CN103975061A

CN103975061A - 靶核酸的检测方法

Info

Publication number: CN103975061A
Application number: CN201280058995.6A
Authority: CN
Inventors: 保坂宪光; 东出诚司
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-08-06
Also published as: KR20140091562A; HK1249143A1; AU2012333771A1; CA2857308C; CN108103145A; JPWO2013065574A1; TWI608103B; TW201333209A; US10876160B2; EP2787077B1; HK1199287A1; JP6085564B2; KR101958048B1; ES2755934T3; EP2787077A1; AU2012333771B2; US20140349295A1; EP2787077A4; WO2013065574A1; CA2857308A1

Abstract

本发明的课题是，提供靶核酸的新的检测方法和用于其的试剂盒。设计本发明的检测的方法，错开具有互补性的、荧光标记的引物/探针和猝灭剂(quencher)标记的探针的解链温度(Tm)，使得荧光标记引物优先地与靶核酸退火。检测方法中，不结合至靶核酸的荧光标记引物/探针与猝灭探针结合，从而不发出荧光，所述方法更加简便廉价，不需要特别的技能、设备，就可能检测靶核酸。

Description

靶核酸的检测方法

【技术领域】

本发明涉及靶核酸的检测方法，和用于检测靶核酸的试剂盒。

【背景技术】

使用核酸碱基序列的互补性的靶核酸的检测方法以前由DNA杂交开始，设法进行各种改良，迄今为止，特别是在体外的核酸扩增法的确立的同时，可以检测更微量的靶核酸。

作为靶核酸的检测方法，开发了使用检测探针的检测方法，所述探针与放射性同位素(RI)，发光剂(luminescent agent)，荧光剂(fluorophore)等的标记结合，含有与靶核酸具有互补性的核酸。出射能量不同的多种RI标记的情况或，出射光的波长不同的多种发光剂(或荧光剂)标记的情况中，可能进行多项目检测。进一步地，也确立了作为Q探针(猝灭探针(Quenching Probe))法的判断单核苷多态现象(SNP)的方法(专利文献1)。

此外，与其相反的是，也存在利用所谓DNA芯片，微阵列等的核酸碱基序列的互补性的靶核酸的检测方法，所述方法以放射性同位素等标记靶核酸，通过使标记的靶核酸和与靶核酸具有互补性的、固相面上固定的寡核苷酸探针一同退火(アニ-リソク·)，使得可能同时检测多种靶核酸的量(专利文献2)。

一方面，作为核酸扩增法，可举出聚合酶链反应(PCR)(专利文献3和专利文献4)，链置换扩增技术(SDA)(专利文献5)，核酸序列扩增(NASBA)(专利文献6)，滚环扩增(rolling circle amplification)(RCA)(非专利文献1)，和DNA环介导的恒温扩增(Loop-mediated isothermalAmplification)(LAMP)(专利文献7)等。这些的核酸扩增法也可能检测靶核酸。

进一步地说，也存在如连接酶链反应(LCR)(专利文献8)的使用连接酶的核酸扩增法。

现在，作为核酸的扩增方法常用的是PCR法。PCR法是使用与耐热性聚合酶，和与靶核酸具有互补性的2个引物的方法，所述方法通过控制温度进行下文所述这些3个步骤，通过反复进行下文所述这些3个步骤，指数函数地扩增靶核酸，所述这些3个步骤是:(1)双链靶核酸的变性，(2)针对变性的靶核酸的引物的退火，(3)来自引物的伸展反应。电泳移动反应后的扩增产物，通过使用溴乙啶(EtBr)，SYBR绿色(SYBR(登记商标)Green)等的嵌入剂，可能检测扩增产物的有无。此外，也存在前述伸展反应的时候，通过使用附加了荧光剂的核酸碱基的检测扩增产物的方法。

进一步地，也确立了，通过使用荧光剂和猝灭剂(quencher)，定量地检测靶核酸的扩增的方法(专利文献9)。具体地说，在PCR扩增反应的时候添加，以TaqMan(登记商标)探针为代表的，邻接附加了荧光剂和猝灭剂的寡核苷酸探针，进行PCR反应。PCR的前述步骤(2)中，该探针也与靶核酸一同退火，伴随步骤(3)的伸展反应，通过聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性分解该探针，通过检测由猝灭剂游离的荧光剂的出射光，可能检测靶核酸。

以通过PCR的扩增作为前提，针对使用如此的荧光剂和猝灭剂的组合的核酸检测方法，存在各种设计(专利文献10和专利文献11)。两者以检测PCR的退火的步骤(前述(2))的扩增中的靶核酸为目的而设计，所述步骤向具有互补性的寡核苷酸探针的一方附加荧光剂，另一方附加猝灭剂。

LAMP法特征是，对于靶核酸的6个结构域设定4种类的引物(FIP，BIP，F3和B3)，利用链置换反应，在一定温度进行扩增。所述方法可以在1个步骤中进行如下工序:混合含有靶核酸的样品，引物，链置换型DNA合成酶，底物等，通过在一定温度(65℃附近)保温，进行反应，到检测为止的工序。进一步地，通过使用补加环引物B(LB)和/或环引物F(LF)，可能将扩增所需的时间由1/2缩短至1/3(专利文献12)。因为扩增效率高，在15分钟～1小时可以将靶核酸扩增10⁹～10¹⁰倍，此外，由于特别高的特异性，也可能判断靶基因序列的有无，从而达到判断扩增产物有无的目的。作为1个如此的方法，使是核酸扩增反应副产物的焦磷酸离子成为不溶性的盐(镁盐)，测定反应液的浊度，或者，使该焦磷酸离子与钙黄绿素锰(カルセイソ-マソカ·ソ)络合物反应，通过检测游离的钙黄绿素(荧光物质)的荧光，检测扩增产物的存在(专利文献13)。进一步地，也确立了使用荧光探针的检测方法(专利文献14和专利文献15)。

此外，也报告了，使用荧光标记的引物和猝灭剂标记的探针，检测通过LAMP法扩增的靶核酸的方法(非专利文献2)。具体地说，存在如下方法，所述方法使用荧光标记的引物，通过LAMP法扩增靶核酸，扩增后，添加猝灭剂标记的探针，通过使对靶核酸的扩增没有贡献的游离的荧光标记的引物和猝灭剂标记的探针一同退火，仅仅检测，来自对靶核酸的扩增有贡献的，即，成为扩增产物的一部分的荧光标记的引物的荧光剂的出射光。

前述核酸检测方法的任一个均有利有弊，特别地高价精密设备对于反应和检测是必要的，进一步地含有各种工序，因此，其实施需要熟练的地方多，这些的核酸检测技术在特定的研究室内进行，其中，专门进行专门的核酸扩增。此外，例如，前述非专利文献2中记载的检测方法中，扩增反应后添加猝灭剂是必要的，开闭反应容器的盖时，通过扩增产物的飞散可能引起样品间或实验环境的污染。

近年，工业，医疗，研究等的各种领域中，核酸扩增试验(Nucleicacid Amplification Test:NAT)的要求提高，同时，试验项目的种类也日益丰富，迄今为止一直增加的核酸扩增试验广泛地普及。例如，以确保对于医药品领域中的血液制剂的多种病毒的安全性为目的而实施的试验中，也可以利用核酸扩增试验。由于如此的普及和一般化的趋势，寻求的是，迄今为止，不仅仅在核酸扩增专用的特定的研究室内进行的核酸扩增试验，在一般实验室或现场工作，床边等的所有场所或场面也可以进行，可以简便使用，并且没有污染试验环境的核酸检测技术，进一步地优选可能同时检测多项目的技术。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】特开2001-286300号公报

【专利文献2】特表2001-521622号公报

【专利文献3】特开昭61-274697号公报

【专利文献4】特开昭62-000281号公报

【专利文献5】特开平5-192195号公报

【专利文献6】特开平2-005864号公报

【专利文献7】专利第3313358号公报

【专利文献8】特开平2-002934公报

【专利文献9】特表平6-500021公报

【专利文献10】特开平10-262700号公报

【专利文献11】特表2004-511227号公报

【专利文献12】国际公开第2002/024902号

【专利文献13】特开2004-283161号公报

【专利文献14】特开2001-272475号公报

【专利文献15】国际公开第2009/051214号

【非专利文献】

【非专利文献1】Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America92:4641-4645(1995)

【非专利文献2】Journal of Medical Virology81:966-972(2009)

【发明内容】

【发明解决的课题】

本发明的课题是，提供新的靶核酸的检测方法。更具体地提供，比现有技术更加简便廉价地检测靶核酸的方法，和用于检测的试剂盒等。

【用于解决课题的手段】

本发明人为了前述解决课题，新开发了通过密闭体系可能简易扩增和检测核酸的方法。具体地说，使用荧光标记的引物和猝灭剂标记的探针，检测通过LAMP法扩增的靶核酸的方法中，可能在扩增反应前添加荧光标记引物和猝灭剂(クェソチャ-)标记探针，因此，两者的解链温度(melting temperature:以下称为Tm)存在差异，通过反应温度条件，即使在猝灭剂标记的探针存在下，更加选择性地使荧光标记引物容易与靶核酸一同退火。其后，发现的是，通过降低温度，可以使得没有结合至靶核酸的荧光标记引物和猝灭剂标记的探针一同退火，其结果是，通过猝灭，猝灭荧光标记，可以仅仅检测，可以结合至靶核酸的荧光标记引物的荧光标记。

本发明人进一步地发现的是，前述方法不仅可以与通过LAMP法的扩增相组合，也可能与其他的任何核酸扩增方法相组合，此外，即使不包含靶核酸的扩增工序，即，仅仅利用作为探针的荧光标记引物，也可能实施前述方法，可以解决本发明的课题，从而完成本发明。

即，本发明的构成是如同以下的[1]至[13]。

[1]是检测样品中存在的1种以上的靶核酸的方法，含有以下的步骤的检测核酸的方法:

(1)向样品添加

是用荧光剂标记的、与靶核酸具有互补性的寡核苷酸的荧光标记的引物或探针，和

是用猝灭剂标记的，与所述荧光标记的引物或探针具有互补性的，与所述荧光标记的引物或探针相比解链温度(Tm)低的寡核苷酸的猝灭剂标记的探针；

(2)在所述荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)以下，并且与所述猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)相比更高的温度，保温该样品；

(3)在所述猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)以下的温度，保温该样品；

(4)测量结合至靶核酸的荧光标记的引物或探针的荧光。

[2][1]中记载的检测方法，其中，在前述步骤(2)的保温期间扩增靶核酸。

[3][2]中记载的检测方法，前述靶核酸的扩增在等温条件进行。

[4][1]-[3]的任一个中记载的检测方法，前述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸碱基长度，与前述荧光标记的引物或探针的寡核苷酸碱基长度相比更短。

[5][1]-[3]的任一个中记载的检测方法，前述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸包含修饰的碱基。

[6][1]-[5]的任一个中记载的检测方法，使前述荧光标记的引物或探针固定在固相面上，使用前述荧光标记的引物或探针。

[7][1]-[6]的任一个中记载的方法，为了检测2种类以上的靶核酸的，使用发光波长不同的2种类以上的荧光标记的引物或探针和分别对应于所述荧光标记的引物或探针的猝灭剂标记的探针的组合。

[8][1]-[7]的任一个中记载的方法，前述步骤(4)中的荧光的测量通过目视进行判断。

[9][1]-[7]的任一个中记载的方法，前述步骤(4)中的荧光的测量通过荧光检测设备进行判断。

[10]用于[1]-[9]的任一个中记载的检测方法的试剂盒，所述试剂盒是靶核酸检测用试剂盒，其含有1种或多种的

是用荧光剂标记的、与靶核酸具有互补性的寡核苷酸的荧光标记的引物或探针；和

是对应于前述各个荧光剂的猝灭剂标记的，与所述荧光标记的引物或探针具有互补性的，与所述荧光标记的引物或探针相比解链温度(Tm)低的寡核苷酸的猝灭剂标记的探针

的组合。

[11][10]中记载的靶核酸检测用试剂盒，前述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸碱基长度，与前述荧光标记的引物或探针的寡核苷酸碱基长度相比更短。

[12][10]中记载的靶核酸检测用试剂盒，前述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸包含修饰的碱基。

[13][10]-[12]中记载的试剂盒，进一步地含有核酸扩增用试剂。

[14][10]-[13]的任一个中记载的靶核酸检测用试剂盒，前述荧光标记的引物或探针被固定在固相面上。

【发明的效果】

在沿用非专利文献2的方法的情况下，在扩增反应前，添加荧光标记引物和猝灭剂标记的探针，不正常引起扩增反应，难以检测靶核酸。但是，本发明中，通过错开荧光标记的引物或探针(以下，称为荧光标记引物/探针)和猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)，即使在猝灭剂标记的探针存在下，使得可能优先地使靶核酸和荧光标记引物一同退火。

不仅对于含有的扩增工序的非专利文献2的方法，而且，即使对于不含扩增工序的其他的方案，如此的本发明的效果也可以有效地发挥。

本发明在扩增反应后没有必要添加猝灭剂标记的探针，因此，不用担心，通过扩增产物的飞散的样品间或实验环境的污染。此外，与以往的杂交法相比，不含洗涤步骤等，温度管理也比较简便，并且，不要求精密度，因此，可能的是，不需特别的手的技术、设备(器械)，而更加简便廉价地检测靶核酸。

【附图简述】

【图1】是本发明的基本的方案的模式图。

【图2】是添加了扩增靶核酸工序的本发明的模式图。

【图3A】是将本发明应用于微阵列的情况下的模式图(不扩增靶核酸的方案)。

【图3B】是显示将本发明应用于微阵列的情况下的荧光标记引物/探针的固定化的例子的模式图。

【图3C】是将本发明应用于微阵列的情况下的模式图(含有靶核酸的扩增工序的方案)。

【图4】显示使用实施例2中的荧光标记引物/探针的靶核酸的实时浊度曲线。

【图5】显示实施例2中的CT-LBc-Q1-0(序列编号8)添加前后的荧光检测。

【图6】显示实施例3中的标准反应，沙眼衣原体(クラミシ·ア·トラコマティス，Chlamydia trachomatis)，淋病奈瑟氏菌的辨别结果。

【图7】显示添加了实施例4中的各靶核酸的情况下的实时浊度曲线。

【图8】显示在实施例4中的扩增反应后添加猝灭剂标记探针，95℃加热5分钟后冷却至室温后的UV照射时反应试管。

【图9】显示实施例5中的UV照射时的反应试管。

【图10】显示实施例6中的使用荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的靶核酸的实时浊度曲线。

【图11】显示实施例6中的扩增反应后的UV照射时的反应试管。

【图12】显示实施例7中的使用沙眼衣原体的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图13】显示实施例7中的使用沙眼衣原体的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应后的UV照射时的反应试管。

【图14】显示实施例7中的使用沙眼衣原体的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应后的荧光波长。

【图15】显示实施例7中使用淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图16】显示实施例7中使用淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应后的UV照射时的反应试管。

【图17】显示实施例7中使用淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应后的荧光波长。

【图18】显示实施例7中的使用人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图19】显示实施例7中使用淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应后的UV照射时的反应试管。

【图20】显示实施例7中的使用人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的单项目扩增靶核酸反应后的荧光波长。

【图21】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图22】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应后的UV照射时的反应试管。

【图23】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应后的荧光波长。

【图24】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图25】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应后的UV照射时的反应试管。

【图26】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应后的荧光波长。

【图27】显示实施例7中的使用淋病奈瑟氏菌和人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图28】显示实施例7中的使用淋病奈瑟氏菌和人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应后的UV照射时的反应试管。

【图29】显示实施例7中的使用淋病奈瑟氏菌和人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的二项目扩增靶核酸反应的扩增反应后的荧光波长。

【图30】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌以及人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的三项目扩增靶核酸反应的实时浊度曲线。

【图31】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌以及人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的三项目扩增靶核酸反应的UV照射时的反应试管。

【图32】显示实施例7中的使用沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌以及人工核酸的引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的三项目扩增靶核酸反应的荧光波长。

【发明的实施方式】

以下，关于本发明详细地说明。

“样品”被认为是含有成为检测对象的“靶核酸”的混合物。样品是包含人的生物体(例如血液，唾液，体液，体组织等)，环境(例如，土壤，海水，环境水(温泉水，浴池水，冷却塔水等))，或人工产物或自然物(例如，面包等的加工食品，酸奶等的发酵食品，或米和/或小麦等的栽培植物，微生物，病毒)来源的样品，通常，使用经过核酸提取操作的样品。如果必要，也可补加核酸精制操作。

“靶核酸”是通过本发明应该检测的核酸分子。作为核酸的种类，也可是脱氧核糖核苷酸(DNA)，核糖核苷酸(RNA)和这些的混合物或结合物。此外，其构成碱基是天然存在的核苷酸，例如鸟嘌呤(G)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)，也可包含除此之外的天然和人工修饰的碱基。本文中，“修饰的碱基”意味着，前述5个核苷酸经过化学修饰的碱基。不限于此，甲基胞苷，假尿苷，4-硫脲苷，二氢尿嘧啶核苷，q核苷，次黄嘌呤(肌苷(I))等也符合本发明要求。本发明中，靶核酸是，在检测时必须是单链的，但是，形成双链和/或高级结构的核酸通过热变性，碱变性处理等也转换为单链，因此，可能使用形成双链和/或高级结构的核酸。本发明的靶核酸中，也包含如此的添加了变性处理的方案。或者，“靶核酸”中也包含通过将RNA作为模板(鋳型)的逆转录反应制作的cDNA。

“寡核苷酸”意味着腺苷，胸腺嘧啶脱氧核苷，胞苷，鸟苷，尿苷等的核苷，或具有修饰的碱基的核苷通过磷酸二酯键连接而成的直链状低聚体，表示DNA，RNA，或这些的结合物。视情况而定，也可是肽核酸(PNA)。

“互补性”不仅意味着多核苷酸或寡核苷酸链与其他的链一同退火，形成双链结构，各链的各核苷酸形成沃森-克里克型的碱基配对，还意味形成脱氧肌苷(dI)，具有2-氨基嘌呤碱基的修饰核苷酸的配对等的非沃森-克里克型的碱基配对。

“荧光剂”意味着被一定波长的激发光照射时，通过吸收其能量激发电子，其返回基态时将剩余能量作为电磁波(出射光)射出的分子，或官能团。作为具体的例子可举出荧光素(fluorescein)，和其衍生物(荧光素亚磷酰胺(ホスホアミタ·ィト·)(phosphoamidite)(FAM)，荧光素异硫氰酸盐(酯)等)，罗丹明(rhodamine)，和其衍生物(德克萨斯红等)，Cy色素(Cy3，Cy5等)等，但是，不限于这些。

“猝灭剂”意味着，具有可以吸收由荧光剂射出的出射光能量的恰当能量水平的分子或官能团。作为荧光素亚磷酰胺(FAM)的猝灭剂，也可将荧光剂作为猝灭剂使用，从而可以使用四甲基罗丹明(TAMRA)。但是作为猝灭剂，更加适合的是，吸收荧光剂的出射光，即使激发，自身不发出出射光的分子或官能团。例如，可举出DABCYL，Black Hole Quencher(BHQ^TM(ハ·イオサ-チテクノロシ·-ス·公司))，Eclipse^TM Dark Quencher(ェホ°ック·ハ·イオサイェソシ-ス·公司)等，但是，不限于这些。

“保温”意味着在某一特定的温度下，放置样品。热传递的手段可举出水浴，空气浴，金属浴等，但是，不限于这些。

解链温度(Tm)意味着，加热双链DNA的溶液的时候，DNA分子的1/2解离，成为单链的时候的温度。本发明中，通过50mM Na⁺浓度(Na⁺＝50×10^-3)和0.5mM寡核苷酸浓度(Ct＝0.5×10^-6)的值，通过最近接碱基对法(Nearest Neighbor method)的以下的计算式可以算出(Nucl.Acids Res.(1990)18(21):6409-6412)。

Tm＝{(1000ΔH)/(-10.8+ΔS+Rln(Ct/4))}-273.15+16.6log[Na⁺]

本文中，ΔH表示杂种中的最近接热函变化的合计[kcal/mol]，ΔS表示杂种中的最近接熵变化的合计[cal/mol·K]，R表示气体常数(1.987cal/deg·mol)，Ct表示寡核苷酸的总摩尔浓度[mol/l]，和Na⁺表示摩尔浓度[mol/l]。

解链温度(Tm)根据寡核苷酸的碱基序列和其长度变化，鸟嘌呤和胞嘧啶的含有量越多，其长度越长，解链温度(Tm)越高。因此，通过碱基序列和其长度，可以决定退火温度，但是，通过使反应溶液中含有解链温度调节剂，也可以调节解链温度。

作为用于核酸扩增法的解链温度调节剂的例子，可举出甲酰胺，甜菜碱(N，N，N，-三甲基氨酸)，脯氨酸，二甲亚砜，三甲基胺-N-氧化物，和四烷基铵盐等。

“荧光标记的引物或探针(以下，称为荧光标记引物/探针)”意味着是“荧光剂”结合的“寡核苷酸”，与靶核酸具有互补性的寡核苷酸。不扩增靶核酸的方案中，可以仅仅作为“探针”使用，但是，在扩增靶核酸方案中，可以作为“引物”使用。“荧光标记引物/探针”也可使用荧光剂结合的(单)核苷酸，例如Alexa Fluor^TM核苷酸(イソヒ·トロシ·ェソ)合成，也可使荧光剂结合至合成的寡核苷酸的5’末端或3’末端。但是，使用“荧光标记引物/探针”，进行靶核酸的扩增的情况下，即，作为“引物”的方案而使用的情况中，不应使荧光剂结合至3’末端。更优选的是，使荧光剂结合至5’末端的“寡核苷酸”。“荧光标记引物/探针”的碱基序列的长度是没有特别限定，但是，优选15个碱基以上，更加优选20个碱基以上，进一步地优选25个碱基。进一步地，期望的是，设计“荧光标记引物/探针”的碱基序列的长度，使得考虑与靶核酸的退火，和其后的扩增反应的温度条件，“荧光标记引物/探针”的解链温度(Tm)为30～70℃，优选50～65℃。

“猝灭剂标记(的)探针”是结合“猝灭剂”的“寡核苷酸”。“猝灭剂标记探针”可以是使用结合猝灭剂的核苷酸而合成，也可使猝灭剂结合至合成的寡核苷酸的5’末端或3’末端，但是，“猝灭剂标记探针”和“荧光标记引物/探针”退火时，优选的是，使猝灭剂结合至通过猝灭剂有效地消除“荧光标记引物/探针”的荧光剂的出射光(荧光)的位置。伴有靶核酸的扩增反应的方案中，优选的是，阻断“猝灭剂标记探针”的寡核苷酸的3’末端，使得不能引起伸展反应。进一步地优选的是，在“荧光标记引物/探针”是使荧光剂结合至5’末端的“寡核苷酸”的情况下，期望的是，形成对应于使猝灭剂结合至3’末端的“寡核苷酸”的“猝灭剂标记探针”。

期望的是，“猝灭剂标记探针”的寡核苷酸的碱基序列与“荧光标记引物/探针”的碱基序列具有互补性，并且所述“猝灭剂标记探针”的寡核苷酸的碱基序列是其长度与荧光标记引物/探针相比还短2，3，4，5，6，7，8，9，10个碱基或短10个碱基以上的序列，进一步地期望的是，其短度导致，“猝灭剂标记探针”的5’末端的碱基少于“荧光标记引物/探针”的3’端的碱基。或即使碱基序列的长度相同，通过使用带有具有降低Tm值效果的修饰的碱基的核苷酸，也可使得，实质上使“猝灭剂标记探针”的解链温度(Tm)低于“荧光标记引物/探针”的解链温度(Tm)。带有具有降低Tm值效果的修饰的碱基的核苷酸是，例如具有肌苷的核苷酸。期望的是，设计“猝灭剂标记探针”的寡核苷酸的碱基序列，使得解链温度达到更优选的室温(例如25℃，26℃，27℃，28℃，29℃或30℃)以上。为了满足如此的条件，优选的是，寡核苷酸的长度是7个碱基以上，更加优选9个碱基以上。

本发明中，必要的是，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的解链温度(Tm)不同，猝灭剂标记探针的解链温度(Tm)低于荧光标记引物/探针的解链温度(Tm)。更具体地说，优选的是低5℃，进一步地优选的是低10℃，进一步地优选的是低15℃，进一步地优选的是低20℃，进一步地优选的是低30℃，进一步地优选的是低35℃，更优选的是低40℃或45℃以上。

向样品“添加”，除向样品添加荧光标记引物/探针，猝灭剂标记探针等的试剂的方案之外，也包含向该试剂添加样品的方案。

“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”的添加时的使用比率可以是摩尔分子数的比的1:1，1:2或1:10以上，也可以更加优选地是1:2以上。

“固相面上固定”意味着，反应中，使“荧光标记引物/探针”不均匀。虽然不限于此，但是，意味着，具体地说，将“荧光标记引物/探针”固定至玻璃，尼龙膜(ナイロンメンフ·レン)，半导体晶圆(半導体ゥェハ-)，微珠等的表面。固定的方法可以使用公知的技术，直接将“荧光标记引物/探针”的寡核苷酸部位固定至玻璃等的表面，也可通过生物素-抗生物素蛋白(ヒ·オチン-アヒ·シ·ン)等的结合，或通过连接基分子实现间接地固定。

“使用荧光标记引物/探针、扩增靶核酸”意味着，使用荧光标记引物/探针作为引物，通过聚合酶进行伸展反应，扩增靶核酸。进而，本领域技术人员显而易见的是，在含有扩增本发明的靶核酸工序的方案中，按照实施的扩增方法，当然除此之外的对靶核酸的扩增必要的试剂，例如引物和/或聚合酶，dNTP等与“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”一同添加至样品。

“在等温条件进行扩增”意味着在一定温度保持的状态、进行扩增靶核酸。作为等温扩增法，可举出核酸的等温和嵌合引物-启动的扩增(ICAN)法，SDA法，NASBA法，RCA法，SMart扩增方法第2版(SMAP2)法(Nature Methods4:257-262(2007))和LAMP法。

“UV照射”意味着，照射波长是10nm-400nm左右的电磁波，该电磁波可以不严格控制波长，可以是荧光剂的激发光。

“通过目视的判断”意味着，在短时间，例如自UV照射起算5秒，15秒，30秒，或1分以内，通过肉眼，判断其荧光剂的出射光的有无。视情况而定，也可与颜色样本(色見本)相比较。

“通过目视的判断”的情况下，“UV照射”产生的激发是最适合的，3至4项目程度的同时多项目检测是可能的，通过“荧光检测设备”的测定的情况下，使用光电二极管阵列(フォトタ·イオ-ト·アレイ)检测器等，更多项目的同时检测也是可能的。

“试剂盒”意味着用于本发明所涉及的检测方法的试剂。除“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”之外，可以包含检测所必要的试剂，工具和器具等。也可进一步地包含该“试剂盒”的使用说明书和/或颜色样本。此外，伴有核酸扩增的方案中，也可进一步地包含核酸扩增所必要的试剂。

本发明的检测方法中，如下检测靶核酸，在荧光标记引物/探针的解链温度(Tm)以下，并且高于猝灭剂标记探针的解链温度(Tm)的温度，孵育，优先使荧光标记引物/探针和靶核酸一同退火，接着，在猝灭剂标记探针的解链温度(Tm)以下的温度，孵育，通过使没有与靶核酸退火的荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针一同退火，使没有与靶核酸退火的荧光标记引物探针的荧光剂和猝灭剂标记探针的猝灭剂相邻接，接着，在猝灭剂标记探针的解链温度(Tm)以下的温度，保持样品，测量结合至靶核酸的荧光标记引物探针的荧光。

本发明的检测方法特征是，错开“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”的解链温度(Tm)，控制这些的解链温度和反应温度的关系，与“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”的退火相比，还优先地使“荧光标记引物/探针”和“靶核酸”退火，由此检测“靶核酸”。进一步地，扩增反应后没有必要添加检测所必要的荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针，因此，操作与以往的技术相比，是简单的，也可以防止扩增产物的扩散导致的污染。

以下，公开本发明的各方案的细节，但是，本发明不限于此。

本发明的最基本的方案是如图1所表示。最初，如果添加“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”，以后不补加任何试剂，采用封闭体系的靶核酸的检测是可能的。假设将荧光标记引物/探针的Tm值设为65℃，猝灭剂标记探针的Tm值设为35℃。将反应温度设为60℃(步骤1)，荧光标记引物/探针结合至靶核酸，但是，不结合猝灭剂标记探针。其后，达到猝灭剂标记探针的Tm值以下(30℃)(步骤2)，引起没有结合至靶核酸的“荧光标记引物/探针”和“猝灭剂标记探针”的退火。通过UV照射，发出出射光(荧光)的仅仅是结合至“靶核酸”的“荧光标记引物/探针”的荧光剂，来自结合至“猝灭剂标记探针”的“荧光标记引物/探针”的荧光剂的荧光是不能检测的。因此，样品的荧光强度依赖于样品中的“靶核酸”的量。

本发明中，含有扩增靶核酸工序的方案在图2中表示。如同是现有技术的专利3016759号公报和专利3999653号公报中记载的核酸扩增检测方法，PCR的退火阶段中，荧光标记探针与靶核酸或猝灭标记探针退火的情况混合存在，因此，荧光强度不表示，与扩增的靶核酸的量成比例的扩增的靶核酸的量，此外，荧光标记探针和猝灭标记探针也可能抑制之后继续的伸展反应，因此，缺乏精确性。一方面，图2的本方案的情况下，扩增的双链产物中含有荧光标记引物/探针，因此，可以更加精确地仅仅检测最终扩增的靶核酸的量。

将本发明用于所谓DNA芯片或微阵列的方案在图3中表示。

图3A是荧光标记引物/探针以探针的方案(不含靶核酸的扩增工序的方案)被使用的模式图。该情况中，在荧光标记引物/探针的寡核苷酸的3’末端被固定也可以。

固定化的方案的例子在图3B中表示。

(1)在荧光标记引物/探针的寡核苷酸的3’末端被固定化。这种情况下，期望的是，对应于猝灭剂标记探针在5’末端处结合猝灭剂。

(2)通过荧光标记引物/探针的寡核苷酸的3’末端处结合的荧光剂，进行固定化。这种情况下，期望的是，对应的猝灭剂标记探针在5’末端处结合猝灭剂。

(3)在荧光标记引物/探针的寡核苷酸的5’末端处结合荧光剂，在3’末端进行固定化。这种情况下，期望的是，对应的猝灭剂标记探针在3’末端处结合猝灭剂。

图3C是含有靶核酸的扩增工序的方案。这种情况下，优选的是，荧光标记引物/探针的寡核苷酸的3’结构域中没有固定。含有核酸扩增的工序的方案的情况下，靶核酸和荧光标记引物/探针的结合更加稳定。

结合至微阵列的核酸被放射性同位素，荧光剂等标记，使其与没有被标记的固定化的寡核苷酸等一同退火。其后，通过洗涤除去没有进行结合的、被标记的核酸，之后，通过退火检测结合至微阵列的核酸的标记，由此，可能检测核酸。但是，看过图3的方案可以明确的是，通过使用结合至固相面的荧光标记引物/探针，没有必要进行样品全体的荧光标记化，另外洗涤的工序是没有必要的，因此，可能更加简便地检测靶核酸。

本发明，通过使用多种的荧光标记引物/探针和对应于多种的荧光标记引物/探针的猝灭剂标记探针，可以同时检测多种的靶核酸，所述多种的荧光标记引物/探针即，采用各种发出不同出射光的荧光剂标记的多种的荧光标记引物/探针。荧光标记引物/探针的荧光剂通过由外部吸收能量，激发电子，其返回基态时将剩余能量作为电磁波(出射光)射出。激发状态与基态的能量水平的差是所述荧光剂特异的，因此，不同荧光剂即使由外部同时吸收能量，各种的荧光剂发出荧光剂特异的波长的出射光(电磁波)，即，“不同颜色的光”。这种出射光仅仅被对应的猝灭剂标记探针的猝灭剂吸收猝灭，不受其他的猝灭剂标记探针的影响。因此，通过观察荧光剂的出射光的“波长”，即，“色”，可能同时检测多种的靶核酸。如果使用分光光度计等，可能分别检测这些出射光，但是，即使通过肉眼，这些出射光作为混合色或中间色也是可能被检测的。

本发明的检测方法，可以用于各种细菌，真菌，病毒等的病原体的检测。作为细菌，可以举出肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，军团菌(レシ·オネラ)属菌，沙门氏菌(サルモネラ)属菌，肠出血性大肠杆菌，结核分枝杆菌，弯曲杆菌属(空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)和结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli))，百日咳菌(百日咳博德特菌(Bordetella pertussis))等。作为真菌，可以举出念珠菌(Candida)属菌，曲霉菌(Aspergillus)属菌，隐球菌属(Cryptococcus)属菌等。作为病毒，可以举出，流感A(H1N1)pdm病毒，流感A(H1N1)病毒，H5亚型流感病毒，SARS冠状病毒，单纯疱疹病毒1型和2型(1/2型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type1/2)；HSV-1/2)，和诺沃克样病毒(ノロ病毒)基因组I(GI)和基因组II(GII)等。此外，作为寄生动物，等可以举出疟疾(マラリア)原虫，(クリフ°トスホ°リシ·ウム)(Criptosporidiu)原虫，贾第虫病(シ·アルシ·ア)原虫。此外，除了病原体的检测，与病原性相关的基因，例如，毒素基因(例如志贺毒素类(ヘ·ロ毒素)(verotoxin)；以下称为VT)基因1型(VT1)和2型(VT2))或药物试剂耐性基因，或与对宿主的感染(侵入·定着·增殖)相关的基因等的检测也是可能的。进一步地，可以用于，细胞色素基因等的一碱基多型(单核苷多态现象；SNP)的检测，或用于牛胚性辨别的判断的雄特异基因序列的检测等。为了进行这些检测，可以如下实施本发明的检测方法，首先设计是寡核苷酸序列的荧光标记引物/探针，所述寡核苷酸序列与对检测对象特异的核酸序列具有互补性，接着，设计对应的猝灭剂标记探针。

特别地，本发明的检测多种的靶核酸的方案有效同时检测识别，人的流感病毒(A型(含有H1N1，H3N2，H1N2，H2N2，H9N1，H5N1)，B型和C型)或肝炎病毒(A型，B型和C型)等的相关种类的病毒。此外，也有效同时检测识别，成为性传播疾病的原因的，淋病奈瑟氏菌，梅毒密螺旋体属菌，沙眼衣原体等的有无。进一步地，也有效同时检测识别，成为感染性胃肠炎的原因的，诺沃克样病毒和/或轮状病毒(ロタ病毒)等的有无。或作为输血用血液的筛选检查，也有效同时检测识别，爱滋病毒(HIV)，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的有无。

本发明的试剂盒是，用于使样品中存在的1种以上的靶核酸扩增，或不进行扩增的检测的靶核酸检测用试剂盒，是含有荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的组合的靶核酸检测用试剂盒，所述荧光标记引物/探针是1种或多种的、荧光剂标记的、与靶核酸具有互补性的寡核苷酸的荧光标记引物/探针，和所述猝灭剂标记探针是用猝灭剂标记的、与所述荧光标记引物/探针具有互补性、解链温度(Tm)低于所述荧光标记引物/探针的寡核苷酸。

前述猝灭剂标记探针的寡核苷酸碱基长度是短于前述荧光标记引物/探针的寡核苷酸碱基长度，或者，可举出的是，前述猝灭剂标记探针的寡核苷酸是包含修饰的碱基的。

前述荧光标记引物/探针也可被固定于固相面上。此外，本发明的试剂盒可以包含用于扩增靶核酸的其他的试剂，如果必要，可以任意包含用于通常核酸检测用的其他的试剂。

以下，根据实施例具体地说明本发明，但是，本发明不限于这些实施例。

【实施例】

实施例1.Tm值的影响确认

(1)测定模板

作为测定用模板，制作亚克隆(サフ·クロ-ニンケ·)沙眼衣原体的潜在质粒结构域的一部分(序列编号21)的质粒DNA(以下称为CT质粒)。

(2)引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的合成

将沙眼衣原体的潜在质粒结构域作为靶标，设计不与类似菌(類縁菌)具有交叉反应性的LAMP反应用的引物。设计的引物中，将LB的5’末端经由FAM而被荧光标记的作为荧光标记引物/探针，将互补链的3’末端处标记BHQ1的作为猝灭剂标记探针。此外，关于猝灭剂标记探针，也设计了，5’末端侧缺失3～10个碱基、Tm值降低的猝灭剂标记探针。引物的合成求助于ォヘ°ロンハ·イオテクノロシ·-公司，关于荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针，求助于日本ハ·イオサ-ヒ·ス公司。猝灭剂标记探针的Tm值表示最近接碱基对法(最近毗邻法(Nearest Neighbor method))的计算值。

<沙眼衣原体引物>

CT-FIP:5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号1)

CT-BIP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号2)

CT-F3:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号3)

CT-B3:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号4)

CT-LF:5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列编号5)

CT-LB:5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号6)

<沙眼衣原体荧光标记引物/探针>

FAM-CT-LB:5’-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号7)

<沙眼衣原体猝灭剂标记探针>

CT-LBc-Q1-0:5’-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号8)Tm＝60.6℃

CT-LBc-Q1-3:5’-CTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号9)Tm＝53.9℃

CT-LBc-Q1-5:5’-TCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号10)Tm＝49.7℃

CT-LBc-Q1-6:5’-CGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号11)Tm＝46.5℃

CT-LBc-Q1-7:5’-GTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号12)Tm＝37.5℃

CT-LBc-Q1-9:5’-AACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号13)Tm＝32.6℃

CT-LBc-Q1-10:5’-ACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号14)Tm＝26.7℃

(3)LAMP反应试剂组成和浓度

LAMP最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。将未进行添加的猝灭剂标记探针作为对照，向猝灭剂标记探针中添加，CT-LBc-Q1-0(序列编号8)，CT-LBc-Q1-3(序列编号9)，CT-LBc-Q1-5(序列编号10)，CT-LBc-Q1-6(序列编号11)，CT-LBc-Q1-7(序列编号12)，CT-LBc-Q1-9(序列编号13)或CT-LBc-Q1-10(序列编号14)的任一项。

·30mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％吐温-20(Tween20)

·2.1mM dATP(GeneACT公司)

·2.1mM dCTP(GeneACT公司)

·2.1mM dGTP(GeneACT公司)

·2.1mM dTTP(GeneACT公司)

·38.4UBstDNAPolymerase(New England Biolab公司)

·引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针

0.8μMCT-FIP(序列编号1)

0.8μMCT-BIP(序列编号2)

0.1μMCT-F3(序列编号3)

0.1μMCT-B3(序列编号4)

0.4μMCT-LF(序列编号5)

0.4μMFAM-CT-LB(序列编号7)

0.8μMCT-LBc-Q1-0(序列编号8)，CT-LBc-Q1-3(序列编号9)，CT-LBc-Q1-5(序列编号10)，CT-LBc-Q1-6(序列编号11)，CT-LBc-Q1-7(序列编号12)，CT-LBc-Q1-9(序列编号13)或CT-LBc-Q1-10(序列编号14)

(4)扩增

在1个反应中添加蒸馏水(DW)或CT质粒104个拷贝，使用实时浊度测定装置LA-320C(テラメックス公司)，65℃进行扩增反应120分钟。

(5)判断

通过LA-320C，进行扩增反应(通过LA-320C，通过是核酸的扩增反应副产物的焦磷酸镁的生成导致的吸光度的变化，即，浊度的变化，监视核酸的扩增反应。Tt值:浊度测定数据的演算值从反应开始到达给定的判断值所用的时间，浊度曲线:浊度的实时测定数据的曲线)的确认，并且，UV照射扩增后反应试管，发出绿色的荧光(FAM)的作为阳性，确认没有荧光的作为阴性。

没有使用猝灭剂标记探针情况下，CT质粒10⁴个拷贝的扩增被确认为20.6分钟。与之相对的是，添加猝灭剂标记探针的情况下，根据猝灭剂标记探针，扩增时间不同，CT-LBc-Q1-0(序列编号8)为92.4分钟(+71.7分钟)，CT-LBc-Q1-3(序列编号9)为41.5分钟(+20.8分钟)，CT-LBc-Q1-5(序列编号10)为27.8分钟(+7.1分钟)，CT-LBc-Q1-6(序列编号11)为25.5分钟(+4.8分钟)，CT-LBc-Q1-7(序列编号12)为22.8分钟(+2.1分钟)，CT-LBc-Q1-9(序列编号13)为20.7分钟(+0.0分钟)，CT-LBc-Q1-10(序列编号14)为20.6分钟(-0.1分钟)。此外，即使是使用任何的猝灭剂标记探针的情况下，添加了CT质粒的试管中，确认了来自FAM的荧光是绿色的，添加了DW的试管中，不能确认荧光(表1)。

【表1】

猝灭剂标记探针的Tm和扩增时间

N.D.*：未检出

“Tt(DW)”表示添加DW，“Tt(CT)”表示在1个反应中添加CT质粒10⁴个拷贝而进行反应时的Tt值。

没有添加CT-LBc-Q1的情况下，即使添加DW，荧光标记也没有被猝灭，因此，可以确认荧光。添加CT-LBc-Q1的情况下(Q1-0)，不仅添加DW时，存在猝灭，而且添加CT质粒的情况下，CT-LBc-Q1的Tm值不被影响，可以确认荧光。

如[表1]所显示的，猝灭剂标记探针的Tm值越大越延迟扩增时间，但是，Tm值是32.6℃以下时，这种影响不存在。因此，教导的是，期望的是，猝灭剂标记探针的Tm是32.6℃以下。

实施例2.采用LAMP法的扩增后添加猝灭剂标记探针的情况

(1)测定模板

作为测定用模板，制作亚克隆沙眼衣原体的潜在质粒结构域的一部分(序列编号21)的质粒DNA(以下称为CT质粒)。

(2)引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的合成

将沙眼衣原体的潜在质粒结构域作为靶标，设计不与类似菌具有交叉反应性的引物。设计的引物中，将LB的5’末端经由FAM而被荧光标记的作为荧光标记引物/探针，将互补链的3’末端处标记BHQ1的作为猝灭剂标记探针。引物的合成求助于オヘ°ロンハ·イオテクノロシ·-公司，关于荧光标记引物和猝灭剂标记探针，求助于日本ハ·イオサ-ヒ·ス公司。

<沙眼衣原体引物>

CT-FIP:5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号1)

CT-BIP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号2)

CT-F3:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号3)

CT-B3:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号4)

CT-LF:5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列编号5)

CT-LB:5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号6)

<沙眼衣原体荧光标记引物>

FAM-CT-LB:5’-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号7)

<沙眼衣原体猝灭剂标记探针>

CT-LBc-Q1-0:5’-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号8)

(3)LAMP反应试剂组成和浓度

LAMP最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％Tween20

·2.1mM dATP(GeneACT公司)

·2.1mM dCTP(GeneACT公司)

·2.1mM dGTP(GeneACT公司)

·2.1mM dTTP(GeneACT公司)

·38.4UBstDNAPolymerase(New England Biolab公司)

·引物和荧光标记引物/探针

0.8μMCT-FIP(序列编号1)

0.8μMCT-BIP(序列编号2)

0.1μMCT-F3(序列编号3)

0.1μMCT-B3(序列编号4)

0.4μMCT-LF(序列编号5)

0.4μMFAM-CT-LB(序列编号7)

此外，扩增反应后添加了以下的试剂。

·猝灭剂标记探针

0.8μMCT-LBc-Q1-0(序列编号8)

(4)扩增

在1个反应中添加DW或CT质粒10⁴个拷贝，使用LA-320C，65℃进行扩增反应120分钟。

(5)判断

与实施例1同样地，通过LA-320C，进行扩增反应的确认(表2，图4)。

添加了DW的反应试管中，检测不出Tt值，没有发现浊度的提高。一方面，添加了CT质粒的反应试管中，Tt值是18.7分钟，和确认了浊度的提高。基于前述原因，确认了，只有包含CT质粒，即，靶核酸的反应试管引起了扩增反应。

关于各反应试管的荧光，添加了DW的反应试管(试管编号1)和添加了CT质粒的反应试管(试管编号2)都检测出荧光(图5)。接着，向各反应试管中在室温添加CT-LBc-Q1-0(序列编号8)，添加了DW的反应试管(试管编号3)被猝灭。与之相对的是，添加了CT质粒的反应试管(试管编号4)中，保持荧光。

【表2】

扩增时间

N.D.*：未检出

实施例3.使用LAMP法的沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌的同时扩增检测方法

(1)测定模板

作为内部标准物质模板，制作亚克隆沙眼衣原体的潜在质粒结构域的一部分(序列编号21)的质粒DNA(以下，称为CT质粒。)。此外，作为靶核酸模板，制作亚克隆淋病奈瑟氏菌mtrA结构域的一部分(序列编号32)的质粒DNA(以下，称为NG质粒。)。

(2)沙眼衣原体引物，TAMRA标记环引物(荧光标记引物/探针) 和BHQ2标记猝灭探针(猝灭剂标记探针)的合成

将沙眼衣原体的潜在质粒结构域作为靶标，设计不与类似菌具有交叉反应性的引物。引物的合成，求助于オヘ°ロンハ·イオテクノロシ·-公司。此外，TAMRA标记环引物和BHQ2标记猝灭探针的合成，求助于J-Bios公司。

<沙眼衣原体引物>

CT-FIP:5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号1)

CT-BIP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号2)

CT-F3:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号3)

CT-B3:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号4)

CT-LB:5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号6)

<沙眼衣原体TAMRA标记环引物>

TAM-CT-LF:5’-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列编号15)

<沙眼衣原体BHQ2标记猝灭探针>

CT-LFc-Q2:5’-GGGGTTATCTT-(BHQ2)-3’(序列编号16)

(3)淋病奈瑟氏菌引物，FAM标记环引物(荧光标记引物/探针)和 BHQ1标记猝灭探针(猝灭剂标记探针)的合成

将淋病奈瑟氏菌的mtrA结构域作为靶标，设计不与类似菌具有交叉反应性的引物。引物的合成，求助于オヘ°ロンハ·イオテクノロシ·-公司。此外，FAM标记环引物和BHQ1标记猝灭探针的合成，求助于J-Bios公司。

<淋病奈瑟氏菌引物>

NG-FIP:5’-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’(序列编号17)

NG-BIP:5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3’(序列编号18)

NG-F3:5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’(序列编号19)

NG-B3:5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’(序列编号20)

NG-LF:5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’(序列编号22)

<淋病奈瑟氏菌FAM标记环引物>

FAM-NG-LB:5’-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’(序列编号23)

<淋病奈瑟氏菌BHQ1标记猝灭探针>

NG-LBc-Q1:5’-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3’(序列编号24)

(4)LAMP反应试剂组成和浓度

LAMP最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％Tween20

·2.1mM ATP

·2.1mM CTP

·2.1mM GTP

·2.1mM TTP

·38.4UBstDNA聚合酶(New England Biolab公司)

·沙眼衣原体引物，TAMRA标记环引物和BHQ2标记猝灭探针

0.8μMCT-FIP(序列编号1)和CT-BIP(序列编号2)

0.1μMCT-F3(序列编号3)和CT-B3(序列编号4)

0.4μMCT-LB(序列编号6)和TAM-CT-LF(序列编号15)

0.8μMCT-LFc-Q2(序列编号16)

·淋病奈瑟氏菌引物，FAM标记环引物和BHQ1标记猝灭探针

0.8μMNG-FIP(序列编号17)和NG-BIP(序列编号18)

0.1μMNG-F3(序列编号19)和NG-B3(序列编号20)

0.4μMNG-LF(序列编号22)和FAM-NG-LB(序列编号23)

0.8μMNG-LBc-Q1(序列编号24)

(5)扩增

添加DW，或CT质粒10⁴个拷贝，或NG质粒10⁴个拷贝，或CT质粒10⁴个拷贝和NG质粒10⁴个拷贝，使用LA-320C，65℃进行扩增反应60分钟。

(6)判断

沙眼衣原体来源的核酸(CT)被扩增时，在UV照射下，可以目视到红色(TAMRA)，淋病奈瑟氏菌来源的核酸(NG)被扩增时，可以目视到绿色(FAM)。前述扩增反应后，通过照射UV，确认荧光的结果(图6)如下，可以目视到的是，DW(阴性受检体(検体))为无色(试管编号1-4)；淋病奈瑟氏菌阳性受检体为绿色(试管编号5-8)；沙眼衣原体阳性受检体为红色(试管编号9-12)；双阳性受检体为黄色(红色+绿色)(试管编号13-16)。

实施例4.沙眼衣原体，淋病奈瑟氏菌和人工核酸的多项目同时扩增检测

(1)测定模板

作为测定用模板，制作亚克隆沙眼衣原体的潜在质粒结构域的一部分(序列编号21)的质粒DNA(以下称为CT质粒)，亚克隆淋病奈瑟氏菌的mtrA结构域的一部分(序列编号32)的质粒DNA(以下称为NG质粒)，亚克隆人工核酸序列(序列编号33)的质粒DNA(以下称为ARITA2质粒)。

(2)引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的合成

将沙眼衣原体的潜在质粒结构域，淋病奈瑟氏菌的mtrA结构域和人工核酸序列作为靶标，设计不与类似菌具有交叉反应性的LAMP反应用的引物。设计的引物中，将沙眼衣原体LF的5’末端通过TAMRA荧光标记的，将淋病奈瑟氏菌LB的5’末端通过FAM荧光标记的，将人工核酸序列LB的5’末端通过AlexaFluor^TM350(以下称为Alexa350)荧光标记的被用作荧光标记引物，沙眼衣原体LF互补链的3’末端处标记BHQ2的，淋病奈瑟氏菌LB互补链的3’末端处标记BHQ1的，人工核酸序列LB互补链的3’末端处标记BHQ0的被用作猝灭剂标记探针。引物的合成求助于オヘ°ロンハ·イオテクノロシ·-公司，关于荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针，求助于日本ハ·イオサ-ヒ·ス公司。

<沙眼衣原体引物>

CT-FIP:5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号1)

CT-BIP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号2)

CT-F3:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号3)

CT-B3:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号4)

CT-LB:5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号6)

<沙眼衣原体荧光标记引物/探针>

TAM-CT-LF:5’-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列编号15)

<沙眼衣原体猝灭剂标记探针>

CT-LFc-Q2:5’-ACGTGCGGGGTTATCTT-(BHQ2)-3’(序列编号16)

<淋病奈瑟氏菌引物>

NG-FIP:5’-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’(序列编号17)

NG-BIP:5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3’(序列编号18)

NG-F3:5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’(序列编号19)

NG-B3:5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’(序列编号20)

NG-LF:5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’(序列编号22)

<淋病奈瑟氏菌荧光标记引物/探针>

FAM-NG-LB:5’-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’(序列编号23)

<淋病奈瑟氏菌猝灭剂标记探针>

NG-LBc-Q1:5’-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3’(序列编号24)

<人工核酸引物>

ARITA2-FIP:5’-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3’(序列编号25)

ARITA2-BIP:5’-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3’(序列编号26)

ARITA2-F3:5’-GGACAATCGAAGCCAGAA-3’(序列编号27)

ARITA2-B3:5’-ATCACGGATCGTATGTGG-3’(序列编号28)

ARITA2-LF:5’-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3’(序列编号29)

<人工核酸荧光标记引物/探针>

Ale-ARITA2-LB:5’-(Alexa350)-AACGATCGCACTAAGCAT-3’(序列编号30)

<人工核酸猝灭剂标记探针>

ARITA2-LBc-Q0:5’-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ0)-3’(序列编号31)

(3)LAMP反应试剂组成和浓度

LAMP最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％Tween20

·2.1mM dATP(GeneACT公司)

·2.1mM dCTP(GeneACT公司)

·2.1mM dGTP(GeneACT公司)

·2.1mM dTTP(GeneACT公司)

·38.4UBstDNAPolymerase(New England Biolab公司)

·引物和荧光标记引物/探针

0.6μMCT-FIP(序列编号1)，NG-FIP(序列编号17)

0.6μMCT-BIP(序列编号2)，NG-BIP(序列编号18)

0.1μMCT-F3(序列编号3)，NG-F3(序列编号19)

0.1μMCT-B3(序列编号4)，NG-B3(序列编号20)

0.3μMCT-LB(序列编号6)，NG-LF(序列编号22)

0.1μMARITA2-FIP(序列编号25)，ARITA2-BIP(序列编号26)

0.02μMARITA2-F3(序列编号27)，ARITA2-B3(序列编号28)

0.1μMARITA2-LF(序列编号29)

0.4μMTAM-CT-LF(序列编号15)，FAM-NG-LB(序列编号23)，Ale-ARITA2-LB(序列编号30)

此外，扩增反应后添加了以下的试剂。

·猝灭剂标记探针

0.8μMCT-LFc-Q2(序列编号16)，NG-LBc-Q1(序列编号24)，ARITA2-LBc-Q0(序列编号31)

(4)扩增

DW，CT质粒10⁴个拷贝，NG质粒10⁴个拷贝或ARITA2质粒10²个拷贝中的1种或多种在1个反应中添加，使用LA-320C，65℃进行扩增反应120分钟。

【表3】

添加模板和扩增时间

N.D.*未检出

(5)判断

与实施例1同样地，通过LA-320C，进行扩增反应的确认(表3，图7)。

添加了DW的(CT，NG和ARITA2质粒全部-)反应试管中，检测不出Tt值，没有发现浊度的提高。一方面，将CT质粒，NG质粒或ARITA2质粒中的1种，2种类组合并添加入反应试管中，或将CT质粒，NG质粒或ARITA2质粒的3种类全部添加入反应试管中，分别针对所述反应试管，得到Tt值，此外，确认了浊度的提高。基于前述原因，确认了，含有CT质粒，NG质粒或ARITA2质粒中的1种或多种的反应试管仅仅引起了扩增反应。扩增结束后的反应试管中，添加CT-LFc-Q2(序列编号16)，NG-LBc-Q1(序列编号24)，ARITA2-LBc-Q0(序列编号31)0.8μM，95℃加热5分钟后冷却至室温，之后，通过照射UV，观察荧光(图8)。

添加了DW的反应试管中，没有扩增产物，因此，不能确认荧光(试管编号1)。添加CT质粒的反应试管中，可以确认红色的荧光(试管编号2)。同样地，添加NG质粒的反应试管中，可以确认绿色的荧光(试管编号3)，添加ARITA2质粒的反应试管中，可以确认蓝色的荧光(试管编号4)。添加了两种质粒的反应试管中，显示各自的荧光色的中间色，添加CT质粒和NG质粒的反应试管中，可以确认黄色的荧光(试管编号5)，添加CT质粒和ARITA2质粒的反应试管中，可以确认紫色的荧光(试管编号6)，添加NG质粒和ARITA2质粒的反应试管中，可以确认淡蓝色的荧光(试管编号7)。此外，添加了三种质粒的反应试管中，可以确认白色的荧光(试管编号8)。

实施例5.使用探针的靶核酸(沙眼衣原体)的检测

(1)样品的制备

在样品中，使用反应后的LAMP反应液。关于LAMP反应条件，各试剂组成和终浓度如下所示，作为模板添加CT质粒，使得每个1个反应的CT质粒为10⁴个拷贝，或添加代替模板的DW，使得LAMP最终反应溶液为30μL，使用LA-320C，65℃进行扩增反应40分钟。此外，在80℃对得到的反应液进行加热处理5分钟，进行BstDNA聚合酶(BstDNAPolymerase)的失活处理，通过之后进行的荧光标记引物/探针的检测时，使得不能引起扩增反应。如此得到的LAMP反应液，即样品中，将CT质粒作为模板而制备的作为阳性受检体，添加DW而制备的作为阴性受检体。

<LAMP反应试剂组成和终浓度>

LAMP最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％Tween20

·2.1mM dATP(GeneACT公司)

·2.1mM dCTP(GeneACT公司)

·2.1mM dGTP(GeneACT公司)

·2.1mM dTTP(GeneACT公司)

·38.4UBstDNAPolymerase(New England Biolab公司)

<沙眼衣原体引物>

·

0.8μMCT-FIP:5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号1)

·

0.8μMCT-BIP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号2)

·0.1μMCT-F3:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号3)

·0.1μMCT-B3:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号4)

·0.4μMCT-FL:5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列编号5)

·0.4μMCT-BL:5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号6)

(2)荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的合成

设计的引物中，将BL的5’末端通过FAM荧光标记的被用作荧光标记引物/探针，将互补链的3’末端处标记BHQ1的作为猝灭剂标记探针。进而，关于荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针，求助于日本ハ·イオサ-ヒ·ス公司。

<沙眼衣原体荧光标记引物/探针>

FAM-CT-BL:5’-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号7)

<沙眼衣原体猝灭剂标记探针>

CT-BLc-Q1-0:5’-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列编号8)

(3)向样品添加荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针

对于(1)所制备的各个阳性受检体和阴性受检体，添加0.4μM荧光标记引物/探针(序列编号7)，95℃进行加热处理5分钟，进行模板的变性。持续冷却至室温，使模板和荧光标记引物退火。

冷却至室温，之后，添加0.8μM猝灭剂标记探针(序列编号8)，搅拌后，UV下确认其荧光(图9)。

(4)判断

阳性受检体，阴性受检体的任一个均，在添加荧光标记引物/探针前，不能检测到荧光(试管编号1，2)，添加是荧光标记引物/探针的FAM-CT-BL(序列编号7)后，可以检测到荧光(试管编号3，4)。将这些在95℃加热5分钟后，冷却至室温，添加是猝灭剂标记探针的CT-BLc-Q1-0(序列编号8)之后，阴性受检体中，不存在LAMP产物，因此，为了使FAM-CT-BL(序列编号7)与CT-BLc-Q1-0(序列编号8)结合，猝灭(猝灭)荧光(试管编号5)。与之相对的是，阳性受检体中，将CT质粒作为模板扩增的LAMP产物与FAM-CT-BL(序列编号7)结合，不与CT-BLc-Q1-0(序列编号8)结合，因此，保持荧光(试管编号6)。

因此，实施例5表示，图1中表示的本申请发明的最基本的方案是可能实施的。

实施例6.使用SMart扩增方法第2版(以下，称为SMAP2)法的沙眼衣原体的扩增检测(LAMP法以外的等温扩增法SMAP2法中，添加猝灭剂标记探针的情况下的核酸扩增和扩增产物的检测)

(1)测定模板

(2)引物，荧光标记引物和猝灭剂标记探针的合成

将沙眼衣原体的潜在质粒结构域的一部分作为靶标，设计不与类似菌具有交叉反应性的SMAP2反应用的引物(FP，TP，OP1，OP2和BP引物的计5本)。设计的引物中，根据TP引物产生扩增产物的环部分处退火的BP引物的5’末端通过Alexa350被荧光标记的用作荧光标记引物/探针。进一步地，BP引物的互补链的3’末端处标记BHQ0的被用作猝灭剂标记探针。引物的合成求助于オヘ°ロンハ″イオテクノロシ″-公司，关于荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针，求助于日本ハ″イオサ-ヒ″ス公司。

<沙眼衣原体SMAP2引物>

CT-FP:5’-TTTATATATATATAAAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号34)

CT-TP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号35)

CT-OP1:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号36)

CT-OP2:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号37)

<沙眼衣原体荧光标记引物/探针>

Ale-CT-BP:5’-(Alexa350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号38)

<沙眼衣原体猝灭剂标记探针>

CT-BPc-Q0:5’-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3’(序列编号39)

(3)SMAP2反应试剂组成和浓度

SMAP2最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％Tween20

·2.1mM dATP(GeneACT公司)

·2.1mM dCTP(GeneACT公司)

·2.1mM dGTP(GeneACT公司)

·2.1mM dTTP(GeneACT公司)

·38.4UBstDNAPolymerase(New England Biolab公司)

·引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针

1.33μMCT-FP(序列编号34)

1.33μMCT-TP(序列编号35)

0.17μMCT-OP1(序列编号36)

0.17μMCT-OP2(序列编号37)

0.67μMAle-CT-BP(序列编号38)

1.33μMCT-BPc-Q0(序列编号39)

(4)扩增

DW或CT质粒10⁶个拷贝在1个反应中添加，使用实时浊度测定装置LoopampEXIA^TM(テラメックス公司)，65℃进行扩增反应45分钟。

(5)判断

通过LoopampEXIA^TM进行扩增反应的确认(LoopampEXIA^TM中，通过是核酸的扩增反应副产物的焦磷酸镁的生成导致的吸光度的变化，即，浊度的变化，监视核酸的扩增反应。Tt值:浊度测定数据的演算值从反应开始到达给定的判断值所用的时间，浊度曲线:浊度的实时测定数据的曲线)(表4，图10)。

添加了DW的反应试管中，检测不出Tt值，没有观察到浊度的提高。一方面，添加了CT质粒的反应试管中，Tt值是23.2分钟，和确认了浊度的提高。确认了，基于前述原因，只有包含CT质粒，即，靶核酸的反应试管引起了扩增反应。

向扩增反应结束后的各反应试管照射UV，观察荧光结果(图11)，添加了DW的反应试管(试管编号1)观察不到荧光，添加了CT质粒的反应试管(试管编号2)确认了荧光。

实施例6表示，不仅仅在LAMP法中，即使在各种核酸的等温扩增反应中，可能实施本申请发明。

【表4】

扩增时间

*N.D.：未检出

实施例7.单项目扩增，二项目或三项目同时扩增反应体系中的荧光波长检测

(1)测定模板

(2)引物，荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的合成

将沙眼衣原体的潜在质粒结构域，淋病奈瑟氏菌的mtrA结构域和人工核酸序列作为靶标，设计不与类似菌具有交叉反应性的LAMP反应用的引物。设计的引物中，沙眼衣原体BL的5’末端通过Alexa350荧光标记的，淋病奈瑟氏菌BL的5’末端通过TAMRA荧光标记的，人工核酸序列BL的5’末端通过FAM荧光标记的被用作荧光标记引物/探针，沙眼衣原体BL互补链的3’末端处标记BHQ0的，淋病奈瑟氏菌BL互补链的3’末端处标记BHQ2的，人工核酸序列BL互补链的3’末端处标记BHQ1的作为猝灭剂标记探针。引物的合成求助于オヘ°ロンハ″イオテクノロシ″-公司，关于荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针，求助于日本ハ″イオサ-ヒ″ス公司。

<沙眼衣原体引物>

CT-FIP:5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列编号1)

CT-BIP:5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列编号2)

CT-F3:5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列编号3)

CT-B3:5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列编号4)

CT-LF:5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列编号5)

<沙眼衣原体荧光标记引物/探针>

Ale-CT-LB:5’-(Alexa350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列编号40)

<沙眼衣原体猝灭剂标记探针>

CT-LBc-Q0:5’-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3’(序列编号41)

<淋病奈瑟氏菌引物>

NG-FIP:5’-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’(序列编号17)

NG-BIP:5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3’(序列编号18)

NG-F3:5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’(序列编号19)

NG-B3:5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’(序列编号20)

NG-LF:5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’(序列编号22)

<淋病奈瑟氏菌荧光标记引物/探针>

TAM-NG-LB:5’-(TAMRA)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’(序列编号42)

<淋病奈瑟氏菌猝灭剂标记探针>

NG-LBc-Q2:5’-CGTTTTGTCG-(BHQ2)-3’(序列编号43)

<人工核酸引物>

ARITA2-FIP:5’-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3’(序列编号25)

ARITA2-BIP:5’-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3’(序列编号26)

ARITA2-F3:5’-GGACAATCGAAGCCAGAA-3’(序列编号27)

ARITA2-B3:5’-ATCACGGATCGTATGTGG-3’(序列编号28)

ARITA2-LF:5’-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3’(序列编号29)

<人工核酸荧光标记引物/探针>

FAM-ARITA2-LB:5’-(FAM)-AACGATCGCACTAAGCAT-3’(序列编号44)

<人工核酸猝灭剂标记探针>

ARITA2-LBc-Q1:5’-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ1)-3’(序列编号45)

(3)LAMP反应试剂组成和浓度

LAMP最终反应溶液30μL中的各试剂浓度如下制备。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％Tween20

·2.1mM ATP

·2.1mM CTP

·2.1mM GTP

·2.1mM TTP

·38.4UBstDNA聚合酶(New England Biolab公司)

关于引物，1个反应中添加了，以下3种类的引物和荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的设置中的1种或多种。

引物和荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针的设置的组合，在单项目扩增中，是如沙眼衣原体，淋病奈瑟氏菌，人工核酸的3种，在2项目同时扩增中，是如沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌，沙眼衣原体和人工核酸，淋病奈瑟氏菌和人工核酸的3种，在3项目同时扩增中，是如沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌以及人工核酸的1种。

<沙眼衣原体引物和荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针>

0.67μMCT-FIP(序列编号1)

0.67μMCT-BIP(序列编号2)

0.17μMCT-F3(序列编号3)

0.17μMCT-B3(序列编号4)

0.33μMCT-LF(序列编号5)

0.67μMAle-CT-LB(序列编号40)

1.33μMCT-LBc-Q0(序列编号41)

<淋病奈瑟氏菌引物和荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针>

1.20μMNG-FIP(序列编号17)

1.20μMNG-BIP(序列编号18)

0.17μMNG-F3(序列编号19)

0.17μMNG-B3(序列编号20)

0.67μMNG-LF(序列编号22)

0.67μMTAM-NG-LB(序列编号42)

1.33μMNG-LBc-Q2(序列编号43)

<人工核酸引物和荧光标记引物/探针和猝灭剂标记探针>

0.20μMARITA2-FIP(序列编号25)

0.20μMARITA2-BIP(序列编号26)

0.03μMARITA2-F3(序列编号27)

0.03μMARITA2-B3(序列编号28)

0.13μMARITA2-LF(序列编号29)

0.67μMFAM-ARITA2-LB(序列编号44)

1.33μMARITA2-LBc-Q1(序列编号45)

(4)扩增

1个反应中添加，DW，CT质粒10³个拷贝，NG质粒10³个拷贝或ARITA2质粒10³个拷贝中的1种或多种，使用LoopampEXIA^TM，65℃进行扩增反应45分钟。

(5)判断

通过LoopampEXIA^TM进行扩增反应的确认。

扩增反应结束后，UV照射反应试管，进行荧光的观察。

此外，将扩增反应后的反应液通过稀释液稀释为100倍的反应液，通过分光荧光光度计RF-5300PC(SHIMADZU公司制)，照射对应于各荧光标记的激发光，进行荧光波长的扫描。

<稀释液的组成>

·30mM Tris-HClpH8.8

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

作为对应于各荧光标记的激发光，使用以下的波长。

·Alexa350350nm

·TAMRA555nm

·FAM495nm

1)单项目沙眼衣原体的扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(根据表5模板CT“-”，检测不出Tt值；根据图12的DW的扩增曲线，发现浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图13试管编号1)，但是，添加了CT质粒的反应试管中，发现核酸的扩增(表5模板CT“+”的Tt值13.3分钟；根据图12的CT的扩增曲线，发现存在浊度的提高)，在UV照射下，可以确认，被认为是Ale-CT-LB(序列编号40)来源的蓝色的荧光(图13试管编号2)。即使在荧光波长中，同样地，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了，采用模板(-)(添加了DW的)的反应液时(图14A)，350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰。一方面，确认了，采用模板(+)(添加了CT质粒的)的反应液时(图14B)，350nm附近处激发光，和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰。

【表5】

添加模板和扩增时间

*N.D.：未检出

2)单项目淋病奈瑟氏菌的扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(通过表6模板NG“-”发现，检测不出Tt值；通过图15的DW的扩增曲线，发现浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图16试管编号1)，但是，添加了NG质粒的反应试管中，发现核酸的扩增(通过表6模板NG“+”发现，Tt值11.6分钟；通过图15的NG的扩增曲线，发现存在浊度的提高)，在UV照射下，可以确认被认为是TAM-NG-LB(序列编号42)来源的红色的荧光(图16试管编号2)。即使在荧光波长方面，同样地，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，采用模板(-)(添加了DW的)的反应液时(图17A)，仅仅确认了，555nm附近处激发光。一方面，采用模板(+)(添加了NG质粒的)的反应液时(图17B)，确认了，555nm附近处激发光，和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰。

【表6】

添加模板和扩增时间

*N.D.：未检出

3)单项目人工核酸的扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(通过表7模板ARITA2“-”发现，检测不出Tt值；通过图18的DW的扩增曲线，发现浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图19试管编号1)，但是，添加了ARITA2质粒的反应试管中，发现核酸的扩增(通过表7模板ARITA2“+”发现，反应时间内检测不到Tt值，通过图18的ARITA2的扩增曲线，确认浊度提高，因此，判核酸扩增定)，可以确认被认为是FAM-ARITA2-LB(序列编号44)来源的绿色的荧光(图19试管编号2)。

荧光波长中，照射对应于FAM的激发光的情况下，使用模板(-)(添加了DW的)的反应液(图20A)和模板(+)(添加了ARITA2质粒的)的反应液(图20B)时都发现了，495nm附近处激发光，522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的峰，但是，确认了，采用模板(-)的反应液时所述峰是更小的(不足荧光强度20的)峰(背景)，采用模板(+)的反应液时，确认了，所述峰是更大的(超过荧光强度80的)峰。

【表7】

添加模板和扩增时间

*N.D.未检出

4)二项目沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌的同时扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(通过表8模板CT“-”和NG“-”发现，检测不出Tt值；通过图21的DW的扩增曲线发现，浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图22试管编号1)，但是，仅仅添加CT质粒的，仅仅添加NG质粒的或添加CT质粒和NG质粒的反应试管中，发现核酸的扩增(表8仅仅模板CT的“+”，仅仅模板NG的“+”，模板CT“+”和NG“+”的Tt值各自是12.8分钟，13.6分钟，12.2分钟；根据图21的CT，NG，CT+NG的扩增曲线发现，其中任一个均存在浊度的提高)，在UV照射下，各自可以确认，被认为是Ale-CT-LB(序列编号40)来源的蓝色的荧光(图22试管编号2)，被认为是TAM-NG-LB(序列编号42)来源的红色的荧光(图22试管编号3)，被认为是Ale-CT-LB和TAM-NG-LB来源的紫色的荧光(图22试管编号4)。

荧光波长中，采用CT和NG两者的模板(-)(添加了DW的)的反应液时(图23A)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了，350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了，555nm附近处激发光。

采用仅仅CT的模板(+)(仅仅添加了CT质粒的)的反应液时(图23B)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了，555nm附近处激发光。

采用仅仅NG的模板(+)(仅仅添加了NG质粒的)的反应液时(图23C)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了，555nm附近处激发光和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰。

采用CT和NG两者的模板(+)(添加CT质粒和NG质粒的)的反应液时(图23D)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处Alexa350的用于的激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了，555nm附近处激发光，和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰。

【表8】

添加模板和扩增时间

*N.D.：未检出

5)二项目沙眼衣原体和人工核酸的同时扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(通过表9模板CT“-”和ARITA2“-”发现，检测不出Tt值；通过图24的DW的浊度曲线，发现浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图25试管编号1)，但是，仅仅添加CT质粒的，仅仅添加ARITA2质粒的或添加了CT质粒和ARITA2质粒的反应试管中，发现核酸的扩增(表9仅仅模板CT的“+”，仅仅模板ARITA2的“+”，模板CT“+”和ARITA2“+”的Tt值各自是12.0分钟，28.2分钟，13.6分钟；图24的CT，ARITA2，CT+ARITA2的浊度曲线，任一个均存在浊度的提高)，在UV照射下，各自可以确认，被认为是Ale-CT-LB(序列编号40)来源的蓝色的荧光(图25试管编号2)，被认为是FAM-ARITA2-LB(序列编号44)来源的绿色的荧光(图25试管编号3)，被认为是Ale-CT-LB和FAM-ARITA2-LB来源的淡蓝色的荧光(图25试管编号4)。

荧光波长中，采用CT和ARITA2两者的模板(-)(添加了DW的)的反应液时(图26A)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了，350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，495nm附近处激发光。

采用仅仅CT的模板(+)(仅仅添加了CT质粒的)的反应液时(图26B)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用仅仅ARITA2的模板(+)(仅仅添加了ARITA2质粒的)的反应液时(图26C)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

采用CT和ARITA2两者的模板(+)(添加了CT质粒和ARITA2质粒的)的反应液时(图26D)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光，和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

【表9】

添加模板和扩增时间

*N.D.：未检出

6)二项目淋病奈瑟氏菌和人工核酸的同时扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(通过表10模板NG“-”和ARITA2“-”发现，检测不出Tt值；通过图27的DW的浊度曲线，发现浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图28试管编号1)，但是，仅仅添加NG质粒的，仅仅添加ARITA2质粒的或添加了NG质粒和ARITA2质粒的反应试管中，发现核酸的扩增(表10仅仅模板NG的“+”，仅仅模板ARITA2的“+”，模板NG“+”和ARITA2“+”的Tt值各自是12.0分钟，29.0分钟，11.9分钟；图27的NG，ARITA2，NG+ARITA2的浊度曲线，任一个均存在浊度的提高)，在UV照射下，各自可以确认，被认为是TAM-NG-LB(序列编号42)来源的红色的荧光(图28试管编号2)，被认为是FAM-ARITA2-LB(序列编号44)来源的绿色的荧光(图28试管编号3)，被认为是TAM-NG-LB和FAM-ARITA2-LB来源的黄色的荧光(图28试管编号4)。

荧光波长中，采用NG和ARITA2G两者的模板(-)(添加了DW的)的反应液时(图29A)，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了，555nm附近处激发光，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用仅仅NG的模板(+)(仅仅添加了NG质粒的)的反应液时(图29B)，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了555nm附近处激发光和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用仅仅ARITA2的模板(+)(仅仅添加了ARITA2质粒的)的反应液时(图29C)，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了555nm附近处激发光，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

采用NG和ARITA2两者的模板(+)(添加了NG质粒和ARITA2质粒的)的反应液时(图29D)，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了555nm附近处激发光和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

【表10】

添加模板和扩增时间

*N.D.：未检出

7)三项目沙眼衣原体，淋病奈瑟氏菌和人工核酸的扩增反应体系的扩增反应后的荧光波长测定结果

添加了DW的反应试管中，不能发现核酸的扩增(通过表11模板CT“-”，NG“-”和ARITA2“-”发现，检测不出Tt值；通过图30的DW的浊度曲线，发现浊度没有提高)，在UV照射下，不能确认荧光(图31试管编号1)，但是，采用添加CT质粒，NG质粒，ARITA2质粒中的1种，组合添加CT质粒，NG质粒，ARITA2质粒中的2种类，或全部添加CT质粒，NG质粒，ARITA2质粒的3种类的反应试管时，发现核酸的扩增(表11仅仅模板CT的“+”，仅仅模板NG的“+”，仅仅模板ARITA2的“+”，模板CT“+”和NG“+”，模板CT“+”和ARITA2“+”，模板NG“+”和ARITA2“+”，模板CT“+”和NG“+”和ARITA2“+”的Tt值各自是14.3分钟，13.5分钟，35.6分钟，12.3分钟，14.2分钟，13.5分钟，12.4分钟；图30的CT，NG，ARITA2，CT+NG，CT+ARITA2，NG+ARITA2，CT+NG+ARITA2的浊度曲线，任一个均存在浊度的提高)，在UV照射下，各自可以确认，被认为是Ale-CT-LB(序列编号40)来源的蓝色的荧光(图31试管编号2)，被认为是TAM-NG-LB(序列编号42)来源的红色的荧光(图31试管编号3)，被认为是FAM-ARITA2-LB(序列编号44)来源的绿色的荧光(图31试管编号4)，被认为是Ale-CT-LB和TAM-NG-LB来源的紫色的荧光(图31试管编号5)，被认为是Ale-CT-LB和FAM-ARITA2-LB来源的淡蓝色的荧光(图31试管编号6)，被认为是TAM-NG-LB和FAM-ARITA2-LB来源的黄色的荧光(图31试管编号7)，Ale-CT-LB和TAM-NG-LB和被认为是FAM-ARITA2-LB来源的白的荧光(图31试管编号8)。

荧光波长中，采用CT，NG和ARITA2全部的模板(-)(添加了DW的)的反应液时(图32A)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了350nm附近处激发光，和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了555nm附近处激发光，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用仅仅CT的模板(+)(添加了CT质粒的)的反应液时(图32B)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的，443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了555nm附近处激发光，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用仅仅NG的模板(+)(仅仅添加了NG质粒的)的反应液时(图32C)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了555nm附近处激发光，除此之外的，580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用仅仅ARITA2的模板(+)(仅仅添加了ARITA2质粒的)的反应液时(图32D)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了555nm附近处激发光，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

采用CT和NG两者的模板(+)(添加CT质粒和NG质粒的)的反应液(图32E)中，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处Alexa350的用于的激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了555nm附近处激发光，和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰，但是，照射对应于FAM的激发光的情况下，仅仅确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的小的(不足荧光强度20的)峰(背景)。

采用CT和ARITA2两者的模板(+)(添加了CT质粒和ARITA2质粒的)的反应液时(图32F)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，仅仅确认了555nm附近处激发光，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光，和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

采用NG和ARITA2两者的模板(+)(添加了NG质粒和ARITA2质粒的)的反应液时(图32G)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，仅仅确认了350nm附近处激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了555nm附近处激发光和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

采用CT，NG和ARITA2全部的模板(+)(添加了CT质粒、NG质粒和ARITA2质粒的)的反应液时(图32H)，照射对应于Alexa350的激发光的情况下，确认了350nm附近处Alexa350的用于的激发光和398nm附近处水的拉曼光谱的峰，除此之外的443nm附近处被认为是Ale-CT-LB来源的荧光的峰，照射对应于TAMRA的激发光的情况下，确认了555nm附近处激发光，和580nm附近处被认为是TAM-NG-LB来源的荧光的峰，进一步地，照射对应于FAM的激发光的情况下，确认了，495nm附近处激发光，和522nm附近处被认为是FAM-ARITA2-LB来源的荧光的非常大的(超过荧光强度80的)峰。

【表11】

添加模板和扩增时间

*N.D.未检出

本申请发明，在单项目或多项目的扩增反应体系中，由1种类的模板扩增核酸的情况下，检测的是，每个项目检测所用的1种类荧光标记来源的荧光，多项目的扩增反应体系中，由多种模板扩增核酸的情况下，检测的是，各项目检测所用的多种荧光标记来源的荧光。通过目视进行检测情况下，通过人的三色型视觉可能识别的范围的荧光色光是必要的，例如，如实施例所显示的，将蓝色的，红色的，绿色的荧光标记用作原色，利用加法混合，表现出的色调的上限是全部共8种类的颜色，所述8种类的颜色包含，之前的三种原色，除此之外的紫色，黄色，淡蓝色，白色的七种的颜色，至此不发出荧光的情况(无色即，无荧光)。一方面，通过荧光测定设备进行检测情况下，可以使用通过设备可能识别的种类的荧光标记，因此，进一步地可能同时检测多项目，此外，通过发光强度也可能定量。

实施例7表示的是，本申请发明，由于在单项目、多项目中均检测出等温扩增反应中的核酸的扩增，可能实施通过荧光检测设备的荧光测量。

【工业上的利用可能性】

本发明可以提供，比现有技术更加简便廉价地检测靶核酸的方法。此外，通过使用本发明微阵列，不标记靶核酸，可以检测基因表达。进一步地，通过与以往的核酸扩增技术组合，添加1步骤的试剂，也可能同时检测多项目的靶核酸。此外，不使用特别的设备，通过目视，这种检测可以是可能的。因此，如此的本发明，不仅在以往的研究室内，而且在医院中的菌、病毒的感染的认定，药物试剂敏感性的确认，通过一碱基多型检测的治疗效果预测，食品制造销售中的安全性的确认等中，是特别有效的工具。

Claims

1.检测样品中存在的1种以上的靶核酸的方法，是含有以下的步骤的检测核酸的方法:

(1)向样品添加

荧光标记的引物或探针，所述荧光标记的引物或探针是用荧光剂标记的、与靶核酸具有互补性的寡核苷酸，和

猝灭剂标记的探针，所述荧光标记的引物或探针是用猝灭剂标记的，与所述荧光标记的引物或探针具有互补性的，与所述荧光标记的引物或探针相比解链温度(Tm)低的寡核苷酸；

(2)在所述荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)以下，并且在与所述猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)相比更高的温度，保温该样品；

(4)测量结合至靶核酸的荧光标记的引物或探针的荧光。

2.权利要求1中记载的检测方法，在所述步骤(2)的保温期间，扩增靶核酸。

3.权利要求2中记载的检测方法，在等温条件下，进行所述靶核酸的扩增。

4.权利要求1-3的任一项中记载的检测方法，所述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸碱基长度，与所述荧光标记的引物或探针的寡核苷酸碱基长度相比更短。

5.权利要求1-3的任一项中记载的检测方法，所述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸包含修饰的碱基。

6.权利要求1-5的任一项中记载的检测方法，使所述荧光标记的引物或探针固定在固相面上，从而使用所述荧光标记的引物或探针。

7.权利要求1-6的任一项中记载的方法，为了检测2种以上的靶核酸，使用发光波长不同的2种以上的荧光标记的引物或探针和各自对应于所述荧光标记的引物或探针的猝灭剂标记的探针的组合。

8.权利要求1-7的任一项中记载的方法，所述步骤(4)中的荧光的测量通过目视进行判断。

9.权利要求1-7的任一项中记载的方法，所述步骤(4)中的荧光的测量通过荧光检测设备进行判断。

10.用于在权利要求1-9的任一项中记载的检测方法中使用的试剂盒，是含有1种或多种的荧光标记的引物或探针、和猝灭剂标记的探针的组合的靶核酸检测用试剂盒，

所述荧光标记的引物或探针是用荧光剂标记的、与靶核酸具有互补性的寡核苷酸；和

所述猝灭剂标记的探针是对应于所述各个荧光剂的猝灭剂标记的，与所述荧光标记的引物或探针具有互补性的，与所述荧光标记的引物或探针相比解链温度(Tm)低的寡核苷酸。

11.权利要求10中记载的靶核酸检测用试剂盒，所述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸碱基长度，与所述荧光标记的引物或探针的寡核苷酸碱基长度相比更短。

12.权利要求10中记载的靶核酸检测用试剂盒，所述猝灭剂标记的探针的寡核苷酸包含修饰的碱基。

13.权利要求10-12中记载的试剂盒，进一步地含有核酸扩增用试剂。

14.权利要求10-13的任一项中记载的靶核酸检测用试剂盒，所述荧光标记的引物或探针被固定在固相面上。