示は、標的核酸を切断する方法、標的核酸を編集する方法、標的核酸からの転写を調節する方法、標的核酸を単離する方法、標的核酸を結合する方法、標的核酸を撮像する方法、標的核酸を改変する方法等を提供する（ただし、これらに限定されない）。
本明細書で使用される場合、「標的核酸を接触させる」、及び、例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドと、またはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド等と「標的核酸を接触させる」という用語／表現は、標的核酸を接触させるための全ての方法を包含する。例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、タンパク質、（Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする）ＲＮＡ、または（Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする）ＤＮＡとして細胞に提供され得るが、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得る。したがって、例えば、細胞中（例えば、インビトロで細胞の内部、インビボで細胞の内部、エクスビボで細胞の内部）で方法を行う場合、標的核酸を接触させることを含む方法は、活性／最終状態にある（例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドのタンパク質（複数可）の形態の、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドのタンパク質の形態の、場合によってはガイドＲＮＡのＲＮＡの形態の）任意のまたは全ての構成要素の、細胞への導入を包含し、また、構成要素のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸（例えば、Ｃａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸（複数可）、ガイドＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸（複数可）、ドナー鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）の、細胞への導入を包含する。これらの方法はまた、細胞の外部でインビトロで行うこともできるため、標的核酸を接触させることを含む方法は、（別途特定されない限り）インビトロで細胞の外部、インビトロで細胞の内部、インビボで細胞の内部、エクスビボで細胞の内部等で接触させることを包含する。
場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的細胞に、Ｃａｓ１２Ｊ座位、例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにＣａｓ１２Ｊ座位を含む細胞からのＣａｓ１２Ｊコードヌクレオチド配列を取り囲む約１キロベース（ｋｂ）～５ｋｂの長さのヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み（例えば、場合によっては、その自然状態（それが天然に生じる状態）にある細胞はＣａｓ１２Ｊ座位を含む）、標的細胞は、通常（その自然状態で）Ｃａｓ１２Ｊ座位を含まない。しかしながら、コードされたｃｒＲＮＡ（複数可）のためのガイド配列をコードする１つ以上のスペーサー配列は、１つの以上の関心対象の標的配列が標的化されるように改変され得る。したがって、例えば、場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的細胞にＣａｓ１２Ｊ座位、例えば、供給源細胞から得られた核酸を導入することを含み（例えば、場合によっては、その自然状態（それが天然に生じる状態）にある細胞はＣａｓ１２Ｊ座位を含む）、核酸は、１００ヌクレオチド（ｎｔ）～５ｋｂの長さ（例えば、１００ｎｔ～５００ｎｔ、５００ｎｔ～１ｋｂ、１ｋｂ～１．５ｋｂ、１．５ｋｂ～２ｋｂ、２ｋｂ～２．５ｋｂ、２．５ｋｂ～３ｋｂ、３ｋｂ～３．５ｋｂ、３．５ｋｂ～４ｋｂ、または４ｋｂ～５ｋｂの長さ）を有し、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。上述したように、場合によっては、コードされたｃｒＲＮＡ（複数可）のためのガイド配列をコードする１つ以上のスペーサー配列は、１つの以上の関心対象の標的配列が標的化されるように改変され得る。場合によっては、方法は、標的細胞に、ｉ）Ｃａｓ１２Ｊ座位、及びｉｉ）ドナーＤＮＡ鋳型を導入することを含む。場合によっては、標的核酸は、インビトロで細胞を含まない組成物中にある。場合によっては、標的核酸は、標的細胞中に存在する。場合によっては、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、原核細胞である。場合によっては、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、真核細胞である。場合によっては、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、哺乳動物細胞である。場合によっては、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、植物細胞である。
場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと、または本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドと接触させることを含む。場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的核酸をＣａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡと接触させることを含む。場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的核酸を、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、第１のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及び第２のＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡと接触させることを含む。場合によっては、標的核酸を改変するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡ鋳型と接触させることを含む。
標的核酸及び関心対象の標的細胞
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、または本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドは、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡに結合する場合、標的核酸に結合することができ、場合によっては、標的核酸に結合し、それを改変することができる。標的核酸は、任意の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）であり得、二本鎖または一本鎖であり得、任意の種類の核酸（例えば、染色体（ゲノムＤＮＡ）、染色体由来、染色体ＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、細胞外、細胞内、ミトコンドリア、葉緑体、線状、環状等）であり得、任意の生物に由来し得る（例えば、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡが、標的核酸中の標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む限り、標的核酸は標的化され得る）。
標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。標的核酸は、二本鎖（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ）または一本鎖（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ）であり得る。場合によっては、標的核酸は、一本鎖である。場合によっては、標的核酸は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。場合によっては、標的ｓｓＲＮＡ（例えば、標的細胞ｓｓＲＮＡ、ウイルスｓｓＲＮＡ等）は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される。場合によっては、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、ウイルスＤＮＡ）である。上述したように、場合によっては、標的核酸は、一本鎖である。
標的核酸は、任意の場所、例えば、インビトロで細胞の外部、インビトロで細胞の内部、インビボで細胞の内部、エクスビボで細胞の内部に位置し得る。好適な標的細胞（ゲノムＤＮＡなどの標的核酸を含み得る）としては、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルドチイ、ナノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドーサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガード等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物等）、昆虫の細胞（例えば、蚊、ミツバチ、農業害虫等）、クモ類の細胞（例えば、クモ、ダニ等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞（例えば、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞、非ヒト哺乳動物の細胞、齧歯類の細胞（例えば、マウス、ラット）、ウサギ類の細胞（例えば、ウサギ）、有蹄動物の細胞（例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒツジ、ヤギ等）、海洋哺乳動物の細胞（例えば、クジラ、アザラシ、ゾウアザラシ、イルカ、アシカ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。任意の種類の細胞が関心対象であり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、成体細胞、体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞、任意の段階にある胚のインビトロまたはインビボの胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフィッシュ胚等）。
細胞は、確立された細胞株に由来し得るか、またはそれらは一次細胞であってもよく、「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」は、本明細書において、対象に由来し、インビトロで培養物の限定数の継代、すなわち分裂のために成長させた細胞及び細胞培養物を指すために互換的に使用される。例えば、一次培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されている場合があるが、危機段階を通過するには十分でない培養物である。典型的には、一次細胞株は、インビトロで１０継代未満にわたって維持される。標的細胞は、単細胞生物であってもよく、及び／または培養物中で成長させてもよい。細胞が一次細胞である場合、それらは任意の簡便な方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって簡便に採取され得るが、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等の組織由来の細胞は、生検によって簡便に採取することができる。
上記適用のうちのいくつかにおいて、対象の方法を用いて、標的核酸切断、標的核酸改変を誘導する、及び／または有糸分裂もしくは有糸分裂後の細胞中の標的核酸を（例えば、可視化のために、収集及び／または分析等のために）、インビボで及び／またはエクスビボで及び／またはインビトロで結合する（例えば、標的化ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生を妨害する、標的ＤＮＡを切断するかまたは他の方法で改変する、標的細胞を遺伝子改変する等）ことができる。ガイドＲＮＡは、標的核酸にハイブリダイズすることによって特異性を提供するため、開示される方法における関心対象の有糸分裂及び／または有糸分裂後の細胞としては、任意の生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルドチイ、ナノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドーサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガード等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞等）を挙げることができる。場合によっては、対象のＣａｓ１２Ｊタンパク質（及び／またはＤＮＡ及び／またはＲＮＡなどのタンパク質をコードする核酸）及び／またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）、及び／またはドナー鋳型、及び／またはＲＮＰは、個体（例えば、哺乳動物、ラット、マウス、ブタ、霊長類、非ヒト霊長類、ヒト等）に導入され得る（すなわち、標的細胞がインビボであり得る）。場合によっては、そのような投与は、例えば、標的化細胞のゲノムを編集することによって、疾患を治療する及び／または予防する目的のためであり得る。
植物細胞には、単子葉植物の細胞、及び双子葉植物の細胞が含まれる。細胞は、根細胞、葉細胞、木部の細胞、師部の細胞、形成層の細胞、頂端分裂組織細胞、柔組織細胞、厚角組織細胞、厚壁組織細胞等であり得る。植物細胞としては、農業作物、例えば小麦、トウモロコシ、米、モロコシ、キビ、大豆等の細胞が挙げられる。植物細胞としては、農業果物及びナッツ植物、例えば、アプリコット、オレンジ、レモン、リンゴ、プラム、ナシ、アーモンド等を産生する植物の細胞が挙げられる。
標的細胞の追加の例は、「改変細胞」と題された上記の項に列記される。細胞（標的細胞）の非限定的な例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類、蘚類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞）、藻類細胞（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルドチイ、ナノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドーサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガード等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、マッシュルーム由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。場合によっては、細胞は、天然の生物に由来しない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得、人工細胞とも称される）。
細胞は、インビトロ細胞（例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体由来の培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体内の細胞）であり得る。細胞は、単離された細胞であり得る。細胞は、生物の内部の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。細胞は、細胞培養内の細胞（例えば、インビトロ細胞培養）であり得る。細胞は、細胞の集団のうちの１つであり得る。細胞は、原核細胞であり得るか、または原核細胞に由来し得る。細胞は、細菌細胞であり得るか、または細菌細胞に由来し得る。細胞は、古細菌細胞であり得るか、または古細菌細胞に由来し得る。細胞は、真核細胞であり得るか、または真核細胞に由来し得る。細胞は、植物細胞であり得るか、または植物細胞に由来し得る。細胞は、動物細胞であり得るか、または動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物に由来し得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得るか、または哺乳動物細胞に由来し得る。細胞は、齧歯類細胞であり得るか、または齧歯類細胞に由来し得る。細胞は、ヒト細胞であり得るか、またはヒト細胞に由来し得る。細胞は、微生物細胞であり得るか、または微生物細胞に由来し得る。細胞は、真菌細胞であり得るか、または真菌細胞に由来し得る。細胞は、昆虫細胞であり得る。細胞は、節足動物細胞であり得る。細胞は、原生動物細胞である得る。細胞は、蠕虫細胞であり得る。
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
場合によっては、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。場合によっては、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。場合によっては、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
場合によっては、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞とも称される。
成体幹細胞は、分化組織中に常駐するが、自己再生の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例は、当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉幹細胞、内皮幹細胞、嗅覚幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。場合によっては、幹細胞は、ヒト幹細胞である。場合によっては、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。場合によっては、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
場合によっては、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３－として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球－マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統をインビボで再配置させることができる。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己再生細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。したがって、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球様細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
他の実施形態では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化することが可能である。神経幹細胞は、多分裂が可能である多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように傾倒した細胞を産生することができる。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において既知である。
他の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されたＭＳＣは、分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の既知の方法を使用して、ＭＳＣを得ることができる。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
細胞は、場合によっては、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であり得る。細胞は、双子葉植物の細胞であり得る。
場合によっては、細胞は、植物細胞である。例えば、細胞は、主要な農業植物、例えば、大麦、豆（乾燥食用）、キャノーラ、トウモロコシ、綿（ピマ）、綿（陸地）、アマニ、乾草（アルファルファ）、乾草（非アルファルファ）、オート麦、ラッカセイ、米、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ（油）、ヒマワリ（非油）、サツマイモ、タバコ（バーレー）、タバコ（黄色種）、トマト、小麦（デュラム）、小麦（春）、小麦（冬）等の細胞であり得る。別の例としては、細胞は、例えば、アルファルファスプラウト、アロエの葉、クズウコン、オモダカ、アーティチョーク、アスパラガス、筍、バナナの花、豆もやし、豆、ビーツの葉茎、ビーツ、ゴーヤ、チンゲンサイ、ブロッコリー、ブロッコリーレイブ（ラピーニ）、芽キャベツ、キャベツ、キャベツスプラウト、カクタスリーフ（ノパル）、カボチャ、カルドン、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハヤトウリ、チョロギ（クローヌ）、ハクサイ、キンサイ、ニラ、サイシン、シュンギク（ｔｕｎｇ ｈｏ）、カラードグリーン、トウモロコシの茎、スイートコーン、キュウリ、ダイコン、食用タンポポの葉、タロイモ、豆苗（エンドウの葉）、トウキ（冬瓜）、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ゼンマイ、グンバイナズナ、フリゼ、カラシナ（チャイニーズマスタード）、カイラン、ガランガル（サイアム、タイ生ショウガ）、ニンニク、ショウガ、ゴボウ、グリーン、ハノーバーサラダグリーン、ウアウソントレ、エルサレムアーティチョーク、ヒカマ、ケールグリーン、コールラビ、アカザ（クェライト）、レタス（ビッブ）、レタス（ボストン）、レタス（ボストンレッド）、レタス（グリーンリーフ）、レタス（アイスバーグ）、レタス（サニーレタス）、レタス（オークリーフ・グリーン）、レタス（オークリーフ・レッド）、レタス（加工）、レタス（レッドリーフ）、レタス（ロメイン）、レタス（ルビーロメイン）、レタス（ロシアンレッドマスタード）、ｌｉｎｋｏｋ、ロボック、ササゲ、レンコン、マーシュ、マゲイ（アガベ）リーフ、ヤムイモ、メスクランミックス、水菜、ｍｏａｐ（ヘチマ）、ｍｏｏ、モクア（ファジースクオッシュ）、マッシュルーム、マスタード、長芋、オクラ、空芯菜、ネギ、ｏｐｏ（ロングスクオッシュ）、装飾トウモロコシ、装飾ヒョウタン、パセリ、パースニップ、豆、トウガラシ（ベルタイプ）、トウガラシ、カボチャ、ラディッキオ、ラディッシュの芽、ラディッシュ、レイプグリーン、レイプグリーン、ルバーブ、ロメイン（ベビーレッド）、ルタバガ、アッケシソウ（シービーン）、ヘチマ（トカド／トカドヘチマ）、ホウレンソウ、スクオッシュ、ストローベイル、サトウキビ、サツマイモ、スイスチャード、タマリンド、タロ、タロの葉、タロの芽、ターサイ、ｔｅｐｅｇｕａｊｅ（ギンネム）、ティンドラ、トマティーヨ、トマト、トマト（チェリー）、トマト（グレープタイプ）、トマト（プラムタイプ）、ターメリック、カブの葉、カブ、ヒシの実、ｙａｍｐｉ、ヤム、アブラナ、ユカ（キャッサバ）等を含むが、これらに限定されない野菜作物の細胞である。
細胞は、場合によっては、節足動物細胞である。例えば、細胞は、例えば、きょう角類、多足類、六脚類、クモ類、昆虫類、イシノミ目、シミ類、旧翅下綱、カゲロウ類、トンボ類、不均翅亜目、近翅亜目、新翅類、外翅類、カワゲラ類、シロアリモドキ目、直翅類、絶翅目、ハサミムシ類、網翅類、ガロアムシ目、コオロギモドキ科、マントファスマ科、ナナフシ、ゴキブリ、シロアリ目、カマキリ類、パラプネウロプテラ、チャタテムシ類、アザミウマ類、シラミ目、半翅類、内翅類もしくは完全変態類、膜翅類、甲虫類、ネジレバネ目、ラフィディオプテラ、広翅亜目、脈翅目、シリアゲムシ目、ノミ類、双翅類、トビケラ類、または鱗翅目である亜目、科、亜科、群、下位群、または種の細胞であり得る。
細胞は、場合によっては、昆虫動物細胞である。例えば、場合によっては、細胞は、蚊、バッタ、ナンキンムシ、ハエ、ノミ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、シラミ、蛾、または甲虫の細胞である。
標的細胞への構成要素の導入
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはドナーポリヌクレオチドは、様々な周知の方法のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得る。
核酸を細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を標的細胞（例えば、原核細胞、ヒト細胞、幹細胞、前駆細胞等）に導入することができる。好適な方法は、本明細書の別の箇所により詳細に記載されており、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型トランスフェクション、リポソーム媒介型トランスフェクション、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）等を含む。任意のまたは全ての構成要素は、既知の方法、例えばヌクレオフェクションを使用して、組成物（例えば、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド等の任意の簡便な組み合わせを含む）として細胞に導入することができる。
ドナーポリヌクレオチド（ドナー鋳型）
Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡによって誘導されると、場合によっては、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、（例えば、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質がニッカーゼバリアントであるとき）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的核酸内で部位特異的二本鎖破断（ＤＳＢ）または一本鎖破断（ＳＳＢ）を生成し、これらは非相同末端接合（ＮＨＥＪ）または相同性配向型組み換え（ＨＤＲ）のいずれかによって修復される。
場合によっては、標的ＤＮＡを（Ｃａｓ１２Ｊタンパク質及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡと）接触させることは、非相同性末端接合または相同性配向型修復を許容する条件下で起こる。したがって、場合によっては、対象の方法は、標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと（例えば、ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することによって）接触させることを含み、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドの複製、またはドナーポリヌクレオチドの複製の一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。場合によっては、方法は、細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように改変される。
場合によっては、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ（またはそれをコードする核酸）、及びＣａｓ１２Ｊタンパク質（またはそれをコードする核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば、１つ以上の発現ベクター）が、少なくとも標的ＤＮＡ配列に対して相同性を有するセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列と同時投与され（例えば、標的核酸と接触される、細胞に投与される等）、対象の方法を使用して、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に付加する、すなわち、挿入または置換すること（例えば、核酸、例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等をコードするものに「ノックイン」すること）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等）を付加すること、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）、調節配列を遺伝子に付加すること（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナル等）、核酸配列を改変すること（例えば、変異を導入する、正しい配列を導入することによって変異を引き起こす疾患を除去する）等ができる。したがって、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及びＣａｓ１２Ｊタンパク質を含む複合体は、任意のインビトロまたはインビボ用途において有用であり、部位特異的、すなわち「標的化」方法、例えば、遺伝子療法において、例えば疾患を治療するため、または抗ウイルス、抗病原性、または抗がん治療として使用される、例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け等、農業における遺伝子改変された生物の産生、治療、診断、または研究を目的とした細胞によるタンパク質の大規模産生、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠失または置換のための病原体の遺伝子の標的化等でＤＮＡを改変することが望ましい。
ポリヌクレオチド配列を、標的配列が切断されるゲノムに挿入することが望ましい用途において、ドナーポリヌクレオチド（ドナー配列を含む核酸）もまた細胞に提供され得る。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナー鋳型」とは、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質によって切断された部位において（ｄｓＤＮＡ切断後、標的ＤＮＡをニッキングした後、標的ＤＮＡを二重ニッキングした後等に）挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位におけるゲノム配列に対して十分な相同性、例えば、標的部位に隣接するヌクレオチド配列（例えば、標的部位の約５０以下の塩基内、例えば、約３０塩基内、約１５塩基内、約１０塩基内、約５塩基内、または標的部位にすぐ隣接する）との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含有し、それと相同性を担持するゲノム配列との間の相同性配向型修復を支持することができる。およそ２５、５０、１００、もしくは２００ヌクレオチド、または２００超のヌクレオチドの、ドナーとゲノム配列との間の配列相同性（または１０～２００ヌクレオチドの任意の整数値、もしくはそれ以上）は、相同性配向型修復を支持することができる。ドナーポリヌクレオチドは、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上等のものであり得る。
ドナー配列は、典型的に、それが置換されるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性配向型修復を支持するのに（例えば、遺伝子補正のため、例えば、疾患を引き起こす塩基対を、疾患を引き起こさない塩基対に変換するために）十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して少なくとも１つ以上の単一塩基変更、挿入、欠失、反転、または再配置を含有し得る。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、相同性の２つの領域に隣接した非相同性配列を含み、それにより標的ＤＮＡ領域と２つの隣接する配列との間の相同性配向型修復は、標的領域における非相同性配列の挿入をもたらす。ドナー配列はまた、関心対象のＤＮＡ領域に対して相同性でなく、関心対象のＤＮＡ領域への挿入が意図されないベクター骨格を含有する配列も含み得る。一般に、ドナー配列の相同領域（複数可）は組み換えが所望されるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。ある特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％～１００％の配列同一性の任意の値が存在し得る。
ドナー配列は、ゲノム配列と比較して、ある特定の配列の相違、例えば、制限部位、ヌクレオチド多形、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素等）を含み得、これらを使用して、切断部位におけるドナー配列の良好な挿入について評価することができるか、または場合によっては、他の目的で使用することができる（例えば、標的化ゲノム座位における発現を示す）。場合によっては、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の相違は、アミノ酸配列を変更しないか、またはサイレントアミノ酸の変更（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響しない変更）をもたらす。あるいは、これらの配列の相違は、マーカー配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組み換え配列、例えば、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列等を含み得る。
場合によっては、ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡとして細胞に提供される。場合によっては、ドナー配列は、二本鎖ＤＮＡとして細胞に提供される。これは、線状または環状形態で細胞に導入され得る。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、任意の簡便な方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得、そのような方法は、当業者に既知である。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の３’末端に付加され得、及び／または自己相補的オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端にライゲーションされ得る。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加、及び修飾ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの使用を含むが、これらに限定されない。線状ドナー配列の末端を保護するための代替として、追加の長さの配列が、組み換えに影響を及ぼすことなく分解され得る相同性の領域の外側に含まれ得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー配列は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合された核酸として導入され得るか、またはＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について本明細書の別の箇所に記載されるように、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
検出方法
本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）の検出によって一度活性化されると、非標的化された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を無差別に切断することができる。本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、ガイドＲＮＡが標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズするときに生じるガイドＲＮＡによって一度活性化されると（すなわち、試料は、標的化ＤＮＡを含む）、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、ｓｓＤＮＡを無差別に切断するヌクレアーゼになる（すなわち、ヌクレアーゼは、非標的ｓｓＤＮＡ、すなわち、ガイドＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしないｓｓＤＮＡを切断する）。したがって、標的ＤＮＡが試料中に存在するとき（例えば、場合によっては、閾値量を超える）、結果は試料中のｓｓＤＮＡの切断であり、これは任意の簡便な検出方法を使用して（例えば、標識された一本鎖検出器ＤＮＡを使用して）検出することができる。非標的核酸の切断は、「トランス切断」と称される。場合によっては、本開示のＣａｓ１２Ｊエフェクターポリペプチドは、ｓｓＤＮＡのトランス切断を媒介するがｓｓＲＮＡのトランス切断は媒介しない。
試料中の標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）を検出するための組成物及び方法が提供される。場合によっては、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）であり、ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出器ＤＮＡが使用される（すなわち、検出器ｓｓＤＮＡは、非標的ｓｓＤＮＡである）。そのような方法は、
（ａ）試料を、
（ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドに結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列を含む、ガイドＲＮＡ、ならびに
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出器ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｂ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドによる一本鎖検出器ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、標的ＤＮＡを検出することと
を含み得る。上述したように、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、試料が、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的ＤＮＡを含む（すなわち、試料が標的化された標的ＤＮＡを含む）ときに生じるガイドＲＮＡによって一度活性化されると、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが活性化され、試料中に存在するｓｓＤＮＡ（非標的ｓｓＤＮＡを含む）を非特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼとして機能する。したがって、標的化された標的ＤＮＡが試料中に存在するとき（例えば、閾値量以上の場合）、結果は試料中のｓｓＤＮＡ（非標的ｓｓＤＮＡを含む）の切断であり、これは任意の簡便な方法を使用して（例えば、標識された検出器ｓｓＤＮＡを使用して）検出することができる。
また、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、非標的ｓｓＤＮＡ）を切断するための組成物及び方法も提供される。そのような方法は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、（ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、ならびに（ｉｉ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドに結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列を含むガイドＲＮＡと接触させることを含み得、Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、該複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する。そのような方法を使用して、例えば、細胞中の外来ｓｓＤＮＡ（例えば、ウイルスＤＮＡ）を切断することができる。
対象の方法の接触ステップは、二価金属イオンを含む組成物中で実行することができる。接触ステップは、無細胞環境、例えば、細胞の外部で実行することができる。接触ステップは、細胞の内部で実行することができる。接触ステップは、インビトロ細胞で実行することができる。接触ステップは、エクスビボ細胞で実行することができる。接触ステップは、インビボ細胞で実行することができる。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得る（例えば、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）。Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドは、タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸として提供され得る（例えば、ｍＲＮＡ、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）。場合によっては、２つ以上の（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）のガイドＲＮＡを、（例えば、Ｃａｓ１２Ｊエフェクタータンパク質によって個々の（「成熟」）ガイドＲＮＡに切断することができる前駆体ガイドＲＮＡアレイを使用して）提供することができる。
場合によっては（例えば、ガイドＲＮＡ及び本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させるとき）、試料を測定ステップの前に２時間以下（例えば、１．５時間以下、１時間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、または５分間以下、または１分間以下）接触させる。例えば、場合によっては、試料を測定ステップの前に４０分間以下接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に２０分間以下接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に１０分間以下接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に５分間以下接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に１分間以下接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に５０秒～６０秒間接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に４０秒～５０秒間接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に３０秒～４０秒間接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に２０秒～３０秒間接触させる。場合によっては、試料を測定ステップの前に１０秒～２０秒間接触させる。
試料中の標的ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）を検出するための本開示の方法は、高感度で標的ＤＮＡを検出することができる。場合によっては、本開示の方法を使用して、複数のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製（例えば、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、または５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製）で存在する。場合によっては、本開示の方法を使用して、複数のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製（例えば、１０１５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０１２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０９個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、または５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製）で存在する。
場合によっては、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
場合によっては、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０１５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０１２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０９個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、または１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
場合によっては、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
場合によっては、試料中の標的ＤＮＡを検出するための対象の方法において、検出閾値は１０ｎＭ以下である。「検出閾値」という用語は、検出を行うために試料中に存在しなければならない標的ＤＮＡの最小量を説明するために本明細書において使用される。したがって、例示的な例として、検出閾値が１０ｎＭである場合には、標的ＤＮＡが１０ｎＭ以上の濃度で試料中に存在する場合にシグナルを検出することができる。場合によっては、本開示の方法は、５ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．５ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．１ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．０５ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．０１ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．０００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．０００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．００００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、０．００００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１０ｐＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１ｐＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、５００ｆＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、２５０ｆＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１００ｆＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、５０ｆＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、５００ａＭ（アトモル）以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、２５０ａＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１００ａＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、５０ａＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１０ａＭ以下の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１ａＭ以下の検出閾値を有する。
場合によっては、（対象の方法において標的ＤＮＡを検出するための）検出閾値は、５００ｆＭ～１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）の範囲である（濃度は、標的ＤＮＡを検出することができる、標的ＤＮＡの閾値濃度を指す）。場合によっては、本開示の方法は、８００ｆＭ～１００ｐＭの範囲の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１ｐＭ～１０ｐＭの範囲の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、１０ｆＭ～５００ｆＭ、例えば、１０ｆＭ～５０ｆＭ、５０ｆＭ～１００ｆＭ、１００ｆＭ～２５０ｆＭ、または２５０ｆＭ～５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
場合によっては、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、５００ｆＭ～１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）の範囲である。場合によっては、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、８００ｆＭ～１００ｐＭの範囲である。場合によっては、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ｐＭ～１０ｐＭの範囲である。
場合によっては、（対象の方法において標的ＤＮＡを検出するための）検出閾値は、１ａＭ～１ｎＭ（例えば、１ａＭ～５００ｐＭ、１ａＭ～２００ｐＭ、１ａＭ～１００ｐＭ、１ａＭ～１０ｐＭ、１ａＭ～１ｐＭ、１００ａＭ～１ｎＭ、１００ａＭ～５００ｐＭ、１００ａＭ～２００ｐＭ、１００ａＭ～１００ｐＭ、１００ａＭ～１０ｐＭ、１００ａＭ～１ｐＭ、２５０ａＭ～１ｎＭ、２５０ａＭ～５００ｐＭ、２５０ａＭ～２００ｐＭ、２５０ａＭ～１００ｐＭ、２５０ａＭ～１０ｐＭ、２５０ａＭ～１ｐＭ、５００ａＭ～１ｎＭ、５００ａＭ～５００ｐＭ、５００ａＭ～２００ｐＭ、５００ａＭ～１００ｐＭ、５００ａＭ～１０ｐＭ、５００ａＭ～１ｐＭ、７５０ａＭ～１ｎＭ、７５０ａＭ～５００ｐＭ、７５０ａＭ～２００ｐＭ、７５０ａＭ～１００ｐＭ、７５０ａＭ～１０ｐＭ、７５０ａＭ～１ｐＭ、１ｆＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～５００ｐＭ、１ｆＭ～２００ｐＭ、１ｆＭ～１００ｐＭ、１ｆＭ～１０ｐＭ、１ｆＭ～１ｐＭ、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）の範囲である（濃度は、標的ＤＮＡを検出することができる、標的ＤＮＡの閾値濃度を指す）。場合によっては、本開示の方法は、１ａＭ～８００ａＭの範囲の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、５０ａＭ～１ｐＭの範囲の検出閾値を有する。場合によっては、本開示の方法は、５０ａＭ～５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
場合によっては、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ａＭ～１ｎＭ（例えば、１ａＭ～５００ｐＭ、１ａＭ～２００ｐＭ、１ａＭ～１００ｐＭ、１ａＭ～１０ｐＭ、１ａＭ～１ｐＭ、１００ａＭ～１ｎＭ、１００ａＭ～５００ｐＭ、１００ａＭ～２００ｐＭ、１００ａＭ～１００ｐＭ、１００ａＭ～１０ｐＭ、１００ａＭ～１ｐＭ、２５０ａＭ～１ｎＭ、２５０ａＭ～５００ｐＭ、２５０ａＭ～２００ｐＭ、２５０ａＭ～１００ｐＭ、２５０ａＭ～１０ｐＭ、２５０ａＭ～１ｐＭ、５００ａＭ～１ｎＭ、５００ａＭ～５００ｐＭ、５００ａＭ～２００ｐＭ、５００ａＭ～１００ｐＭ、５００ａＭ～１０ｐＭ、５００ａＭ～１ｐＭ、７５０ａＭ～１ｎＭ、７５０ａＭ～５００ｐＭ、７５０ａＭ～２００ｐＭ、７５０ａＭ～１００ｐＭ、７５０ａＭ～１０ｐＭ、７５０ａＭ～１ｐＭ、１ｆＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～５００ｐＭ、１ｆＭ～２００ｐＭ、１ｆＭ～１００ｐＭ、１ｆＭ～１０ｐＭ、１ｆＭ～１ｐＭ、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、１ｐＭ～１０ｐＭ）の範囲である。場合によっては、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ａＭ～５００ｐＭの範囲である。場合によっては、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１００ａＭ～５００ｐＭの範囲である。
場合によっては、対象の組成物または方法は、アトモル（ａＭ）の検出感度を示す。場合によっては、対象の組成物または方法は、フェムトモル（ｆＭ）の検出感度を示す。場合によっては、対象の組成物または方法は、ピコモル（ｐＭ）の検出感度を示す。場合によっては、対象の組成物または方法は、ナノモル（ｎＭ）の検出感度を示す。
標的ＤＮＡ
標的ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）であり得る。標的ＤＮＡが一本鎖である場合、標的ＤＮＡにおけるＰＡＭ配列に対する嗜好性または要件は存在しない。しかしながら、標的ＤＮＡがｄｓＤＮＡである場合、ＰＡＭは通常、標的ＤＮＡの標的配列に隣接して存在する（例えば、本明細書の別の箇所のＰＡＭの考察を参照されたい）。標的ＤＮＡの供給源は、例えば、下記に記載するような、試料の供給源と同一であり得る。
標的ＤＮＡの供給源は、任意の供給源であり得る。場合よっては、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスのゲノムＤＮＡ）である。したがって、対象の方法は、（例えば、試料中の）核酸の集団の中のウイルスＤＮＡの存在を検出するためのものであり得る。また、対象の方法は、標的ＤＮＡの存在下で非標的ｓｓＤＮＡの切断に使用することもできる。例えば、方法が細胞内で行われる場合、対象の方法は、特定の標的ＤＮＡが細胞内に存在する場合（例えば、細胞がウイルスに感染し、ウイルス標的ＤＮＡが検出される場合）、細胞内の非標的ｓｓＤＮＡ（ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないｓｓＤＮＡ）を無差別に切断するために使用することができる。
可能性のある標的ＤＮＡの例としては、例えば、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスリンパ球向性ウイルス、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ等のウイルスＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、標的ＤＮＡは、寄生虫ＤＮＡである。場合によっては、標的ＤＮＡは、細菌ＤＮＡ、例えば、病原性細菌のＤＮＡである。
試料
対象試料は、核酸（例えば、複数の核酸）を含む。「複数」という用語は、本明細書において、２つ以上を意味するために使用される。したがって、場合によっては、試料は、２個以上（例えば、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上）の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。対象の方法を、非常に高感度の方法として使用して、試料中の（例えば、ＤＮＡなどの核酸の複合混合物中の）標的ＤＮＡの存在を検出することができる。場合によっては、試料は、配列中に互いに異なる５個以上のＤＮＡ（例えば、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上のＤＮＡ）を含む。場合によっては、試料は、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０３個以上、５×１０３個以上、１０４個以上、５×１０４個以上、１０５個以上、５×１０５個以上、１０６個以上、５×１０６個以上、または１０７個以上のＤＮＡを含む。場合によっては、試料は、１０～２０個、２０～５０個、５０～１００個、１００～５００個、５００～１０３個、１０３～５×１０３個、５×１０３～１０４個、１０４～５×１０４個、５×１０４～１０５個、１０５～５×１０５個、５×１０５～１０６個、１０６～５×１０６個、または５×１０６～１０７個、または１０７個超のＤＮＡを含む。場合によっては、試料は、（例えば、配列中に互いに異なる）５～１０７個のＤＮＡ（例えば、５～１０６個、５～１０５個、５～５０，０００個、５～３０，０００個、１０～１０６個、１０～１０５個、１０～５０，０００個、１０～３０，０００個、２０～１０６個、２０～１０５個、２０～５０，０００個、または２０～３０，０００個のＤＮＡ）を含む。場合によっては、試料は、配列中に互いに異なる２０個以上のＤＮＡを含む。場合によっては、試料は、細胞溶解物（例えば、真核細胞溶解物、哺乳動物細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、原核細胞溶解物、植物細胞溶解物等）由来のＤＮＡを含む。例えば、場合によっては、試料は、真核細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞由来のＤＮＡを含む。
「試料」という用語は、本明細書において、ＤＮＡを含むあらゆる試料（例えば、標的ＤＮＡがＤＮＡの集団の中に存在するかどうかを決定するために）を意味するために使用される。試料は、任意の供給源に由来し得る。例えば、試料は、精製されたＤＮＡの合成的な組み合わせであり得、試料は、細胞溶解物、ＤＮＡ富化細胞溶解物、または細胞溶解物から単離された及び／または精製されたＤＮＡであり得る。試料は、（例えば、診断の目的のために）患者由来であり得る。試料は、透過処理された細胞由来であり得る。試料は、架橋された細胞由来であり得る。試料は、組織切片中であり得る。試料は、架橋、続いて脱脂及び調整して、均一な屈折率を作ることによって調製された組織由来であり得る。架橋、続いて脱脂及び調整して、均一な屈折率を作ることによる組織調製物の例は、例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）１４３，２８６２－２８６７ ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１３８５６０に記載されている。
「試料」は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含むことができる。場合によっては、標的ＤＮＡは、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、または１０６ 個の非標的ＤＮＡあたり１つ未満の複製で試料中に存在する。場合によっては、標的ＤＮＡは、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製で試料中に存在する。
好適な試料としては、唾液、血液、血清、血漿、尿、吸引液、及び生検試料が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、患者に関する「試料」という用語は、生物学的起源の血液及び他の液体試料、固形組織試料、例えば、生検標本またはそれ由来の組織培養物もしくは細胞、ならびにそれらの子孫を包含する。定義はまた、調達後に任意の方法で、例えば、試薬を用いた処理、洗浄、またはある特定の細胞集団、例えば、がん細胞に対する濃縮などによって操作されている試料も含む。定義はまた、特定の種類の分子、例えば、ＤＮＡに対して濃縮されている試料も含む。「試料」という用語は、血液、血漿、血清、吸引液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床試料などの生体試料を包含し、また、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、器官、骨髄等も含む。「生体試料」は、それに由来する生物学的流体（例えば、がん細胞、感染細胞等）、例えば、そのような細胞から得られるＤＮＡを含む試料（例えば、細胞溶解物またはＤＮＡを含む他の細胞抽出物）を含む。
試料は、任意の様々な細胞、組織、器官、または無細胞流体を含むことができるか、またはそれらから得ることができる。好適な試料の供給源としては、真核細胞、細菌細胞、及び古細菌細胞が挙げられる。好適な試料の供給源としては、単一細胞生物及び多細胞生物が挙げられる。好適な試料の供給源としては、単一細胞の真核生物；植物または植物細胞；藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルドチイ、ナノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドーサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガード等；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；動物細胞、組織、または器官；無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物、昆虫動物、クモ類等）由来の細胞、組織、または器官；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、組織、流体、または器官；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等）由来の細胞、組織、流体、または器官が挙げられる。好適な試料の供給源としては、線形動物、原生動物等が挙げられる。好適な試料の供給源としては、例えば、蠕虫、マラリア原虫等の寄生虫が挙げられる。
好適な試料の供給源としては、６界、例えば、細菌（例えば、真正細菌）界、古細菌界、原生生物界、菌界、植物界、及び動物界のうちのいずれかの細胞、組織、または生物が挙げられる。好適な試料の供給源としては、藻類（例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、シアノバクテリア）を含むがこれらに限定されない原生生物界の植物様メンバー；原生生物界の菌様メンバー、例えば、粘菌類、水生菌類等；原生生物の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫類（例えば、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ））、アメーバ様（例えば、アメーバ）、胞子虫類（例えば、アピコンプレックス門（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）、ミクソゾア門（Ｍｙｘｏｚｏａ）、微胞子虫類（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ））、及び繊毛虫類（例えば、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ））が挙げられる。好適な試料の供給源としては、門：担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（棍棒状菌、例えば、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アマニタ（Ａｍａｎｉｔａ）、ヤマドリタケ属（Ｂｏｌｅｔｕｓ）、カンテレルス（Ｃａｎｔｈｅｒｅｌｌｕｓ）等のメンバー）、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を含む子嚢菌）、ミコフィコフィタ（Ｍｙｃｏｐｈｙｃｏｐｈｙｔａ）（地衣類）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（抱合菌）、及び不完全菌門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、菌界のメンバーが挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門：コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）（例えば、蘚類）、ツノゴケ植物門（Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ）（例えば、ツノゴケ類）、ヘパティコフィタ（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、苔類）、リコフィタ（Ｌｙｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、ヒカゲノカズラ類）、スフェノフィタ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｙｔａ）（例えば、ツクシ）、プシノフィタ（Ｐｓｉｌｏｐｈｙｔａ）（例えば、マツバラン）、オフィオグロソフィタ（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｐｈｙｔａ）、プテロフィタ（Ｐｔｅｒｏｐｈｙｔａ）（例えば、シダ類）、ソテツ門（Ｃｙｃａｄｏｐｈｙｔａ）、ギングコフィタ（Ｇｉｎｇｋｏｐｈｙｔａ）、マツ植物門（Ｐｉｎｏｐｈｙｔａ）、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔａ）、及びモクレン植物門（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ）（例えば、顕花植物）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、植物界のメンバーが挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門：カイメン動物門（Ｐｏｒｉｆｅｒａ）（海綿類）、平板動物門（Ｐｌａｃｏｚｏａ）、直泳動物門（Ｏｒｔｈｏｎｅｃｔｉｄａ）（海洋無脊椎動物の寄生虫）、ロンボゾア（Ｒｈｏｍｂｏｚｏａ）、刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ）（サンゴ、イソギンチャク、クラゲ、ウミエラ、ウミシイタケ、ハコクラゲ）、有櫛動物門（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）（クシクラゲ類）、扁形動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）（扁形動物）、ネメルティナ（Ｎｅｍｅｒｔｉｎａ）（ひも形動物）、ヌガトストムリダ（Ｎｇａｔｈｏｓｔｏｍｕｌｉｄａ）（顎口動物）、腹毛動物門（Ｇａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ）、ロティフェラ（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）、プリアプリダ（Ｐｒｉａｐｕｌｉｄａ）、動吻動物門（Ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ）、胴甲動物門（Ｌｏｒｉｃｉｆｅｒａ）、鉤頭虫門（Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）、内肛動物門（Ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ）、ネモトーダ（Ｎｅｍｏｔｏｄａ）、類線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ）、有輪動物門（Ｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ）、軟体動物門（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）（軟体動物）、星口動物門（Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ）（星口動物）、環形動物門（Ａｎｎｅｌｉｄａ）（環形動物）、緩歩動物門（Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ）（緩歩動物）、有爪動物門（Ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ）（有爪動物）、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）（きょう角類、ミリアポーダ（Ｍｙｒｉａｐｏｄａ）、ヘキサポーダ（Ｈｅｘａｐｏｄａ）、及びクルスタセア（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）の亜門を含み、きょう角類は、例えば、クモ類、メロストマ類（Ｍｅｒｏｓｔｏｍａｔａ）、及びウミグモ類（Ｐｙｃｎｏｇｏｎｉｄａ）を含み、ミリアポーダは、例えば、唇脚類（Ｃｈｉｌｏｐｏｄａ）（ムカデ）、倍脚類（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）（ヤスデ）、パロポーダ（Ｐａｒｏｐｏｄａ）、及び結合類（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）を含み、ヘキサポーダは昆虫を含み、クルスタセアは、エビ、オキアミ、フジツボ等を含む）、箒虫類（Ｐｈｏｒｏｎｉｄａ）、外肛類（Ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ）（苔虫）、腕足類（Ｂｒａｃｈｉｏｐｏｄａ）、棘皮動物（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ）（例えば、ヒトデ、シャリンヒトデ、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリットルバスケット等）、毛顎動物（Ｃｈａｅｔｏｇｎａｔｈａ）（顎動物）、半索動物（Ｈｅｍｉｃｈｏｒｄａｔａ）（腸鰓類）、及び脊索動物（Ｃｈｏｒｄａｔａ）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない動物界のメンバーが挙げられる。脊索動物の好適なメンバーとしては、以下の亜門：尾索動物亜門（Ｕｒｏｃｈｏｒｄａｔａ）（海鞘類（Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ）、サルパ類（Ｔｈａｌｉａｃｅａ）、及び幼形類（Ｌａｒｖａｃｅａ）を含むホヤ）、頭索動物亜門（Ｃｅｐｈａｌｏｃｈｏｒｄａｔａ）（ナメクジウオ）、ミクシニ（Ｍｙｘｉｎｉ）（ヌタウナギ）、及び脊椎動物亜門（Ｖｅｒｔｅｂｒａｔａ）のうちのいずれかのメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えばペトロミゾンチダ（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｔｉｄａ）（ヤツメウナギ）、コンドリキティセス（Ｃｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｃｅｓ）（軟骨魚類）、条鰭亜綱（Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ）（硬骨魚類）、アクチニスタ（Ａｃｔｉｎｉｓｔａ）（シーラカンス）、肺魚亜綱（Ｄｉｐｎｏｉ）（肺魚類）、レプティリア（Ｒｅｐｔｉｌｉａ）（爬虫類、例えば、ヘビ、ワニ、ワニ、トカゲ等）、アベス（Ａｖｅｓ）（鳥類）、及びマンマリアン（Ｍａｍｍａｌｉａｎ）（哺乳動物）のメンバーが挙げられる。好適な植物としては、任意の単子葉植物及び任意の双子葉植物が挙げられる。
好適な試料の供給源としては、生物から採取した細胞、流体、組織、もしくは器官、生物から単離された特定の細胞もしくは細胞の集団等が挙げられる。例えば、生物が植物である場合、好適な供給源としては、木部、師部、形成層、葉、根などが挙げられる。生物が動物である場合、好適な供給源としては、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織等）、または特定の細胞型（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、膵島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等）が挙げられる。
場合によっては、試料の供給源は、罹患した（または罹患した疑いがある）細胞、流体、組織、または器官である。場合によっては、試料の供給源は、正常な（罹患していない）細胞、流体、組織、または器官である。場合によっては、試料の供給源は、病原体に感染した（または感染した疑いがある）細胞、組織、または器官である。例えば、試料の供給源は、感染しているか、または感染していない個人であり得、試料は、個体から収集された任意の生体試料（例えば、血液、唾液、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、微細針吸引液、スワブ試料（例えば、頬スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻汁、涙、軟膜、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞擦過物）等）であり得る。場合によっては、試料は、細胞を含まない液体試料である。場合によっては、試料は、細胞を含み得る液体試料である。病原体としては、ウイルス、真菌類、蠕虫類、原虫動物、マラリア原虫、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）寄生虫、シストストーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）寄生虫等が挙げられる。「蠕虫類」としては、回虫、犬糸状虫、及び植物食性線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、吸虫（Ｔｅｍａｔｏｄａ）、鉤頭虫門、及び条虫（Ｃｅｓｔｏｄａ）が挙げられる。原虫感染症としては、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）菌種、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）菌種、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム赤痢、Ｃｈａｇａ病、コクシジウム症、マラリア、及びトキソプラズマ症由来の感染症が挙げられる。病原性寄生虫／原虫などの病原体の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、及びトキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。病原性真菌としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。病原性ウイルスとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デング、西ナイルウイルス、ヘルペスウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス等が挙げられる。病原性ウイルスとしては、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルス等のＤＮＡウイルスなどを挙げることができる。病原体としては、例えば、ＤＮＡウイルス（例えば、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルス等）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ヘモフィルスインフルエンザ菌Ｂ型、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳房腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンヂ、ランゲルトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒａｎｇｅｌｉ）、トリパノソーマ・クルージ、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、シストストーマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストストーマ・ジャポニクム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バベシア・ボービス（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ）、エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）、オンコセルカ・ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、リーシュマニア・トロピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒｖａ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、ヒツジ条虫（Ｔａｅｎｉａ ｏｖｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、メソセストイデス・コルティ（Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ ｃｏｒｔｉ）、マイコプラズマ・アルスリティディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ヒオルヒニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、Ｍ．オラレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、アコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、Ｍ．サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）及びＭ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を挙げることができる。
検出可能なシグナルの測定
場合によっては、対象の方法は、測定（例えば、Ｃａｓ１２Ｊ媒介型ｓｓＤＮＡ切断によって生成される検出可能なシグナルの測定）のステップを含む。本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドは、一度活性化されると非標的化ｓｓＤＮＡを切断するため（それはガイドＲＮＡがＣａｓ１２Ｊエフェクタータンパク質の存在下で標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合に起こる）、検出可能なシグナルは、ｓｓＤＮＡが切断されるときに産生される任意のシグナルであり得る。例えば、場合によっては、測定のステップは、金ナノ粒子ベースの検出（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００７；４６（１９）：３４６８－７０、及びＸｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ Ｊｕｎ １５；１０７（２４）：１０８３７－４１を参照されたい）、蛍光偏光、コロイド相転移／分散（例えば、Ｂａｋｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｊａｎ ８；４２７（６９７０）：１３９－４１）、電気化学的検出、半導体ベースの感知（例えば、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｊｕｌ ２０；４７５（７３５６）：３４８－５２、例えば、２’－３’環状リン酸の開口によって、及び溶液中への無機ホスフェートの放出によって、ホスファターゼを使用してｓｓＤＮＡ切断反応後にｐＨ変化を生成することができる）、及び標識された検出器ｓｓＤＮＡの検出（詳細は本明細書の別の箇所を参照されたい）のうちの１つ以上を含むことができる。そのような検出方法の読み出しは、任意の簡便な読み出しであり得る。可能性のある読み出しの例としては、検出可能な蛍光シグナルの測定された量、ゲル上のバンド（例えば、未切断基質に対する切断産生物を表すバンド）の視覚的分析、色の存在または不在の視覚的またはセンサベースの検出（すなわち、色検出法）、及び電気シグナル（もしくはその特定の量）の存在または不在が挙げられるが、それらに限定されない。
場合によっては、測定は、例えば、検出されるシグナルの量が、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定するために使用することができるという意味において、定量的であり得る。場合によっては、測定は、例えば、検出可能なシグナルの存在または不在が、標的化ＤＮＡ（例えば、ウイルス、ＳＮＰ等）の存在または不在を示すことができるという意味において、定性的であり得る。場合によっては、検出可能なシグナルは、標的化ＤＮＡ（複数可）（例えば、ウイルス、ＳＮＰ等）が特定の閾値濃度を超えて存在しない限り、（例えば、所定の閾値レベルを超えて）存在しないであろう。場合によっては、検出閾値は、Ｃａｓ１２Ｊエフェクター、ガイドＲＮＡ、試料容積、及び／または検出器ｓｓＤＮＡ（使用される場合）の量を変更することによって滴定することができる。したがって、例えば、当業者によって理解されるように、いくつかの対照を、１つ以上の反応をセットアップするために必要に応じて使用することができ、各々が、異なる閾値レベルの標的ＤＮＡを検出するためにセットアップされ、したがって、そのような一連の反応を使用して試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することができる（例えば、そのような一連の反応を使用して、「少なくともＸの濃度で」試料中に存在する標的ＤＮＡを決定することができる）。
本開示の検出方法の使用の例としては、例えば、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の検出、がんのスクリーニング、細菌感染の検出、抗生物質耐性の検出、ウイルス感染の検出等が挙げられる。本開示の組成物及び方法を使用して、任意のＤＮＡ標的を検出することができる。例えば、対象の試料が細胞のゲノムＤＮＡを含み得るため、核酸材料をゲノムに組み込むいかなるウイルスも検出することができ、ガイドＲＮＡは組み込まれたヌクレオチド配列を検出するように設計することができる。
場合によっては、本開示の方法を使用して、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）中の標的ＤＮＡの量を決定することができる。試料中の標的ＤＮＡの量を決定することは、試験試料から生成された検出可能なシグナルの量を、参照試料から生成された検出可能なシグナルの量と比較することを含み得る。試料中の標的ＤＮＡの量を決定することは、検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、参照試料によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、試験測定値を参照測定値と比較して、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと、を含む。
例えば、場合によっては、試料中の標的ＤＮＡの量を決定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）試料中に存在するＲＮＡを切断する本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及び（ｉｉｉ）検出器ｓｓＤＮＡと接触させることと、ｂ）Ｃａｓ１２Ｊ媒介型ｓｓＤＮＡ切断（例えば、検出器ｓｓＤＮＡの切断）によって生成される検出可能なシグナルを測定して、試験測定値を生成することと、ｃ）参照試料によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、ｄ）試験測定値を参照測定値と比較して、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することとを含む。
別の例としては、場合によっては、試料中の標的ＤＮＡの量を判定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）それぞれが異なるガイド配列を有する、２つ以上のガイドＲＮＡを含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、（ｉｉ）前駆体ガイドＲＮＡアレイを個々のガイドＲＮＡに切断し、試料のＲＮＡも切断する本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、（ｉｉｉ）検出器ｓｓＤＮＡと接触させることと、ｂ）Ｃａｓ１２Ｊ媒介型ｓｓＤＮＡ切断（例えば、検出器ｓｓＤＮＡの切断）によって生成される検出可能なシグナルを測定して、試験測定値を生成することと、ｃ）２つ以上の参照試料のそれぞれによって生成される検出可能なシグナルを測定して、２つ以上の参照測定値を生成することと、ｄ）試験測定値を参照測定値と比較して、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することとを含む。
試料中の核酸の増幅
いくつかの実施形態では、対象の組成物及び／または（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ中のウイルスＤＮＡまたはＳＮＰなどの標的ＤＮＡの存在を検出するための）方法の感度は、検出を核酸増幅と結合することによって増加させることができる。場合によっては、試料中の核酸は、ｓｓＤＮＡを切断する本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させる前に増幅される（例えば、試料中の核酸の増幅は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドとの接触前に開始することができる）。場合によっては、試料中の核酸は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドとの接触と同時に増幅される。例えば、場合によっては、対象の方法は、増幅された試料を本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させる前に（例えば、試料を増幅構成要素と接触させることによって）試料の核酸を増幅することを含む。場合によっては、対象の方法は、試料を本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させるのと一緒に（同時に）試料を増幅構成要素と接触させることを含む。全ての構成要素（増幅構成要素及び検出構成要素、例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、ガイドＲＮＡ、及び検出器ＤＮＡ）が同時に付加される場合、Ｃａｓ１２Ｊのトランス切断活性は、核酸が増幅を受けているのと同時に試料の核酸を分解し始めることが可能である。しかしながら、このような場合であっても、増幅及び検出を同時に行うことは、増幅せずに方法を実施する場合と比較して、依然として感度を高めることができる。
場合によっては、特定の配列（例えば、ウイルスの配列、関心対象のＳＮＰを含む配列）は、例えば、プライマーを使用して、試料から増幅される。このように、ガイドＲＮＡがハイブリダイズするであろう配列は、対象の検出方法の感度を高めるために増幅することができ、これにより、試料中に存在する他の配列と比較して試料中に存在する関心対象の配列の複製の数を増加させるために、所望の配列の偏った増幅を達成することができる。例示的な一例として、所与の試料が特定のウイルス（または特定のＳＮＰ）を含むかどうかを決定するために対象の方法が使用されている場合、ウイルス配列（または非ウイルスゲノム配列）の所望の領域を増幅することができ、増幅された領域は、ウイルス配列（またはＳＮＰ）が実際に試料中に存在した場合、ガイドＲＮＡにハイブリダイズするであろう配列を含む。
前述のように、場合によっては、増幅された核酸を本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させる前に（例えば、増幅構成要素と接触させることによって）核酸は増幅される。場合によっては、増幅は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させる前に１０秒間以上（例えば、３０秒間以上、４５秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上、７．５分間以上、１０分間以上等）生じる。場合によっては、増幅は、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させる前に２分間以上（例えば、３分間以上、４分間以上、５分間以上、７．５分間以上、１０分間以上等）生じる。場合によっては、増幅は、１０秒～６０分（例えば、１０秒～４０分、１０秒～３０分、１０秒～２０分、１０秒～１５分、１０秒～１０分、１０秒～５分、３０秒～４０分、３０秒～３０分、３０秒～２０分、３０秒～１５分、３０秒～１０分、３０秒～５分、１分～４０分、１分～３０分、１分～２０分、１分～１５分、１分～１０分、１分～５分、２分～４０分、２分～３０分、２分～２０分、２分～１５分、２分～１０分、２分～５分、５分～４０分、５分～３０分、５分～２０分、５分～１５分、または５分～１０分）の範囲の期間にわたって生じる。場合によっては、増幅は、５分～１５分の範囲の期間にわたって生じる。場合によっては、増幅は、７分～１２分の範囲の期間にわたって生じる。
場合によっては、試料を、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドと接触させるのと同時に増幅構成要素と接触させる。いくつかのそのような場合には、Ｃａｓ１２Ｊタンパク質は、接触時に不活性であり、試料中の核酸が一度増幅されると活性化される。
様々な増幅方法及び構成要素が当業者に既知であり、任意の簡便な方法を使用することができる（例えば、Ｚａｎｏｌｉ ａｎｄ Ｓｐｏｔｏ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１３ Ｍａｒ；３（１）：１８－４３、Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００８，２７：２２４－２４３、Ｃｒａｗ ａｎｄ Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎａ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１２，１２，２４６９－２４８６（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。核酸増幅としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ｑＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、多重ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ランダムプライマーＰＣＲ、ヘミネステッドＰＣＲ、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、コロニーＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、デジタルＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、より低い変性温度での同時増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳ－ＰＣＲ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、逆ＰＣＲ、及び熱非対称インターレースＰＣＲ（ＴＡＩＬ－ＰＣＲ）が挙げられる。
場合によっては、増幅は等温増幅である。「等温増幅」という用語は、単一温度インキュベーションを使用することによってサーマルサイクラーを不要とすることができる（例えば、酵素連鎖反応を使用する）核酸（例えば、ＤＮＡ）増幅の方法を示す。等温増幅は、増幅反応中の標的核酸の熱変性に依存せず、したがって、温度の複数の急激な変更を必要としなくてもよい、核酸増幅の一形態である。したがって、等温核酸増幅方法は、実験室環境の内部または外部で実行することができる。逆転写ステップと組み合わせることによって、これらの増幅方法を使用してＲＮＡを等温的に増幅することができる。
等温増幅方法の例としては、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、分岐（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノムの指数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、及び等温複数置換増幅（ＩＭＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である（例えば、米国特許第８，０３０，０００号、同第８，４２６，１３４号、同第８，９４５，８４５号、同第９，３０９，５０２号、及び同第９，６６３，８２０号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、２つの対向するプライマーを使用し（ＰＣＲに非常に類似）、３つの酵素－リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、及び鎖置換ポリメラーゼを用いる。リコンビナーゼはオリゴヌクレオチドプライマーを二重鎖ＤＮＡ中の相同配列と対合し、ＳＳＢはＤＮＡの置換された鎖と結合して、プライマーが置換されることを阻止し、鎖置換ポリメラーゼは、プライマーが標的ＤＮＡに結合している場合、ＤＮＡ合成を開始する。ＲＰＡ反応に逆転写酵素を添加して、ｃＤＮＡを産生するための別個のステップを必要とすることなく、ＲＮＡならびにＤＮＡの検出を容易にすることができる。ＲＰＡ反応のための構成要素の一例は、以下の通りである（例えば、米国特許第８，０３０，０００号、同第８，４２６，１３４号、同第８，９４５，８４５号、同第９，３０９，５０２号、同第９，６６３，８２０号を参照されたい）：５０ｍＭのトリスｐＨ８．４、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ－２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、３０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μｌのクレアチンキナーゼ、４２０ｎｇ／μｌのｇｐ３２、１４０ｎｇ／μｌのＵｖｓＸ、３５ｎｇ／μｌのＵｖｓＹ、２０００ＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、３５ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼ、及び核酸含有試料。
転写増幅（ＴＭＡ）では、ＲＮＡポリメラーゼは、プライマー領域で操作されたプロモーターからＲＮＡを作製するために使用され、次いで、逆転写酵素は、プライマーからｃＤＮＡを合成する。次いで、第３の酵素、例えば、Ｒｎａｓｅ Ｈを使用して、熱変性のステップなしにｃＤＮＡからＲＮＡ標的を分解することができる。この増幅技法は、自家持続配列複製（３ＳＲ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）と同様であるが、用いられる酵素は異なる。別の例としては、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）は、ｄｓＤＮＡをほどいて一本鎖を作製するために、熱よりもむしろ熱安定性ヘリカーゼ（Ｔｔｅ－ＵｖｒＤ）を利用し、それは次いで、ポリメラーゼによるハイブリダイゼーション及びプライマーの伸長のために利用可能である。さらに別の例としては、ループ型増幅（ＬＡＭＰ）は、鎖置換能力を有する熱安定性ポリメラーゼ、及び４つ以上の特異的に設計されたプライマーのセットを用いる。各プライマーは、一度置換されるとヘアピンにスナップされるヘアピン端部を有するように設計されており、セルフプライミング及びさらなるポリメラーゼ伸長を容易にする。ＬＡＭＰ反応では、等温条件下で反応が進行するが、最初の熱変性ステップが二本鎖標的のために必要とされる。加えて、増幅は、様々な長さの産生物のラダーパターンを生じる。さらに別の例では、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限エンドヌクレアーゼの、その標的ＤＮＡの非修飾鎖に切れ目を入れる能力と、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの、切れ目で３’末端を伸長して下流のＤＮＡ鎖を置換する能力とを組み合わせる。
検出器ＤＮＡ
場合によっては、対象の方法は、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチド、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（または前駆体ガイドＲＮＡアレイ）、及び（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出器ＤＮＡと接触させることを含む。例えば、場合によっては、対象の方法は、試料を、蛍光発光色素対を含む標識された一本鎖検出器ＤＮＡ（検出器ｓｓＤＮＡ）、（標的ＤＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡの文脈においてガイドＲＮＡに結合することによって）活性化された後に標識された検出器ｓｓＤＮＡを切断するＣａｓ１２Ｊポリペプチド、及び蛍光発光色素対によって産生される、測定される検出可能なシグナルと接触させることを含む。例えば、場合によっては、対象の方法は、試料を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対、またはクエンチャー／蛍光体対、またはそれら両方を含む、標識された検出器ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。場合によっては、対象の方法は、試料を、ＦＲＥＴ対を含む標識された検出器ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。場合によっては、対象の方法は、試料を、蛍光体／クエンチャー対を含む標識された検出器ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。
蛍光発光色素対は、ＦＲＥＴ対またはクエンチャー／蛍光体対を含む。ＦＲＥＴ対及びクエンチャー／蛍光体対の両方の場合において、対の一方の色素の発光スペクトルは、対の他方の色素の吸収スペクトルの領域と重複する。本明細書で使用される場合、「蛍光発光色素対」という用語は、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対」及び「クエンチャー／蛍光体対」（いずれの用語も以下でより詳細に説明される）の両方を包含するために使用される総称である。「蛍光発光色素対」という用語は、「ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対」という語句と互換的に使用される。
場合によっては（例えば、検出器ｓｓＤＮＡが、ＦＲＥＴ対を含む場合）、標識された検出器ｓｓＤＮＡは、切断される前に検出可能なシグナルの量を生成し、測定される検出可能なシグナルの量は、標識された検出器ｓｓＤＮＡが切断される場合、低減される。場合によっては、標識されたｓｓＤＮＡ検出器は、（例えば、ＦＲＥＴ対から）切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、標識された検出器ｓｓＤＮＡが（例えば、クエンチャー／蛍光体対から）切断される場合、第２の検出可能なシグナルを生成する。したがって、場合によっては、標識された検出器ｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対及びクエンチャー／蛍光体対を含む。
場合によっては、標識された検出器ｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む。ＦＲＥＴは、それによって励起状態のフルオロフォアから極めて近接した第２の発色団へのエネルギーの無放射移動が起こるプロセスである。エネルギー移動が起こり得る範囲は、約１０ナノメートル（１００オングストローム）に限定され、転写の効率は、フルオロフォア間の分離距離に非常に敏感である。したがって、本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴ」（「蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）共鳴エネルギー移動」、「蛍光（Ｆｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動」としても知られる）という用語は、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重複するように選択され、さらに、ドナー及びアクセプターが互いに極めて近接している（通常１０ｎｍ以下）場合、エネルギーの一部が量子結合効果によりドナーからアクセプターへ通過する際に、ドナーの励起がアクセプターの隆起及びそれからの発光を生じさせるように選択された、ドナーフルオロフォア及び一致するアクセプターフルオロフォアに関与する物理現象を指す。したがって、ＦＲＥＴシグナルは、ドナー及びアクセプターの近接ゲージとして機能し、それらが互いに極めて近接している場合にのみ生成されるシグナルである。ＦＲＥＴドナー部分（例えば、ドナーフルオロフォア）及びＦＲＥＴアクセプター部分（例えば、アクセプターフルオロフォア）は、本明細書において集合的に「ＦＲＥＴ対」と称される。
ドナーアクセプター対（ＦＲＥＴドナー部分及びＦＲＥＴアクセプター部分）は、本明細書において「ＦＲＥＴ対」または「シグナルＦＲＥＴ対」と称される。したがって、場合によっては、対象の標識された検出器ｓｓＤＮＡは、２つのシグナルパートナー（シグナル対）を含み、一方のシグナルパートナーがＦＲＥＴドナー部分である場合、他方のシグナルパートナーはＦＲＥＴアクセプター部分である。したがって、そのようなＦＲＥＴ対（ＦＲＥＴドナー部分及びＦＲＥＴアクセプター部分）を含む、対象の標識された検出器ｓｓＤＮＡは、シグナルパートナーが極めて近接している場合（例えば、同じＲＮＡ分子上にある間）は、検出可能なシグナル（ＦＲＥＴシグナル）を示すであろうが、パートナーが分離している場合（例えば、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドによるＲＮＡ分子の切断後）は、シグナルは低減する（または不在となる）であろう。
ＦＲＥＴドナー及びアクセプター部分（ＦＲＥＴ対）は当業者に既知であり、任意の簡便なＦＲＥＴ対（例えば、任意の簡便なドナー及びアクセプター部分対）を使用することができる。好適なＦＲＥＴ対の例としては、表１に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１６ Ｓｅｐ １４；１６（９）及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ａｕｇ ３；１０（８）：ｅ０１３４４３６も参照されたい。
（表１）ＦＲＥＴ対の例（ドナー及びアクセプターＦＲＥＴ部分）
Figure 0007239725000079
（１）５－（２－ヨードアセチルアミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸
（２）Ｎ－（４－ジメチルアミノ－３，５－ジニトロフェニル）マレイミド
（３）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル
（４）４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン
場合によっては、検出可能なシグナルは、標識された検出器ｓｓＤＮＡが切断されたときに生成される（例えば、場合によっては、標識された検出器ｓｓＤＮＡは、クエンチャー／蛍光体対を含む）。シグナルクエンチング対の一方のシグナルパートナーは、検出可能なシグナルを生成し、他方のシグナルパートナーは、第１のシグナルパートナーの検出可能なシグナルをクエンチするクエンチャー部分である（すなわち、クエンチャー部分は、シグナルパートナーが互いに近接している場合に、例えば、シグナル対のシグナルパートナーが極めて近接している場合に、シグナル部分からのシグナルが低減される（クエンチされる）ように、シグナル部分のシグナルをクエンチする）。
例えば、場合によっては、検出可能なシグナルの量は、標識された検出器ｓｓＤＮＡが切断されたときに増加する。例えば、場合によっては、例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドによる切断の前に両方が同一のｓｓＤＮＡ分子上に存在する場合、一方のシグナルパートナー（シグナル部分）によって示されるシグナルは、他方のシグナルパートナー（クエンチャ－シグナル部分）によってクエンチされる。そのようなシグナル対は、本明細書において「クエンチャー／蛍光体対」、「クエンチング対」、または「シグナルクエンチング対」と称される。例えば、場合によっては、一方のシグナルパートナー（例えば、第１のシグナルパートナー）は、第２のシグナルパートナー（例えば、クエンチャー部分）によってクエンチされる検出可能なシグナルを生成するシグナル部分である。したがって、そのようなクエンチャー／蛍光体対のシグナルパートナーは、（例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドによる検出器ｓｓＤＮＡの切断後に）パートナーが分離された場合、検出可能なシグナルを生成するであろうが、（例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドによる検出器ｓｓＤＮＡの切断前に）パートナーが極めて近接している場合、シグナルはクエンチされるであろう。
クエンチャー部分は、（例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドによる検出器ｓｓＤＮＡの切断前に）シグナル部分からシグナルを様々な程度にクエンチすることができる。場合によっては、クエンチャー部分は、シグナル部分からシグナルをクエンチし、クエンチャー部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接している場合）で検出されたシグナルは、クエンチャー部分の不在下（シグナルパートナーが分離されている場合）で検出されたシグナルの９５％以下である。例えば、場合によっては、クエンチャー部分の存在下で検出されるシグナルは、クエンチャー部分の不在下で検出されるシグナルの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下であり得る。場合によっては、シグナル（例えば、上記バックグラウンド）は、クエンチャー部分の存在下では検出されない。
場合によっては、クエンチャー部分の不在下（シグナルパートナーが分離されている場合）で検出されるシグナルは、クエンチャー部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接している場合）で検出されるシグナルより、少なくとも１．２倍大きい（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍大きい）。
場合によっては、シグナル部分は、蛍光標識である。いくつかのこのような場合では、クエンチャー部分は、蛍光標識からのシグナル（光シグナル）を（例えば、標識の発光スペクトルのエネルギーを吸収することによって）クエンチする。したがって、クエンチャー部分がシグナル部分に近接していない場合、シグナルはクエンチャー部分によって吸収されないため、蛍光標識からの発光（シグナル）は検出可能である。任意の簡便なドナーアクセプター対（シグナル部分／クエンチャー部分対）を使用することができ、多くの好適な対が当該技術分野で既知である。
場合によっては、クエンチャー部分は、シグナル部分（本明細書において「検出可能な標識」とも称される）からエネルギーを吸収し、次いでシグナル（例えば、異なる波長の光）を発光する。したがって、場合によっては、クエンチャー部分はそれ自体がシグナル部分であり（例えば、シグナル部分は、６－カルボキシフルオレセインであり得、一方でクエンチャー部分は、６－カルボキシ－テトラメチルローダミンであり得る）、いくつかのそのような場合では、対はまた、ＦＲＥＴ対でもあり得る。場合によっては、クエンチャー部分は、ダーククエンチャーである。ダーククエンチャーは、励起エネルギーを吸収し、エネルギーを別の方法で（例えば、熱として）消散することができる。したがって、ダーククエンチャーは、それ自体は最小の蛍光を有するか、または蛍光を有しない（蛍光を発光しない）。ダークエンチャーの例は、米国特許第８，８２２，６７３号、及び同第８，５８６，７１８号、米国特許公開第２０１４／０３７８３３０号、同第２０１４／０３４９２９５号、及び同第２０１４／０１９４６１１号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２００１／４２５０５号、及びＷＯ２００１／８６００１号（これらは全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
蛍光標識の例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、及びＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅから選択される蛍光標識である。
場合によっては、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である。
ＡＴＴＯ色素の例としては、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、及びＡＴＴＯ ７４０が挙げられるが、これらに限定されない。
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素の例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０等が挙げられるが、これらに限定されない。
クエンチャー部分の例としては、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、ＱＳＹ ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金ナノ粒子などの金属クラスター等が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、クエンチャー部分は、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、ＱＳＹ ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金属クラスターから選択される。
ＡＴＴＯクエンチャーの例としては、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ ６１２Ｑが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））の例としては、ＢＨＱ－０（４９３ｎｍ）、ＢＨＱ－１（５３４ｎｍ）、ＢＨＱ－２（５７９ｎｍ）、及びＢＨＱ－３（６７２ｎｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの検出可能な標識（例えば、蛍光色素）及び／またはクエンチャー部分の例については、例えば、Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．２００９；１１：２５－４７、ならびに米国特許第８，８２２，６７３号、及び同第８，５８６，７１８号、米国特許公開第２０１４／０３７８３３０号、同第２０１４／０３４９２９５号、同第２０１４／０１９４６１１号、同第２０１３／０３２３８５１号、同第２０１３／０２２４８７１号、同第２０１１／０２２３６７７号、同第２０１１／０１９０４８６号、同第２０１１／０１７２４２０号、同第２００６／０１７９５８５号、及び同第２００３／０００３４８６号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２００１／４２５０５号、及び同第ＷＯ２００１／８６００１号（これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に含まれる）を参照されたい。
場合によっては、標識された検出器ｓｓＤＮＡの切断は、比色分析の読み出しを測定することによって検出することができる。例えば、フルオロフォアの遊離（例えば、ＦＲＥＴ対からの遊離、クエンチャー／蛍光体対からの遊離等）は、検出可能なシグナルの波長シフト（及び、したがって色ずれ）をもたらすことができる。したがって、場合によっては、対象の標識された検出器ｓｓＤＮＡの切断は、色ずれによって検出することができる。このようなシフトは、ある色（波長）のシグナルの量の損失、別の色の量の増加、ある色の別の色に対する比率の変化等のように表すことができる。
遺伝子導入の非ヒト生物
上記のように、場合によっては、本開示の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）（例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）を導入遺伝子として使用して、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドを産生する遺伝子導入の非ヒト生物を生成する。本開示は、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子導入の非ヒト生物を提供する。
遺伝子導入の非ヒト動物
本開示は、遺伝子導入の非ヒト動物を提供し、この動物は、Ｃａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子導入の非ヒト動物のゲノムは、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。場合によっては、遺伝子導入の非ヒト動物は、遺伝子改変のためにホモ接合性である。場合によっては、遺伝子導入の非ヒト動物は、遺伝子改変のためにヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入の非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、魚類（例えば、サケ、トラウト、ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚等）、両生類（カエル、イモリ、サンショウウオ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥等）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲ等）、非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄類、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等、ウサギ類（例えば、ウサギ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類等）等である。場合によっては、遺伝子導入の非ヒト動物は、無脊椎動物である。場合によっては、遺伝子導入の非ヒト動物は、昆虫（例えば、蚊、農業害虫等）である。場合によっては、遺伝子導入の非ヒト動物は、クモ類である。
本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、未知のプロモーターの制御下にあり得るか（すなわち作動可能に連結される）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれる場合）、または既知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、作動可能に連結される）。好適な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等）、空間的制約及び／または時間的制約のあるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）等を含み得る。
遺伝子導入植物
上記のように、場合によっては、本開示の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）（例えば、本開示のＣａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）を導入遺伝子として使用して、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドを産生する遺伝子導入植物を生成する。本開示は、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子導入植物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子導入植物のゲノムは、対象の核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子導入植物は、遺伝子改変のためにホモ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入植物は、遺伝子改変のためにヘテロ接合性である。
外因性核酸を植物細胞に導入する方法は、当該技術分野において周知である。そのような植物細胞は、上記に定義されるように「形質転換された」と見なされる。好適な方法としては、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、形質移入、共役、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、炭化ケイ素ウィスカー技術、アグロバクテリウム媒介型形質転換等が挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類、及び形質転換が起こる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。
土壌細菌のアグロバクテリウム・ツメファシエンスに基づく形質転換方法は、外因性核酸分子を維管束植物に導入するために特に有用である。野生型形態のアグロバクテリウムは、宿主植物上で成長する腫瘍原性クラウンゴールの産生を配向するＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドを含有する。Ｔｉプラスミドの腫瘍誘導Ｔ－ＤＮＡ領域の、植物ゲノムへの移行は、Ｔｉプラスミドにコードされた病原性遺伝子ならびにＴ－ＤＮＡ境界を必要とし、これらは移行される領域を描写する直接ＤＮＡ反復のセットである。アグロバクテリウムベースのベクターは、改変形態のＴｉプラスミドであり、腫瘍誘導機能は、植物宿主に導入される関心対象の核酸配列によって置換される。
アグロバクテリウム媒介型形質転換は、一般に、融合体ベクターまたはバイナリベクター系を用い、Ｔｉプラスミドの構成要素は、アグロバクテリウム宿主に永久に常駐し、病原性遺伝子を担持するヘルパーベクターと、Ｔ－ＤＮＡ配列によって限定された関心対象の遺伝子を含有するシャトルベクターとに分けられる。様々なバイナリベクターが、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。例えば、アグロバクテリウムを培養された植物細胞、または葉組織、根外植片、子葉下部、茎断片もしくは塊茎などの損傷組織とともに共培養する方法も、当該技術分野において周知である。例えば、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照されたい。
マイクロプロジェクタイル媒介型形質転換を使用して、対象の遺伝子導入植物を産生することもできる。Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０－－７３（１９８７））によって最初に説明されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールでの沈降によって所望の核酸分子でコーティングされた金またはタングステンなどのマイクロプロジェクタイルに依存する。マイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＤ－１０００（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆ．）などのデバイスを使用して、被子植物組織中に高速で進められる。
本開示の核酸（例えば、本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組み換え発現ベクター））は、核酸が、例えば、インビボまたはエクスビボプロトコルにより植物細胞（複数可）に侵入することができるような方法で植物に導入され得る。「インビボ」とは、核酸が植物の生体に投与されること、例えば、浸潤を意味する。「エクスビボ」とは、細胞または外植片が、植物の外側で改変され、次いでそのような細胞または器官が、植物に再生されることを意味する。植物細胞の安定した形質転換または遺伝子導入植物の確立に好適ないくつかのベクターが記載されており、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載されるものが挙げられる。具体的な例としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するもの、ならびにＨｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９、Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：８７１１－８７２１、Ｋｌｅｅ（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ３：６３７－６４２によって開示されるものが挙げられる。あるいは、非Ｔｉベクターを使用して、遊離ＤＮＡ送達技法を使用することによって、ＤＮＡを植物及び細胞に移行させることができる。これらの方法を使用することによって、小麦、米（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７－９及び４４６２）ならびにトウモロコシ（Ｇｏｒｄｏｎ－Ｋａｍｍ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３－６１８）などの遺伝子導入植物を産生することができる。未熟な胚もまた、粒子ガンを使用することによる直接ＤＮＡ送達技法（Ｗｅｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０２：１０７７－１０８４、Ｖａｓｉｌ（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ １０：６６７－６７４、Ｗａｎ ａｎｄ Ｌｅｍｅａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７－４８、及びアグロバクテリウム媒介型ＤＮＡ移行（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：７４５－７５０）のための単子葉植物の良好な標的組織であり得る。ＤＮＡを葉緑体に導入するための例示的な方法は、微粒子銃ボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションである（Ｄａｎｉｅｌｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３４５－３４８，１９９８、Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：３３３－３３８，２０００、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７２９－７３８，１９９３、Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９０６－９０９、米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１７号、同第５，５４５，８１８号、及び同第５，５７６，１９８号、国際出願第ＷＯ９５／１６７８３号、ならびにＢｏｙｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５１０－５３６（１９９３）、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３－９１７（１９９３）、及びＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１－７３０５（１９９４））。微粒子銃ボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションの方法に好適な任意のベクターは、葉緑体形質転換のための標的化ベクターとして好適である。任意の二本鎖ＤＮＡベクターは、特に導入の方法がアグロバクテリウムを利用しないときに、形質転換ベクターとして使用され得る。
遺伝子改変することができる植物は、穀物、飼料作物、果物、野菜、油料種子作物、ヤシ、森林、及びつる植物が含まれる。改変され得る植物の具体的な例としては、トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、エンドウマメ、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、タバコ、小麦、大麦、オート麦、ジャガイモ、大豆、綿、カーネーション、モロコシ、ハウチワマメ、及び米が挙げられる。
本開示は、形質転換された植物細胞、組織、植物、及び形質転換された植物細胞を含有する産生物を提供する。対象の形質転換細胞、及び組織、ならびにそれらを含む産生物の特徴は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸の存在、及び植物細胞による本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドの産生である。本発明の組み換え植物細胞は、組み換え細胞の集合として、または組織、種子、全植物、幹、果実、葉、根、花、幹、塊茎、穀物、動物飼料、植物の分野等において有用である。
本開示のＣａｓ１２ＪポリペプチドまたはＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、未知のプロモーターの制御下にあり得るか（すなわち作動可能に連結される）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれる場合）、または既知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、作動可能に連結される）。好適な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり得、構成的に活性なプロモーター、誘導性プロモーター、空間的制約及び／または時間的制約のあるプロモーター等が挙げられる。
本開示の非限定的な態様の例
上述の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を制限することなく、１～１４９の番号が付けられた本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々の番号が付けられた態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
態様１．
ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、または前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする核酸分子と、
ｂ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、または前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と
を含む、組成物。
態様２．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１の組成物。
態様３．前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡが、図７に示されるｃｒＲＮＡ配列のいずれか１つと８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様１または態様２の組成物。
態様４．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合している、態様１または態様２の組成物。
態様５．脂質を含む、態様１～４のいずれか１つの組成物。
態様６．ａ）及びｂ）が、リポソーム内にある、態様１～４のいずれか１つの組成物。
態様７．ａ）及びｂ）が、粒子内にある、態様１～４のいずれか１つの組成物。
態様８．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤のうちの１つ以上を含む、態様１～７のいずれか１つの組成物。
態様９．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１～８のいずれか１つの組成物。
態様１０．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、態様１～９のいずれか１つの組成物。
態様１１．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、触媒的に不活性なＣａｓ１２Ｊポリペプチド（ｄＣａｓ１２Ｊ）である、態様１～９のいずれか１つの組成物。
態様１２．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３のＤ４６４、Ｅ６７８、及びＤ７６９から選択される位置に対応する位置に１つ以上の変異を含む、態様１０または態様１１の組成物。
態様１３．ＤＮＡドナー鋳型をさらに含む、態様１～１２のいずれか１つの組成物。
態様１４．異種ポリペプチドと融合したＣａｓ１２Ｊポリペプチドを含む、Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様１５．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１４のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様１６．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１４のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様１７．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、態様１４～１６のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様１８．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、触媒的に不活性なＣａｓ１２Ｊポリペプチド（ｄＣａｓ１２Ｊ）である、態様１４～１７のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様１９．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３のＤ４６４、Ｅ６７８、及びＤ７６９から選択される位置に対応する位置に１つ以上の変異を含む、態様１７または態様１８のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２０．前記異種ポリペプチドが、前記Ｃａｓ１２ＪポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端と融合している、態様１４～１９のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２１．核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、態様１４～２０のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２２．前記異種ポリペプチドが、標的細胞または標的細胞型上の細胞表面部分への結合を提供する標的化ポリペプチドである、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２３．前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを改変する酵素活性を示す、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２４．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様２３のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２５．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様２４のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２６．前記異種ポリペプチドが、標的核酸と会合した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を示す、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２７．前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を示す、態様２６のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２８．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様２６または態様２７のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様２９．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様２８のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３０．前記異種ポリペプチドが、エンドソーム脱出ポリペプチドである、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３１．前記エンドソーム脱出ポリペプチドが、
Figure 0007239725000080
から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される、態様３０のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３２．前記異種ポリペプチドが、葉緑体輸送ペプチドである、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３３．前記異種ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインを含む、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３４．前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３５．前記異種ポリペプチドが、転写リプレッサードメインである、態様３４のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３６．前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、態様３４のＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３７．前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、態様１４～２１のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド。
態様３８．態様１４～３７のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
態様３９．前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結している、態様３８の核酸。
態様４０．前記プロモーターが、真核細胞で機能する、態様３９の核酸。
態様４１．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上で機能する、態様４０の核酸。
態様４３．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、態様３９～４１のいずれか１つの核酸。
態様４３．組み換え発現ベクターである、態様３８～４２のいずれか１つの核酸。
態様４４．前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、態様４３の核酸。
態様４５．前記プロモーターが、原核細胞で機能する、態様３９の核酸。
態様４６．前記核酸分子が、ｍＲＮＡである、態様３８の核酸。
態様４７．
（ａ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、
（ｂ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
を含む、１つ以上の核酸。
態様４８．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様４７の１つ以上の核酸。
態様４９．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様４７の１つ以上の核酸。
態様５０．前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡが、図７に記載のｃｒＲＮＡ配列のいずれか１つと８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様４７～４９のいずれか１つの１つ以上の核酸。
態様５１．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合している、態様４７～５０のいずれか１つの１つ以上の核酸。
態様５２．前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結している、態様４７～５１のいずれか１つの１つ以上の核酸。
態様５３．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結している、態様４７～５２のいずれか１つの１つ以上の核酸。
態様５４．前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結している前記プロモーター、及び／または前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結している前記プロモーターが、真核細胞で機能する、態様５２または態様５３の１つ以上の核酸。
態様５５．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上で機能する、態様５４の１つ以上の核酸。
態様５６．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、態様５３～５５のいずれか１つの１つ以上の核酸。
態様５７．１つ以上の組み換え発現ベクターである、態様４７～５６のいずれか１つの１つ以上の核酸。
態様５８．前記１つ以上の組み換え発現ベクターが、１つ以上のアデノ随伴ウイルスベクター、１つ以上の組み換えレトロウイルスベクター、または１つ以上の組み換えレンチウイルスベクターから選択される、態様５７の１つ以上の核酸。
態様５９．前記プロモーターが、原核細胞で機能する、態様５３の１つ以上の核酸。
態様６０．
ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、または前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、または前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び
ｃ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、または前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
のうちの１つ以上を含む、真核細胞。
態様６１．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている、態様６０の真核細胞。
態様６２．植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ細胞、真菌細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、無脊椎動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、態様６０または態様６１の真核細胞。
態様６３．Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、または前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むことを含む、細胞。
態様６４．原核細胞である、態様６３の細胞。
態様６５．前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸を含み、前記核酸分子が、前記細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている、態様６３または態様６４の細胞。
態様６６．標的核酸を改変する方法であって、前記方法が、前記標的核酸を、
ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、及び
ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ
と接触させることを含み、前記接触が、前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドによる前記標的核酸の改変をもたらす、
前記方法。
態様６７．前記改変が、前記標的核酸の切断である、態様６６の方法。
態様６８．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、態様６６または態様６７の方法。
態様６９．前記接触が、細胞の外部でインビトロで起きる、態様６６～６８のいずれかの方法。
態様７０．前記接触が、培養中の細胞の内部で起きる、態様６６～６８のいずれの方法。
態様７１．前記接触が、インビボで細胞の内部で起きる、態様６６～６８のいずれかの方法。
態様７２．前記細胞が、真核細胞である、態様７０または態様７１の方法。
態様７３．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞から選択される、態様７２の方法。
態様７４．前記細胞が、原核細胞である、態様７０または態様７１の方法。
態様７５．前記接触が、ゲノム編集をもたらす、態様６６～７４のいずれか１つの方法。
態様７６．前記接触が、細胞に、
（ａ）前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、または前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び
（ｂ）前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、または前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を導入することを含む、態様６６～７５のいずれか１つの方法。
態様７７．前記接触が、ＤＮＡドナー鋳型を前記細胞に導入することをさらに含む、態様７６の方法。
態様７８．前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡが、図７に記載のｃｒＲＮＡ配列のいずれか１つと８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様６６～７７のいずれか１つの方法。
態様７９．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、核局在化シグナルと融合している、態様６６～７８のいずれか１つの方法。
態様８０．標的ＤＮＡからの転写を調節する方法、標的核酸を改変する方法、または標的核酸と会合したタンパク質を修飾する方法であって、前記標的核酸を、
ａ）異種ポリペプチドと融合されたＣａｓ１２Ｊポリペプチドを含むＣａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、及び
ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ
と接触させることを含む、前記方法。
態様８１．前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡが、図７に記載のｃｒＲＮＡ配列のいずれか１つと８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様８０の方法。
態様８２．前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドが、核局在化シグナルを含む、態様８０または態様８１の方法。
態様８３．前記改変が、前記標的核酸の切断ではない、態様８０～８２のいずれかの方法。
態様８４．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、態様８０～８３のいずれかの方法。
態様８５．前記接触が、細胞の外部でインビトロで起きる、態様８０～８４のいずれかの方法。
態様８６．前記接触が、培養中の細胞の内部で起きる、態様８０～８４のいずれかの方法。
態様８７．前記接触が、インビボで細胞の内部で起きる、態様８０～８４のいずれかの方法。
態様８８．前記細胞が、真核細胞である、態様８６または態様８７の方法。
態様８９．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞から選択される、態様８８の方法。
態様９０．前記細胞が、原核細胞である、態様８６または態様８７の方法。
態様９１．前記接触が、細胞に、
（ａ）前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、または前記Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び
（ｂ）前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、または前記Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を導入することを含む、態様８０～９０のいずれか１つの方法。
態様９２．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、触媒的に不活性なＣａｓ１２Ｊポリペプチド（ｄＣａｓ１２Ｊ）である、態様８０～９１のいずれか１つの方法。
態様９３．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３のＤ４６４、Ｅ６７８、及びＤ７６９から選択される位置に対応する位置に１つ以上の変異を含む、態様８０～９２のいずれか１つの方法。
態様９４．前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを改変する酵素活性を示す、態様８０～９３のいずれか１つの方法。
態様９５．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様９４の方法。
態様９６．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様９５の方法。
態様９７．前記異種ポリペプチドが、標的核酸と会合した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を示す、態様８０～９３のいずれか１つの方法。
態様９８．前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を示す、態様９７の方法。
態様９９．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様９７または態様９８の方法。
態様１００．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を示す、態様９９の方法。
態様１０１．前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、態様８０～９３のいずれか１つの方法。
態様１０２．前記異種ポリペプチドが、転写リプレッサードメインである、態様１０１の方法。
態様１０３．前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、態様１０１の方法。
態様１０４．前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、態様８０～９３のいずれか１つの方法。
態様１０５．遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物であって、そのゲノムが、
ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、
ｂ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、及び
ｃ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ
のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、前記遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
態様１０６．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１０５の遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
態様１０７．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１０５の遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
態様１０８．前記生物が、植物、単子葉植物、双子葉植物、無脊椎動物、昆虫、節足動物、クモ、寄生虫、蠕虫、刺胞動物、脊椎動物、魚類、爬虫類、両生類、有蹄動物、鳥類、ブタ、ウマ、ヒツジ、齧歯類、マウス、ラット、または非ヒト霊長類である、態様１０５～１０７のいずれか１つの遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
態様１０９．以下のうちの１つを含むシステム：
ａ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、
ｂ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
ｃ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、
ｄ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチド、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
ｅ）Ｃａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、
ｆ）Ｃａｓ１２ＪポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
ｇ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及びＣａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、
ｈ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
ｉ）（ｉ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター、
ｊ）（ｉ）Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ＤＮＡドナー鋳型と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター、
ｋ）（ｉ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター、及び
ｌ）（ｉ）Ｃａｓ１２Ｊ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ＤＮＡドナー鋳型と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター。
態様１１０．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１０９のＣａｓ１２Ｊシステム。
態様１１１．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１０９のＣａｓ１２Ｊシステム。
態様１１２．前記ドナー鋳型核酸が、８ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドの長さを有する、態様１０９～１１１のいずれかのＣａｓ１２Ｊシステム。
態様１１３．前記ドナー鋳型核酸が、２５ヌクレオチド～５００ヌクレオチドの長さを有する、態様１０９～１１１のいずれかのＣａｓ１２Ｊシステム。
態様１１４．態様１０９～１１３のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊシステムを含む、キット。
態様１１５．前記キットの構成要素が、同じ容器にある、態様１１４のキット。
態様１１６．前記キットの構成要素が、別個の容器にある、態様１１４のキット。
態様１１７．態様１０９～１１６のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊシステムを含む、滅菌容器。
態様１１８．前記容器が、シリンジである、態様１１７の滅菌容器。
態様１１９．態様１０９～１１６のいずれか１つのＣａｓ１２Ｊシステムを含む、埋め込み型デバイス。
態様１２０．前記Ｃａｓ１２Ｊシステムが、マトリックス内にある、態様１１９の埋め込み型デバイス。
態様１２１．前記Ｃａｓ１２Ｊシステムが、リザーバにある、態様１１９の埋め込み型デバイス。
態様１２２．試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、
（ｉ）Ｃａｓ１２Ｌポリペプチド、
（ｉｉ）前記Ｃａｓ１２Ｌポリペプチドに結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列と、を含む、ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない検出器ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｂ）前記Ｃａｓ１２Ｌポリペプチドによる前記一本鎖検出器ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記標的ＤＮＡを検出することと
を含む、前記方法。
態様１２３．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、態様１２２の方法。
態様１２４．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、態様１２２の方法。
態様１２５．前記標的ＤＮＡが、細菌ＤＮＡである、態様１２２～１２４のいずれか１つの方法。
態様１２６．標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、態様１２２～１２４のいずれか１つの方法。
態様１２７．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヘパドナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、態様１２６の方法。
態様１２８．前記標的ＤＮＡが、ヒト細胞由来である、態様１２２の方法。
態様１２９．前記標的ＤＮＡが、ヒト胎児またはがん細胞ＤＮＡである、態様１２２の方法。
態様１３０．前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドが、図６Ａ～６Ｒのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１２２～１２９のいずれか１つの方法。
態様１３１．前記試料が、細胞溶解物からのＤＮＡを含む、態様１２２の方法。
態様１３２．前記試料が、細胞を含む、態様１２２の方法。
態様１３３．前記試料が、血液、血清、血漿、尿、吸引液、または生検試料である、態様１２２の方法。
態様１３４．前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することをさらに含む、態様１２２～１３３のいずれか１つの方法。
態様１３５．前記検出可能なシグナルを測定することが、視覚ベースの検出、センサベースの検出、色検出、金ナノ粒子ベースの検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースの感知のうちの１つ以上を含む、態様１２２の方法。
態様１３６．前記標識された検出器ＤＮＡが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸連結を含む、態様１２２～１３５のいずれか１つの方法。
態様１３７．陽性対照試料中の陽性対照標的ＤＮＡを検出することをさらに含み、前記検出が、
（ｃ）前記陽性対照試料を、
（ｉ）前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチド、
（ｉｉ）前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドに結合する領域と、前記陽性対照標的ＤＮＡとハイブリダイズする陽性対照ガイド配列と、を含む、陽性対照ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記陽性対照ガイドＲＮＡの前記陽性対照ガイド配列とハイブリダイズしない標識された検出器ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｄ）前記Ｃａｓ１２Ｊポリペプチドによる前記標識された検出器ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記陽性対照標的ＤＮＡを検出することと
を含む、態様１２２～１３５のいずれか１つの方法。
態様１３８．前記検出可能なシグナルが、４５分未満で検出可能である、態様１２２～１３６のいずれか１つの方法。
態様１３９．前記検出可能なシグナルが、３０分未満で検出可能である、態様１２２～１３６のいずれか１つの方法。
態様１４０．ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、分岐（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノムの指数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、または等温複数置換増幅（ＩＭＤＡ）により、前記試料中の前記標的ＤＮＡを増幅することをさらに含む、態様１２２～１３９のいずれか１つの方法。
態様１４１．前記試料中の標的ＤＮＡが、１０ａＭ未満の濃度で存在する、態様１２２～１４０のいずれか１つの方法。
態様１４２．前記一本鎖検出器ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、態様１２２～１４１のいずれか１つの方法。
態様１４３．前記蛍光発光色素対が、前記一本鎖検出器ＤＮＡの切断前に、検出可能なシグナルの量を生成し、前記検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出器ＤＮＡの切断後に低下する、態様１４２の方法。
態様１４４．前記一本鎖検出器ＤＮＡが、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、前記一本鎖検出器ＤＮＡの切断後に第２の検出可能なシグナルを生成する、態様１４２の方法。
態様１４５．前記蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、態様１４２～１４４のいずれか１つの方法。
態様１４６．検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出器ＤＮＡの切断後に増加する、態様１４２の方法。
態様１４７．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、態様１４２～１４６のいずれか１つの方法。
態様１４８．前記一本鎖検出器ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、態様１４２～１４７のいずれか１つの方法。
態様１４９．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及びクエンチャー／蛍光体対を含む、態様１４８の方法。
以下の実施例は、当業者に本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示するものであり、本発明者らが考える発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施した全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。標準的な略語、例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃは皮下の（に）、等が使用され得る。
実施例１
多くの多様な生態系からのメタゲノムデータセットを生成し、長さ２００ｋｂｐ～７１６ｋｂｐの数百の巨大ファージゲノムを再構築した。まだ報告されていない最大のファージゲノムを含む、３４のゲノムを手作業で精選して完成させた。拡張された遺伝子レパートリーには、多様で新しいＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ修飾酵素、開始及び延長因子、ならびにリボソームタンパク質が含まれる。ファージＣＲＩＳＰＲは、潜在的に、生体合成をファージにコードされた機能に再配向するために翻訳を妨害するより大きな相互作用ネットワークの一部として、宿主転写因子及び翻訳遺伝子を発現停止させる能力を有する。いくつかのファージは、競合するファージを排除するためにファージ防御のための細菌系を別の目的で使用する。ヒト及び他の動物微生物叢、海洋、湖、堆積物、土壌、ならびに構築環境由来の７つの巨大なファージの主要分岐群が系統的に定義された。大規模な遺伝子インベントリは、広範な細菌宿主範囲にわたって観察され、地球の生態系にわたって巨大なファージの分布をもたらす保存された生物学的戦略を反映していると結論付けられる。
多種多様な生態系から生成された微生物叢データセットから再構築された長さ２００ｋｂｐ超の数百のファージ配列が提示された。長さが最大６４２ｋｂｐの範囲の、これまでに知られているファージの３つの最大の完全ゲノムを再構築した。グラフィカルアブストラクトは、アプローチ及び主な所見の概要を提供する。この研究は、ファージの生物多様性の理解を拡大し、ファージが小細胞細菌に匹敵するゲノムサイズを有する様々な生態系を明らかにする。
生態系サンプリング
メタゲノムデータセットは、ヒトの糞便及び経口試料、他の動物からの糞便試料、淡水湖及び河川、海洋生態系、堆積物、温泉、土壌、深部地下生息圏、ならびに構築環境から取得した（図５）。これらのサブセットについては、細菌、古細菌、及び真核生物の分析が以前に公開された。明らかに細菌、古細菌、古細菌ウイルス、真核、または真核ウイルスではなかったゲノム配列を、それらの遺伝子インベントリに基づいて、ファージまたはプラスミド様のいずれかとして分類した。２００ｋｂｐ近くまたは２００ｋｂｐ超の長さの新規に組み立てられた断片を、環化について試験し、手作業による検証及び精選のために選択されたサブセットを完成させた（方法を参照されたい）。
ゲノムサイズ及び基本的な特徴
３５８のファージ、３つのプラスミド、及び４つのファージ－プラスミド配列を再構築した（図５）。プラスミドであると推測される追加の配列を除外し（方法を参照されたい）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ座位をコードする配列のみを保持した（以下を参照されたい）。ファージとしての分類と一致して、溶解及びコード構造タンパク質に関与するものを含む多種多様なファージ関連遺伝子が特定され、他の予想されるファージゲノム特徴が文書化された。いくつかのファージ予測タンパク質は、大きく、最大７６９４アミノ酸長である。これらの多くは構造タンパク質として暫定的に注釈付けされた。１８０のファージ配列を環化し、３４を、場合によっては、複合体反復領域及びそれらのコードされたタンパク質を分解することによって、手作業で精選して完了させた（方法を参照されたい）。いくつかのゲノムは、双方向複製のための明確なＧＣ歪みシグナルを示し、これは、それらの複製起源を制約する情報である。３つの最大の完全な手作業による精選及び環化ファージゲノムは、６３４、６３６、及び６４３ｋｂｐの長さであり、これまでに報告された最大のファージゲノムを表す。以前、最大の環化ファージゲノムの長さは５９６ｋｂｐであった（Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）（上記））。同研究では長さ６３０ｋｂｐの環化ゲノムが報告されているが、これは人工物である。連結配列の問題は、ＩＭＧ－ＶＲにおいて十分に顕著であり、これらのデータはさらなる分析に含まれなかった。ファージゲノムサイズの分布の現在の図を示すために、研究、Ｒｅｆｓｅｑ、及び公開された研究からの完全な環化ゲノムを使用した（方法）。完全なファージのゲノムサイズの中央値は、約５２ｋｂｐであり（図１Ａ）、以前に報告された約５４ｋｂｐの平均サイズと類似する（Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）（上記））。したがって、ここで報告される配列は、異常に大きなゲノムを有するファージのインベントリを実質的に拡大する（図１Ｂ）。
興味深いことに、長さ７１２及び７１６超ｋｂｐの２つの関連配列を特定し、手作業により精選した（図５）。これらは、それらの全体的なゲノム含有量及びターミナーゼ遺伝子の存在に基づいてファージとして分類された。アセンブリは、両ゲノム末端の小さな反復で構成される数ｋｂ長の複合体領域によって複雑である。反復領域を合理化することができれば、これらのゲノムを閉鎖することができると予想される。
いくつかのゲノムは、遺伝子予測に使用されるものとは異なる遺伝子コードの使用に起因して、非常に低いコード密度（９が７５％未満）を有する。Ｌａｋファージについても同様の現象が報告された（Ｄｅｖｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄ Ｉｖａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４：９０９－９１３）。以前の研究とは異なり、ゲノムは、ＴＡＧ、通常は停止コドンがアミノ酸をコードする遺伝子コード１６を使用するように思われる。
一例のみで、隣接細菌ゲノム配列への移行に基づいてプロファージとして分類された２００ｋｂｐ超の配列が特定された。しかしながら、約半数のゲノムは環化されなかったため、プロファージからのそれらの誘導体を除外することはできない。いくつかのゲノムにおけるインテグラーゼの存在は、いくつかの条件下での溶原性ライフスタイルを示唆する。
宿主、多様性、及び分布
興味深い質問は、巨大なゲノムを有するファージの進化の歴史に関する。それらは、正常なサイズのファージの分岐群内の最近のゲノム拡大の結果であるのか、または遺伝子の大量のインベントリが確立された持続的な戦略であるのかである。これを調査するために、あらゆるサイズのファージの公開データベースにおいてコンテキスト配列（ｃｏｎｔｅｘｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用するターミナーゼ大サブユニット（図２）及び主要カプシドタンパク質の系統樹を構築した（方法）。大きなファージゲノムからの配列の多くが一緒にクラスター化され、分岐群を定義する。データベース配列についてのゲノムサイズ情報の分析は、これらの分岐群に含まれる公開配列が、少なくとも１２０ｋｂｐの長さのゲノムを有するファージに由来することを示す。ここでＭａｈａｐｈａｇｅ（Ｍａｈａはサンスクリット語で巨大である）と称される最大の分岐群は、本研究の最大ゲノムの全て、ならびにヒト及び動物微生物叢からのＬａｋゲノムを含む（Ｄｅｖｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）（上記））。他の６つの明確に定義された大型ファージのクラスターが特定され、それらは様々な言語で「巨大」を指す単語を使用して命名された。これらの分岐群の存在は、大きなゲノムサイズが比較的安定した形質であることを確立する。７つの分岐群内で、ファージを多種多様な環境型からサンプリングし、生態系にわたってこれらの大きなファージ及びそれらの宿主の多様化を示す。それらのゲノムが主に整列することができるほど密接に関連するファージの環境分布も調べた。１７の例では、これらのファージは、少なくとも２つのビオトープ型で生じる。
細菌宿主系統発生がファージ分岐群と相関する程度を決定するために、同じまたは関連試料中の細菌からＣＲＩＳＰＲスペーサー標的化、及びファージ上で生じる通常は宿主関連遺伝子の系統発生を使用して、ファージ宿主を特定した（以下を参照されたい）。ファージ遺伝子インベントリの細菌関係の予測値も試験し（方法）、あらゆる場合において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー標的化及び門レベルの系統発生プロファイリングが遺伝子インベントリ特徴付けと一致することが見出された。したがって、この方法を使用して、多くのファージの宿主の門レベルの関係を予測した。結果は、フィルミクテス門（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）及びプロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）宿主の重要性を確立し、他の環境と比較してヒト及び動物の腸においてフィルミクテス門ファージの罹患率が高いことを示す（図５）。特に、４つの最大ゲノム（長さ６３４～７１６ｋｂｐ）は、全て、５４０～５５２ｋｂｐのゲノムを有するＬａｋファージ（Ｄｅｖｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）（上記））と同様に、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）において複製すると予測されるファージ、及びＭａｈａｐｈａｇｅ内の全てのクラスターのためのものである。全体的に、系統的に一緒に群化されたファージは、同じ門の細菌において複製されると予測される。
代謝、転写、翻訳
ファージゲノムは、細菌膜または細胞表面に局在すると予測されるタンパク質をコードする。これらは、他のファージによる感染に対する宿主の感受性に影響を及ぼし得る。感染中に宿主代謝を増強することが示唆される遺伝子のほぼ全ての以前に報告されたカテゴリが特定された。多くのファージは、プリン及びピリミジンの新たな生合成のステップ、ならびに核酸及びリボ核酸ならびにヌクレオチドのリン酸化状態を相互変換する複数のステップに関与する遺伝子を有する。これらの遺伝子セットは、興味深いことに、非常に小さい細胞及び推定的な共生ライフスタイルを有する細菌の遺伝子セットに類似している（Ｃａｓｔｅｌｌｅ ａｎｄ Ｂａｎｆｉｅｌｄ（２０１８）Ｃｅｌｌ １７２：１１８１－１１９７）。
特に、多くのファージは、その予測機能が転写及び翻訳である遺伝子を有する。ファージは、それらの宿主のものとは異なる配列を有する、ゲノムあたり最大６４のｔＲＮＡをコードする。一般に、ゲノムあたりのｔＲＮＡの数は、ゲノムの長さとともに増加する（図１）。それらは、しばしば、それらの宿主のものに関連するが、それらとは異なる、ゲノムあたり最大１６のｔＲＮＡ合成酵素を有する。ファージは、これらのタンパク質を使用して、宿主由来アミノ酸で自身のｔＲＮＡバリアントを充填し得る。ゲノムのサブセットは、ｔＲＮＡ修飾のための遺伝子を有し、ファージ感染に対する宿主防御の一部として切断されたｔＲＮＡを修復する。特定されるのは、ゲノムあたり最大３つの推定リボソームタンパク質であり、その中で最も一般的なのは、ｒｐＳ２１（ファージにおいて最近報告されたばかりの現象）である（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：７５２）、図３）。興味深いことに、ファージｒｐＳ２１配列は、核酸と結合する残基であるアルギニン、リジン、及びフェニルアラニンを豊富に含むＮ末端伸長を有することに留意されたい。これらのファージリボソームタンパク質がリボソーム内の宿主タンパク質の代わりになり（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ（２０１９）（上記）、伸長が翻訳開始部位の近くのリボソーム表面から突出してファージｍＲＮＡを局在化することが予測される。
いくつかのファージは、効率的な翻訳を確実にすることを含む、他のタンパク質合成ステップで機能すると予測される遺伝子を有する。いくつかは、開始因子１もしくは３のいずれか、またはその両方、時には延長因子Ｇ、Ｔｕ、Ｔｓ、及び放出因子もコードする。損傷した転写産物上で失速し、異常なタンパク質の分解を引き起こすリボソームを救出するｔｍＲＮＡ及び小タンパク質Ｂ（ＳｍｐＢ）とともに、リボソームリサイクリング因子をコードする遺伝子も特定される。ｔｍＲＮＡはまた、宿主細胞の生理学的状態を感知するためにファージによって使用され、宿主内で失速したリボソームの数が多いときに溶解を誘導することができる。
これらの観察は、いくつかの大きなファージが実質的にリボソーム機能を妨害し、及び再配向することができる多くの方法を示唆する。ファージｍＲＮＡ配列が、翻訳を開始するために宿主１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端と係合する必要があるため、それらのｍＲＮＡリボソーム結合部位を予測した。ほとんどの場合、ファージｍＲＮＡは、正準シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列を有し、追加の約１５％は、非標準ＳＤ結合部位を有する。しかしながら、興味深いことに、ゲノムが推定または可能なｒｐＳ１をコードするファージは、識別可能なまたは正準ＳＤ配列をほとんど有することがない。したがって、ファージにコードされたｒｐＳ１は、ファージｍＲＮＡの翻訳を選択的に開始し得る。全体的に、ファージ遺伝子は、翻訳の最早ステップを妨害することによって、ファージ遺伝子を好むように宿主のタンパク質産生能力を再配向するように思える。これらの推論は、タンパク質合成のあらゆる段階を制御するいくつかの真核生物ウイルスの所見と一致している（Ｊａａｆａｒ ａｎｄ Ｋｉｅｆｔ（２０１９）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：１１０－１２３）。興味深いことに、いくつかの大型の推定プラスミドは、翻訳関連遺伝子の類似するスイートも有する。
ファージゲノムの約半分は、完璧なヘアピンに折り畳まれる長さ２５ｎｔ超の１～５０の配列を有する。回文（ダイアド対称性を有する配列）は、ほぼ独占的に遺伝子間に存在し、それぞれがゲノム内で独特である。全てではないが、いくつかは、ｒｈｏ非依存的ターミネーターであると予測され、したがって、独立して調節された単位として機能する遺伝子に関する手がかりを提供する（方法）。しかしながら、いくつかの回文は、最大７４ｂｐの長さであり、３４個のゲノムは、４０ｎｔ以上の長さの例を有し、通常のターミネーターよりも大きいように思える。これらは、Ｍａｈａｐｈａｇｅにおいてほぼ排他的に生じ、リボソームを通るｍＲＮＡの移動の調節などの代替または追加の機能を有し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介相互作用
Ｃａｓ９、最近記載されたＶ－Ｉ型（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６３：８８－９１）、及びＶ－Ｆ型システムの新しいサブタイプを含む、ファージ上のほぼ全ての主要な種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが特定された（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２：８３９－８４２）。クラスＩＩシステム（ＩＩ型及びＶ型）は、ファージで初めて報告される。ほとんどのエフェクターヌクレアーゼ（干渉用）は、保存された触媒残基を有し、それらが機能的であり得ることを暗示する。
ＣＲＩＳＰＲシステムを有するファージの前に十分に説明された場合とは異なり（Ｓｅｅｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９４：４８９－４９１）、ほぼ全てのファージＣＲＩＳＰＲシステムはスペーサー獲得機構（Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣａｓ４）を欠き、多くは干渉のための認識可能な遺伝子を欠く。例えば、２つの関連ファージは、Ｃａｓ１及びＣａｓ２を欠くＩ－Ｃ型バリアントシステム、ならびにＣａｓ３の代わりにヘリカーゼタンパク質の両方を有する。それらはまた、ＣＲＩＳＰＲアレイの近位に生じる約７５０ａａのＶ型エフェクタータンパク質の新たな候補を含有する第２のシステムを保有する。場合によっては、干渉及びスペーサー組み込みのための遺伝子を欠くファージは、それらの宿主と同様のＣＲＩＳＰＲ反復を有するため、これらの機能のためにそれらの宿主によって合成されたＣａｓタンパク質を使用し得る。あるいは、エフェクターヌクレアーゼを欠くシステムは、切断なしに標的配列の転写を抑制し得る（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３：６７４－６８１、Ｓｔａｃｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｃｈｆｅｌｄｅｒ（２０１６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９１：１５２２６－１５２４２）。
ファージにコードされたＣＲＩＳＰＲアレイは、しばしばコンパクトである（３～５５反復、アレイあたりの中央値６）。この範囲は、細菌ゲノムにおいて典型的に見られるものよりも大幅に小さい（Ｔｏｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（２０１７）Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １２：２０）。いくつかのファージスペーサーは、他のファージのコア構造遺伝子及び調節遺伝子を標的とする。したがって、ファージは、競合するファージによる感染を予防するために、それらの宿主の免疫兵器を明らかに増強する。
様々な種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードするいくつかの大型プラスミドまたはプラスミド様ゲノムが特定された。これらのシステムのいくつかはまた、Ｃａｓ１及びＣａｓ２を欠く。最も一般的には、スペーサーは、他のプラスミドの動員及びコンジュゲーション関連遺伝子、ならびにファージのヌクレアーゼ及び構造タンパク質を標的とする。
ファージにコードされたいくつかのＣＲＩＳＰＲ座位は、同じ試料中または同じ研究からの試料中の細菌を標的とするスペーサーを有する。標的化細菌がこれらのファージの宿主であるとされており、他の宿主予測分析によって支持される推論である。宿主染色体を切断することができ得るＣａｓタンパク質をコードする、細菌染色体標的化スペーサーを有する座位もあれば、そうでないものもある。宿主遺伝子の標的化は、それらの調節を無効にするか、または変化させることができ得、これは、ファージ感染サイクル中に有利であり得る。いくつかのファージＣＲＩＳＰＲスペーサーは、プロモーターを遮断するか、または非コードＲＮＡを発現停止することによってゲノム調節に干渉する可能性がある細菌遺伝子間領域を標的とする。
細菌染色体のＣＲＩＳＰＲ標的化の最も興味深い例は、転写及び翻訳に関与する遺伝子である。例えば、１つのファージは、その宿主のゲノム中のσ７０転写因子を標的にしながら、σ７０の遺伝子をコードする。抗シグマ因子を有するファージによるσ７０ハイジャックの報告が以前にある。これは、ゲノムが抗シグマ因子をコードするいくつかの巨大なファージでも生じ得る。別の例では、ファージスペーサーは、宿主グリシルｔＲＮＡ合成酵素を標的とする。
興味深いことに、宿主にコードされたスペーサーによる任意のＣＲＩＳＰＲ担持ファージの標的化の証拠は見出されず、ファージ－宿主－ＣＲＳＰＲ相互作用におけるまだ明らかにされていない構成要素を示唆した。しかしながら、細菌ＣＲＩＳＰＲ（ＦＯＧ／４）によっても標的とされる他のファージのファージＣＲＩＳＰＲ標的化は、ファージ系統発生プロファイルによって広く確認されたファージ宿主会合を示唆した。
いくつかの大きなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージは、抗ＣＲＩＳＰＲ（Ａｃｒ）（Ｂｏｎｄｙ－Ｄｅｎｏｍｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２６：１３６－１３９、Ｐａｗｌｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １：１６０８５）、及び宿主防御及び他の細菌系からそれらの複製ゲノムを分離する核様区画を組み立てるタンパク質をコードする。Ａｃｒとして機能し得るＡｃｒＶＡ５、ＡｃｒＶＡ２、及びＡｃｒＩＩＡ７とクラスター化する巨大ファージゲノムにコードされるタンパク質を特定した。「ファージ核」を位置付けるチューブリンホモログ（ＰｈｕＺ）、ならびにタンパク質性バリアの構成要素に関連するタンパク質も特定された。したがって、ファージ「核」は、大きなファージにおいて比較的一般的な特徴であり得る。
方法
ファージ及びプラスミドゲノム特定
本研究で生成されたデータセット、以前の研究から生成されたデータセット、Ｔａｒａ Ｏｃｅａｎｓ微生物叢（Ｋａｒｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．９：ｅ１００１１７７）、及びＧｌｏｂａｌ Ｏｃｅａｎｓ Ｖｉｒｏｍｅ（ＧＯＶ；（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５３７：６８９－６９３）を、長さが２００ｋｂｐ超のゲノムを有するファージに由来し得る配列アセンブリについて検索した。読み取りアセンブリ、遺伝子予測、及び初期遺伝子注釈は、以前に報告された標準的な方法に従った（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＩＳＭＥ Ｊ．８：１４５２－１４６３）。
ファージ候補は、最初、ゲノムに割り当てられず、ドメインレベルで明確な分類プロファイルを有さなかった配列を取得することによって発見された。分類プロファイルは、投票方式により決定され、そこでは、Ｕｎｉｐｒｏｔ及びｇｇＫｂａｓｅ（ｇｇｋｂａｓｅ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）データベース注釈に基づいた各分類階級で勝者分類は５０％超の票がなければならなかった。ファージを、多数の仮説上のタンパク質注釈及び／またはファージ構造遺伝子、例えば、キャプシド、尾部、ホリンの存在を有する配列を特定することによってさらに絞り込んだ。全ての候補ファージ配列を、全体を通してチェックして、推定プロファージをファージから区別した。プロファージは、多くの場合、コア代謝機能と関連付けられる高い信頼機能予測率、及び細菌ゲノムと極めて高い類似性を有するゲノムへの明確な移行に基づいて特定された。プラスミドを、プラスミドマーカー遺伝子（例えば、ｐａｒＡ）との一致に基づいてファージから区別した。３つの配列アセンブリは、ファージとプラスミドとを明確に区別することができず、「ファージ－プラスミド」として割り当てられた。
ファージ及びプラスミドゲノムの手作業による精選
ファージまたはファージ様に分類される全ての足場を、カスタムスクリプトを使用して末端のオーバーラップについて試験し、オーバーラップについて手作業でチェックした。完全に環化され得る組み立てられた配列は、潜在的に「完全」であると見なされた。誤った連鎖状の配列アセンブリは、Ｖｍａｔｃｈ（Ｋｕｒｔｚ（２００３）Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ４１２：２９７）を使用して、５ｋｂ超の直接反復について検索することによって最初にフラグが付けられた。潜在的に連鎖状の配列アセンブリを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ９のドットプロット及びＲｅｐｅａｔＦｉｎｄｅｒ特徴を使用して、複数の大きな反復配列について手作業でチェックした。補正された長さが２００ｋｂｐ未満である場合、配列を補正し、さらなる分析から除いた。
ファージ配列のサブセットを、終了すること（足場ギャップまたは局所的なミスアセンブリの全てのＮを、正しいヌクレオチド配列及び環化によって置き換える）を目的として、手作業による精選のために選択した。精選は概して、以前説明された方法に従った（Ｄｅｖｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）（上記））。簡潔に、適切なデータセットからの読み取りデータを、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ（２０１２）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３５７－３５９）を使用して、新たに組み立てられた配列にマッピングした。マッピングされた読み取りデータの配置されていない交配対を、ｓｈｒｉｎｋｓａｍ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｃｔｈｏｍａｓ／ｓｈｒｉｎｋｓａｍ）で保持した。全体を通してマッピングを手作業でチェックして、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ９を使用して局所的なミスアセンブリを特定した。Ｎが満たされたギャップまたはミスアセンブリ補正は、配置されていない対の読み取りデータを使用し、場合によっては、それらが誤ってマッピングされた部位から再配置された読み取りデータを使用した。そのような場合、予想よりもはるかに大きい対の読み取り距離、高い多型密度、１つの読み取り対の後方マッピング、または前述の任意の組み合わせに基づいて、誤ったマッピングが特定された。
同様に、環化が確立されるまで、配置されていない、または誤って配置された対の読み取りデータを使用して末端を伸長した。場合によっては、伸長端を使用して、後にアセンブリに付加される新しい足場を採用した。全ての伸長及び局所的なアセンブリの変更の精度を、読み取りマッピングの後続の段階で検証した。多くの場合、アセンブリは、反復配列の存在によって終了するか、または内部的に破損した。これらの場合では、反復配列ならびに独特の隣接配列のブロックが特定された。次いで、読み取りデータを手作業で再配置し、対の読み取り配置ルール及び独特の隣接配列に配慮した。全体を通してギャップ閉鎖、環化、及び精度の検証の後、末端のオーバーラップが排除され、全体を通して遺伝子が予測され、開始が遺伝子間領域に移動し、場合によっては、被覆傾向及びＧＣ歪みの組み合わせに基づいて起源であると疑われた（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：１２５６－１２６３）。最後に、配列をチェックして、反復領域が対の読み取りデータによって及ぶ距離よりも大きかったため、不正確な経路選択につながり得る任意の反復配列を特定した。このステップはまた、前述のデータセットにおいて生じる、より小さいファージの末端から末端までの反復によって生成される人工的な長いファージ配列を除外した。
構造及び機能的注釈
ファージゲノムの特定及び精選後、コード配列（ＣＤＳ）を、遺伝子コード１１を有するｐｒｏｄｉｇａｌ（－ｍ－ｃ－ｇ １１－ｐシングル）で予測した。ＵｎｉＰｒｏｔ、ＵｎｉＲｅｆ、及びＫＥＧＧ（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）（上記））で検索することによって、以前説明されたように、結果として得られたＣＤＳに注釈を付けた。Ｐｆａｍ ｒ３２（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：Ｄ２２２－３０）、ＴＩＧＲＦＡＭＳ ｒ１５（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｄ３８７－９５）、及びＶｉｒｕｓ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｒ９０（ｖｏｇｄｂ．ｏｒｇ）でタンパク質を検索することによって、機能的注釈をさらに割り当てた。ｔＲＮＡは、細菌モデルを使用して、ｔＲＮＡｓｃａｎ－ＳＥ ２．０（Ｌｏｗｅ ａｎｄ Ｅｄｄｙ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：９５５－９６４）で特定された。ｔｍＲＮＡを、細菌／植物遺伝子コードを用いたＡＲＡＧＯＲＮ ｖ１．２．３８（Ｌａｓｌｅｔｔ ａｎｄ Ｃａｎｂａｃｋ，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：１１－１６）を使用して割り当てた。タンパク質配列のファミリーへのクラスター化は、２段階手順を使用して達成された。第１のタンパク質クラスター化を、高速かつ高感度なタンパク質配列検索ソフトウェアであるＭＭｓｅｑを使用して行った（（Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３２：１３２３－１３３０）。ａｌｌ－ｖｓ－ａｌｌ配列検索は、ｅ値：０．００１、感度：７．５、及びカバー率：０．５を使用して実施された。配列類似性ネットワークをペアワイズ類似性に基づいて構築し、ＭＭｓｅｑからの貪欲な集合カバーアルゴリズムを実施して、タンパク質サブクラスターを定義した。結果として得られたサブクラスターをサブファミリーとして定義した。遠隔相同性を試験するために、サブファミリーを、ＨＭＭ－ＨＭＭ比較を使用してタンパク質ファミリーに群化した。少なくとも２つのタンパク質メンバーを有する各サブファミリーのタンパク質を、ｍｍｓｅｑｓ２のｒｅｓｕｌｔ２ｍｓａパラメータを使用して整列させ、複数の配列アライメントからＨＭＭプロファイルを、ＨＨｐｒｅｄスイートを使用して構築した。次いで、ＨＨｐｒｅｄスイート（パラメータ－ｖ ０－ｐ ５０－ｚ ４－Ｚ ３２０００－Ｂ ０－ｂ ０を用いて）からのＨＨｂｌｉｔｓ（Ｒｅｍｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：１７３－１７５）を使用して、サブファミリーを互いに比較した。確率スコアが≧９５％、カバー率≧０．５０のサブファミリーについては、インフレーションパラメータとして２．０を用いて、Ｍａｒｋｏｖ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇアルゴリズムを使用して、最終クラスタリングにおける入力ネットワークの重みとして類似性スコア（確率×被覆率）を使用した。これらのクラスターは、タンパク質ファミリーとして定義された。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｒｅｐｅａｔ Ｆｉｎｄｅｒを使用してヘアピン（順方向及び逆方向の同一の重複反復に基づく回文）を特定し、Ｖｍａｔｃｈ（Ｋｕｒｔｚ（２００３）（上記））を使用してデータセット全体に位置付けた。１００％類似性を有する＞２５ｂｐの反復を表にした。
サイズ比較のための参照ゲノム
ＲｅｆＳｅｑ ｖ９２ゲノムを、ＮＣＢＩウイルスポータルを使用し、細菌宿主を有する完全なｄｓＤＮＡゲノムのみを選択することによって回収した。（Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）（上記））からのゲノムをＩＭＧ／ＶＲからダウンロードし、予測される細菌宿主を有する「環状」と標識された配列アセンブリのみを保持した。ゲノムの多くは、誤った連鎖状配列アセンブリの結果であった。誤った連鎖に基づくＩＭＧ／ＶＲにおける配列の存在を考慮して、この研究は、２００ｋｂ超のこの供給源からの配列のみを考慮し、これらのサブセットを人工配列として除去した。
宿主予測
ファージに対する細菌宿主の門関係を、各ファージゲノムについての各ＣＤＳのＵｎｉｐｒｏｔ分類プロファイルを考慮することによって予測した。各ファージゲノムの門レベルの一致を合計し、最もヒットがあった門を潜在的な宿主門とみなした。しかしながら、次の最も計数された門の３倍の計数を有するこの門が暫定的なファージ宿主門として割り当てられた場合のみである。ファージ宿主をさらに割り当て、ＣＲＩＳＰＲ標的化を使用して検証した。ＣＲＩＳＰＲアレイを、各ファージゲノムを再構築した同じ環境から１ｋｂｐ超の配列アセンブリ上で予測した。スペーサーを抽出し、ＢＬＡＳＴＮ－ｓｈｏｒｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）を使用して、同じ部位からゲノムに対して検索した。長さ２４ｂｐ超の一致及び１以下のミスマッチ、またはゲノムに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するスペーサーを含有する配列アセンブリを標的とみなした。ファージの場合、一致を使用して、ファージ－宿主関係を推測した。全ての場合において、分類プロファイリング及びＣＲＩＳＰＲ標的化に基づく予測宿主門は、完全に一致した。同様に、宿主の門は、宿主ゲノム（例えば、翻訳及びヌクレオチド反応に関与する）においても見出されるファージ遺伝子の系統発生分析に基づいて予測された。計算された分類プロファイル及び系統樹に基づく推論も完全に一致した。
代替遺伝子コード
標準的な細菌コード（コード１１）を使用した遺伝子予測が一見異常に低いコード密度をもたらした場合、潜在的な代替の遺伝子コードが調査された。Ｆａｓｔ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｏｇｏ（ＦＡＣＩＬ；Ｄｕｔｉｌｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７：１９２９－１９３３））を使用して予測を行うことに加えて、十分に定義された機能（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ）を有する遺伝子を特定し、予想よりも短い遺伝子を終結する停止コドンを決定した。次いで、コドンが停止として解釈されないように、Ｇｌｉｍｍｅｒ及びＰｒｏｄｉｇａｌセットを使用して遺伝子を再予測した。別の目的で使用された停止コドンの他の組み合わせを評価し、考えられない遺伝子融合予測により、候補コード（例えば、１つの停止コドンのみを有するコード６）を除外した。
イントロンは、真核生物の設定を使用してｔＲＮＡを再予測することによって、予想よりもいくつか長い疑似ｔＲＮＡにおいて特定された（ｔＲＮＡスキャンは、細菌及びファージのｔＲＮＡ遺伝子におけるイントロンを予想しないため）。
ターミナーゼ系統発生分析
大きなターミナーゼ系統樹を、前述の注釈パイプラインから大きなターミナーゼを回収することによって構築した。ＰＦＡＭ、ＴＩＧＲＦＡＭＳ、及びＶＯＧに対して３０超のビットスコアと一致したＣＤＳを保持した。ビットスコアにかかわらず、大きなターミナーゼにヒットした任意のＣＤＳは、ＨＨｂｌｉｔｓ（Ｓｔｅｉｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１：９５１－９６０）を使用して、ｕｎｉｃｌｕｓｔ３０＿２０１８＿０８データベースに対して検索した。次いで、結果として得られたアライメントをＰＤＢ７０データベースに対してさらに検索した。大きなターミナーゼＨＭＭを有するタンパク質ファミリーにクラスター化された残りのＣＤＳも、手作業による検証後に含めた。検出された大きなターミナーゼを、ＨＨＰｒｅｄ（Ｓｔｅｉｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記））及びｊＰｒｅｄ（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：Ｗ１９７－２０１）を使用して手作業で検証した。２００ｋｂ超（Ｐａｅｚ－Ｅｓｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）（上記））ファージゲノム由来の大きなターミナーゼ、及びＲｅｆＳｅｑ ｒ９２由来の全ての２００ｋｂ超の完全ｄｓＤＮＡファージゲノムも、この研究からのファージＣＤＳを用いたタンパク質ファミリークラスター化によって含まれた。結果として得られたターミナーゼを９５％アミノ酸同一性（ＡＡＩ）でクラスター化して、ｃｄ－ｈｉｔ（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：６８０－６８２）を使用して冗長性を低減した。より小さいファージゲノムを、Ｒｅｆｓｅｑタンパク質データベースに対して結果として得られたＣＤＳセットを検索し、上位１０位の最良ヒットを保持することによって含めた。ＰＦＡＭ、ＴＩＧＲＦＡＭＳ、またはＶＯＧに対して大きなターミナーゼ一致を有しなかったこれらのヒットをさらなる検討から外し、残りのセットを９０％ＡＡＩでクラスター化した。最終セットの大きなターミナーゼＣＤＳをＭＡＦＦＴ ｖ７．４０７（－－ｌｏｃａｌｐａｉｒ－－ｍａｘｉｔｅｒａｔｅ １０００）で整列させ、整列不良の配列を除去し、結果として得られたセットを再整列した。系統樹を、ＩＱＴＲＥＥ ｖ１．６．９（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３２：２６８－２７４）を使用して推測した。
ファージにコードされたｔＲＮＡ合成酵素樹
ＮＣＢＩからの最も近い参照セットのセット及び現在の研究からの細菌ゲノムを使用して、ファージにコードされたｔＲＮＡ合成酵素、リボソーム、及び開始因子タンパク質配列のための系統樹を構築した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ座位の検出及び宿主の特定
ファージにコードされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ座位を、細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ座位を特定するために使用したのと同じ方法を使用して特定し、ＭｉｎＣＥＤ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｔＳｋｅｎｎｅｒｔｏｎ／ｍｉｎｃｅｄ）及びＣＲＩＳＰＲＤｅｔｅｃｔ（Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を使用してＣＲＩＳＰＲ座位の反復間から抽出されたスペーサーを、同じ部位から再構築された配列、及び細菌、ファージ、またはその他として分類される標的と比較した。
多くのファージ宿主は、ＣＲＩＳＰＲ標的化によって特定することができないため（おそらく、感受性宿主を含有する試料中でファージが増殖していたか、またはスペーサー検出を回避するように標的が十分に変異しているため）、追加の一連のエビデンスを使用して、宿主同一性を提案した。これらの方法の不確実性により、考えられるファージ予測が、門レベルでのみ行われた。この分析では、各門と最良の予測されるタンパク質一致を有する任意のゲノム上でコードされた遺伝子の画分を計算した。最高に示された門の頻度が、次に最も多く見られた門の頻度を３倍以上超えた場合、それを提案される暫定的な細菌宿主とした。この閾値は、ＣＲＩＳＰＲ標的化または系統発生分析からの確認された宿主門情報に基づいて、控えめであると検証された。
データの可用性
補足文書「Ｇｅｎｂａｎｋ」は、この研究で報告したゲノム配列のＧｅｎｂａｎｋフォーマットファイルを含む。全ての読み取りデータは、ショートリードアーカイブ（すでにそこに保管されていない場合）及びＮＣＢＩのゲノム配列に寄託されている。
実施例２
Ｃａｓ１２Ｊは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的化能力を有する最小の既知の単一エフェクターＣａｓタンパク質を表す。Ｃａｓ１２Ｊは、補助ＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡなど）が機能することを必要とせずにｄｓＤＮＡを切断することができる。加えて、Ｃａｓ１２及びＣａｓ９にわたって高度に保存されたドメインであるＲｕｖＣドメインは、Ｃａｓ１２Ｊにおいて、既知のＣａｓタンパク質から非常に異なり、ドメイン構造はＣａｓ１２タンパク質スーパーファミリーのメンバーにわたって異なる。
結果
異種の文脈におけるＣａｓ１２Ｊエフェクターの機能性及びＤＮＡ標的化能力を調査するために、形質転換（ＥＯＴ）プラスミド干渉アッセイの効率を設定した（図１１Ａ）。Ｃａｓ１２Ｊを発現するエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）及びｂｌａ遺伝子のアンチセンス鎖を標的とするｃｒＲＮＡガイド、または非標的化ガイドを、ｐＵＣ１９で形質転換した（図１１Ｂ）。アッセイは、Ｃａｓ１２Ｊ及び非標的化ガイドを産生する株と比較して、Ｃａｓ１２Ｊ及びｐＵＣ１９標的化ガイドを産生する株において、ｐＵＣ１９形質転換効率が２～３桁減少することを明らかにした（図１１Ｃ）。この結果は、Ｃａｓ１２Ｊの堅牢でガイド依存的な二本鎖ＤＮＡ干渉活性を示す。各株のＤＮＡ干渉の偏りのない相対形質転換効率を評価するために、ｐＹＴＫ００１プラスミドを対照として形質転換した（図１１Ｂ）。形質転換効率は、株が非標的化プラスミドの形質転換に対して等しくコンピテントであることを明らかにした（図１１Ｃ）。
方法
発現プラスミドのクローニング
コンティグＰ０＿Ａｎ＿ＧＤ２０１７Ｌ＿Ｓ７＿ｃｏａｓｓｅｍｂｌｙ＿ｋ１４１＿３３３９３８０からのｃａｓ１２Ｊの遺伝子配列を、ＩＤＴからＧブロックとして注文し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを使用してｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングしてＭＣＳＩにした。同じ反応において、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ媒介スペーサー交換に適した３５ｂｐのスペーサーとともに、Ｔ７プロモーター、コンティグＰ０＿Ａｎ＿ＧＤ２０１７Ｌ＿Ｓ７＿ｃｏａｓｓｅｍｂｌｙ＿ｋ１４１＿３３３９３８０上に位置するＣＲＩＳＰＲアレイからのそれぞれのコンセンサス反復配列を、ＭＣＳＩＩの代わりにｃａｓ１２Ｊ ＯＲＦの下流に導入した。同じ反応において、肝炎デルタウイルスリボザイム（ＨＤＶｒｚ）をスペーサーの下流に導入して、その３’末端で未成熟ｃｒＲＮＡ転写産物の均質なプロセシングを容易にした。ｐＵＣ１９標的化Ｃａｓ１２Ｊベクターを生成するために、非標的化スペーサーを、Ｇｏｌｄｅｎ ＧａｔｅアセンブリでＡＧＴＡＴＴＣ配列の下流のｐＵＣ１９ ｂｌａ遺伝子の塩基対１１～４５に一致する配列と交換し、アンチセンス鎖相補的ｃｒＲＮＡガイドの産生を可能にした。
プラスミド干渉アッセイ
生成したＣａｓ１２Ｊベクター（非標的化及びｐＵＣ１９標的化）を、化学的にコンピテントなＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）において形質転換した。各株（Ａ、Ｂ、及びＣ株）について３つの個々のコロニーを採取して、３つの５ｍＬ（ＬＢ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の開始培養物を接種し、翌日にエレクトロコンピテントな細胞を調製した。５０ｍＬ（ＬＢ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の主培養物を１：１００で接種し、３７℃で激しく振盪して、０．３のＯＤ６００に成長させた。続いて、培養物を室温に冷却し、Ｃａｓ１２Ｊ発現を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を２５℃で１時間、０．６～０．７のＯＤ６００に成長させた後、氷冷ｄｄＨ２０及び１０％グリセロール洗浄を繰り返してエレクトロコンピテントな細胞を調製した。細胞を２５０μＬの１０％グリセロールに再懸濁した。９０μＬのアリコートを液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。翌日、８０μＬのコンピテントな細胞を３．２μＬのプラスミド（２０ｎｇ／μＬのｐＵＣ１９標的プラスミド、または２０ｎｇ／μＬのｐＹＴＫ００１対照プラスミド）と組み合わせ、氷上で３０分間インキュベートし、３つの個々の２５μＬの形質転換反応物に分割した。Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上、０．１ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で電気穿孔した後、０．２ｍＭのＩＰＴＧを補充した１ｍＬの回収培地（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で細胞を回収し、３７℃で１時間振盪させた。その後、１０倍希釈系列を調製し、それぞれの希釈ステップの５μＬを、適切な抗生物質を含有するＬＢ－Ａｇａｒ上にスポットプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日にコロニーを計数して、形質転換効率を決定した。形質転換効率を評価するために、電気穿孔３つ組の１ｎｇ形質転換プラスミドあたりの細胞形成単位から平均及び標準偏差を計算した。
図１１Ａ～１１Ｃは、形質転換プラスミド干渉アッセイの効率を示す。図１１Ａ上部パネル：実験スキーム。Ｅ．コリ産生Ｃａｓ１２Ｊを標的のプラスミド（ｐＵＣ１９）で形質転換する。下部パネル：エフェクター発現プラスミドのベクターマップ。図１１Ｂ、ｐＵＣ１９（左）またはｐＹＴＫ００１（右）で形質転換された、Ｃａｓ１２Ｊを産生するＥ．コリ、及びｐＵＣ１９標的化または非標的化ガイドのいずれかの連続希釈物。図１１Ｃ、１ｎｇ形質転換プラスミドあたりの細胞形成単位（ｃｆｕ）における計算された形質転換効率。平均及び＋／－ｓ．ｄ．（エラーバー）値は、３つ組から導き出された。
実施例３
結果
Ｃａｓ１２ＪがｄｓＤＮＡを切断することを示すために、細胞の外部で（すなわち、非細胞状況において）インビトロ実験を実施した。線状ｄｓＤＮＡを、Ｃａｓ１２Ｊ及びＰＡＭモチーフに隣接する標的配列にハイブリダイズするように設計されたガイドＲＮＡの存在下で切断した。Ｃａｓ１２Ｊリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、細胞の内部（この場合、タンパク質及びガイドＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡの導入を介してＥ．コリ）に組み立てたか、またはアポタンパク質及び合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドから細胞の外部で、インビトロで組み立てた。実験は、Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５（「オルソログ＃１」）、Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２（「オルソログ＃２」）、またはＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０（「オルソログ＃３」）を有するＲＮＰが、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡスペーサー配列によって誘導される切断された線状ｄｓＤＮＡ断片の内部または外部のいずれかで組み立てられたことを明らかにした（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。１．９ｋｂの線状ＤＮＡ基質を１．２ｋｂ及び０．７ｋｂの断片に切断し、ガイド相補性の部位に近いヌクレオチド鎖切断ＤＮＡ二本鎖切断事象を示す。ｄｓＤＮＡ切断は、ＤＮＡ上のガイド相補的部位の不在下では観察されなかった。この実験は、Ｃａｓ１２Ｊ（例えば、Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０）が、二本鎖切断をＤＮＡに導入することができるｃｒＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼであることを示した。さらに、実験は、機能的Ｃａｓ１２Ｊ ＲＮＰが細胞の内部及び／または外部で組み立てられ得ることを示した。
図１２Ａ～１２Ｂは、Ｃａｓ１２Ｊ（例えば、Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０）が、ｃｒＲＮＡスペーサー配列によって誘導される線状ｄｓＤＮＡ断片を切断することを示す。図１２Ａ、細胞の内部に組み立てられたＲＮＰについての時間依存的ｄｓＤＮＡ切断アッセイ。上部：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５（Ｃａｓ１２Ｊ－１）、中央：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２（Ｃａｓ１２Ｊ－２）、及び下部：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０（Ｃａｓ１２Ｊ－３）。最右レーンは、それぞれのｃｒＲＮＡガイドによって特定できなかった非相補的ＤＮＡ対照である。図１２Ｂ、細胞の外部で、インビトロで組み立てられたＲＮＰについての時間依存的ｄｓＤＮＡ切断アッセイ。上部：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５（Ｃａｓ１２Ｊ－１）、中央：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２（Ｃａｓ１２Ｊ－２）、及び下部：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０（Ｃａｓ１２Ｊ－３）。最右レーンは、それぞれのｃｒＲＮＡガイドによって特定できなかった非相補的ＤＮＡ対照である。
エシェリキア・コリでＰＡＭ枯渇アッセイを実施した。アッセイでは、Ｃａｓ１２Ｊは、プラスミドライブラリ内のランダム化配列に隣接するＤＮＡ配列を標的とする。ＮＧＳ配列決定は、ＴリッチＰＡＭ配列がプロトスペーサーに隣接しているときに、Ｃａｓ１２Ｊ及びｃｒＲＮＡが、細菌において、ｃｒＲＮＡガイド相補的標的ＤＮＡ部位を有するプラスミドを枯渇させるのに十分であることを明らかにした（図１３）。実験はまた、機能的エフェクターの形成にｔｒａｃｒＲＮＡが必要なかったことも示した。注目すべきは、オルソログ＃２は、最小の５′－ＴＢＮ－３′ＰＡＭ配列を特徴とする。
図１３。３つの異なるオルソログによって枯渇されたＰＡＭ配列であり、ＰＡＭが任意の所望のＣａｓ１２Ｊタンパク質について特定するのが容易であることを示す。
方法
発現構築物のクローニング
Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びＣａｓ１２Ｊ－３３３９３８０の遺伝子配列を、ＩＤＴからＧブロックとして注文し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを使用してｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングしてヘキサヒスチジンタグにＣ末端融合したＭＣＳＩにした。ｃｒＲＮＡガイドとのｃａｓ１２Ｊの共発現のために、ＣＲＩＳＰＲアレイ（３６ｂｐ反復、続いて３５ｂｐスペーサー、その６単位）を、Ｔ７プロモーターの制御下で、選択のためのｂｌａ遺伝子を含有する高複製ベクター（ＣｏｌＥ１起源）にクローニングした。
インビボでのＣａｓ１２Ｊ－ＲＮＰの産生及び精製
生成したｃａｓ１２Ｊ過剰発現ベクター及びＣＲＩＳＰＲアレイ発現ベクターを、Ｅ．コリＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）において共形質転換し、ＬＢ－Ｋａｎ－ Ｃａｒｂ寒天プレート（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン）上、一晩３７℃でインキュベートした。単一コロニーを採取して、８０ｍＬ（ＬＢ、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ及びカナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の開始培養物を接種し、これらを３７℃で激しく振盪させて一晩インキュベートした。翌日、１．５ＬのＴＢ－Ｋａｎ－Ｃａｒｂ培地（カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ及びカナマイシン５０μｇ／ｍＬ）にそれぞれ４０ｍＬの開始培養液を接種し、３７℃で０．６のＯＤ６００に成長させ、氷上で１５分間冷却し、その後、遺伝子発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した後、１６℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）に再懸濁し、その後超音波処理により溶解し、続いて遠心分離による溶解物の清澄化を行った。可溶性画分を、洗浄緩衝液中で予備平衡化した５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ）上に充填した。結合したタンパク質を２０カラム体積（ＣＶ）の洗浄緩衝液で洗浄し、その後、３ＣＶ溶出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で溶出した。溶出したタンパク質を、イオン交換（ＩＥＸ）充填緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０、４℃、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）に対して、ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ透析カセット１０ｋ ｍｗｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において４℃で一晩透析した。タンパク質を、２×５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填した。タンパク質を、ＩＥＸ溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０、４℃、１ＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）の勾配で溶出した。溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び尿素－ＰＡＧＥによって分析し、Ｃａｓ１２Ｊ及びｃｒＲＮＡによって形成されたＲＮＰを含有する画分を１ｍＬに濃縮した。最後に、タンパク質を、サイズ排除緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で予備平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムに注入した。ピーク画分を、推定濃度５００μＭに対応する６０ＡＵ（ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の２８０ｎｍでの吸収まで濃縮した。その後、タンパク質を液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。
アポＣａｓ１２Ｊの産生及び精製
生成したｃａｓ１２Ｊ過剰発現ベクターを、化学的にコンピテントなＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）において形質転換し、ＬＢ－Ｋａｎ寒天プレート（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）上、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを採取して、８０ｍＬ（ＬＢ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の開始培養物を接種し、これらを３７℃で激しく振盪させて一晩インキュベートした。翌日、１．５ＬのＴＢ－Ｋａｎ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）にそれぞれ４０ｍＬの開始培養液を接種し、３７℃で０．６のＯＤ６００に成長させ、氷上で１５分間冷却し、その後、遺伝子発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した後、１６℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）に再懸濁し、その後超音波処理により溶解し、続いて遠心分離による溶解物の清澄化を行った。可溶性画分を、洗浄緩衝液中で予備平衡化した５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ）上に充填した。結合したタンパク質を２０カラム体積（ＣＶ）の洗浄緩衝液で洗浄し、その後、５ＣＶ溶出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で溶出した。溶出したタンパク質を、１ｍＬに濃縮した後、サイズ排除緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で予備平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムに注入した。ピーク画分を、推定濃度５００μＭに対応する４０ＡＵ（ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の２８０ｎｍでの吸収まで濃縮した。その後、タンパク質を液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。
Ｃａｓ１２Ｊ－ｃｒＲＮＡ ＲＮＰ再構成
Ｃａｓ１２Ｊ－ｃｒＲＮＡ ＲＮＰ複合体を、タンパク質及び合成ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）を、再構成緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｋ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）に１：１モル比で混合し、２０℃で３０分間インキュベートすることによって、１．２５μＭの濃度で組み立てた。合成ｃｒＲＮＡを、アセンブリ反応の前に、３分間９５℃に加熱し、次いで適切な折り畳みのために室温に冷却した。
ＤＮＡ切断アッセイ
ＤＮＡ標的基質を、プラスミド鋳型ＤＮＡからＰＣＲによって生成した。反応緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｋ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で予め形成されたＲＮＰ（１μＭ）にＤＮＡ（１０ｎＭ）を添加することによって切断反応を開始させた。反応物を３７℃でインキュベートし、アリコートを指示された間隔で除去し、５０ｍＭのＥＤＴＡでクエンチし、液体窒素中で保存した。時系列の完了後、試料を解凍し、０．８単位のプロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）で２０分間、３７℃で処理した。充填色素を添加し（Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ Ｐｕｒｐｌｅ ６Ｘ、ＮＥＢ）、１％アガロースゲル上で電気泳動により試料を分析した。
使用した配列
ｃｒＲＮＡガイド：
＞ｃｒＲＮＡ－１（ガイド配列／標的化配列は太字である）
Figure 0007239725000081
＞ｃｒＲＮＡ－２（ガイド配列／標的化配列は太字である）
Figure 0007239725000082
＞ｃｒＲＮＡ－３（ガイド配列／標的化配列は太字である）
Figure 0007239725000083
ＤＮＡ標的（ＰＡＭモチーフは下線が引かれ、ｃｒＲＮＡスペーサー相補的配列は太字である）：
＞線状ｐＴａｒｇｅｔ１：
Figure 0007239725000084
＞線状ｐＴａｒｇｅｔ２：
Figure 0007239725000085
＞線状ｐＴａｒｇｅｔ３：
Figure 0007239725000086
実施例４
結果
トランスクリプトームマッピングは、ｃｒＲＮＡがＥ．コリ細胞において異種発現され、２５ヌクレオチド長反復及び１４～２０ヌクレオチドスペーサーを含むようにプロセシングされたことを示唆した。データはまた、Ｃａｓ１２Ｊがそれ自体のｃｒＲＮＡをプロセシングする可能性が高いことも示唆した（図１４Ａ～１４Ｃを参照されたい）。
図１４Ａ～１４Ｃは、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５（図１４Ａ）、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２（図１４Ｂ）、及びｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０（図１４Ｃ）からＲＮＡ配列をＣａｓ１２Ｊ ＣＲＩＳＰＲ座位にマッピングした結果を図示する。挿入図は、各座位における第１の反復－スペーサー－反復の繰り返しのトランスクリプトームマッピングの詳細図を示す。黒いダイヤモンドは反復を表し、色付きの正方形はスペーサーを表し、色あせた反復及びスペーサーはアレイの変性末端を表す。
方法
ＲＮＡ－ｓｅｑ
ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－１９４７４５５、ｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－２０７１２４２、及びｐＢＡＳ：：Ｃａｓ１２Ｊ－３３３９３８０構築物を、化学的にコンピテントなＥ．コリＤＨ５α（ＱＢ３－Ｍａｃｒｏｌａｂ，ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）において形質転換し、ＬＢ－ＣＭ寒天プレート（３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）上、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを採取して、５ｍＬ（ＬＢ、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）の開始培養物を接種し、これらを３７℃で激しく振盪させて一晩インキュベートした。翌朝、主培養物を１：１００（ＬＢ、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）で接種し、座位発現を２００ｎＭのａＴｃで、１６℃で２４時間誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｎａ ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、ガラスビーズ（０．１ｍｍのガラスビーズ、４℃で４×３０秒のボルテックス、３０秒間隔で、氷上でクールダウン）を使用して溶解した。２００μＬの細胞溶解上清を、製造業者のプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）に従ってＲＮＡ抽出のためにトリゾールに移した。１０μｇのＲＮＡを、脱リン酸化のために、２０単位のＴ４－ＰＮＫ（ＮＥＢ）で、３７℃で６時間処理した。その後、１ｍＭのＡＴＰを添加し、試料を３７℃で１時間、５’－リン酸化のためにインキュベートした後、６５℃で熱不活性化し、その後のトリゾール精製を行った。
次に、ＲｅａｌＳｅｑ－ＡＣ ｍｉＲＮＡライブラリキットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定（ｓｏｍａｇｅｎｉｃｓ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリを調製した。ｃＤＮＡライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定に供し、５０ヌクレオチド長の単一読み取りデータを生成した。生の配列決定データを処理して、アダプター及び配列決定人工物を除去し、高品質の読み取りデータを維持した。結果として得られた読み取りデータをそれぞれのプラスミドにマッピングして、ＣＲＩＳＰＲ座位の発現及びｃｒＲＮＡプロセシングを決定した。
実施例５
結果
図１５に提供されるデータは、Ｃａｓ１２Ｊが標的化ＧＦＰ破壊を誘導することができることを示し、ヒト細胞における非相同末端接合（ＮＨＥＪ）及び標的化ゲノム編集の成功を示す。１つの場合では、個々のＣａｓ１２Ｊ／ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸについて報告されたレベル（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３、及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ ５６６：７７４３）と同等の３３％ほどの細胞を編集することができた（Ｃａｓ１２Ｊ－２ガイド２）。
方法
ヒト細胞における発現のためのＣａｓ１２Ｊエフェクタープラスミドのクローニング
ｃａｓ１２Ｊ－２及びｃａｓ１２Ｊ－３の遺伝子配列を、ヒト細胞における発現のためのコドン最適化遺伝子をコードするＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からＧブロックとして注文した。Ｇブロックを、ＧＳＧリンカーコード配列を介して２つのＳＶ４０ ＮＬＳに融合された下流のｐＢＬＯ６２．５のベクター骨格内にＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを介してクローニングした（図１６Ａ～１６Ｂは構築物マップを提供し、表１は構築物のヌクレオチド配列を提供する（図１７Ａ～１７Ｇに提供される））。ｐＢＬＯ６２．５のガイドコード配列を交換して、それぞれのホモログの単一のＣＲＩＳＰＲ反復をコードし、続いて、制限酵素ＳａｐＩを使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ交換に適した２０ｂｐのスタッファースペーサー配列をコードした（図１６Ａ～１６Ｂ、及び表１（図１７Ａ～１７Ｇに提供される））。ＥＧＦＰ標的化構築物を生成するために、スタッファーをＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを介して交換して、選択された標的部位のガイドをコードした（表２）。
（表２）ガイド配列
Figure 0007239725000087
ヒト細胞標的化ＧＦＰ破壊
ＧＦＰ ＨＥＫ ２９３レポーター細胞は、以前に記載されているように、レンチウイルス組み込みを介して以前に生成された。Ａｎｔｏｎｙ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ５：９。製造業者のプロトコルに従って、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマについて、細胞を日常的に試験した。ＧＦＰ ＨＥＫ２９３レポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、翌日、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびにＣａｓ１２Ｊ ｇＲＮＡ及びＣａｓ１２Ｊ－Ｐ２Ａ－ピューロマイシン融合物をコードする２００ｎｇのプラスミドＤＮＡで形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞培養培地に１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを７２時間添加することによって、形質移入に成功した細胞を選択した。細胞を継代してサブコンフルエント状態を維持し、次いで、オートサンプラーを備えたＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで分析した。細胞を、７日後にフローサイトメーターで分析し、細胞からのＧＦＰのクリアランスを可能にした。
実施例６
結果
一度シス標的化核酸によって活性化されるとＣａｓ１２Ｊが非特異的トランス切断活性を特徴とするかを試験するために、インビトロ切断アッセイを設定した。アッセイにおいて、Ｃａｓ１２Ｊ ＲＮＰ及びトランス切断ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ基質を、シス－アクティベーター、ｓｓＤＮＡシス－アクティベーター、ｄｓＤＮＡシス－アクティベーター、またはｓｓＲＮＡシス－アクティベーターの存在下でインキュベートした。
図１８に示されるように、３つの試験したＣａｓ１２Ｊホモログは、反応中にＲＮＡではなく活性化ＤＮＡが存在する場合、ｓｓＤＮＡを効率的に切断するが、ｓｓＲＮＡは切断しない。このアッセイは、Ｃａｓ１２Ｊが、スペーサー相補的ｓｓＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡによって活性化されて、トランスのｓｓＤＮＡを標的とし得ることを示す。さらに、このＤＮＡ活性化ｓｓＤＮＡトランス切断活性は、フルオロフォア－クエンチャー標識レポーターアッセイ（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３８，２７０－２７３（２０１６））を使用して核酸検出に使用され得る。
方法
トランス切断のためのｓｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡ基質は、Ｃａｓ１２ＪガイドＲＮＡのスペーサーに非相補的であるように設計された。基質は、３２Ｐ－γ－ＡＴＰの存在下でＴ４－ＰＮＫ（ＮＥＢ）を使用して５’末端標識された。活性Ｃａｓ１２Ｊ ＲＮＰ複合体を、複合体アセンブリ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、３００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中でＣａｓ１２Ｊタンパク質及びガイドｃｒＲＮＡを４μＭに希釈し、室温で３０分間インキュベートすることによって組み立てた。スペーサー相補的活性化基質をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．８、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ）中で４μＭの濃度に希釈し、５分間９５℃に加熱し、その後室温（ＲＴ）で冷却し、二本鎖活性化基質の二重鎖形成を可能にした。２００ｎＭのＲＮＰを４００ｎＭのアクティベーター基質と組み合わせることによって切断反応を設定し、２ｎＭのｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡのトランス切断基質を添加する前に室温で１０分間インキュベートした。反応緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で反応を行い、３７℃で６０分間インキュベートした。２体積のホルムアミド充填緩衝液（９６％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬのブロモフェノールブルー、５０μｇ／ｍＬのキシレンシアノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍＬのヘパリン）を添加することによって反応を停止させ、５分間９５℃に加熱し、氷上で冷却した後、１２．５％変性尿素－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離した。ゲルを８０℃で４時間乾燥させた後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してリン光体撮像可視化を行った。
実施例７
材料及び方法
メタゲノムアセンブリ、ゲノム精選、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２Ｊ）検出
以前説明された方法（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２８，１４２０－１４２８（２０１２）、及びＮｕｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２７，８２４－８３４（２０１７）を使用して、メタゲノム配列決定データを組み立てた。コード配列（ＣＤＳ）を、遺伝子コード１１（－ｍ－ｇ １１－ｐシングル）及び（－ｍ－ｇ １１－ｐメタ）を有するプロディガルを使用して配列アセンブリから予測し、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＵｎｉＲｅｆ１００、及びＫＥＧＧ（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ＩＳＭＥ Ｊ．８、１４５２－１４６３（２０１４））に対して検索することによって以前に記載されているように、予備注釈を実施した。ファージゲノム精選は、上述のように実施した。簡潔に、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｖ２．３．４．１（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．９，３５７－３５９（２０１２））を使用して、読み取りデータを新たに組み立てられた配列にマッピングし、マッピングされた読み取りデータの配置されていない交配対をｓｈｒｉｎｋｓａｍ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｃｔｈｏｍａｓ／ｓｈｒｉｎｋｓａｍ）で保持した。Ｎが満たされたギャップ及び局所的なミスアセンブリを特定及び補正し、配置されていない、または誤って配置された対読み取りデータは、コンティグ末端の伸長を可能にした。局所的なアセンブリの変更及び伸長は、さらなる読み取りマッピングで検証された。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４０７（Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３０，７７２－７８０（２０１３））及びｈｍｍｂｕｉｌｄを使用して、ＣａｓΦ配列のデータベースを生成した。Ｅ値＜１×１０－５のｈｍｍｓｅａｒｃｈを使用して、新しいアセンブリからのＣＤＳをＨＭＭデータベースに対して検索し、検証時にデータベースに加えた。
Ｖ型システムの系統発生分析
上述のようにＣａｓタンパク質配列を収集し、ＴｎｐＢスーパーファミリーからの代表物をＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１－１７（２０１９））、及びＲｅｆＳｅｑからの上位ＢＬＡＳＴヒットから収集した。結果として得られたセットを、ＣＤ－ＨＩＴを使用して９０％アミノ酸同一性でクラスター化して、冗長性を低減した（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２６，６８０－６８２（２０１０））。結果として得られた配列セットとのＣａｓΦの新しいアライメントは、１０００回の繰り返しでＭＡＦＦＴ ＬＩＮＳＩを使用して生成され、フィルタリングされて、配列の９５％のギャップで構成されるカラムを除去した。整列不良の整列した配列を除去し、結果として得られたセットを再整列した。系統樹を、自動モデル選択（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３２，２６８－２７４（２０１５））及び１０００ブートストラップを使用して、ＩＱＴＲＥＥ ｖ１．６．６を使用して推定した。
ｃｒＲＮＡ配列分析
ファージにコードされたＣＲＩＳＰＲ座位からのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）反復を、ＭｉｎＣＥＤ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｔＳｋｅｎｎｅｒｔｏｎ／ｍｉｎｃｅｄ）及びＣＲＩＳＰＲＤｅｔｅｃｔ（Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１７，３５６（２０１６））を使用して特定した。反復を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、続いてＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ＭｃＷｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１，Ｗ５９７－６００（２０１３））を使用してペアワイズ類似性スコアを生成することによって比較した。類似性スコアマトリックス及び階層クラスタリングを使用してヒートマップを構築し、ヒートマップ上に重ね合わせた樹状図を産生し、異なる反復のクラスターを描写した。
プラスミドの生成
ＣａｓΦの上流の追加のＥ．コリＲＢＳを含むＣａｓΦ座位を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からＧブロックとして注文し、ＲＮＡ ｓｅｑ及びＰＡＭ枯渇プラスミド干渉実験のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ（ＧＧ）を使用してクローニングした。メタゲノムによって特定されたＣＲＩＳＰＲアレイの完全な反復－スペーサー単位を、ＧＧアセンブリ（ＡａｒＩ制限部位）によるスタッファー－スペーサー交換に適した単一の反復－スペーサー－反復単位に還元した。その後、ＣａｓΦ遺伝子配列を、形質転換プラスミド干渉アッセイの効率のためのタグなしで、ＧＧアセンブリによってＭＣＳＩ内のｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングするか、またはタンパク質精製のためにＣ末端ヘキサヒスチジンタグと融合させた。プラスミド干渉アッセイのために、ＧＧアセンブリ（ＡａｒＩ制限部位）によるスタッファー－スペーサー交換に適したミニＣＲＩＳＰＲアレイ（反復－スペーサー－反復、または反復－スペーサー－ＨＤＶリボザイム）をｐＲＳＦＤｕｅｔのＭＣＳ ＩＩにクローニングした。ヒト細胞におけるゲノム編集実験のために、ヒト細胞における発現のためのコドン最適化遺伝子をコードするＩＤＴからＧブロックとしてｃａｓΦ遺伝子を注文した。Ｇブロックを、ＧＳＧリンカーコード配列を介して２つのＳＶ４０ ＮＬＳに融合された下流のｐＢＬＯ６２．５のベクター骨格内にＧＧアセンブリを介してクローニングした。ｐＢＬＯ６２．５のガイドコード配列を交換して、それぞれのホモログの単一のＣＲＩＳＰＲ反復をコードし、続いて、制限酵素ＳａｐＩを使用してＧＧアセンブリ交換に適した２０ｂｐのスタッファースペーサー配列をコードした。プラスミドのリスト及び簡単な説明を図３４に示す（表３を提供する）。プラスミド配列及びマップは、ａｄｄｇｅｎｅで利用可能になるであろう。異なる座を標的とするようにＣａｓΦベクターを再プログラムするために、スタッファー－ペーサーを、ＧＧアセンブリを介して交換して、選択された標的部位のガイドをコードした（ガイドスペーサー配列を図３５に列記する（表４を提供する））。ＣａｓΦ遺伝子における変異をＧＧアセンブリによって導入して、ｄｃａｓΦ遺伝子を作製した。
ＰＡＭ枯渇ＤＮＡ干渉アッセイ
メタゲノムに由来するＣａｓΦ座位全体をいずれか担持したＣａｓΦプラスミド（ｐＰＰ０４９、ｐＰＰ０５６、及びｐＰＰ０６２）、またはＣａｓΦ遺伝子及びミニＣＲＩＳＰＲのみを含有するプラスミド（ｐＰＰ０９７、ｐＰＰ１０２、及びｐＰＰ１０７）の両方を用いて、ＰＡＭ枯渇アッセイを実施した。アッセイを、３つの個々の生物学的複製物として実施した。ＣａｓΦ及びミニＣＲＩＳＰＲを含有するプラスミドを、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）に形質転換し、ＣａｓΦゲノム座位を含有する構築物を、Ｅ．コリＤＨ５α（ＱＢ３－Ｍａｃｒｏｌａｂ，ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）に形質転換した。その後、氷冷Ｈ２Ｏ及び１０％グリセロール洗浄によってエレクトロコンピテントな細胞を調製した。プラスミドライブラリを、標的配列の上流（５’）端に８個のランダム化ヌクレオチドを用いて構築した。２００ｎｇのライブラリプラスミド（Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上の０．１ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））で電気穿孔することにより、３つ組でコンピテントな細胞を形質転換した。２時間の回復期間後、細胞を選択培地にプレーティングし、コロニー形成単位を決定して、ランダム化された５’ＰＡＭ領域の全ての可能な組み合わせの適切なカバー範囲を確保した。プラスミドの増殖及びＣａｓΦエフェクター産生を確実にするために、ベクターにより、適切な抗生物質（１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、または１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンのいずれか）ならびに０．０５ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、または２００ｎＭのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を含有する培地上、２５℃で４８時間、株を成長させた。その後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、増殖させたプラスミドを単離した。
ＰＡＭ枯渇配列決定分析
標的化されたプラスミドのアンプリコン配列決定を使用して、優先的に枯渇しているＰＡＭモチーフを特定した。配列決定読み取りデータをそれぞれのプラスミドにマッピングし、ＰＡＭランダム化領域を抽出した。各可能な８ヌクレオチドの組み合わせの存在量を整列された読み取りデータから計数し、各試料についての総読み取りデータに対して正規化した。濃縮されたＰＡＭは、対照プラスミド中の存在量と比較した対数比を計算することによって計算され、配列ロゴを産生するために使用された。
ＲＮＡｓｅｑのＲＮＡ調製
ＣａｓΦ座位を含有するプラスミドを、化学的にコンピテントなＥ．コリＤＨ５α（ＱＢ３－Ｍａｃｒｏｌａｂ，ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）に形質転換した。調製を、３つの個々の生物学的複製物として実施した。単一コロニーを採取して、５ｍＬの開始培養物（ＬＢ、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）を接種し、これらを３７℃で激しく振盪させて一晩インキュベートした。翌朝、主培養物を１：１００（ＬＢ、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）で接種し、座位発現を２００ｎＭのａＴｃで、１６℃で２４時間誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、２００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、ガラスビーズ（０．１ｍｍのガラスビーズ、４℃で４×３０秒のボルテックス、３０秒間隔、氷上で冷却）を使用して溶解した。２００μＬの細胞溶解上清を、製造業者のプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）に従ってＲＮＡ抽出のためにトリゾールに移した。１０μｇのＲＮＡを、２′－３′－脱リン酸化のために、２０単位のＴ４－ＰＮＫ（ＮＥＢ）で３７℃で６時間処理した。その後、１ｍＭのＡＴＰを添加し、試料を３７℃で１時間、５’－リン酸化のためにインキュベートした後、６５℃で２０分間熱不活性化し、その後のトリゾール精製を行った。
ＲＮＡｓｅｑによるＲＮＡ分析
ＲｅａｌＳｅｑ－ＡＣ ｍｉＲＮＡライブラリキットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定（ｓｏｍａｇｅｎｉｃｓ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリを調製した。ｃＤＮＡライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定に供し、生の配列決定データを処理して、アダプター及び配列決定人工物を除去し、高品質の読み取りデータを維持した。結果として得られた読み取りデータをそれぞれのプラスミドにマッピングして、ＣＲＩＳＰＲ座位の発現及びｃｒＲＮＡプロセシングを決定し、カバー範囲を各領域で計算した。
形質転換プラスミド干渉アッセイの効率
ＣａｓΦベクターを、化学的にコンピテントなＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）に形質転換した。生物学的複製のための個々のコロニーを採取して、３つの５ｍＬ（ＬＢ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の開始培養物を接種し、翌日にエレクトロコンピテントな細胞を調製した。５０ｍＬ（ＬＢ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の主培養物を１：１００で接種し、３７℃で激しく振盪して、０．３のＯＤ６００に成長させた。続いて、培養物を室温に冷却し、ｃａｓΦ発現を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を２５℃で０．６～０．７のＯＤ６００に成長させた後、氷冷Ｈ２O及び１０％グリセロール洗浄を繰り返してエレクトロコンピテントな細胞を調製した。細胞を２５０μＬの１０％グリセロールに再懸濁した。９０μＬのアリコートを液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。翌日、８０μＬのコンピテントな細胞を３．２μＬのプラスミド（２０ｎｇ／μＬのｐＵＣ１９標的プラスミド、または２０ｎｇ／μＬのｐＹＴＫ００１対照プラスミド）と組み合わせ、氷上で３０分間インキュベートし、３つの個々の２５μＬの形質転換反応物に分割した。Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上の０．１ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で電気穿孔した後、０．２ｍＭのＩＰＴＧを補充した１ｍＬの回収培地（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で細胞を回収し、３７℃で１時間振盪させた。その後、１０倍希釈系列を調製し、それぞれの希釈ステップの５μＬを、適切な抗生物質を含有するＬＢ－Ａｇａｒ上にスポットプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日にコロニーを計数して、形質転換効率を決定した。形質転換効率を評価するために、電気穿孔３つ組の１ｎｇ形質転換プラスミドあたりの細胞形成単位から平均及び標準偏差を計算した。
タンパク質の産生及び精製
ＣａｓΦ過剰発現ベクターを、化学的にコンピテントなＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｓｔａｒ（ＱＢ３－Ｍａｃｒｏｌａｂ，ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）に形質転換し、ＬＢ－Ｋａｎ寒天プレート（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）上、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを採取して、８０ｍＬ（ＬＢ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）の開始培養物を接種し、これらを３７℃で激しく振盪させて一晩インキュベートした。翌日、１．５ＬのＴＢ－Ｋａｎ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）に４０ｍＬの開始培養液を接種し、３７℃で０．６のＯＤ６００に成長させ、氷上で１５分間冷却し、その後、遺伝子発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した後、１６℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）に再懸濁し、その後超音波処理により溶解し、続いて遠心分離による溶解物の清澄化を行った。可溶性画分を、洗浄緩衝液中で予備平衡化した５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ）上に充填した。結合したタンパク質を２０カラム体積（ＣＶ）の洗浄緩衝液で洗浄し、その後、５ＣＶ溶出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で溶出した。溶出したタンパク質を、１ｍＬに濃縮した後、サイズ排除クロマトグラフィー緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で予備平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。ピーク画分を１ｍＬに濃縮し、濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。タンパク質を４℃の一定温度で精製し、凝集を防止するために濃縮タンパク質を氷上に保持し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。前述のように、ＡｓＣａｓ１２ａを精製した（Ｋｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３１５）。
インビトロ切断アッセイ－スペーサータイリング
プラスミド標的を、同族５’－ＴＴＡ ＰＡＭ、または非同族５’－ＣＣＡ ＰＡＭの下流のＣａｓΦ－１のＣＲＩＳＰＲアレイに見出されるスペーサー２のＧＧアセンブリによってｐＹＴＫ０９５にクローニングした（標的配列を図３６に示す（表５を提供する））。ＬＢ及びカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）中のＥ．コリＭａｃｈ１（ＱＢ３－Ｍａｃｒｏｌａｂ，ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）においてプラスミドを一晩３７℃で増殖させ、その後、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製することによって、スーパーコイルプラスミドを調製した。線状ＤＮＡ標的をプラスミド標的からＰＣＲによって調製した。ｃｒＲＮＡガイドを、ＩＤＴからの合成ＲＮＡオリゴとして注文し（図３７（表６を提供する））、ＤＥＰＣ Ｈ２Oに溶解し、９５℃で３分間加熱した後、室温で冷却した。活性ＲＮＰ複合体を、タンパク質及びｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）を切断緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｋ ｐＨ７．５、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中に１：１のモル比で混合し、室温で３０分間インキュベートすることによって、１．２５μＭの濃度で組み立てた。切断反応を、反応緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ－Ｋ ｐＨ７．５、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中の予め形成されたＲＮＰ（１μＭ）にＤＮＡ（１０ｎＭ）を添加することによって開始させた。反応物を３７℃でインキュベートし、５０ｍＭのＥＤＴＡでクエンチし、液体窒素中で保存した。試料を解凍し、０．８単位のプロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）で２０分間、３７℃で処理した。充填色素を添加し（Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ Ｐｕｒｐｌｅ ６Ｘ、ＮＥＢ）、１％アガロースゲル上で電気泳動により試料を分析し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。切断産生物と比較するために、スーパーコイルプラスミドを、線状化のためのＰｃｉＩ（ＮＥＢ）、及びプラスミドのニッキング及びオープンサークル形成のためのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）で消化した。様々な条件下での比較可能な切断アッセイ（ｎ≧３）は、一貫した結果を示した。
インビトロ切断アッセイ－放射標識核酸
活性ＣａｓΦ ＲＮＰ複合体を、ＲＮＰアセンブリ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、３００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中でＣａｓΦタンパク質を４μＭに、及びｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）を５μＭに希釈し、室温で３０分間インキュベートすることによって１：１．２モル比で組み立てた。基質は、３２Ｐ－γ－ＡＴＰの存在下でＴ４－ＰＮＫ（ＮＥＢ）を使用して５’末端標識された（基質配列を図３６に示す（表５を提供する））。オリゴ二重鎖標的を、３２Ｐ標識及び非標識相補的オリゴヌクレオチドを１：１．５モル比で組み合わせることによって生成した。オリゴを、加熱ブロック中で５分間９５℃に加熱し、徐々に室温まで冷却することによって、ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ）中５０ｎＭの濃度のＤＮＡ二重鎖にハイブリダイズした。２００ｎＭのＲＮＰを、反応緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｎａ ｐＨ７．５、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中２ｎＭの基質と組み合わせることによって切断反応を開始させ、その後、３７℃でインキュベートした。トランス切断アッセイのために、ガイド相補的アクティベーター基質をオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．８、室温、１５０ｍＭのＫＣｌ）中４μＭの濃度に希釈し、９５℃に５分間加熱し、その後室温で冷却して、二重鎖アクティベーター基質の二重鎖形成を可能にした。２００ｎＭのＲＮＰを１００ｎＭのアクティベーター基質と組み合わせることによって切断反応を設定し、２ｎＭのｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡのトランス切断基質を添加する前に室温で１０分間インキュベートした。反応を、２体積のホルムアミド充填緩衝液（９６％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬのブロモフェノールブルー、５０μｇ／ｍＬのキシレンシアノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍＬのヘパリン）の添加によって停止させ、５分間９５℃に加熱し、氷上で冷却した後、１２．５％変性尿素－ＰＡＧＥで分離した。ゲルを８０℃で４時間乾燥させた後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してリン光体撮像可視化を行った。技術的複製（ｎ≧２）及び様々な条件下での同等の切断アッセイ（ｎ≧３）の生物学的複製（ｎ≧２）は、一貫した結果を示した。バンドを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（ＧＥ）を使用して定量し、切断基質を、ｔ＝０分で観察された強度に対する強度から計算した。曲線をＰｒｉｓｍ ８（グラフパッド）中のＯｎｅ－Ｐｈａｓｅ－Ｄｅｃａｙモデルに適合させて、切断速度を得た。
インビトロプレｃｒＲＮＡプロセシングアッセイ
プレｃｒＲＮＡ基質は、３２Ｐ－γ－ＡＴＰの存在下でＴ４－ＰＮＫ（ＮＥＢ）を使用して５’末端標識された（基質配列を図３６に示す（表５を提供する））。５０ｎＭのＣａｓΦを、プレｃｒＲＮＡプロセシング緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８、室温、２００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２または２５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中１ｎＭの基質と組み合わせることによって、プロセシング反応を開始させ、その後、３７℃でインキュベートした。製造業者のプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）に従って、アルカリ加水分解緩衝液を使用して、基質加水分解ラダーを調製した。１０μＬのプロセシング反応産生物を、末端化学分析のためのＡＴＰの不在下で、１０単位のＴ４－ＰＮＫ（ＮＥＢ）で１時間、３７℃で処理した。反応を、２体積のホルムアミド充填緩衝液（９６％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬのブロモフェノールブルー、５０μｇ／ｍＬのキシレンシアノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍＬのヘパリン）の添加によって停止させ、３分間９５℃に加熱し、氷上で冷却した後、１２．５％または２０％変性尿素－ＰＡＧＥで分離した。ゲルを８０℃で４時間乾燥させた後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してリン光体撮像可視化を行った。技術的複製（ｎ≧３）及び様々な条件下での同等の切断アッセイ（ｎ≧３）の生物学的複製（ｎ≧２）は、一貫した結果を示した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（ＧＥ）を使用してバンドを定量し、プロセシングされたＲＮＡを、ｔ＝０分で観察された強度に対するｔ＝６０分での強度から計算した。
分析サイズ排除クロマトグラフィー
５００μＬの試料（５～１０μＭのタンパク質、ＲＮＡ、または再構築ＲＮＰ）を、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－Ｃｌ ｐＨ７．５、室温、２５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で予備平衡化したＳ２００ ＸＫ１０／３００サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入した。ＳＥＣの前に、ＣａｓΦ ＲＮＰ複合体をＣａｓΦタンパク質及びプレｃｒＲＮＡを２ＸプレｃｒＲＮＡプロセシング緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．８、室温、４００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、２ｍＭのＤＴＴ）中で１時間インキュベートすることによって組み立てた。
ヒト細胞におけるゲノム編集
ＧＦＰ ＨＥＫ２９３レポーター細胞は、前述のように、レンチウイルス組み込みを介して生成された。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：３３９。製造業者のプロトコルに従って、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマの不在について、細胞を日常的に試験した。ＧＦＰ ＨＥＫ２９３レポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、翌日、製造業者のプロトコルに従って、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびにＣａｓΦ ｇＲＮＡ及びＣａｓΦ－Ｐ２Ａ－ＰＡＣ融合物をコードする２００ｎｇのプラスミドＤＮＡで、６０～７０％の集密度で形質移入した。比較対照として、ＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ及びＳｐｙＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＰＡＣ融合物をコードする２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを同一に形質移入し、標的配列をＰＡＭ差について調整した。形質移入の２４時間後、細胞培養培地に１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを７２時間添加することによって、形質移入に成功した細胞を選択した。細胞を定期的に継代してサブコンフルエント状態を維持し、次いで、オートサンプラーを備えたＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで分析した。細胞を、１０日後にフローサイトメーターで分析し、細胞からのＧＦＰのクリアランスを可能にした。
結果
Ｃａｓ１２Ｊ、または単にそのファージ制限起源へのオマージュとしてのＣａｓΦは、Ｂｉｇｇｉｅｐｈａｇｅ分岐群においてコードされるＣａｓタンパク質の以前は未知であったファミリーである。ＣａｓΦは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が進化したと考えられるＴｎｐＢヌクレアーゼスーパーファミリーのものと遠隔相同性を有するＣ末端ＲｕｖＣドメインを含有する（図２０）。しかしながら、ＣａｓΦは、他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と７％未満のアミノ酸同一性を共有し、ミニチュアＶ型（Ｃａｓ１４）タンパク質とは異なるＴｎｐＢ基に最も密接に関連している（図１９Ａ）。
ＣａｓΦは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａの約半分のサイズである約７０～８０ｋＤａという通常とは異なる小さなサイズであり（図１９Ｂ）、その共存遺伝子の欠如は、ＣａｓΦが真のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとして機能するかどうかの疑問を提起した。図２１でＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－２、及びＣａｓΦ－３と称される、メタゲノムアセンブリからの３つの異なるＣａｓΦオルソログを、それらのタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ反復配列の分岐（図２１）に基づく研究のために選択した。細菌細胞内のＤＮＡを認識し標的化するＣａｓΦの能力を調査するために、これらのシステムがエシェリキア・コリをプラスミド形質転換から保護できるかどうかを試験した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、自己対非自己識別のための２～５ヌクレオチドプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の後または前のＤＮＡ配列を標的とすることが知られている（Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６：５０４）。ＣａｓΦがＰＡＭを使用するかどうかを決定するために、ｃｒＲＮＡ相補的標的部位に隣接するランダム化領域を含有するプラスミドのライブラリをＥ．コリに形質転換し、それによって機能的ＰＡＭを含むプラスミドを優先的に枯渇させた。これにより、ＣａｓΦ－２について観察された最小５’－ＴＢＮ－３’ＰＡＭを含む、ＣａｓΦ及び異なるＴリッチＰＡＭ配列のｃｒＲＮＡ誘導二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的化能力が明らかになった（図１９Ｃ）。
Ｅ．コリ発現システム及びプラスミド干渉アッセイを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦシステム機能に必要な構成要素を決定した。ＲＮＡ配列決定分析は、ｃａｓΦ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイの転写を明らかにしたが、座位内またはその近くでコードされるトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）などの他の非コードＲＮＡの証拠はなかった（図１９Ｄ）。加えて、ＣａｓΦ活性は、ガイドＲＮＡを変化させることによって、他のプラスミド配列に対して容易に配向され得ることが見出され、このシステムのプログラム可能性が示された（図２２Ａ～２２Ｃ）。これらの所見は、その天然環境において、ＣａｓΦが、異なるｃｒＲＮＡ、おそらく他のＭＧＥに相補性を有するＤＮＡを切断して重複感染を抑制することができる機能的ファージタンパク質及び真のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターであることを示唆する（図１９Ｅ）。さらに、これらの結果は、この単一ＲＮＡシステムが他の活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムよりもはるかにコンパクトであることを示す（図１９Ｆ）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体は、ＭＧＥに対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介免疫の最終段階中に、外来核酸を特定及び切断する（Ｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ １７２：１２３９）。ＣａｓΦがＢｉｇｇｉｅｐｈａｇｅｓのＲＮＡ誘導ＤＮＡ標的化をどのように達成するかを決定するために、ＣａｓΦのインビトロでの認識及び切断要件を調査した。ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＤＮＡ標的に相補的なｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列が１４～２０ヌクレオチド（ｎｔ）長であることを明らかにした（図１９Ｄ）。精製されたＣａｓΦ（図２４Ａ～２４Ｄ）を、スーパーコイルプラスミドまたは線状ｄｓＤＮＡとともに異なるスペーサーサイズのｃｒＲＮＡとインキュベートすることにより、標的ＤＮＡ切断には、同族ＰＡＭ及び１４ｎｔ以上のスペーサーの存在が必要であることが明らかになった（図２３Ａ、図２５Ａ）。切断産生物の分析は、ＣａｓΦが、Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓＸを含む他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素について観察される互い違いのＤＮＡ切断と類似して、８～１２ｎｔの互い違いの５’－オーバーハングを生成する（図２３Ｂ及び２３Ｃ、図２５Ｂ及び２５Ｃ）ことを示した（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：７５９、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ ５６６：２１８）。ＣａｓΦ－２及びＣａｓΦ－３がＣａｓΦ－１よりもインビトロでより活性であり、非標的鎖（ＮＴＳ）が標的鎖（ＴＳ）よりも早く切断されることが観察された（図２３Ｄ、図２６Ａ、図２７Ａ及び２７Ｂ）。さらに、ＣａｓΦは、ｓｓＤＮＡ標的を切断するが、ｓｓＲＮＡ標的を切断しないことが見出され（図２６Ｂ）、ＣａｓΦがｓｓＤＮＡ ＭＧＥまたはｓｓＤＮＡ中間体も標的とし得ることを示唆する。
ＣａｓΦ触媒ＤＮＡ切断におけるＲｕｖＣドメインの役割を評価するために、活性部位を変異させて（Ｄ３７１Ａ、Ｄ３９４Ａ、またはＤ４１３Ａ）、インビトロでｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｓｓＲＮＡを切断しないことが見出されたＣａｓΦバリアント（ｄＣａｓΦ）を産生した（図２６Ａ及び２６Ｂ）。ＣＲＩＳＰＲアレイとともにＥ．コリで発現された場合、ｄＣａｓΦは、ＲｕｖＣ触媒ＤＮＡ切断の要件と一致して、ｃｒＲＮＡ相補的プラスミドの形質転換を妨げることができなかった（図２２Ａ～２２Ｂ）。この観察は、非標的鎖切断後の標的鎖の遅延切断とともに（図２３Ｄ、図２７Ａ、及び２７Ｂ）、ＣａｓΦがＲｕｖＣ活性部位内で各鎖を順次切断することを示唆する。順次的なｄｓＤＮＡ鎖切断は、ＣａｓΦと最も近い進化起源を共有するＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（１０）のｄｓＤＮＡ切断機序と一致する。
さらに、他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターと同様に、ＣａｓΦは、シスにおける標的ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ結合によって活性化されると、トランスでｓｓＤＮＡを分解することが見出された。シスにおけるＤＮＡ標的認識時の、ＲＮＡｓｅではなく、トランス一本鎖ＤＮＡｓｅの活性が観察された（図２８Ａ～２８Ｂ）。このトランス切断活性は、最小限のＰＡＭ要件に加えて、より広範な核酸検出に有用であり得る。
ゲノム防御を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦシステムは、外来ＤＮＡ切断を誘導するために成熟ｃｒＲＮＡ転写産生物を産生しなければならない。他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメインとは異なる内部活性部位を使用するか（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．５３２，５１７－５２１（２０１６）、またはｔｒａｃｒＲＮＡとのプレｃｒＲＮＡ塩基対合によって形成される二重鎖ＲＮＡ基質を切断するためにリボヌクレアーゼＩＩＩを動員することによって、それら自体のプレｃｒＲＮＡをプロセシングする（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２：８３９、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６３：８８、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６０：３８５）。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦゲノム座位におけるコードされた検出可能なｔｒａｃｒＲＮＡの不在は、ＣａｓΦが単独でｃｒＲＮＡ成熟を触媒し得ることを示唆した。この可能性を試験するために、精製したＣａｓΦを、プレｃｒＲＮＡ構造を模倣するように設計された基質でインキュベートした（図２９Ａ）。ｃｒＲＮＡの２６～２９ヌクレオチド長反復及び２０ヌクレオチドガイド配列に対応する反応産生物は、天然座位のＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって実証された野生型ＣａｓΦの存在下でのみ観察された（図１９Ｄ、図２９Ａ、図２９Ｃ、図３０Ａ～３０Ｃ）。対照実験では、ＣａｓΦ触媒プレｃｒＲＮＡプロセシングがマグネシウム依存的であることが見出され（図２９Ｂ、図３０Ａ～３０Ｃ）、これは、他の全ての既知のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡプロセシング反応とは異なり、切断の異なる化学機序を示唆した。注目すべきことに、ＲｕｖＣドメイン自体は、ＤＮＡ基質を切断するためにマグネシウム依存的機序を用い（Ｎｏｗｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．１０：１４４）、いくつかのＲｕｖＣドメインは、エンドリボヌクレオチド鎖切断活性を有することが報告されている（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６３：８８）。これらの観察に基づいて、ＲｕｖＣ不活性化変異を含有するＣａｓΦを試験し、プレｃｒＲＮＡをプロセシングすることができないことが見出された（図２９Ｂ、図３０Ａ及び３０Ｂ）。野生型及び触媒的に不活性のＣａｓΦタンパク質の両方は、ｃｒＲＮＡ結合が可能であり、プレｃｒＲＮＡとのそれらの再構築された複合体は、サイズ排除カラムから同様の溶出プロファイルを有し、ＲｕｖＣ点変異から生じるプレｃｒＲＮＡ結合またはタンパク質安定性欠損がないことを示唆する（図３１Ａ～３１Ｂ）。
ＣａｓΦ ＲｕｖＣドメインがプレｃｒＲＮＡ切断の原因である場合、産生物は、ＲｕｖＣ関連ＲＮａｓｅ ＨＩ酵素によって生成されたＲＮＡで観察されるように、５’－リン酸ならびに２’－及び３’－ヒドロキシル部分を含有するであろうと仮定した（Ｎｏｗｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）（上記））。対照的に、Ｃａｓ１２ａ（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６６：２２１）について観察されるように、他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、ＲｕｖＣドメインとは異なる活性部位で金属依存的酸－塩基触媒機序によって、プレｃｒＲＮＡをプロセシングし、２’－３’－環状リン酸ｃｒＲＮＡ末端を生成する。ＣａｓΦ生成ｃｒＲＮＡのＰＮＫホスファターゼ処理、続いて変性アクリルアミドゲル分析は、Ｃａｓ１２ａによって生成されたｃｒＲＮＡで行われた同様の実験で検出された移動度の変化とは異なるｃｒＲＮＡ転移挙動に変化を示さなかった（図２９Ｃ、図３０Ｃ）。この結果は、ＡｓＣａｓ１２ａによるＲｕｖＣ非依存的酸－塩基触媒プレｃｒＲＮＡプロセシング反応とは対照的に、ＣａｓΦによって触媒された反応中に２’－３’－環状リン酸が形成されなかったことを意味する（図２９Ｃ及び２９Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＣａｓΦがプレｃｒＲＮＡプロセシング及びＤＮＡ切断の両方に単一の活性部位を使用することを示し、これは、ＲｕｖＣ活性部位またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素には以前に見られなかった活性である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの汎用性及びプログラム可能性は、実質的にあらゆる生物のゲノムを操作するために用いられているため、バイオテクノロジー及び基礎研究の革命のきっかけとなった。プログラムされたヒトゲノム編集のためにＣａｓΦのＤＮＡ切断活性を利用することができるかどうかを調査するために、ＨＥＫ２９３細胞において好適なｃｒＲＮＡと共発現されたＣａｓΦを使用して、遺伝子破壊アッセイ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ ５６６：２１８、Ｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：６４６）を実施した（図３２Ａ）。ＣａｓΦ－１ではなくＣａｓΦ－２及びＣａｓΦ－３が、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするゲノム的に組み込まれた遺伝子の標的破壊を誘導することができることが見出された（図３３Ａ、図３２Ｂ）。１つの場合では、個々のガイドＲＮＡを有するＣａｓΦ－２は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸについて最初に報告されたレベル（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：７５９、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）（上記）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３）と同等の最大３３％の細胞を編集することができた（図３３Ａ）。ＣａｓΦの小さなサイズとその最小限のＰＡＭ要件との組み合わせは、ベクターベースの細胞への送達及びより広範囲の標的化可能なゲノム配列の両方にとって特に有利であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓツールボックスに強力な追加を提供する。
ＣａｓΦは、ＲＮＡ及びＤＮＡ切断の両方のためのその単一の活性部位によって定義されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の新しいファミリーを表す。他の３つの十分に特徴付けられたＣａｓ酵素Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、及びＣａｓＸは、ＤＮＡ切断に１つ（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓＸ）または２つの活性部位（Ｃａｓ９）を使用し、ｃｒＲＮＡプロセシングのために別個の活性部位（Ｃａｓ１２ａ）または追加の因子（ＣａｓＸ及びＣａｓ９）に依存する（図３３Ｂ）。ＣａｓΦにおいて、単一のＲｕｖＣ活性部位がｃｒＲＮＡプロセシング及びＤＮＡ切断の両方を可能にするという発見は、原核生物（２４～２６）と比較して、おそらく大きな母集団サイズ及びファージにおけるより高い変異率と組み合わせて、ファージゲノムのサイズ制限が１つの触媒中心内の化学の強化をもたらしたことを示唆する。
図１９Ａ～１９Ｆ。ＣａｓΦは、巨大なファージ由来の真のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。（Ａ）報告されたＶ型エフェクタータンパク質及びそれぞれの予測祖先ＴｎｐＢヌクレアーゼの最尤系統樹。ブートストラップ及び９０以上の、およその尤度比試験値は、黒丸で分岐上に示される。（Ｂ）以前にゲノム編集用途で用いられたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのゲノム座位の図示。（Ｃ）３つのＣａｓΦオルソログのＰＡＭ枯渇アッセイ及び結果として得られたＰＡＭのグラフ表示。（Ｄ）ＣａｓΦオルソログの天然ゲノム座位上、及びそれらのそれぞれの発現プラスミドにクローニングされた、それらの上流及び下流の非コード領域にマッピングされたＲＮＡ配列決定結果（左）。第１の反復－スペーサー対上にマッピングされたＲＮＡの拡大図（右）。（Ｅ）宿主の重複感染の例におけるＢｉｇｇｉｅｐｈａｇｅにコードされたＣａｓΦの仮定された機能の概略図。ＣａｓΦは、競合する可動遺伝要素を排除するために巨大なファージによって使用され得る。（Ｆ）小ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、及び哺乳動物細胞の編集において機能するものの予測分子量。
図２０。Ｖ型サブタイプａ～ｋの系統樹の最尤系統樹。ファージにコードされたＣａｓΦタンパク質は赤色で示され、原核生物及びトランスポゾンにコードされたタンパク質は青色で示される。ブートストラップ及び９０超のおよその尤度比試験値は、分岐上（丸）に示される。
図２１。ＣａｓΦ ｃｒＲＮＡ反復は非常に多様である。類似性マトリックスを構築し、ヒートマップ及び階層クラスタリング樹状図を使用して可視化した。ＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－２、及びＣａｓΦ－３反復。
図２２Ａ～２２Ｃ。ＣａｓΦ－３は、プラスミド形質転換を保護する。（Ａ）形質転換（ＥＯＴ）アッセイの効率を図示するスキーム。（Ｂ）ベータ－ラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子標的化ガイドによってプログラムされたＣａｓΦが、ｐＵＣ１９形質転換（赤色の棒）の効率を低下させることを示すＥＯＴアッセイ。３つの生物学的複製物及び技術的電気穿孔形質転換３つ組（ドット；それぞれｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．）において実験を実施した。コンピテントな細胞を、試験したｂｌａ及びＮＴ（非標的化）ガイドによって標的化されないｐＹＴＫ０９５の形質転換による一般的な形質転換効率（灰色の棒）について試験した。（Ｃ）ＣａｓΦ－３ ＲｕｖＣ活性部位残基の変異（ＲｕｖＣＩ：Ｄ４１３Ａ、ＲｕｖＣＩＩ：Ｅ６１８Ａ、ＲｕｖＣＩＩＩ：Ｄ７０８Ａ）に依存するＥＯＴ。それぞれＮ＝３、平均±ｓ．ｄ．。コンピテントな細胞は、一般的な形質転換効率について試験された（灰色の棒）。
図２３Ａ～２３Ｄ。ＣａｓΦはＤＮＡを切断する。（Ａ）ガイドスペーサー長に依存するスーパーコイルプラスミド切断アッセイ。（Ｂ）切断構造のマッピングのためのｄｓＤＮＡオリゴ二重鎖を標的とする切断アッセイ。（Ｃ）切断パターンを図示するスキーム。（Ｄ）ＮＴＳ及びＴＳ ＤＮＡ切断効率（それぞれｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．）。データを図２７Ｂに示す。
図２４Ａ～２４Ｄ。アポＣａｓΦの精製。（Ａ）精製されたアポＣａｓΦオルソログ及びそれらのｄＣａｓΦバリアントのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（Ｂ）ＣａｓΦ－１ ＷＴ（青色のトレース）及びｄＣａｓΦ－１（オレンジ色のトレース）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ２００）。（Ｃ）ＣａｓΦ－２ ＷＴ（青色のトレース）及びｄＣａｓΦ－２（オレンジ色のトレース）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ２００）。（Ｄ）ＣａｓΦ－３ ＷＴ（青色のトレース）及びｄＣａｓΦ－３（オレンジ色のトレース）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ２００）。
図２５Ａ～２５Ｃ。ＣａｓΦは、インビトロでＤＮＡを標的として、互い違いの切断をもたらす。（Ａ）ガイドスペーサーの長さ及び同族５’－ＴＴＡ－３’ＰＡＭ（左）、または非同族５’－ＣＣＡ－３’ＰＡＭ（右）の存在に依存する線状ＰＣＲ断片切断アッセイ。（Ｂ）切断構造のマッピングのためのｄｓＤＮＡオリゴ二重鎖を標的とする切断アッセイ。（Ｃ）互い違いの切断の切断パターンを図示するスキーム。ｃｒＲＮＡスペーサーに結合するＤＮＡを標的とする際にＣａｓΦによって形成される提案されたＲループ（複製ループ）構造を示す。
図２６Ａ～２６Ｃ。ＣａｓΦは、インビトロでｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡを標的とするが、ＲＮＡは標的としない。（Ａ）ｄｓＤＮＡオリゴ二重鎖の標的鎖（ＴＳ）及び非標的鎖（ＮＴＳ）を切断するＣａｓΦ及びｄＣａｓΦバリアント（Ｄ３７１Ａ、Ｄ３９４Ａ、及びＤ４１３Ａ）ＲＮＰの能力を評価する切断アッセイ。（Ｂ）ＣａｓΦ及びｄＣａｓΦバリアント（Ｄ３７１Ａ、Ｄ３９４Ａ、及びＤ４１３Ａ）ＲＮＰが一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ標的鎖を標的とし切断する能力を試験する切断アッセイ。
図２７Ａ～２７Ｂ。ＣａｓΦによるＴＳ及びＮＴＳ切断効率を比較する切断アッセイ。（Ａ）Ｐｒｉｓｍ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＯｎｅ Ｐｈａｓｅ Ｄｅｃａｙモデルに適合した切断アッセイ曲線（それぞれｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．）。切断画分は、それぞれの時点に対するｔ＝（０分）（パネルＢ）での基質バンド強度に基づいて計算される。（Ｂ）３つの独立した反応複製物（複製物１、２、及び３）の尿素－Ｐａｇｅゲル。このパネルは、ＣａｓΦ－２についての図２３Ｄにも関する。
図２８Ａ～２８Ｂ。ＣａｓΦは、シスで活性化されると、トランスでｓｓＤＮＡを標的とするが、ＲＮＡは標的としない。（Ａ）シスでアクティベーターとしてのｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｓｓＲＮＡのいずれかに依存する、トランスで標的としてのｓｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡ上のＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－２、及びＣａｓΦ－３のトランス切断活性を比較する切断アッセイ。（Ｂ）ＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－２、及びＣａｓΦ－３のトランス切断活性を比較する切断アッセイ。
図２９Ａ～２９Ｄ。ＣａｓΦは、ＲｕｖＣ活性部位内でプレｃｒＲＮＡをプロセシングする。（Ａ）パネルＣ中のＯＨ－ラダーに由来するプレｃｒＲＮＡ基質及びプロセシング部位（赤色の三角形）。（Ｂ）Ｍｇ２＋及びＲｕｖＣ活性部位残基変異（Ｄ３７１Ａ及びＤ３９４Ａ）に依存するＣａｓΦ－１及びＣａｓΦ－２のプレｃｒＲＮＡプロセシングアッセイ（それぞれｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．；ｔ＝６０分）。データを図３０Ｂに示す。（Ｃ）左及び中央：プレｃｒＲＮＡ基質のアルカリ加水分解ラダー（ＯＨ）。右：ＣａｓΦ及びＣａｓ１２ａ切断産生物のＰＮＫ－ホスファターゼ処理。（Ｄ）ＣａｓΦ及びＣａｓ１２ａの成熟ｃｒＲＮＡ末端化学、ならびにＰＮＫ－ホスホリラーゼ治療結果のグラフ表示。
図３０Ａ～３０Ｃ。ＣａｓΦ－３ではなく、ＣａｓΦ－１及びＣａｓΦ－２が、プレｃｒＲＮＡをプロセシングする。（Ａ）Ｍｇ２＋及びＲｕｖＣ活性部位触媒残基（ｄＣａｓΦバリアント）に依存するＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－２、及びＣａｓΦ－３のプレｃｒＲＮＡプロセシングアッセイ。（Ｂ）ｔ＝０分及びｔ＝６０分での、ＣａｓΦ－１及びＣａｓΦ－２の反応複製物のプロセシング。紫色の正方形は、定量されたバンドを示す。このパネルは、図２９Ｂに関連する。（Ｃ）Ｍｇ２＋及びＲｕｖＣ活性部位触媒残基（ｄＣａｓΦバリアント）に依存するＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－２、及びＡｓＣａｓ１２ａのプレｃｒＲＮＡプロセシングアッセイ。
図３１Ａ～３１Ｂ。ＣａｓΦ ＷＴ及びｄＣａｓΦタンパク質は、プレｃｒＲＮＡとＲＮＰを形成する。（Ａ）野生型タンパク質（青色のトレース）、プレｃｒＲＮＡ（黄色のトレース）、及びそれらのそれぞれの再構成されたＲＮＰ（緑色のトレース）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ２００）。（Ｂ）ｄＣａｓΦバリアントタンパク質（青色のトレース）、プレｃｒＲＮＡ（黄色のトレース）、及びそれらのそれぞれの再構成されたＲＮＰ（緑色のトレース）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ２００）。
図３２Ａ～３２Ｃ。ＨＥＫ２９３細胞において、ＣａｓΦはＥＧＦＰ遺伝子破壊を媒介した。（Ａ）ＧＦＰ破壊アッセイ（左）及びＳｐｙＣａｓ９によるＥＧＦＰ破壊（右）の実験ワークフローの概略図。（Ｂ）ＧＦＰ破壊が５％未満のＣａｓΦガイド（それぞれｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．）。（Ｃ）標的部位及びガイドの配向（矢印及び数字）を示すＥＧＦＰマップ。黄色の三角形は、遺伝子破壊のための最良のガイドを示す（図３４Ａに関する）。ガイド配列を表４に列記する（図３５に示される）。
図３３Ａ～３３Ｂ。ＣａｓΦは、ヒトゲノム編集に機能的である。（Ａ）ＣａｓΦ－２（左）及びＣａｓΦ－３（右）ならびに陰性対照としての非標的化（ＮＴ）ガイドを使用するＧＦＰ破壊（それぞれｎ＝３、平均±ｓ．ｄ．）。ＥＧＦＰ遺伝子内の全ての試験したガイド及び標的化領域を図３２Ａ～３２Ｃに示す。（Ｂ）Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、ＣａｓＸ、及びＣａｓΦのＲＮＡプロセシング及びＤＮＡ切断の違いを図示するスキーム。
図３４は、表３を示す。
図３５は、表４を示す。
図３６は、表５を示す。
図３７は、表６を示す。
本発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、均等物が置き換えられてもよいことを理解されたい。加えて、特定の状態、材料、主題の組成物、プロセス、プロセスのステップ（複数可）を本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの修正がなされてもよい。全てのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (56)

  1. ａ）配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに
    ｂ）（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記ポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子
    を含み、前記ポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、組成物。
  2. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７７、１７８、１７９、および１８１のいずれか１つと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合している、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  5. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ポリペプチドが、（ｉ）ヌクレアーゼ、または（ｉｉ）二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメインにおける変異を含み、前記変異が、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つと１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドの触媒活性と比較して低下した触媒活性を有するポリペプチドをもたらす、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記ポリペプチドが、配列番号１１３のＤ４６４、Ｅ６７８、及びＤ７６９から選択される位置に対応する位置に１つ以上の変異を含む、請求項６または請求項７に記載の組成物。
  9. ＤＮＡドナー鋳型をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 異種ポリペプチドと融合したポリペプチドを含む、融合ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは、ガイドＲＮＡと会合して、前記ガイドＲＮＡと標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、融合ポリペプチド。
  12. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
  13. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
  14. 前記ポリペプチドが、（ｉ）ヌクレアーゼ、または（ｉｉ）二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  15. 前記ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメインにおける変異を含み、前記変異が、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つと１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドの触媒活性と比較して低下した触媒活性を有するポリペプチドをもたらす、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  16. 核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  17. 前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  18. （ａ）（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ならびに
    （ｂ）前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列
    を含む、１つ以上の核酸を含む組成物であって、前記ポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、組成物。
  19. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７７、１７８、１７９、および１８１のいずれか１つと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記ポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合している、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. １つ以上のアデノ随伴ウイルスベクター、１つ以上の組み換えレトロウイルスベクター、または１つ以上の組み換えレンチウイルスベクターから選択される１つ以上の組み換え発現ベクターである、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣ活性部位を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の１つ以上の組成物。
  25. （ａ）配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、または前記第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
    （ｂ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記第１のポリペプチドは配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドまたは核酸、ならびに
    （ｃ）（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記第１のポリペプチドまたは融合ポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸
    のうちの１つ以上を含む真核細胞であって、
    前記第１のポリペプチドまたは融合ポリペプチド、および前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成し、
    前記真核細胞は、ヒト生殖細胞ではない、
    真核細胞。
  26. （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載の前記核酸を含み、前記核酸が、前記細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている、請求項２５に記載の真核細胞。
  27. 植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ細胞、真菌細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、無脊椎動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項２５または請求項２６に記載の真核細胞。
  28. 請求項１１～１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、ヒト生殖細胞ではない、細胞。
  29. 原核細胞である、請求項２８に記載の細胞。
  30. 前記融合ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸を含み、前記核酸が、前記細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている、請求項２８または請求項２９に記載の細胞。
  31. （ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記第１のポリペプチドまたは融合ポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡを含み、前記第１のポリペプチドまたは融合ポリペプチド、および前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の細胞。
  32. 前記融合ポリペプチドが、異種ポリペプチドと融合したポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣ活性部位を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の細胞。
  33. 標的核酸を改変するインビトロまたはエクスビボ方法であって、前記方法が、前記標的核酸を、
    ａ）配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
    ｂ）（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記ポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡ
    と接触させることを含み、
    前記ポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成し、
    前記接触が、前記ポリペプチドによる前記標的核酸の改変をもたらし、
    前記標的核酸がヒト生殖細胞中にない、
    前記インビトロまたはエクスビボ方法。
  34. 前記改変が、前記標的核酸の切断である、請求項３３に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  35. 前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、請求項３３または請求項３４に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  36. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  37. 前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  38. 標的核酸からの転写を調節する、標的核酸を改変する、または標的核酸と会合したタンパク質を修飾する、インビトロまたはエクスビボ方法であって、前記標的核酸を、
    ａ）異種ポリペプチドと融合された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドは、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチド、ならびに
    ｂ）（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記第１のポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡ
    と接触させることを含み、前記第１のポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成し、前記標的核酸がヒト生殖細胞中にない、前記方法。
  39. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７７、１７８、１７９、および１８１のいずれか１つと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  40. 前記融合ポリペプチドが、核局在化シグナルを含む、請求項３８または請求項３９に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  41. 前記第１のポリペプチドが、配列番号１１３のＤ４６４、Ｅ６７８、およびＤ７６９から選択される位置に対応する位置に１つ以上の変異を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  42. 前記第１のポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  43. 遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物であって、そのゲノムが、ヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、前記ヌクレオチド配列が、
    ａ）配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｂ）請求項１１～１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、ならびに
    ｃ）（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記ポリペプチドに会合する領域とを含むガイドＲＮＡ
    のうちの１つ以上をコードし、前記ポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、前記遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
  44. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
  45. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
  46. 前記生物が、植物、単子葉植物、双子葉植物、無脊椎動物、昆虫、節足動物、クモ、寄生虫、蠕虫、刺胞動物、脊椎動物、魚類、爬虫類、両生類、有蹄動物、鳥類、ブタ、ウマ、ヒツジ、齧歯類、マウス、ラット、または非ヒト霊長類である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
  47. 前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、かつ／または前記融合ポリペプチドのポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の遺伝子導入した、多細胞の、非ヒト生物。
  48. 以下ａ）～ｌ）：
    ａ）第１のポリペプチド及びガイドＲＮＡ、
    ｂ）第１のポリペプチド、ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
    ｃ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチド及びガイドＲＮＡ、
    ｄ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
    ｅ）第１のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ、
    ｆ）第１のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
    ｇ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ、
    ｈ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナー鋳型、
    ｉ）（ｉ）第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター、
    ｊ）（ｉ）第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ＤＮＡドナー鋳型と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター、
    ｋ）（ｉ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター、ならびに
    ｌ）（ｉ）異種ポリペプチドと融合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ＤＮＡドナー鋳型と、を含む、１つ以上の組み換え発現ベクター
    のうちの１つを含むキットであって、
    前記第１のポリペプチドは、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
    前記ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記第１のポリペプチドに会合する領域とを含み、
    前記第１のポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、
    キット。
  49. 前記第１のポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のキット。
  50. 前記第１のポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のキット。
  51. 前記ドナー鋳型核酸が、８ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のキット。
  52. 前記ドナー鋳型核酸が、２５ヌクレオチド～５００ヌクレオチドの長さを有する、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のキット。
  53. 前記第１のポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、かつ／または前記融合ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載のキット。
  54. 試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、
    （ａ）前記試料を、
    （ｉ）配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
    （ｉｉ）（ａ）標的配列に相補的であるヌクレオチド配列と、（ｂ）前記ポリペプチドに結合する領域とを含む、ガイドＲＮＡ、ならびに
    （ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない検出器ＤＮＡ
    と接触させることであって、前記ポリペプチドおよび前記ガイドＲＮＡは、前記ガイドＲＮＡと前記標的配列との間の塩基対合を介して前記標的配列に標的化されるリボ核タンパク質複合体を形成する、接触させること、ならびに
    （ｂ）前記ポリペプチドによる前記一本鎖検出器ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記標的ＤＮＡを検出すること
    を含む、前記方法。
  55. 前記ポリペプチドが、配列番号１０９、１１０、１１２、１２０、および１２６のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ポリペプチドが、ＤＮＡの切断およびｃｒＤＮＡのプロセシングの両方が可能な単一のＲｕｖＣドメインを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
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