JP2019509066A - 増強型Sleeping Beautyトランスポゾン、並びに転移のキット及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
pT(https://www.addgene.org/26555/sequences/#depositor-partial)、
pT2(https://www.addgene.org/26557/sequences/#depositor-full)、又は
pT3(Yant SR, et al. Mutational analysis of the N-terminal DNA-binding domain ofsleeping beauty transposase: critical residues for DNA binding andhyperactivity in mammalian cells. Mol Cell Biol. 2004 Oct;24(20):9239-47.)。
(i)上記トランスポゾンは、Sleeping Beautyトランスポザーゼタンパク質により動作され、
(ii)左側のIR/DRは、左側の外側において配列番号1のヌクレオチド配列を含むDRモチーフを含み、左側の内側において配列番号2のヌクレオチド配列を含むDRモチーフを含み、
(iii)右側のIR/DRは、右側の外側において配列番号1のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含むDRモチーフを含み、右側の内側において配列番号2のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含むDRモチーフを含む。
表1:外側DR(米国特許第8227432号の配列番号3又は4に対する差異は太字で示され、新規の位置は、太字で且つ下線により示される。Y=C/T、W=A/T)
表2:内側DR(米国特許第8227432号の配列番号3又は4に対する差異は太字で示され、新規の位置は、太字で且つ下線により示される。Y=C/T、M=A/C、R=A/G、V=A/G/C(好ましくはC)、K=G/T(好ましくはG))
配列番号7 HDR GTKTA CAKACASD
K=G/T
S=C/G
D=A/T/G
表3:好ましいIR/DR配列
HDRを含むpT4の左側IR/DR:
配列番号8
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
HDRを含むpT5の左側IR/DR:
配列番号9
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
HDRを含まないpT4の右側IR/DR(右側IR/DRは所定の配列の逆相補鎖を含む):
配列番号10
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
HDRを含まないpT5の右側IR/DR(右側IR/DRは所定の配列の逆相補鎖を含む):
配列番号11
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
HDRを含むpT4の右側IR/DR(右側IR/DRは所定の配列の逆相補鎖を含む):
配列番号12
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
HDRを含むpT5の右側IR/DR(右側IR/DRは所定の配列の逆相補鎖を含む):
配列番号13
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
Y=C/T、好ましくは、Yは左側DRにおいてTであり、右側DRにおいてCである。
W=A/T、好ましくは、Wは左側DRにおいてAであり、右側DRにおいてTである。
V=A/G/C、好ましくは、VはCである。
K=G/T、好ましくは、KはGである。
S=C/G、
D=A/T/G。
最も好ましくは、Yは左側DRにおいてTであり、右側DRにおいてCであり、Wは左側DRにおいてAであり、右側DRにおいてTであり、VはCであり、SはCであり、DはGであり、KはGである。
(i)アデノウィ得うる、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス、バキュロウィルス、エプスタイン‐バールウィルス及びポックスウィルスベクターを含む群から選択されるウィルスベクター、又は
(ii)プラスミド、ミニサークル、pFARコンストラクト若しくはウィロソームを含む群から選択される非ウィルスベクター
からなる群から選択されるベクターであってもよい。
(i)本発明のポリヌクレオチドと、
(ii)(a)SBトランスポザーゼタンパク質、又は(b)SBトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸と、
(iii)(A)SSRP1及びSUPT16H/SPT16からなる群から選択されるFACT複合体の要素を欠失できる補助因子、
(B)F、H、L、S及びV(例えばE64D)を含む群から選択されるカテプシンの阻害剤、
(C)HSP90(HSPAA1)を欠失又は阻害できる補助因子、ゲルダナマイシン、ラジシコール又は17−N−アリルアミノ−17−デメトキシゲルダナマイシンを含む群から選択される阻害剤、
(D)細胞周期G0/G1、G1/S又はG2/Mで細胞を一時的に停止する因子、
(E)PCNA(増殖細胞核抗原)のユビキチン化を阻害する因子、並びに、
(F)ATR(毛細血管拡張性小脳失調症及びRad3関連タンパク質)の濃度及び/若しくはシグナリングを増大できる因子、
を含む群から選択される少なくとも1つの補助因子と、を含み、
上記補助因子は、小分子、siRNA及びmiRNA、又は、以下の特徴を有する細胞から選択される。
(AA)上記FACT複合体の要素、
(BB)上記カテプシン、及び/若しくは、
(CC)上記HSP90(HSPAA1)がノックダウンされている、
(DD)細胞周期がG0/G1、G1/S若しくはG2/Mで一時的に停止されている、
(EE)PCNAのユビキチン化が阻害されている、並びに/又は
(FF)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングが増大されている。
[結果]
(SBトランスポザーゼのPAIサブドメインは、主要な基質の接触を仲介する)
IR/DRのDRは、複合構造を有し、複合DNA結合ドメインにより認識される。SBトランスポザーゼのDNA結合ドメインは、PAXファミリーの転写因子への類似に基づいて、PAI及びREDと呼ばれる2つのへリックス−ターン−へリックス(HTH)モチーフからなる(Izsvak Z, et al., 2002J Biol Chem, 277: 34581-8.; Czerny T, et al.,1993. Genes Dev., 7: 2048-61.)。両方のサブドメインは、配列特異性DNA結合に関連し、PAIは、DRで示される二分のトランスポザーゼ結合サイトの3’部分に結合し、REDは5’部分に相互作用する(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8)。DNA結合に加えて、PAIはタンパク質−タンパク質相互作用干渉性を有することが以前に示されている(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)。特に、トランスポゾンの末端におけるDR(外側DR)は2bp長い(図1の14DR対12DR)ので、SBの4つのDRは同一でない。
RED又はPAIにより認識される配列は、12DRと14DRとで異なる(図3A)。特に、RED結合は、12DRと14DRとの2塩基対の差異でオーバーラップし(Izsvak Z, et al., 2002. Chem, 277: 34581-8.)(図3A)、REDがトランスポゾンの末端から離れて位置するDR(12DR)又は近くに位置するDR(14DR)を識別するのに関連し得ることを提案する。この仮定を試験するために、12DR及び14DRで示される二本鎖オリゴヌクレオチドについて、SBトランスポザーゼのPAI(1〜57aa)又はRED(58〜123aa)サブドメインを用いて、EMSAを行った。図3B(レーン3、5及び6)に示すように、PAIは両方のDRに同様に結合した(図3B、レーン2、7、8及び13)。これに対して、REDは12DRに対して明らかに好適であり(図3B、レーン3、5及び6)、14DR基質を用いた場合では顕著な結合は検出されなかった(図3B、レーン12)。従って、REDは、12DRと14DRとを明確に区別でき、それは、配列の変化又は長さの差異を認識することにより起こり得る。これらの可能性を区別するために、14DRと同一の長さを有するように2ヌクレオチドを埋めた12DR様オリゴヌクレオチドを用いてEMSAを繰り返した。12DRへの2ヌクレオチドの組み込みは、REDによる特異的DNA結合を無効にしたが、PAIによる左側の結合には影響が無かった(図3B、下部、レーン8)。これらの結果は、明らかに、REDが配列ではなく、長さによって内側DRと外側DRとを区別することを示す。上記データは、内側(12DR)と外側(14DR)とのトランスポザーゼ結合サイトの選択的認識が12DRと14DRとの長さの差異により導かれ、また、それはSBトランスポザーゼのREDサブドメインにより認識されるといった仮説を支持する。奇妙にも、REDは、この試験条件において逆向き反復配列の末端に配置された14DRを認識する。
PAI及びREDサブドメインは類似のサイズであるが(それぞれ57及び66アミノ酸)、それらの核タンパク質複合体は、EMSAにおいて異なる移動をする(図3B)。移動性に基づいて、PAIは、モノマーとして12DR及び14DRの両方に結合すると考えられる。これに対して、類似の条件を用いて、REDと12DRとの間に形成されたドミナント核タンパク質複合体はゆっくりと移動し、これは、REDの2つの分子を含む複合体に一致する(図3B、レーン3、5及び6)。特に、REDモノマーにより形成された複合体は、結合反応において(20倍以上)低減したタンパク質濃度が検出された。この結果は、REDが12DRに結合するのに容易にダイマーを形成することを提示し、PAIと同様に、REDは、タンパク質−DNA及びタンパク質−タンパク質相互作用に関連することを提示する。REDがタンパク質−タンパク質相互作用表面を有するか否かを試験するために、REDペプチドに化学的架橋を施した後にウェスタンブロットを行った。REDの二量体、四量体及びそれ以上の多量体構造に対応するバンドを、DNA基質の存在(図3C)又は非存在下(図示せず)で同定した。これらの結果は、PAIと同様に(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)、REDサブドメインがホモ二量体化できることを示す。要するに、PAI(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)及びREDサブドメインの両方は、タンパク質−タンパク質相互作用表面を有するが、PAIでなくREDのみが単一のDNA基質にあたり二量体を形成する。
結合サイトの親和性の変更は、SBトランスポゾンの転移の際に起こる要求されたアセンブリプロセスを促し得る。従って、12DR及び/又は14DRモチーフをCASTingで選択された高親和性結合サイトに置き換えて一連のトランスポゾンの型を構築し(図4A)、その種々のコンストラクトに対して転移アッセイを行った。驚くべきことに、高親和性CAST−5配列で野生型モチーフを置換すると、転移頻度は改善しなかった。それどころか、12DR又は14DRのいずれかをCAST−5モチーフに置換すると、それぞれ野生型の活性の65%及び3%の活性となった(図4A)。同様に、4つ全てのDRをCAST−5に変更すると、転移が負に影響し(2.2%)、いずれかのDR位置での増強されたDNA結合親和性はSB転移を抑制し得ることを提示する。代替的に、転移におけるCAST−5の負の影響は、少なくとも部分的に、PAI結合の好適な選択のための原因となり、REDの機能を抑制する。実際に、CAST配列は、内側と外側との位置を区別する能力を含んで(図2)、RED相互作用に準最適となると予想される。2つのシナリオを区別するために、我々は、CAST−5をPAIのみ置換し、他はDR野生型(wt)を維持したCAST−5/wtを生成した。再度、我々は、種々の組合せでの転移におけるハイブリッドモチーフの影響を試験した。高親和性のCAST−5/wtハイブリッドモチーフは、外側と、組み合わせられた内側/外側の位置とにおいて、転移に負の影響を与えた。しかしながら、内側の位置で12DRを置換した場合は、CAST−5/wtモチーフは明らかに転移を改善した(130%)(図4B)。
(SB10が関連する)転移における顕著な増強は、RNA干渉により生成された安定的ノックダウンHEK293T細胞のノックダウンで観察された(図5の左欄参照)。同様に、約50%の増強がSB100Xを用いて見られた(図5の右欄)。また、SUPT16Hのノックダウンは、転移の増大を引き起こし、対応するスクランブルRNAiは転移に顕著な影響を及ぼさなかった。SUPT16Hの欠失は、最も強い影響を引き起こす。
(プラスミドコンストラクト)
ヘキサヒスチジンタグが付けられたSB DNA結合ドメインのサブドメインとしてのPAI、RED及びN123のそれぞれを発現する原核生物ベクターpET−21a/N57、pET−21a/58−123及びpET−21a/N123は、以前に説明されている(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)。HeLa細胞におけるSBトランスポザーゼの発現のために、pCMV−SB10(Ivics et al., 1997, Cell 91:501-510)及びpCMV−SBD3(D3)、SBの触媒的変異体(E278D)が用いられた。インビボアッセイにおけるドナープラスミドとして以下のコンストラクトが用いられる:以前に記載されたpT/neo(Ivics et al., 1997, Cell 91:501-510)。
Hisタグ化PAI及びREDサブドメインの発現及び精製は、Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.に記載されているように行った。
12DR又は14DRに対応する二本鎖オリゴヌクレオチドを、[α−32P]dCTP及びKlenow断片を用いて末端標識した。左側IRを含むDNAプローブは、pT/neoのEcoRI断片であり、[α−32P]dATPで末端標識される。Klenow反応後、標識化されたDNAを製造者の説明書通りにMicroSpinG−25カラムで精製した。結合反応液は、総量10μl中に20mMのHEPES(pH7.5)、0.1mMのEDTA、1mMのDTTを含み、20000〜50000cpmの標識化DNAプローブ及び種々の濃度のタンパク質(図に記載)を加え、氷上で10分間、インキュベートした。3μlのローディングダイ(50%グリセロール及びブロモフェノールブルー含有)を加えた後に、サンプルを4%又は6%ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動をTris−グリシンバッファpH8.3で、25mA、2〜3時間行った。ゲルをBIO−RAD社のゲルドライヤーを用いて45分間乾燥させた。ゲルを一晩中曝露した後、FujifilmFLA−3000を用いてスキャンし、AIDAプログラムで分析した。
14DR:
S 5’−ACATACACTTAAGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTTGG−3’(配列番号79)
AS 5’−GACTCCAAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTGTATGT−3’(配列番号80)
12DR:
S 5’−ACATACATTAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGTTGG−3’(配列番号81)
AS 5’−GACTCCAACAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAATGTATGT−3’(配列番号82)
CAST−2 S 5’−acatacaccctggtgtatgtaaagatcggacggccggttgg−3’(配列番号34)
AS 5’−gactccaaccggccgtccgatctttacatacaccagggtgtatgt−3’(配列番号35)
CAST−5 S 5’−acatacaggcgcgtgtatgtacacttggggtcgtcacttgg−3’(配列番号36)
AS 5’−gactccaagtgacgaccccaagtgtacatacacgcgcctgtatgt−3’(配列番号37)
CAST−9 S 5’−acatacagcaccatgtacttaaatctctgacctgggcttgg−3’(配列番号38)
AS 5’−gactccaagcccaggtcagagatttaagtacatggtgctgtatgt−3’(配列番号39)
CAST−20 S 5’−acatacacgtaagtgtacatactgtgtacacaaagacttgg−3’(配列番号40)
AS 5’−gactccaagtctttgtgtacacagtatgtacacttacgtgtatgt−3’(配列番号41)
反応は、製造者の推奨に従って、ビス(スルホスクシンイミジル)基質(BS3、Pierce Biotechnology, USA)を用いて行った。タンパク質(3μM)を、最終体積が15μlの20mMのHEPES(pH7.5)、5mMのMgCl2、100mMのNaCl及び2.5mMのBS3において、氷上で2時間インキュベートした。最終濃度50mMのTris−HCl(pH7.5)を加え、室温で10分間インキュベートすることにより、反応を停止させた。その後、Laemliバッファ(125mMのTris−HCl(pH6.8)、5%のSDS、10%のβ−メルカプトエタノール、25%のグリセロール及びブロモフェノールブルー)を加え、サンプルを15%SDS−PAGEにロードし、ポリクローナル抗SB抗体(R&D Systems, USA)及び抗ヤギIgG(PierceBiotechnology, USA)を用いたウェスタンブロットによって分析した。
Wright, Binderet al. (1991) に記載された方法に基づいて、CASTingを行った。ランダムの35bp長のコアを含むオリゴヌクレオチドSB−DOL:5’−GCG GGA TCC ACT CCA GGC CGG ATG CT (N)35 CAC CAG GGT GTA AGG CGG ATC CCG C -3’(配列番号42)を合成し、コアに隣接する配列に相補的なプライマーを用いたPCR反応で二本鎖を作製した。0.15μgの精製Hisタグ化SBトランスポザーゼ(SBFl−6H)(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)と共に2μgの上記オリゴヌクレオチドを1時間インキュベートして形成された核タンパク質複合体を、Ni−NTAレジン(QIAGEN)を用いて回収した。結合されたオリゴヌクレオチドを広範な洗浄ステップにより濃縮した。選択されたオリゴヌクレオチドを抽出し、プライマーA:5’− GCG GGA TCC GCC TTA CAC CCT GGT G -3’(配列番号43)及びプライマーB:5’− GCG GGA TCC ACT CCA GGC CGG ATG CT -3’(配列番号44)により増幅し、その方法の特異性を増大するために追加のCASTingサイクルを行った。6度目のサイクルから得られたオリゴヌクレオチドを配列決定し、結合及び転移の試験を行った。
HeLa細胞を、10%ウシ胎児血清Gold(FCS Gold)(PAA, Germany)及び1%抗真菌性抗生物質(Invitrogen,Germany)を含むDMEM(GIBCO BRL, Germany)で増殖させた。トランスフェクションの1日前に細胞を6ウェルプレートに播種した。jetPEIRGDトランスフェクション試薬(Polyplus Transfection, France)を用いて、Qiagenで精製されたDNA (Qiaprep spin miniprep kit,Qiagen)を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの2日後に、細胞を除去(excision)アッセイのために回収し、1mg/mlのG418(Biochrom, Germany)を用いた選択のために、10cmプレートに播種した。選択の3週間後に、Ivics et al., Cell 1997に記載されたようにコロニーを染色し、カウントした。
Sleeping Beautyトランスポゾンのプラスミドからゲノムへの転移の際の除去効率を決定するために、我々は、pCMV(CAT)−GFP/T2neoと呼ばれるSleeping Beautyトランスポゾンベースのレポーターをクローニングした。詳細には、まず、CMVプロモーターにより制御されるGFPのオープンリーディングフレームを、pcDNA3.1ベクターにクローニングした。続いて、選択遺伝子neo(SV40により作動)を含むsleeping beautyトランスポゾンを、GFPのORFにおけるTAサイトにクローニングした。
変異されたSBトランスポゾン末端をPCR介在突然変異誘発により生成した。プライマー配列及びクローニング方法を表4に要約した。
表5に記載された標的マイクロRNAを用いてmiRNAコンストラクトを生成した。安定的ノックダウン細胞株を構築するために、Hek293T細胞に対して上記マイクロRNAコンストラクトを用いて形質導入した。
MPSV−LTR-Intron-truncatedhNGFR-WPRE-miRNA−LTR
骨髄増殖性腫瘍ウィルス(MPSV);マウスの長い末端反復(LTR);トランケート型ヒト神経成長因子受容体(NGFR);ウッドチャック肝炎ウィルス(WHP)転写後調節エレメント(wPRE);標的(ssrp1又はsupt16H)を含むマウスmiR155のコア配列のセンス及びアンチセンス配列。
表5:ノックダウンのためのmiRNA配列
表6:プライマー
DNA−PKcs及びATM活性の両方が有効なSB転移に必要であることが、以前から示されている(Izsvak et al., 2004, Mol Cell 13(2):279-90)。DNA−PKcs及びATMと同様に、ATRもホスファチジルイノシトール3キナーゼ様キナーゼ(PIKK)ファミリーに属し、チェックポイントシグナリング及び修復に関連する。ATRは、複製の際のDNA損傷により特異的に活性化される(Lupardus et al., 2002, Genes Dev 16(18):2327-32)。カフェインは、ATM、ATR及びmTOR(PIKKメンバー)の阻害剤であるが、DNA−PKCsは異なる(Sarkaria et al., 1999, Cancer Res. 59(17):4375-82)。本発明者らは、カフェイン処理下で(4mM)、標準転移アッセイを用いてSB転移を試験した。
Claims (16)
- 逆向き反復配列/直列反復配列(IR/DR)に左側及び右側に隣接されたカーゴ核酸を含むトランスポゾンを含むポリヌクレオチド又はその相補的ポリヌクレオチドであって、
(i)前記トランスポゾンは、Sleeping Beautyトランスポザーゼタンパク質によって移動可能であり、
(ii)前記左側のIR/DRは、配列番号1のヌクレオチド配列を含む外側の左側DRモチーフと、配列番号2のヌクレオチド配列を含む内側の左側DRモチーフとを含み、
(iii)前記右側のIR/DRは、配列番号1のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む外側の右側DRモチーフと、配列番号2のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む内側の右側DRモチーフとを含む、ポリヌクレオチド。 - 前記外側の左側DRモチーフは、配列番号3のヌクレオチド配列を含み、及び/又は前記外側の右側DRモチーフは、配列番号4のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記内側の左側DRモチーフは、配列番号5のヌクレオチド配列を含み、及び/又は前記内側の右側DRモチーフは、配列番号6のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記左側のIR/DRは、前記外側の左側DRモチーフと前記内側の左側DRモチーフとの間に、配列番号7のヌクレオチド配列を含むエンハンサーとして機能可能なHDR領域を含み、
任意に前記右側のIR/DRは、前記HDR領域の逆相補鎖を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記左側のIR/DRは、配列番号8及び配列番号9からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記右側のIR/DRは、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群から選択される逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記カーゴ核酸は、プロモーターに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含み、
前記オープンリーディングフレームは、好ましくはT細胞受容体コンストラクト又はその断片をコードする、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - (i)アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス、バキュロウィルス、エプスタイン−バールウィルス及びポックスウィルスベクターを含む群から選択されるウィルスベクター、又は、
(ii)プラスミド、ミニサークル、pFARベクター若しくはウィロソームを含む群から選択される非ウィルスベクター、
からなる群から選択されるベクターである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 核酸を転移するためのキットであって、
(i)請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、
(ii)(a)Sleeping Beautyトランスポザーゼタンパク質、又は(b)Sleeping Beautyトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸と、
(iii)任意に、
(A)SSRP1及びSUPT16H/SPT16からなる群から選択されるFACT複合体の要素を欠失できる補助因子、
(B)H、S、V及びLを含む群から選択されるカテプシン阻害剤、
(C)HSP90を欠失又は阻害できる補助因子、
(D)G0/G1、G1/S若しくはG2/Mの細胞周期で細胞を一時停止する因子、
(E)PCNAのユビキチン化を阻害する因子、
(F)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングを増大できる因子
の群から選択される少なくとも1つの補助因子、又は、
(AA)前記FACT複合体の要素がノックダウンされた、
(BB)前記カテプシンがノックダウンされた、
(CC)前記HSP90がノックダウンされた、
(DD)前記細胞周期がG0/G1、G1/S若しくはG2/Mで一時停止された、
(EE)PCNAのユビキチン化が阻害された、及び/又は、
(FF)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングが増大された、細胞と、を含み、
前記補助因子は、小分子、siRNA及びmiRNAを含む群から選択される、キット。 - 組換え核酸を生成する方法であって、
Sleeping Beautyトランスポザーゼの認識配列を含む標的核酸を請求項9に記載のキットの要素に接触することを含む、方法。 - トランスフェクト細胞を生成する方法であって、
請求項9に記載のキットの要素を前記細胞に導入することを含み、好ましくは細胞にエレクトロポレーションを行うことを含む、方法。 - 前記Sleeping Beautyトランスポザーゼは、活動亢進性トランスポザーゼSB100Xである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項9に記載のキット又は請求項10若しくは11に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む養子T細胞移植に適するT細胞である、宿主細胞。 - 請求項13に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
- 組換えポリペプチド、又はSleeping Beautyトランスポゾン等のトランスポゾンの転移による組換えポリペプチドを含む組換え細胞を調製するための、補助因子又は細胞の使用であって、
前記補助因子は、
(A)SSRP1及びSUPT16H/SPT16からなる群から選択されるFACT複合体の要素を欠失できる補助因子、
(B)H、S、V及びLを含む群から選択されるカテプシン阻害剤、
(C)HSP90を欠失又は阻害できる補助因子、
(D)G0/G1、G1/S若しくはG2/Mの細胞周期で細胞を一時停止する因子、
(E)PCNAのユビキチン化を阻害する因子、
(F)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングを増大できる因子、
の群から選択される少なくとも1つの補助因子であり、
前記補助因子は、好ましくはFACT複合体の要素を欠失できる補助因子であり、
前記補助因子は、小分子、抗体、siRNA及びmiRNAを含む群から選択され、
前記細胞は、
(AA)前記FACT複合体の要素がノックダウンされた、
(BB)前記カテプシンがノックダウンされた、
(CC)前記HSP90がノックダウンされた、
(DD)前記細胞周期がG0/G1、G1/S若しくはG2/Mで一時停止された、
(EE)PCNAのユビキチン化が阻害された、及び/又は、
(FF)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングが増大された、細胞であり、
前記トランスポゾンは、好ましくは請求項1〜8のいずれか1項にポリペプチドである、使用。 - 組換えポリヌクレオチド、又はSleeping Beautyトランスポゾン等のトランスポゾンの転移による組換えポリヌクレオチドを含む組換え細胞を生成するための方法であって、
(A)SSRP1及びSUPT16H/SPT16からなる群から選択されるFACT複合体の要素を欠失できる補助因子、
(B)H、S、V及びLを含む群から選択されるカテプシン阻害剤、
(C)HSP90を欠失又は阻害できる補助因子、
(D)G0/G1、G1/S若しくはG2/Mの細胞周期で細胞を一時停止する因子、
(E)PCNAのユビキチン化を阻害する因子、並びに、
(F)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングを増大できる因子、
からなる群から選択される補助因子を細胞に導入することと、
前記細胞内で転移を誘導することと、を含み、又は、
(AA)前記FACT複合体の要素がノックダウンされた、
(BB)前記カテプシンがノックダウンされた、
(CC)前記HSP90がノックダウンされた、
(DD)前記細胞周期がG0/G1、G1/S若しくはG2/Mで一時停止された、
(EE)PCNAのユビキチン化が阻害された、及び/又は、
(FF)ATRの濃度及び/若しくはシグナリングが増大された、細胞を誘導する又は該細胞内で転移を誘導すること、を含み、
前記トランスポゾンは、好ましくは、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドであり、
前記補助因子は、好ましくはFACT複合体の要素を欠失できる補助因子であり、
前記補助因子は、小分子、抗体、siRNA及びmiRNAを含む群から選択される、方法。
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