CN117512071A - 一种耐高温TnpB蛋白及其在核酸检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐高温TnpB蛋白及其在核酸检测中的应用，所述耐高温TnpB蛋白具有反式切割活性，且具体为Sis_TnpB蛋白、Sso_TnpB蛋白、Sto_TnpB蛋白、Tsi_TnpB蛋白、Tvo_TnpB蛋白中的一种。本发明所述的TnpB蛋白来源于嗜热微生物，同时具有顺式和反式切割活性，可实现体外核酸检测，而且所述TnpB蛋白的反式切割活性对TAM和靶标序列上的突变非常敏感，故其在区分病毒不同分型单碱基突变等方面具有独特的价值。本发明提供的核酸检测方法还能与等温扩增技术联用，提高检测灵敏度的同时还可实现一管式检测，避免交叉污染。因此，本发明提供的新型核酸检测工具在病原微生物检测、分子诊断等领域具有极大的应用前景。

Description

一种耐高温TnpB蛋白及其在核酸检测中的应用
技术领域
本发明属于TnpB蛋白技术领域，具体涉及具有顺式切割(cis-cleavage)活性和反式切割(trans-cleavage)活性的耐高温TnpB蛋白及其应用，尤其是在核酸检测中的应用。
背景技术
TnpB是属于IS200/IS605家族转座子编码的一种具有核酸切割活性的RNA引导的核酸酶(Karvelis T,Druteika G,Bigelyte G,et al.Transposon-associated TnpB is aprogrammable RNA-guided DNA endonuclease[J].Nature.2021,599(7886):692-696；HanA T,Soumya K,F Esra D,et al.The widespread IS200/IS605 transposon familyencodes diverse programmable RNA-guided endonucleases[J].Science,374(6563):57-65.9；Xiang,G.,Li,Y.,Sun,J.,Huo,Y.,Cao,S.,Cao,Y.,Guo,Y.,Yang,L.,Cai,Y.,Zhang,Y.E.et al.(2023)Evolutionary mining and functional characterization ofTnpB nucleases identify efficient miniature genome editors[J].Naturebiotechnology.)。虽然国际和国内已经报道了多个TnpB可以作为一种核酸编辑工具用于体内的基因组编辑，未来在基因编辑、细胞治疗、遗传改造等领域具有应用前景。但是，TnpB是一种普遍存在于原核和真核生物(同源蛋白为Fanzor)中的的转座酶，目前仅有少数几个TnpB能作为基因编辑的工具酶使用，还有很多TnpB蛋白的活性和功能未知。
此外，TnpB在进化关系上是Cas12蛋白的祖先，Cas12蛋白是一类广泛应用于核酸检测的蛋白，目前基于Cas12已经开发了多种核酸检测工具，包括DETECTR，HOLMES等(Chen,J.S.,Ma,E.,Harrington,L.B.,Da Costa,M.,Tian,X.,Palefsky,J.M.and Doudna,J.A.(2018)CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-strandedDNase activity[J].Science,360,436-439；Li,S.Y.,Cheng,Q.X.,Wang,J.M.,Li,X.Y.,Zhang,Z.L.,Gao,S.,Cao,R.B.,Zhao,G.P.and Wang,J.(2018)CRISPR-Cas12a-assistednucleic acid detection[J].Cell Discov,4,20.)。TnpB作为Cas12家族蛋白的祖先，是否存在可以用于核酸检测的反式切割活性尚不清楚，制约了基于TnpB的核酸检测技术开发。
到目前为止，已报道的TnpB大多数来源于中温细菌，并且是用于基因组编辑。嗜热微生物来源的TnpB蛋白具有天然的耐热特性，有望开发得到耐高温的TnpB蛋白，可以适用于体外检测的各种高温条件，在核酸检测领域具有巨大的应用潜力。
发明内容
本发明旨在获得耐高温且能够用于核酸检测的TnpB蛋白，并基于该蛋白构建核酸检测体系，为核酸检测提供一种新型工具。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种耐高温TnpB蛋白，具体为以下任一：
a1)Sis_TnpB蛋白，为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
a2)Sso_TnpB蛋白，为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
a3)Sto_TnpB蛋白，为氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
a4)Tsi_TnpB蛋白，为氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
a5)Tvo_TnpB蛋白，为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQ ID NO.5所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白。
本发明从不同嗜热微生物中分离鉴定了上述5种TnpB，这些TnpB与已报道的TnpB相似度很低，并且具有与已报道特异性DNA识别和顺式切割活性不同的反式切割活性(也成称为附带核酸酶活性)，即：在靶标序列存在的条件下，该TnpB蛋白可以在高温下(65-85℃)非特异性切割其他的单链DNA、双链DNA和单链RNA。利用TnpB蛋白的反式切割活性，可实现核酸检测。
本发明所述的与SEQ ID NO.1～5所示蛋白中任一蛋白具有高度序列相似性且功能相同的蛋白，具体是指在对应氨基酸序列的基础上，进行一个或多个碱基的替换、缺失、改变或插入，或者在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基，从而获得的蛋白。
本发明第二方面提供了一种引导上述耐高温TnpB核酸酶发挥反式切割活性的ωRNA分子，所述ωRNA分子包括两个部分，分别为：含有发卡结构的RNA片段以及3’末端的引导序列(即guide)。
优选地，ωRNA分子的长度为200～250nt，引导序列的长度为16-20nt。
优选地，含有发卡结构的RNA片段由对应tnpB基因末端的保守序列所编码，各RNA片段的序列具体为：
b1)Sis_ωRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
b2)Sso_ωRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
b3)Sto_ωRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
b4)Tsi_ωRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
b5)Tvo_ωRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在上述ωRNA分子中，引导序列与靶标序列互补配对，且靶标序列5’端相邻连接有TAM(Transposon Associated Motif)序列。
本发明所述的“靶标序列”是指被ωRNA分子中的引导序列所靶向的多核苷酸，例如与该引导序列具有互补性的序列，其中靶标序列与引导序列之间的杂交将促进TnpB复合物(TnpB蛋白和ωRNA分子)的形成。本发明所述的“靶标序列”可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA。在某些情况下，靶标序列位于细胞内或细胞外。
本发明所述的“互补配对”只要存在足够互补性以引起杂交并且促进一种复合物的形成即可，完全互补性不是必需的。
优选地，不同TnpB蛋白的识别位点TAM不同，本发明提供的5个TnpB蛋白的TAM序列具体为：
c1)Sis_TnpB的TAM序列为：5’-TTTAA，或该序列中某一个位置进行了单碱基突变后得到的序列；
c2)Sso_TnpB对应的TAM序列为：5’-TTTAT，或该序列中某一个位置进行了单碱基突变后得到的序列(如5’-ATTAT)；
c3)Sto_TnpB对应的TAM序列为：5’-TGAC，或该序列中某一个位置进行了单碱基突变后得到的序列；
c4)Tsi_TnpB对应的TAM序列为：5’-TTAC，或该序列中某一个位置进行了单碱基突变后得到的序列；
c5)Tvo_TnpB对应的TAM序列为：5’-TGAC，或该序列中某一个位置进行了单碱基突变后得到的序列。
本发明第三方面提供了一种蛋白复合物，包括TnpB蛋白及其对应的ωRNA分子，所述TnpB蛋白为Sis_TnpB，Sso_TnpB，Sto_TnpB，Tsi_TnpB和Tvo_TnpB中的任一个。
本发明第四方面提供了TnpB蛋白与ωRNA分子在体外进行体外转录和组装成蛋白复合物的方法，具体为：通过PCR获得编码ωRNA的含有T7启动子的DNA，然后进行T7 RNA聚合酶体外转录，获得ωRNA后与宿主细胞表达系统获得的TnpB蛋白在体外可以形成复合物，或直接按照摩尔比TnpB：ωRNA＝1:1或1:2将二者添加到反应体系中。
本发明第五方面提供了与上述耐高温TnpB蛋白相关的生物材料，至少包括以下：
d1)编码Sis_TnpB，Sso_TnpB，Sto_TnpB，Tsi_TnpB或Tvo_TnpB的核苷酸序列；
d2)包含d1)所述核苷酸序列的重组载体或表达盒；
d3)包含d2)所述重组载体或表达盒的工程化宿主细胞。
在上述生物材料中，所述的宿主细胞可以为微生物细胞，例如大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌细胞；或为哺乳动物细胞，例如HEK293T细胞；或为植物细胞；或为昆虫细胞；或为无细胞合成体系。
本发明第六方面提供了一种核酸检测体系，具体包括：
①TnpB蛋白和ωRNA分子，或二者形成的蛋白复合物；
②包含靶标序列的核酸；
③缓冲液，用于维持复合物的核酸酶活性。
在上述应用中，所述蛋白复合物靶向识别靶标序列(核酸为双链DNA或单链DNA)，然后反式切割其他双链DNA、单链DNA或单链RNA。
优选地，在上述核酸检测体系中，所述缓冲液为HEPES-NaOH。
优选地，在上述核酸检测体系中，所述缓冲液中含有一种或多种金属离子，且所述金属离子用于增强蛋白复合物中TnpB蛋白的活性。更为优选地，所述金属离子包括Mg2+、Mn2 +，其中Mg2+浓度为5mM时为最佳，Mn2+浓度为1mM时为最佳。
优选地，在上述核酸检测体系中，所述缓冲液含有NaCl。
优选地，在上述核酸检测体系中，所述缓冲液含有二硫苏糖醇(DTT)。
优选地，在上述核酸检测体系中，所述TnpB蛋白为Sis_TnpB蛋白，且所述TAM的5’端至少有7bp侧翼序列，同时靶标序列3’端至少有6bp侧翼序列。
本发明第七方面提供了一种核酸检测方法，具体为：将本发明提供的蛋白复合物置于缓冲体系中，加入分子信标和包含靶标序列的核酸，于65-85℃的环境中反应；其中所述分子信标的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
在本发明一实施例中，分子信标为一端带有FAM荧光基团且另一端带有BHQ1淬灭基团的序列；可以理解的是，分子信标两端还可以采用其他已知的荧光基团和荧光淬灭基团进行标记，只需要所选择的荧光基团可以产生可被仪器检测到的荧光并且淬灭基团可将该荧光基团产生的荧光淬灭。
在本发明的核酸检测方法中，蛋白复合物中的TnpB蛋白被靶标序列激活产生反式切割活性，TnpB蛋白利用该活性非特异性切割分子信标，从而产生可被检测的荧光。
在本发明的核酸检测方法中，蛋白复合物可以是一种也可以是多种，分子信标和待测靶标序列可以是一个也可以是多个；本领域技术人员可根据实际需求进行设置。
在本发明的核酸检测方法中，当蛋白复合物中的TnpB蛋白为Sis_TnpB蛋白时，分析信标的长度优选为18-24nt，分子信标的碱基组成优选为AG或GT。
优选地，本发明的核酸检测方法可与等温扩增技术联合使用以提高检测灵敏度，具体为：通过等温扩增试剂对包含待测靶标序列的样本进行扩增，然后将扩增产物代替样本加入缓冲体系中进行检测。可以理解的是，所述等温扩增试剂是环介导的等温扩增(LAMP)试剂，包括等温扩增引物、酶和缓冲液等。另外，当待测靶标序列为RNA时，需要使用RT-LAMP试剂，即在前述体系中增加反转录酶。
在本发明的核酸检测方法中，由于TnpB蛋白对TAM和靶标序列上的突变非常敏感，故该方法可以用于同种病毒不同突变株的检测。如本发明实施例将Sis_TnpB成功用于了SARS-Cov2、HPV16/18的检测。
本发明第八方面提供了一种核酸检测的产品，该产品包括本发明所述的TnpB蛋白，或这些TnpB蛋白与ωRNA分子形成的蛋白复合物；所述产品可以为试剂盒、试纸条或其他可视化检测设备。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的耐高温TnpB酶，与已报道的TnpB同源性低，且在活性上有较大差异，并在区分病毒不同分型单碱基突变等方面具有独特价值，可以用于临床、畜牧等领域的核酸检测，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的五个耐高温TnpB与已报道TnpB的蛋白序列比对结果。
图2为本发明提供的五个耐高温TnpB的TAM和ωRNA序列的获取过程分析；其中A为编码Sis_TnpB的转座子结构，TAM为LE前端5nt保守序列，ωRNA编码序列位于tnpB基因后面且与tnpB基因有部分重叠，比对tnpB基因终止子后的保守序列即为ωRNA序列，具体为从最后一个保守碱基开始往5’端选取200nt的保守序列为有功能的ωRNA序列；B为通过比对LE的保守序列预测获取其他四个耐高温TnpB的TAM。
图3为本发明制备的耐高温TnpB的纯化检测结果；其中A为Sis_TnpB蛋白的SDS-PAGE图，B为Sto_TnpB蛋白的SDS-PAGE图，C为Sso_TnpB蛋白的SDS-PAGE图，D为Tvo_TnpB蛋白的SDS-PAGE图，E为Tsi_TnpB蛋白的SDS-PAGE图，F为Sis_TnpB蛋白过分子筛后的SDS-PAGE图，G为Sis_TnpB分子筛图。
图4为本发明耐高温Sis_TnpB的顺式和反式切割活性检测结果；其中A为耐高温TnpB对单链靶标DNA的顺式切割活性，B为耐高温TnpB对双链靶标DNA的顺式切割活性，C为耐高温TnpB对单链非靶标DNA的反式切割活性，D为耐高温TnpB对双链非靶标DNA的反式切割活性，E为耐高温TnpB对单链非靶标RNA的反式切割活性，F为耐高温TnpB对三种非靶标核酸的反式切割效率统计。
图5为本发明耐高温Sis_TnpB在不同金属离子条件下的反式切割活性检测结果；其中A为Sis_TnpB在不同金属离子条件下的反式切割效果，B为Sis_TnpB在不同Mg2+和Mn2+离子浓度条件下的反式切割效果，C为Sis_TnpB在Mg2+离子条件下不同时间的反式切割效果，D为Sis_TnpB在Mn2+离子条件下不同时间的反式切割效果，E为Sis_TnpB在Mg2+离子和Mn2 +离子条件下不同时间的反式切割比率统计。
图6为本发明耐高温Sis_TnpB在不同NaCl浓度条件下的反式切割活性检测结果。
图7为本发明耐高温Sis_TnpB在不同温度下的反式切割活性检测结果；其中A和B为不同温度下，Sis_TnpB对单链非靶标DNA的反式切割效果图；C为通过定量统计数据反映65-85℃温度下反式切割比例。
图8为本发明耐高温Sis_TnpB对靶标和TAM序列突变的敏感性分析结果；其中A为靶标和TAM序列突变示意图，B为双链DNA靶标双碱基突变对Sis_TnpB反式切割活性的影响，C为单链DNA靶标双碱基突变对Sis_TnpB反式切割活性的影响，D为双链靶标TAM单碱基突变对Sis_TnpB反式切割活性的影响，E为单链靶标TAM单碱基突变对Sis_TnpB反式切割活性的影响，F为热图分析双链和单链靶标双碱基突变和TAM单碱基突变对反式切割的影响。
图9为靶标序列的侧翼序列对耐高温Sis_TnpB反式切割活性影响的检测结果；其中A为双链DNA靶标侧翼序列缺失示意图，B为双链DNA靶标侧翼序列缺失对反式切割活性的影响。
图10为耐高温Sis_TnpB的核酸酶活性位点突变对其切割活性影响的检测结果；其中A为两个突变体的顺式切割活性检测，B为两个突变体的反式切割活性检测。
图11为反式切割底物长度和序列对耐高温Sis_TnpB反式切割特异性和效率影响的检测结果；其中A为耐高温Sis_TnpB对不同长度底物的切割特异性和效率，B为耐高温Sis_TnpB对不同碱基组成底物的切割效率。
图12为耐高温Sis_TnpB检测灵敏度的分析结果。
图13为本发明利用耐高温Sis_TnpB对SARS-Cov2三个靶标位点进行检测的结果图。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本发明以及在本发明实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本发明所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本发明作为参考。
除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写，氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。
本发明所述的“核酸”，包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。
本发明所述的“编码”或“所编码”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。
本发明可互换地使用术语“肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。本发明可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽的氨基酸。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本发明的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的物种密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。
本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本发明所用的术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1耐高温TnpB蛋白的获取
本例从NCBI数据库获取了五个嗜热微生物(Sulfolobusislandicus、Sulfurisphaeratokodaii、Saccharolobussolfataricus、Thermococcus sibiricus和Thermoplasma volcanium)编码TnpB的基因，其编码的蛋白分别命名为蛋白Sis_TnpB、Sto_TnpB、Sso_TnpB、Tvo_TnpB和Tsi_TnpB，具体信息如表1所示。
表1
将上述五个耐高温TnpB蛋白与已报道的ISDra2_TnpB和Ama_TnpB的蛋白序列比对。结果如图1所示，五种耐高温TnpB与已报道的ISDra2_TnpB的相似度分别为34.52％(Sis_TnpB)、29.61％(Sso_TnpB、Tvo_TnpB、Tsi_TnpB)、26.11％(Sto_TnpB)，与Ama_TnpB的相似度分别为26.01％(Sis_TnpB)、24.77％(Sso_TnpB、Tvo_TnpB、Tsi_TnpB)、27.06％(Sto_TnpB)，表明这五个耐高温TnpB与已报道的蛋白同源性很低。
实施例2耐高温TnpB蛋白的TAM和ωRNA序列的获取
本例通过比较IS200/605的Left Element(左侧原件，LE)序列，从保守的LeftElement紧邻外侧鉴定到保守的TAM序列；从保守的Right Element的保守序列中预测到引导RNA序列以及3’端紧邻的guide序列。
以Sis_TnpB为例，通过序列比对及生信分析，发现编码Sis_TnpB的IS200/IS605转座子的基本结构如图2A所示，包含tnpA和tnpB两个基因，以及位于tnpA基因前端的左侧元件和位于tnpB基因后端的编码ωRNA的序列。通常，位于LE前端4～5bp保守序列就是IS200/IS605转座子的LE切割位点(方框所示)，同时该位点也是TnpB蛋白的识别位点TAM，因此根据这种普遍现象预测Sis_TnpB的TA为5’-TTTAA(图2A)。然后根据已有研究报道，位于tnpB基因末端的保守序列就是编码ωRNA的发卡结构序列，通常长度为200～250nt，根据图3A的序列比对结果，预测Sis_TnpB的ωRNA序列如SEQ ID NO.5。
根据相同的方法，预测了其他几个TnpB的TAM分别为(图2B)：5’-TTTAT(Sso_TnpB)，5’-TGAC(Sto_TnpB)，5’-TTAC(Tsi_TnpB)，5’-TGAC(Tvo_TnpB)。其他几个TnpB对应的ωRNA序列分别如SEQ ID NO.6～10所示。
实施例3耐高温TnpB蛋白与ωRNA的复合物的制备
本例合成了5个耐高温TnpB蛋白与其对应的ωRNA的蛋白复合物，具体过程如下：
分别根据5个TnpB蛋白的编码序列合成基因，合成时在基因起始密码子ATG后增加8个组氨酸标签(基因序列为CATCACCATCACCACCATCATCAC)，将合成的基因克隆到pET30a载体，得到pET3oa-TnpB载体。然后在编码ωRNA发卡结构的序列5’端加上T7启动子，同时在3’端加上guide序列，合成该序列并克隆到pET3oa-TnpB载体，得到表达TnpB和ωRNA复合物的pET3oa-TnpB-ωRNA载体。将该载体转入大肠杆菌Rossetta(DE3)表达菌株，并使用含有30mg/ml卡那霉素的LB培养基37℃180rpm震荡培养该菌到OD600＝0.6～0.8，然后在培养物中加入0.1mM IPTG，于16℃180rpm培养过夜，收集菌体。将该菌体在含有20mM HEPES-NaOH(pH 8.0)，5mM巯基乙醇，20mM咪唑和500mM NaCl的缓冲液中重悬，将重悬后的液体进行低温压力破碎，破碎后的溶液14,000rpm 4℃离心30min，取离心后的上清与镍柱纯孵育10min，用带有不同浓度咪唑的洗脱液(20mM HEPES-NaOH(pH 8.0)，5mM巯基乙醇，20/50/100/200/500mM咪唑和500mM NaCl)洗脱，取含不同咪唑浓度的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。
其中部分TnpB蛋白的SDS-PAGE结果如图3所示，从图3可知：在含有100mM咪唑浓度的洗脱液中可以分别检测到与5个耐高温TnpB蛋白分子量一致的目的条带(A、B、C、D和E)，即可认为纯化到目的蛋白。取含有目的蛋白大小条带且条带较单一的洗脱液进行超滤浓缩，然后将浓缩液通过凝胶过滤层析进一步纯化可以得到较纯的目的蛋白和ωRNA的复合物(F和G)。
利用本例制备的复合物对五个TnpB蛋白的活性进行试验验证，发现这5个蛋白都具备反式切割活性，故均可开发用于核酸检测。
实施例4体外转录获得ωRNA的方法
本例提供了一种获取ωRNA的方法，具体过程如下：
以原始ωRNA编码序列为模板，设计一对PCR引物，上游引物为T7-F加上ωRNA编码序列5’端20nt，下游引物为靶标反向互补序列加上ωRNA编码序列3’端20nt反向互补序列。
使用表2的PCR扩增体系进行PCR扩增，得到体外转录的模板，其中扩增程序为：95℃，5min预变性；95℃，10s变性，50℃，10s退火，72℃，10s延伸；40-55个循环；72℃，5min。
将获得的模板加入表3所示的体外转录体系中，轻柔混匀以后37℃孵育2～4小时。然后加入2μL DNase I(1U/μL)后在37℃孵育30min，再加入1倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:25:1)涡旋混匀1min，12000rmp离心2min，将上层水相转移到新的离心管中，加入0.1倍体积3M醋酸钠(pH＝5.2)和1倍体积异戊醇，涡旋混匀1min，-20℃静置2h，12000rmp离心2min。小心去除上清，并用1mL 75％乙醇清洗沉淀并去除上清，将沉淀置于室温晾干后加入50μL无RNA酶水，直接使用或保存于-80℃备用。
表2
表3
实施例5耐高温TnpB蛋白的反式切割活性检测
本例以Sis_TnpB蛋白为例，展示了其对ssDNA、dsDNA和RNA三种不同底物的反式切割活性。具体过程如下：
将1μMTnpB-ωRNA复合物(按照摩尔比TnpB:ωRNA＝1:1形成)，0.1μM含有TAM和靶标序列的核酸片段，0.2μM底物加入到缓冲液体系为20mM HEPES-NaOH(pH 8.0),25mMNaCl，1mM DTT和5mM MgCl2的溶液中，在75℃条件下反应，待反应结束后，加入4％ SDS和50mM EDTA溶液终止反应。在以上反应液中加入2×上样缓冲液，用变性PAGE电泳检测切割产物，使用FUJIFILM扫描仪检测变性PAGE中的DNA片段。
结果如图4所示，耐高温TnpB不仅可以在75℃条件下顺式切割单链和双链的靶标DNA(A和B)，同时还可以反式切割底物(ssDNA、dsDNA和RNA，C、D和E)，其中反式切割DNA的能力优于反式切割RNA。
实施例6金属离子对耐高温TnpB的反式切割活性的影响
参照实施例5，本例分别使用MnCl2或CoCl2或CuCl2或CaCl2或NiCl2替换缓冲体系中的MgCl2，检测了不同金属离子对耐高温TnpB的反式切割活性的影响。结果如图5中A所示，发现TnpB在含有MnCl2或MgCl2的缓冲液中具有相似的活性。
进一步分析了不同MnCl2或MgCl2浓度对TnpB反式切割活性的影响，结果如图5中B所示，TnpB在含有5～20mMMgCl2或1～5mMMnCl2的缓冲体系中具有较高的反式切割活性。
本例还检测了TnpB分别在含有5mMMgCl2或MnCl2的缓冲体系中的反式切割速率，结果显示：在含有5mMMgCl2的缓冲液中TnpB完全切割底物需要9min，在含有5mMMnCl2的缓冲液中TnpB完全切割底物只需要2min(图5中C、D和E)。
实施例7盐浓度对耐高温TnpB的反式切割活性的影响
参照实施例4，本例分析盐浓度对TnpB反式切割的影响，具体为：将实施例4中缓冲体系中的NaCl浓度分别改变为50mM，75mM，125mM，150mM，200mM和250mM。
结果如图6所示，TnpB在较低的NaCl浓度(25mM或50mM)下具有较高的反式切割活性，当NaCl浓度超过75mM时TnpB反式切割活性大大降低。
实施例8温度对耐高温TnpB的反式切割活性的影响
参照实施例5，本例分析了耐高温TnpB在不同高温条件下的反式切割活性，具体为：将实施例5中的反应温度分别设置为37℃、55℃、65℃和75℃。结果如图7中A所示，Sis_TnpB在75℃条件下具有反式切割活性。
然后进一步检测了Sis_TnpB在66～85℃条件下的反式切割活性，结果显示，当温度从66℃升高到75℃时，随温度上升Sis_TnpB反式切割活性逐渐增强；当温度从75℃升高到85℃时，随温度上升Sis_TnpB反式切割活性逐渐减弱(图7中B和C)。
实施例9Sis_TnpB蛋白对TAM和靶标序列碱基突变的敏感性分析
在核酸检测中，需要对靶标序列中的碱基突变进行检测，从而可以区分同种病毒的不同突变株，因此本例通过试验分析了Sis_TnpB对TAM和靶标序列碱基突变的敏感性。
按照图8中A所示，分别将碱基突变(或/>)引入TAM和靶标序列中，以研究不同位点突变对Sis_TnpB反式切割活性的影响。
参照实施例5，分别使用含有碱基突变的单链和双链靶标序列进行切割实验，结果显示：在靶标序列的第1位到第14位碱基上的突变会显著降低Sis_TnpB的反式切割活性，第15位到第20位碱基上的突变会略微降低Sis_TnpB的反式切割活性(图8中B和C)；在TAM的第-1到第-4位碱基上的突变会显著降低Sis_TnpB的反式切割活性，第-5位碱基上的突变会略微降低Sis_TnpB的反式切割活性(图8中D和E)。这些结果说明Sis_TnpB对TAM和靶标序列上的突变非常敏感，可以用于同种病毒不同突变株的检测。
实施例10靶标序列的侧翼序列突变对Sis_TnpB蛋白的反式切割活性的影响
本例分析了靶标序列的侧翼序列对Sis_TnpB反式切割活性的影响，具体为：参照图9中A所示；分别将靶标序列5’和3’端的侧翼序列进行不同长度的缺失，然后参照实施例5进行切割实验。
结果显示：在靶标序列的5’端至少需要有7bp侧翼序列，同时3’端至少需要有6bp侧翼序列，Sis_TnpB才具有反式切割活性。
实施例11Sis_TnpB蛋白核酸酶活性位点突变对反式切割活性的影响
本发明对Sis_TnpB的核酸酶活性位点进行了分析，并确认其序列的第187位天冬氨酸和第271位谷氨酸是核酸酶活性位点。
本例分别突变其中一个活性位点并参照实施例1制备了突变体蛋白，再参照实施例5对两个突变体蛋白的顺式和反式切割活性进行检测。
结果如图10所示，突变体任一个活性位点都会使Sis_TnpB丧失顺式切割活性和反式切割活性。
实施例12Sis_TnpB蛋白的反式切割底物的长度和序列分析
本例的目的在于分析反式切割底物序列和长度对Sis_TnpB反式切割活性的影响，具体为：分别使用不同长度的带有FAM荧光标记的polyT寡核苷酸单链作为底物进行反式切割。
结果显示：18nt，20nt，22nt和24nt的底物都具有较高的特异性，且随着长度增加反式切割活性增高；当底物长度为26nt时，在不含有靶标序列时Sis_TnpB也具有微弱的非特异性反式切割活性(图11中A)。
选择24nt作为底物的最佳长度，进一步分析底物序列对Sis_TnpB反式切割活性的影响。具体为：分别使用碱基组成为AC或AG或AT或CT或GT的24nt长度的底物进行反式切割实验。
结果显示：Sis_TnpB对碱基组成为AG和GT的两种底物具有较高的反式切割活性(图11中B)。
实施例13Sis_TnpB检测靶标的灵敏度分析
根据实施例12的分析结果，本例选择碱基组成为GT的24nt底物作为灵敏度分析的分子信标，且分子信标为一端带有FAM荧光基团且另一端带有BHQ1淬灭基团的序列。本例所用分子信标序列组成为5′-TGGGTGGGTGGTTGTGTTGTGTTT-3′的单链DNA，
本例分别使用含有靶标序列的不同浓度的双链DNA进行核酸检测实验，其中反应缓冲液体系为：20mM HEPES-NaOH buffer(pH＝7.5)，1mM DTT，1mM EDTA，50mM NaCl，5mMMnCl2，将1μMTnpB-ωRNA复合物，1μM分子信标和不同浓度的靶标DNA。将反应体系放置于荧光定量PCR仪中，反应温度为75℃，反应时间为10min，每10s检测一次荧光值。
结果显示如图12所示：在靶标浓度为100nM以上时Sis_TnpB可以反式切割分子信标产生可检测的荧光值，且该荧光值明显高于不含有靶标序列时产生的背景荧光。
实施例14利用耐热TnpB对进行SARS-Cov2进行检测
本例选取了SARS-Cov2基因组上的3个靶标位点进行了核酸检测实验，三个靶点的序列和引物序列如表4所示：
表4
分别使用表4中的3对引物对含有靶标序列片段进行PCR扩增，扩增体系如表5所示，且扩增程序为：95℃，5min预变性；95℃，10s变性，50℃，10s退火，72℃，10s延伸；40-55个循环；72℃，5min，反应体系如表2所示。
表5
取上述2μL PCR扩增产物以及1μL体外转录获得的ωRNA(制备方法参照实施例4)加入反式切割体系，且反应体系如表6所示。然后放置于Bio-Rad CFX96 Touch荧光定量PCR仪，设置反应温度为75℃，反应时间30min，每1min检测一次荧光值，得到如图13所示结果。
表6
结果显示：实验组3个靶点产生的荧光值都显著高于不含有靶标的对照组，说明本发明方法可以用于SARS-Cov2核酸检测。
可以理解的是，表4中的PCR扩增产物可以替换为LAMP扩增产物(由相应的LAMP引物对靶标区域进行等温扩增所得)，从而实现TnpB核酸检测与等温扩增技术联合使用，以进一步提高检测灵敏度，而且与等温扩增技术联用时还可采用一管式检测，避免交叉污染。
另外，可以将针对其他靶点或核酸样本这几引物替换本例中用于扩增靶标和体外转录ωRNA的引物，即可实现对其他的靶点或其他的核酸样本的检测。
综上所述，本发明提供的五个嗜热微生物来源的TnpB蛋白，不仅具有天然的耐热特性，而且同时具有顺式切割活性和反式切割活性，因此利用TnpB蛋白可实现体外核酸检测。鉴于这些TnpB蛋白在高温下(65-85℃)具有良好活性，该核酸检测方法能与等温扩增技术联用，实现一管式检测，并提高检测灵敏度。另外，本发明所述TnpB蛋白的反式切割活性对TAM和靶标序列上的突变非常敏感，故其在区分病毒不同分型单碱基突变等方面具有独特的价值。可见，本发明为病原微生物检测、分子诊断等领域提供了一种新型的核酸检测工具。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种耐高温TnpB蛋白或所述耐高温TnpB蛋白与ωRNA分子形成的蛋白复合物在核酸检测中的应用，所述耐高温TnpB蛋白具有反式切割活性，所述耐高温TnpB蛋白为Sis_TnpB蛋白、Sso_TnpB蛋白、Sto_TnpB蛋白、Tsi_TnpB蛋白、Tvo_TnpB蛋白中的一种；
其中，所述Sis_TnpB蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％的序列一致性且功能相同的蛋白；
所述Sso_TnpB蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQID NO.2所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
所述Sto_TnpB蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQID NO.3所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
所述Tsi_TnpB蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQID NO.4所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白；
所述Tvo_TnpB蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的蛋白，或为氨基酸序列与SEQID NO.5所示序列具有至少95％的序列一致性且具有相同功能的蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ωRNA分子包含发卡结构和位于末端的引导序列，所述引导序列与靶标序列互补配对，所述靶标序列末端连接有TAM序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Sis_TnpB蛋白的TAM序列为5’-TTTAA，所述Sso_TnpB的TAM序列为5’-TTTAT或5’-ATTAT，所述Sto_TnpB蛋白的TAM序列为5’-TGAC，所述Tsi_TnpB的TAM序列为5’-TTAC，所述Tvo_TnpB蛋白TAM序列为5’-TGAC。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Sis_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ ID NO.6所示，所述Sso_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ IDNO.7所示，所述Sto_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ ID NO.8所示，所述Tsi_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ ID NO.9所示，所述Tvo_TnpB蛋白的ωRNA分子的发卡结构序列如SEQ ID NO.10所示。
5.一种核酸检测体系，其特征在于，包括：
权利要求1～4任一项所述的TnpB蛋白和ωRNA分子；
包含待测靶标序列的核酸；
两端分别带有荧光基团和淬灭基团的分子信标；
用于维持TnpB蛋白活性的缓冲液。
6.根据权利要求5所述的核酸检测体系，其特征在于，所述核酸为双链DNA和/或单链DNA，所述分子信标为双链DNA、单链DNA和单链RNA中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的核酸检测体系，其特征在于，所述缓冲液中含有金属离子Mg2+和/或Mn2+。
8.一种核酸检测方法，其特征在于，将TnpB蛋白和ωRNA分子形成的蛋白复合物、包含待测靶标序列的核酸样本、两端分别带有荧光基团和淬灭基团的分子信标加入缓冲液中，于65-85℃的环境中反应，检测荧光信号。
9.如权利要求1所示的耐高温TnpB蛋白或耐高温TnpB蛋白与ωRNA分子形成的蛋白复合物在制备核酸检测试剂盒中的应用。
10.如权利要求5所示的核酸检测体系在区分病毒不同突变株中的应用，所述病毒包括SARS-Cov2和HPV。
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