JP2023537158A - Ｋｒａｂ融合抑制因子並びに遺伝子発現を抑制する方法及び組成物 - Google Patents

Ｋｒａｂ融合抑制因子並びに遺伝子発現を抑制する方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

ＤＮＡターゲティングドメイン、好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質などの触媒不活性のＤＮＡターゲティングタンパク質、並びにＺＩＭ３－ＫＲＡＢ、ＺＩＭ２－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ５５４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ２６４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３２４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３５４Ａ－ＫＲＡＢ、ＺＦＰ８２－ＫＲＡＢ、及びＺＮＦ６６９－ＫＲＡＢからなる群から選択されるＫＲＡＢドメインを含む異種転写抑制因子。前記転写抑制因子をコード又は発現する発現コンストラクト、ベクター、及び細胞、並びに標的遺伝子の転写抑制のためのシステム及び方法、並びにその作製及び使用に用いられる組成物、キット及び試薬も本明細書で提供される。【選択図】図１

Description

関連するファミリーメンバー
これは、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年８月１４日出願の米国特許出願番号６３／０６５，９５３の優先権の利益を主張するＰＣＴ出願である。
配列表の組み込み
２０２１年８月１３日に作成した配列表「２２２３－Ｐ６１９４４ＰＣ００＿配列表」（５６，３２０バイト）のコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、転写抑制のための試薬及び方法、特に、標的化転写抑制のための転写抑制因子中の異種ＫＲＡＢドメインの使用に関する。
序論
クリュッペル（Ｋｒｕｐｐｅｌ）関連ボックス（ＫＲＡＢ）転写抑制ドメインに融合された触媒的に不活性なｄＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲｉとして知られる遺伝子スクリーニングツールとして広く採用されている［１～４］。ＣＲＩＳＰＲｉは、ＤＮＡ二本鎖切断の形成によって引き起こされるＣａｓ９の非特異的細胞毒性を欠いており、ノンコーディングＲＮＡをサイレンシングでき、遠位調節領域の発見を可能にする［１，５，６］。しかし、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲｉは、活性Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯ）に基づくノックアウトスクリーニングほど堅牢に機能しない。例えば、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯよりもｇＲＮＡ選択に対して感受性が高い［７］。さらに、ＣＲＩＳＰＲｉが機能する場合でも、遺伝子サイレンシングは部分的なものにすぎないことが多く、この方法の有用性を制限する［８］。これらの課題は、一方ではより効率的なｇＲＮＡライブラリーを設計すること［７，９］、他方ではｄＣａｓ９に融合された異なる抑制因子コンストラクトを試す［９～１１］ことにより部分的に取り組まれてきた。これらの手法は全て、強力な転写抑制因子であるＫＯＸ１（ＺＮＦ１０）由来の十分に特徴付けられたＫＲＡＢドメインを使用する［１０］。最近、より優れた抑制因子の体系的な探索により、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインに融合されたメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）からなる２部の抑制因子が得られた。ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２－ｄＣａｓ９抑制因子は、複数のアッセイでＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９を上回った［８］。
細胞、組織、及び生物での遺伝子発現の精密に制御される調節は、組織工学、細胞ベースの治療、及び遺伝子治療における主要な課題の１つである。細胞における遺伝子発現の制御は、トランスフェクション若しくはウイルス形質導入によりｃＤＮＡを外から導入することにより、又は配列特異的な転写調節因子を導入することにより達成される。これらの調節因子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｔｅｔ－抑制因子及びその変異体、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又は遺伝子発現を抑制するための転写抑制ドメインに融合された酵素的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。内因性遺伝子座の調節は、それがより大きなｃＤＮＡによるウイルス力価の劇的な減少を回避し、かつ組織特異的な様式で遺伝子発現のサイレンシングを可能にするため、特に魅力的な選択肢である。
現在、わずか数個のエフェクタードメインが転写抑制に使用されている。ＣＲＩＳＰＲ阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）に最も一般的に使用されるドメインは、ＺＮＦ１０タンパク質のクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインであるが、最近、ＺＮＦ１０ ＫＲＡＢをメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）と共に使用する二部システムが、複数の遺伝子のサイレンシングにおいてより効果的であることが示された。ＣＲＩＳＰＲｉは広く使用されているが、２つの主要な制限がある。第一に、ほとんどのｇＲＮＡは効率的に機能せず、そのため機能的なものを特定するために多数のｇＲＮＡを広範囲に試験する必要がある。これは、例えばゲノムワイドＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにおける主な制限である。第２の問題は、ｇＲＮＡが機能しても、転写抑制の程度が最適ではない可能性があることである。つまり、ＫＲＡＢ融合は遺伝子発現を部分的にしかサイレンスしない。
本発明者らは、遺伝子のプロモーター又は３’ＵＴＲに繋留された場合に、現在利用可能なシステムよりも遺伝子発現のより完全な抑制をもたらすタンパク質ドメインを同定した。本発明者らは、ＳＶ４０プロモーターによって促進されるＥＧＦＰレポーターをサイレンスする能力について、酵素的に不活性なｄＣａｓ９に融合された５７の異なるＫＲＡＢ（クルッペル関連ボックス）ドメインを試験した。これらのＫＲＡＢドメインは、本質的に抑制なし～ほぼ完全な抑制の幅広い抑制能力を示した（図５）。特に、ＫＯＸ１からのＫＲＡＢドメインは、レポーターをそれほど強力に抑制しなかった。これは重要なことであり、理由は、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢが、ヒト細胞内で遺伝子発現を調節するために全てのＣＲＩＳＰＲｉベースのプラットフォームで現在使用されており、かつＣＲＩＳＰＲｉの幅広い採用がその予測不可能性によって妨げられてきたからである。例えば、ＣＲＩＳＰＲｉに使用される多くのｇＲＮＡは機能せず、それらが機能する場合、それらは転写を部分的にしか抑制しないことがよくある。したがって、多くの研究所はより強力なプラットフォームを開発しようとした。最新のものであるｄＣａｓ９－ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２［８］は、２つの抑制因子ドメインをタンデムに使用するため、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインよりも良好に機能する。しかし、本明細書に記載されるように、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインを含む他のＫＲＡＢドメインは、複数の異なる遺伝子座においてこのプラットフォームよりも優れている（図６）。そのため、本明細書に記載のプラットフォームは、既存のシステムよりも翻訳の堅牢な抑制を容易にする。このシステムが非常に有用であるいくつかのアプリケーションは、遺伝子発現に重要な調節エレメントを同定するためのＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング；ノンコーディング転写物のＣＲＩＳＰＲｉサイレンシング；複数の遺伝子を同時に抑制するための大きな染色体ドメインのサイレンシング、を含むがこれらに限定されない。これは、例えば、ヒトの疾患に関与する微小重複をサイレンシングするのに有利であろう。さらに、ＫＲＡＢドメインはわずか約２００ｂｐ長であるため、それは、例えばＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２融合体と比較して、例えばアデノウイルスベクターのパッケージングをより効率的に促進する。
本明細書に記載のこのシステムは、ｄＣａｓ９に限定されないが、選択されたＺｎＦ ＤＮＡ結合ドメイン、ｔｅｔ－抑制因子、又はＴＡＬＥを含む操作されたジンクフィンガーのような他の遺伝子抑制因子標的化システムに結合できる。ＴＡＬＥ－ＫＲＡＢベースの転写抑制因子ベクターは、Ｚｈａｎｇら，２０１５［２２］に記載されているように複数の遺伝子標的をノックダウンするために、かつ真核生物プロモーターのテトラサイクリン可逆サイレンシング［２３］のために使用されてきた。
したがって、ある態様は、
ＤＮＡターゲティングドメイン、任意選択でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、好ましくは酵素的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９タンパク質、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔ－抑制因子又はＴＡＬＥ；
並びにＺＩＭ３－ＫＲＡＢ、ＺＩＭ２－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ５５４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ２６４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３２４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３５４Ａ－ＫＲＡＢ、ＺＦＰ８２－ＫＲＡＢ、及びＺＮＦ６６９－ＫＲＡＢからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＢドメイン
を含む異種転写抑制因子である。
別の態様は、転写抑制因子をコードする単離核酸、又は上記核酸を含む発現コンストラクト、ベクター若しくは細胞である。
ある態様は、１以上のプロモーター及び／又は１以上の転写終結部位に作用可能に連結された本明細書に記載の核酸を含む発現コンストラクトを含む。
ある態様は、本明細書に記載の核酸又は発現コンストラクトを含むベクターを含み、任意選択でベクターは、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
ある態様は、本明細書に記載の転写抑制因子、核酸、発現コンストラクト、又はベクターを含む細胞を含む。
さらなる態様は、
ＤＮＡターゲティングドメインがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、本明細書に記載の異種転写抑制因子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載の発現コンストラクト、本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載の細胞、かつ
少なくとも１つのｇＲＮＡ及び／又は誘導剤
を含む転写抑制システムを含む。
ある態様は、細胞中で標的遺伝子の転写を抑制する方法を含み、方法は、ａ）本明細書に記載の転写抑制因子、核酸、発現コンストラクト、又はベクターを細胞中に導入すること；かつｂ）少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが標的遺伝子の転写を抑制するような適切な条件下で細胞を培養すること、を含む。
ある態様は、スクリーニング法を含み、方法は、ａ）ＤＮＡターゲティングドメインがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、本明細書に記載の転写抑制因子、１以上の核酸、１以上の発現コンストラクト、又は１以上のベクター；及び複数のｇＲＮＡを複数の細胞中に導入すること；又はＤＮＡターゲティングドメインがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、本明細書に記載の細胞の集団中に複数のｇＲＮＡを導入すること；ｂ）１以上のｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と会合するように複数の細胞を培養すること、および少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが標的遺伝子の転写を抑制するように転写抑制因子をＣＲＩＳＰＲ標的部位に導くこと；ｃ）任意選択で、ある量の試験薬又は毒素で処理すること；ｄ）任意選択で、ｇＲＮＡのドロップアウト若しくは濃縮を可能にするために一定期間複数の細胞を培養すること；かつｅ）複数の細胞若しくはそのサブセットを収集すること、を含む。
ある態様は、本明細書に記載の転写抑制因子、核酸、発現コンストラクト、ベクター、又は細胞を含む組成物を含む。
ある態様は、バイアル及び本明細書に記載の異種転写抑制因子、核酸、発現コンストラクト、ベクター、細胞、又は組成物、及び任意選択で、誘導剤、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ発現コンストラクトの１以上を含むキットを含む。
前節は、例としてのみ提供され、本開示及び添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本開示の組成物及び方法と関連付けられるさらなる目的及び利点は、本発明の特許請求の範囲、明細書、及び実施例に照らして当業者によって理解されよう。例えば、本開示の様々な態様及び実施形態は、多数の組み合わせで利用でき、それらの全ては本明細書によって明示的に企図される。これらの追加の利点、目的及び実施形態は、本開示の範囲に明示的に含まれる。本開示の背景を明らかにするために、及び特定の場合に、実施を尊重する追加の詳細を提供するために、本明細書で使用される刊行物及び他の資料は、参照により組み込まれ、便宜上、添付の参考文献の節に列挙される。
本開示のさらなる目的、特徴及び利点は、本開示の例示的な実施形態を示す添付の図と併せて読むべき以下の詳細な説明から明らかになる。
図１ａ～ｈは、非常に強力なＫＲＡＢドメインの同定を示す。ａ、ＫＲＡＢドメイン活性のアッセイで使用される２つのレポーターの概略図。ベン図は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、又はその両方の細胞株内でアッセイされたＫＲＡＢドメインの数を示す。ｂ、ｇＲＮＡを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞株を、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合コンストラクトで感染させ、ＥＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーで２１日後に分析した。ＣＲＩＳＰＲｉの現在の実行で使用されるＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９及びＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２－ｄＣａｓ９が強調表示される。ｃ、Ｋ５６２レポーター細胞におけるサイレンシングの結果。アッセイを、ｄＣａｓ９コンストラクトがＤｓＲｅｄ（ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＤｓＲｅｄ）も発現したことを除いて、ｂと同様に実施した。ＥＧＦＰ蛍光を、ｂ及びｃにおいて、ｇＲＮＡのみを発現するレポーター細胞に対して正規化する。ｄ、ＫＲＡＢドメインの抑制活性と、全長ＫＲＡＢジンクフィンガータンパク質を用いたアフィニティー精製－質量分析によって回収されたＴＲＩＭ２８ペプチドの数の相関（参考文献９のデータ）。ｅ、ＫＲＡＢドメインの抑制活性と、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＬＵＭＩＥＲアッセイにより測定されたＴＲＩＭ２８とのそれらの相互作用の相関。相互作用強度は、陰性対照ベイト（ＥＧＦＰ）に対する倍数変化として示される。示される値は、２つの生物学的反復の平均である。スピアマン相関を、ｄ及びｅにおいて多重仮説補正なしでｌｏｇ１０変換されたデータから計算した。ｆ、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ及びＫＯＸ１ ＫＲＡＢは、ＡＢＡベースの二量体化システムによりＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーターにリクルートされた。ｇ、ＥＧＦＰサイレンシングを、１００μＭ ＡＢＡで細胞を処理することにより誘導した。９日後、ＡＢＡを洗い流すか、又は処理をさらに１１日間継続した。ＥＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーにより測定し、Ｎａｎｏｌｕｃ－ＰＹＬ１を発現するレポーター細胞に対して正規化した。示される値は、２つの生物学的反復の平均である。エラーバーは標準偏差を示す。ｈ、ＥＧＦＰサイレンシングを、１００μＭ ＡＢＡでＫＲＡＢ－ＰＹＬ１及びＡＢＩ１－ｄＣａｓ９を発現するＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター細胞を処理することにより誘導した。ＡＢＡ処理の４０日後、ＡＢＡを中止し、ＥＧＦＰ発現をさらに４８日間フローサイトメトリーで追跡した。ＥＧＦＰ蛍光を、同様にレポーターにリクルートされたホタルルシフェラーゼ－ｄＣａｓ９融合体の蛍光に対して正規化した。示される値は、単一の生物学的複製からのものである。 図２ａ～ｅは、ＣＲＩＳＰＲｉアプリケーションにおけるＺＩＭ３ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合体のベンチマークを示す。ａ、ｄＣａｓ９融合体を、単一のｇＲＮＡでＥＲＫ１及びＳＥＬ１Ｌプロモーターに７日間リクルートし、メッセンジャーＲＮＡ発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。発現レベルを、ｇＲＮＡを発現しないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の発現レベルに正規化する。複数の仮説に対するボンフェローニ補正を使用する両側スチューデントのｔ検定を用いて、統計的有意性を評価した。ｎ、３つの独立したレンチウイルス感染。ｂ、示されるｄＣａｓ９融合体を、ＣＤ８１プロモーターにリクルートし、ＣＤ８１表面発現を、感染の７日後にフローサイトメトリーにより測定した。ｃ、ｄＣａｓ９融合体を、５つの異なるｇＲＮＡを用いて、又はプールとしてＨＢＥＧＦにリクルートした。７日後、ＤＴＡに対する細胞株の感受性を、段階希釈により測定した。点線は、ＨＢＥＧＦノックアウト細胞（上）又はｇＲＮＡを有しない細胞の感受性を示す。右パネル、半最大増殖阻害（ＧＩ５０）曲線を、ｇＲＮＡ２について計算した。データを、平均±ｓ．ｄ．（ｎ、各濃度について３つの処理されたウェル）として提示する。ＧＩ５０値を、「対数（阻害剤）対応答（３つのパラメータ）」非線形フィット（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｆｉｔ）を用いるグラフパッドプリズムで計算した。ｄ、ｄＣａｓ９融合体を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ゲノムワイドなＤｏｌｃｅｔｔｏセットＡ ｇＲＮＡライブラリーを感染させ、ｇＲＮＡ発現を、培養物中で２１日後に測定した。ＲＯＣ曲線を、ゴールドスタンダードの必須の及び必須でない遺伝子を標的とするｇＲＮＡの欠乏に基づき計算した。平均ｇＲＮＡ欠乏を、遺伝子レベルの測定基準に使用した。ｅ、ＡＵＲＯＣを、ガイド又は遺伝子レベルで各スクリーニングについて計算した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実施された以前のスクリーニングと発明者らの結果を直接比較するために、両方のスクリーニングにより標的とされた遺伝子のサブセットのみを分析した。 図３は、Ａ）ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合体の発現及び抑制活性を示す。発現を、ウエスタンブロッティングにより測定した；Ｂ）ＫＲＡＢサイレンシング活性と、全長ＫＲＡＢドメインタンパク質のアフィニティー精製によって回収されたＴＲＩＭ２８ペプチドの相関（ＢｉｏＰｌｅｘ／Ｈｕｔｔｌｉｎら ２０１８及びＩｍｂｅａｕｌｔら ２０１９からのデータ）；及びＣ）示されるｄＣａｓ９融合体を、２つの内因性プロモーターにリクルートし、遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｋ５６２及びＡ３７５細胞におけるＴＲＩＭ２８の発現レベル。 図４Ａ～Ｃは、転写を抑制するためにゲノム遺伝子座にＫＲＡＢドメインを繋留することを示す。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合体を、転写を抑制するために、プロモーター（Ａ）、遠位調節部位（Ｂ）、又は潜在的な遠位非調節部位（Ｃ）に繋留できる。遠位非調節部位の場合、ＫＲＡＢドメインは、隣接する領域に広がるヘテロクロマチンの形成を誘導できる。 図５は、ＫＲＡＢが、一連の転写抑制活性を呈することを示す。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合体を、ＥＧＦＰの発現を促進するＳＶ４０プロモーターにリクルートした。蛍光を、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ融合体の感染後２１日目に測定した。破線は、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）に融合されたｄＣａｓ９によって誘導される抑制を示す。 図６は、ＺＩＭ３のＫＲＡＢドメインに融合されたｄＣａｓ９が、ＫＯＸ１単独のＫＲＡＢドメインに融合されたｄＣａｓ９よりも、又はＫＯＸ１ ＫＲＡＢ及びＭｅＣＰ２に融合されたｄＣａｓ９よりも遺伝子発現のサイレンシングにおいてより有効であることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＥＲＫ１、ＳＥＬ１Ｌ、ＢＬＭ、及びＭＥＴプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９融合体を感染させた。 ７Ａ～Ｃは、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインが、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢよりも効率的にＥＧＦＰレポーターの３’ＵＴＲからの転写を抑制することを示す。Ａ）ＫＲＡＢドメインを、アブシジン酸ベースの近接誘導システムを用いてｄＣａｓ９にリクルートした。Ｂ）Ｋ５６２細胞中のＡＡＶＳ１遺伝子座中のレポーター遺伝子。Ｃ）１００μＭのアブシジン酸で５日間又は１４日間細胞を処理した後（又は未処理のまま）の細胞のＥＧＦＰ蛍光。 図８は、ＳＶ４０プロモーターを標的とする示されるｄＣａｓ９融合体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター細胞株のＲＮＡ－ｓｅｑ分析を示す。差次的に発現された転写物（絶対ｌｏｇ２倍数変化＞０．５及びＦＤＲ＜０．０５）を、実線の円として示す。 図９Ａ～Ｃは、一連のグラフ及びイムノブロットである。Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞株におけるＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合体の有効性と、Ｋ５６２レポーター細胞株におけるＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合体の有効性の相関。相関を、ｌｏｇ１０変換値を用いて計算した。Ｂ、異なるＫＯＸ１ ＫＲＡＢ及びＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインコンストラクトの比較。示されるＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合体を、Ａ３７５細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＣＤ８１プロモーター（左）又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター（右）にリクルートし、ＥＧＦＰ蛍光を、フローサイトメトリーで測定した。ＫＯＸ１（１～７５）ｐＬＸ３１１は、以前のＣＲＩＳＰＲｉ研究で使用されたレンチウイルスコンストラクトである。コンストラクトラベルの数字は、融合体に含まれるＫＯＸ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２１５０６－１）及びＺＩＭ３（Ｑ９６ＰＥ６－１）のアミノ酸を指す。Ｃ、ｄＣａｓ９融合タンパク質の発現レベルを、Ｃａｓ９特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングによりアッセイした。
以下は、当業者が本開示を実施するのを支援するために提供される詳細な説明である。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の説明で使用される用語は、単なる特定の実施形態を説明するためのものであり、本開示を制限することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、図及び他の参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定されない限り、以下のそれらに帰される意味を有し得る。しかし、当業者によって知られる又は理解される他の意味も可能であり、本開示の範囲内であることを理解されたい。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用する用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「プライマー」は、２以上の共有結合で連結されたヌクレオチドを意味する。文脈が特に明らかに示さない限り、この用語は一般に、一本鎖（ｓｓ）又は二本鎖（ｄｓ）であり得るデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない。例えば、本開示の核酸分子又はポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には二本鎖又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成され得る。加えて、核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成され得る。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は一般に、長さが最大で２００塩基対の核酸を指し、一本鎖又は二本鎖であり得る。本明細書で提供される配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であり得るが、文脈が特に明確に示さない限り、提供される配列はＤＮＡとＲＮＡの両方、並びに相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列を包含することを理解されたい。例えば、配列５’－ＧＡＡＴＣＣ－３’は、５’－ＧＡＡＵＣＣ－３’、５’－ＧＧＡＴＴＣ－３’、及び５’ＧＧＡＵＵＣ－３’を含むと理解される。
本明細書で使用する用語「機能的変異体」は、本明細書に開示されるポリペプチド分子と実質的に同じ機能を実質的に同じように遂行する本明細書に開示されるポリペプチド配列の改変を含む。例えば、機能的変異体は、本明細書に記載のポリペプチドの活性断片、例えば、転写抑制活性及び／又は補助抑制因子（例えば、ＴＲＩＭ２８）相互作用を保持するＮ末端及び／又はＣ末端切断を含み得る。機能的変異体は、１以上の置換アミノ酸を有し、かつ／又は非修飾配列と少なくとも最小の配列同一性を保持する変異体を含み得る。例えば、機能的変異体は、１０個のアミノ酸毎に最大１、２、３個の又はそれより多いアミノ酸の置換を含み得る。例えば、機能的変異体は、本明細書に開示される配列と少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み得る。機能的変異体はまた、本明細書に開示される配列の保存的置換されたアミノ酸配列を含み得る。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。置換アミノ酸変異体の例は、保存的アミノ酸置換である。転写抑制活性及び／又は補助抑制因子相互作用を保持する活性断片などの機能的変異体は、例えば、本明細書に記載の方法を用いて同定できる。
本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質の所望の性質を消失させることなく、あるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置き換える置換である。適切な保存的アミノ酸置換は、類似の疎水性、極性、及びＲ鎖長を有するアミノ酸を互いに置換することによって行うことができる。保存的置換の例は、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別の非極性（疎水性）残基への置換、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリンとの間などのある極性（親水性）残基の別の極性（親水性）残基への置換、リジン、アルギニン又はヒスチジンなどの１つの塩基性残基の別の塩基性残基への置換、又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などのある酸性残基の別の酸性残基への置換を含む。語句「保存的置換」はまた、そのようなポリペプチドが必要な活性を示すことを条件に、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基又は非天然アミノ酸の使用を含む。
本明細書で使用する用語「異種転写抑制因子」又は「本明細書に記載の転写抑制因子」は、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢ、ＺＩＭ２－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ５５４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ２６４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３２４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３５４Ａ－ＫＲＡＢ、ＺＦＰ８２－ＫＲＡＢ、及びＺＮＦ６６９－ＫＲＡＢ並びにそれらの機能的変異体から選択されるＫＲＡＢドメイン、並びにＤＮＡターゲティングドメインを含む二量体などの操作された融合タンパク質又は操作された多量体を意味する。
転写抑制因子は、ＫＲＡＢドメイン及び／又はＤＮＡターゲティングドメイン及び／又は標的ＤＮＡの間の機能的相互作用を提供する、相互作用システムの１以上の相互作用構成要素をさらに含み得る。用語「相互作用構成要素」は、本明細書で、相互作用システムの１以上の構成要素を包含するために使用され、これらは共に上記機能的相互作用を提供する。本明細書で使用する用語「相互作用システム」は、共有結合相互作用若しくは非共有結合相互作用、及び／又は構成的相互作用若しくは誘導可能な相互作用を可能にする相互作用構成要素を包含することを意図する。そのような相互作用システムは、例えばペプチドリンカー、任意選択でプロテアーゼ感受性ペプチドリンカー；相互作用ドメインなどの１以上の二量体、三量体、又は高次多量体化構成要素、任意選択で誘導可能な二量体、三量体、又は多量体化構成要素、任意選択で誘導可能な相互作用ドメイン；及び／又は転写抑制因子の細胞内局在を調節できる１以上の構成要素を含み得る。相互作用システムは、１以上の構成要素を含んでよい。
ＤＮＡ標的化ドメイン及びＫＲＡＢドメインは、例えば単一ポリペプチドのドメインとして共有結合で連結されてよく（例えば融合タンパク質）、又は例えば、特定の条件下で相互作用する相互作用ドメインなどの相互作用構成要素によって（例えば二量体として）連結されてもよい。したがって、異種転写抑制因子は、単一のポリペプチドを含んでよく、又はＤＮＡターゲティングドメインを含む第１のポリペプチドと二量体相互作用ドメインなどの第１の相互作用構成要素、及びＫＲＡＢドメインを含む第２のポリペプチドと二量体相互作用ドメインなどの第２の相互作用構成要素を含んでよく、第１及び第２の二量体相互作用ドメインは、例えばある条件下で相互作用できる。ＳｕｎＴａｇシステム（Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら，２０１４）などの高次多量体化システムも、本明細書で企図される。
ＫＲＡＢドメイン及び／又はＤＮＡターゲティングドメイン及び／又は標的ＤＮＡの間の相互作用は、様々な誘導相互作用システムを用いて制御できる。例えば、ＫＲＡＢドメインとＤＮＡターゲティングドメインは、グラゾプレビルなどのＮＳ３阻害剤の存在下で安定化される自己切断ＮＳ３プロテアーゼドメインなどのプロテアーゼ感受性リンカーによって連結されてよい。別の例では、核へのＤＮＡターゲティングドメイン及び／又はＫＲＡＢドメインの局在化は、局在化ドメインなどの相互作用構成要素によって制御でき、例として、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン変異体を用いるタモキシフェンにより調節される核局在が挙げられる。さらなる例では、ＤＮＡターゲティングドメインが、第１の相互作用ドメインなどの第１の相互作用構成要素に連結されてよく、かつＫＲＡＢドメインが、第２の相互作用ドメインなどの第２の相互作用構成要素に連結されてよく、それにより第１と第２の相互作用ドメインが相互作用する。
本明細書で使用する用語「相互作用ドメイン」は、第２のポリペプチド内の配列モチーフ（例えば第２の二量体相互作用ドメイン）を含む結合パートナーと相互作用できる第１のポリペプチド内の配列モチーフ（例えば第１の二量体相互作用ドメイン）を意味する。特に、この用語は、例えば適切な誘導条件下で二量体化するヘテロ二量体対を共に形成する、第１又は第２の相互作用二量体ドメインを包含すると意図される。他の相互作用ドメインは、具体的に企図され、所望の特性に応じて当業者により同定できる。適切な誘導相互作用ドメイン対は、限定されないが、例えばラパマイシン又ＡＰ２１９６７で誘導できる、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合）；例えばアブシジン酸で誘導できる、ＰＹＬ／ＡＢＩ；ジベレリン又はジベレリン酸で誘導できる、ＧＩＤ１／ＧＡＩ；並びに例えば青色光及び／又は温度により誘導できる、ｐＭａｇ／ｎＭａｇを含む。
ＤＮＡターゲティングドメインは、任意の適切なＤＮＡターゲティングドメインであり得る。好ましくは、ＤＮＡターゲティングドメインは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、任意選択でｄＣａｓ９、カスタムＤＮＡ結合特異性を有するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ｔｅｔ－抑制因子及びその変異体、又は転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などの酵素不活性の配列特異的ＤＮＡターゲティングタンパク質である。酵素的に活性なＣａｓ９もまた、それが抑制をもたらす場合、例えばガイドが切り詰められたガイドである場合に使用できる（例えば［２４］参照）。
本明細書で使用する用語「ＫＲＡＢドメイン」又はクリュッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインは、多くのクリュッペル型Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）に見出される、約７５個のアミノ酸のポリペプチドドメイン及びその活性断片などのその変異体、又は文脈に応じて、上記ドメインをコードする核酸を指す。本明細書に記載の抑制因子において、活性断片は、約６０個のアミノ酸であり得る。例えば、ＺＩＭ３の場合、それは、ＺＩＭ３のアミノ酸８～６９（配列番号３）に対応するＶＴＦＥＤＶＴＶＮＦＴＱＧＥＷＱＲＬＮＰＥＱＲＮＬＹＲＤＶＭＬＥＮＹＳＮＬＶＳＶＧＱＧＥＴＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＱＧＫＥＰＷＬ（配列番号２）であり得る。例えば、活性断片は、アミノ酸４～７６であり得る。活性断片の例は、本明細書、例えば図９に開示される。他のＫＲＡＢドメインの活性断片は、任意の適切なアラインメント法、例えば、ＳＭＡＲＴコンセンサスアラインメントによって同定できる。
異種転写抑制因子は、ＫＲＡＢ Ｎ末端又はＣ末端融合体であり得、例えば、融合体の順序は、ＫＲＡＢドメイン－ＤＮＡターゲティングドメイン又はＤＮＡターゲティングドメイン－ＫＲＡＢドメインであり得る（例えば［２５］、［２６］、［２７］及び［２８］参照）。ＫＲＡＢドメインは、リンカーによってＤＮＡターゲティングドメインに融合できる。例えば、グリシン及びグリシンセリンリンカーが使用できる。実施例に記載の転写抑制因子は、ＫＲＡＢドメインがｄＣａｓ９のＣ末端に融合された場合Ｇｌｙ４リンカーを用い、ＫＲＡＢドメインがｄＣａｓ９のＮ末端に融合された場合Ｇｌｙ３ＳｅｒＧｌｙ３Ｓｅｒを用いた。他のリンカーももまた、使用できる。
本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」又は「Ｃａｓ」は、ＲＮＡを結合し、かつそれが結合するＲＮＡにより特異的ＤＮＡ配列に標的化される、ＣＲＩＳＰＲクラスター化され規則的に間隔を置かれた短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ－ＣＲＩＳＰＲ）関連（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）タンパク質を指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、クラスＩＩモノマーＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９などのＩＩ型Ｃａｓである。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ菌、Ａ．ナエスルンディ（Ａ．Ｎａｅｓｕｌｎｄｉｉ）、黄色ブドウ球菌又は髄膜炎菌由来のＣａｓ９であり得る。任意選択でＣａｓ９は、化膿連鎖球菌由来である。Ｃａｓタンパク質はまた、例えばアシダミノコッカス属、ラクノスピラ科細菌、又はフランシセラ・ツラレンシスからのＣａｓ１２ａ（例えば、ｄＣａｓ１２ａ）であり得（これらはｄＣａｓ変異体として働くことが示されている）、ＣａｓΦ（Ｃａｓ１２ｊ）及びＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）も使用され得る。
本明細書で使用する用語「ｄＣａｓ９」は、酵素的に不活性な（又は死んだ）Ｃａｓ９を指し、これは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を欠くが、標的ＤＮＡ結合活性を保持する。例えば、ｄＣａｓ９は、ＣＡＳ９の配列ならびにＲｕｖＣ１及びＨＮＨヌクレアーゼドメイン中のＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ変異を含む。任意選択で、ｄＣａｓ９は、配列番号１によってコードされるタンパク質と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ変異を含み、Ｃａｓ９標的ＤＮＡ結合活性を保持する（例えばｇＲＮＡと標的部位を結合する）タンパク質である。同様にｄＣａｓ１２ａは、酵素的に不活性なＣａｓ１２ａを指す。
本明細書で使用する用語「ガイドＲＮＡ」、「ガイド」、又は「ｇＲＮＡ」は、特異的ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつ最小限にスペーサー配列を含む、操作されたＲＮＡ分子を指す。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を結合するタンパク質結合セグメントをさらに含んでよい。特異的ＤＮＡ配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡの部分は、本明細書では核酸標的配列、又はスペーサー配列と呼ばれる。ガイドのタンパク質結合セグメントは、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ及び／又はダイレクトリピートを含み得る。用語「ガイド」又は「ガイドＲＮＡ」は、文脈に応じて、スペーサー配列のみ、又はスペーサー配列とタンパク質結合セグメントを含むＲＮＡ分子を指し得る。ガイドＲＮＡは、対応するＤＮＡ配列により表されてよい。ガイドは、切り詰め型ガイドであってよく、例えば、酵素がＣａｓ９である場合［２４］に記載されるように、標的部位に相補性のある１５以下のヌクレオチドを含む。例えば、Ｃａｓ９が切り詰められたガイドと相互作用すると、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合能力はそのまま残るが、その核酸分解活性は除去される。Ｃａｓ結合能を維持する任意の長さのガイドを使用できる。
本明細書で使用する用語「スペーサー」又は「スペーサー配列」は、標的配列又はその一部とＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖を形成する、又は形成できるガイドの部分を指す。スペーサー配列は、特異的ＣＲＩＳＰＲ標的配列に相補的であるか又は対応し得る。スペーサー配列のヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ標的配列を決定し、所望のＣＲＩＳＰＲ標的部位を標的とするように設計又は構成され得る。
本明細書で使用する用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、例えば、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と相互作用し、かつガイドＲＮＡに連結されるか、又はその一部を形成し得る「トランスコード化ｃｒＲＮＡ」を指す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば化膿連鎖球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば５’－ｇｔｔｔｃａｇａｇｃｔａｔｇｃｔｇｇａａａｃａｇｃａｔａｇｃａａｇｔｔｇａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号１１）の配列を有し得る。他のｔｒａｃｒＲＮＡも使用されてよい。例えば５’－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ－３’（配列番号１２）又は５’－ＧＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴ－３’（配列番号１３）を含む適切なｔｒａｃｒＲＮＡは、当業者により同定できる。
本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ標的部位」又は「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的部位」は、活性化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えばガイドＲＮＡに結合されたｄＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質）が適切な条件下で結合する核酸を意味する。ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）及びＣＲＩＳＰＲ標的配列（すなわち、活性化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が結合されるガイドのスペーサー配列に対応する）を含む。ＣＲＩＳＰＲ標的配列に対するＰＡＭの配列及び相対位置は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のタイプに依存する。例えば、Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９のＣＲＩＳＰＲ標的部位は、５’から３’に１５～２５、１６～２４、１７～２３、１８～２２、又は１９～２１ヌクレオチドを含み得、任意選択で２０ヌクレオチドの標的配列、それに続く配列ＮＧＧを有する３ヌクレオチドＰＡＭを含み得る。したがって、Ｃａｓ９標的部位は、配列５’－Ｎ１ＮＧＧ－３’を有し得、ここでＮ１は、１５～２５、１６～２４、１７～２３、１８～２２、又は１９～２１ヌクレオチド長、任意選択で２０ヌクレオチド長、又は１５と２５を含む１５～２５の間の任意の整数である。
ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、任意の適切なゲノム遺伝子座に存在し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、プロモーター、エンハンサー、３’ＵＴＲ、又は他の調節エレメントの中、遺伝子、任意選択でイントロン又はエクソン中に、非コードＲＮＡに対応する遺伝子座に、又は遺伝子間領域に存在してよい。
細胞の核に位置する標的ＤＮＡは、核に入ることができる転写抑制因子を必要とする。したがって、転写抑制因子は、核局在化し得、かつ／又は例えば、１以上の核局在シグナル（ＮＬＳ）、任意選択で１以上のＳＶ４０ ＮＬＳを含み得る。任意選択で、転写抑制因子は、１以上のＮＬＳを含む。任意選択で、転写抑制因子は、１以上のＮ末端ＮＬＳ、１以上のＣ末端ＮＬＳ、又は１以上のＮ末端と１以上のＣ末端ＮＬＳを含み得る。他の配置が、具体的に企図される。
転写抑制因子はまた、タグで標識されてよい。例えば、適切なタグは、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｖ５、ＡＬＦＡ、Ｔ７、６ｘＨｉｓ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｓ－ｔａｇ、ＡｖｉＴａｇ、ＳｔｒｅｐＴａｇ ＩＩ、ＣＢＰ、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙを含むが、これらに限定されない。例えば、実施例に記載されるように、かつ配列番号１７に示されるように、異種転写抑制因子は、ｍＣｈｅｒｒｙなどの標識を含んでよい。標識は、Ｎ末端で、Ｃ末端で、又はＤＮＡターゲティングドメインとＫＲＡＢドメインの間などの異種転写抑制因子の２つの構成要素の間に融合されてよい。
値の範囲が提供される場合、各介在値は、その範囲の上限と下限の間、及び任意の他の記載された値とその記載された範囲中の介在する値の間で、文脈が特に明確に指示しない限り下限の単位の十分の一まで、本明細書内に包含されることが理解される。任意の下限～任意の上限の範囲が、企図される。より小さな範囲に独立して含まれ得るこれらのより小さな範囲の上限及び下限もまた、所定の範囲で具体的に除外される限度に従いに、本明細書内に包含される。所定の範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか両方を除外する範囲もまた、本明細書に含まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その」は、文脈が特に明確に指示しない限り、複数形の言及を含むことに留意しなければならない。
本明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲内の全ての数値は、「約」又は「およそ」の示される値により修飾され、当業者によって予想される実験誤差及び変動を考慮に入れる。
本明細書で使用する語句「及び／又は」は、本明細書及び特許請求の範囲において、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合される要素の「１以上」と解釈されるべきである。他の要素は、具体的に特定されるそれらの要素に関連するか否かに関わらず、「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外に任意選択で存在し得る。
本明細書及び特許請求の範囲で使用する「又は」は、上で定義される「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分ける場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的である、つまり、多数の又はリストの要素の、少なくとも１つの含有だけでなく、２以上の要素、かつ任意選択で追加の列挙されていない項目も含めると解釈されるものとする。「の１つのみ」又は「正確に１つの」、又は特許請求の範囲で使用される場合の「からなる」などの、反対に明確に示される用語のみが、多数の又はリストの要素の正確に１つの要素の含有を指す。一般に、本明細書で使用する用語「又は」は、「いずれか」、「の１つ」、「の１つのみ」、又は「の正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的な代替物（すなわち、「一方又は他方、しかし両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。
特許請求の範囲において、並びに上記本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「で構成される」などの全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、を含むがこれらに限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」及び「本質的にからなる」のみが、それぞれクローズド又はセミクローズド移行句であるものとする。
本明細書及び特許請求の範囲で使用する語句「少なくとも１つ」は、１以上の要素のリストに関して、要素のリスト中の要素の任意の１以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙される各要素及び全ての要素の少なくとも１つを含むわけではなく、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除するものでもない。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するか否かにかかわらず、任意選択で存在し得ることを可能にする。
本明細書で使用する用語「約」は、言及がなされている数のプラス又はマイナス１０％～１５％、５～１０％、又は任意選択で約５％を意味する。
２以上の工程又は行為を含む本明細書に記載のある方法において、方法の工程又は行為の順序は、文脈が特に指示しない限り、方法の工程又は行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。
本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の材料及び方法もまた、本開示の実施又は試験において使用できるが、以下の材料及び方法をここで説明する。
ＩＩ．材料と方法
酵素的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びＫＲＡＢドメインなどのＤＮＡターゲティングドメインを使用する異種転写抑制因子及び転写抑制のためのシステムが、本明細書に記載される。実施例において実証されるように、ｄＣａｓ９又はｄＣａｓ１２ａと、ＺＩＭ３、ＺＮＦ５５４、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ３２４、ＺＮＦ３５４Ａ、ＺＦＰ８２、及びＺＮＦ６６９からなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＢドメインとを含む融合タンパク質並びにそれらの変異体は、転写抑制においてより大きな効力を有し、ＴＲＩＭ２８とより強く相互作用し、ｇＲＮＡ選択に対する感受性が低く、かつ／又は既存のＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９ベースの転写抑制因子よりも標的位置に対する感受性が低い。さらに実施例で実証されるように、これらの融合タンパク質は、ハイスループットスクリーニング、例えば必須遺伝子の細胞生存率スクリーニングを行うために使用できる。また実施例で実証されるように、ｄＣａｓ９－ＡＢＩ１融合タンパク質及びＺＩＭ３ ＫＲＡＢ－ＰＹＬ１融合タンパク質を含む誘導性転写抑制因子は、アブシジン酸の存在下で転写抑制を誘導できる。
ｄＣａｓ配列は、配列ｆに基づいてよい。
したがって、本開示の一態様は、ＤＮＡターゲティングドメイン、好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質などの酵素的に不活性な配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ又はＫＯＸ１ ＫＲＡＢ ＭｅＣＰ２よりも強いＫＲＡＢ／ＴＲＩＭ２８相互作用を示すＫＲＡＢタンパク質、任意選択でＺＩＭ３－ＫＲＡＢ、ＺＩＭ２－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ５５４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ２６４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３２４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３５４Ａ－ＫＲＡＢ、ＺＦＰ８２－ＫＲＡＢ、及びＺＮＦ６６９－ＫＲＡＢからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＢドメインとを含む異種転写抑制因子を含む。
ＤＮＡターゲティングドメイン及びＫＲＡＢドメインは、例えば単一ポリペプチドのドメインとして、共有結合で連結されるか、又は相互作用ドメインなどの１以上の相互作用構成要素によって連結されかつ／又はある条件下で相互作用する別々のポリペプチドであり得る。したがって、一実施形態において、転写抑制因子は、単一ポリペプチドである。別の実施形態において、転写抑制因子は、一対の（すなわち第１及び第２の）相互作用ドメイン、任意選択で二量体相互作用ドメイン、任意選択で適切な条件下で二量体化する一対の誘導性二量体相互作用ドメインをさらに含む。例えば、転写抑制因子は、ＤＮＡターゲティングドメインと第１の二量体相互作用ドメイン、任意選択で誘導性二量体化ドメインを含む第１のポリペプチド、及びＫＲＡＢドメインと第２の二量体相互作用ドメイン、任意選択で誘導性二量体化ドメインを含む第２のポリペプチドを含み得、任意選択で第１の誘導性二量体化ドメインと第２の誘導性二量体化ドメインは、１以上の誘導剤の存在下で相互作用する。
実施例で示されるように、ＡＢＩ１とＰＹＬ１を含む異種転写抑制因子の二量体化は、アブシジン酸の添加により誘導され得る。したがって、実施形態において、転写抑制因子は、誘導剤の存在下で誘導可能な転写抑制を提供する第１及び第２の誘導性二量体化ドメインを含む。当業者は、共に使用され得る適切な誘導性二量体化ドメインを容易に同定し選択できる。任意の適切な誘導性二量体化ドメインを用いてよく、例えば、ＡＢＩ１とＰＹＬ１の二量体化は、アブシジン酸の添加により誘導され得る。他の誘導システムは、ラパマイシン、ジベレリン酸／ジベレリンによる誘導に基づくシステム、及び分割ｄＣａｓ９ベースのシステムを含む。例えば、ＧＩＤ１とＧＡＩの二量体化はジベレリンにより誘導でき、ＦＫＢＰとＦＲＢの二量体化はラパマイシン又はその類似体、例えばラパログで誘導できる。ＳｕｎＴａｇシステム（Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら、２０１４）などの高次多量体化システムもまた、本明細書で企図される。
ＤＮＡターゲティングドメインとＫＲＡＢドメインの間の相互作用は、他の誘導システムを用いて制御されてもよい。他のシステム（二量体化に依存しない）は、グラゾプレビル誘導性安定化（Ｔａｇｕｅら ２０１８）又はエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン変異体を用いるタモキシフェン調節性核局在化を含む。グラゾプレビル誘導性安定化の場合、ＤＮＡターゲティングドメインとＫＲＡＢドメインは、自己切断ＮＳ３プロテアーゼドメインによって連結される。グラゾプレビル（ＮＳ３活性を阻害する）の存在下でのみ、ＤＮＡターゲティングドメインとＫＲＡＢドメインは一緒にとどまり、遺伝子発現を調節する。
一実施形態において、少なくとも１つのＫＲＡＢドメインは、２以上のＫＲＡＢドメイン、任意選択で２以上のタンデムＫＲＡＢドメイン、任意選択で２以上の同じ又は２以上の異なるＫＲＡＢドメインを含む。ＫＲＡＢドメインは例えば、図１ｂ及び／又はｃで実証されるように、ＨＥＫ２９３及び／又はＫ５６２細胞においてより大きな抑制因子データを実証するＫＲＡＢドメインであり得る。適切なＫＲＡＢドメインは、配列番号２～１０及び１８に示したＫＲＡＢドメイン、又はその機能的変異体を含む。実施形態において、少なくとも１つのＫＲＡＢドメインは、配列番号２～１０及び１８におけるＫＲＡＢドメインのいずれか１つ、例えば登録番号Ｑ９６ＰＥ６－１（ＵｎｉＰｒｏｔ）に関連するＫＲＡＢドメインと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有し、かつそれは、例えば上記ＫＲＡＢドメイン（例えば、配列番号２～１０若しくは１８又は例えば、登録番号Ｑ９６ＰＥ６－１に関連するＫＲＡＢドメイン）又は例えば、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ ＭｅＣＰ２のように転写抑制活性及び／又はＴＲＩＭ２８との相互作用を保持する（例えば、それと同程度に有効である）。ある実施形態において、少なくとも１つのＫＲＡＢドメインは、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインであり、任意選択で登録番号Ｑ９６ＰＥ６－１（ＵｎｉＰｒｏｔ）又は配列番号２（又は配列番号３のＫＲＡＢドメイン）と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有するアミノ酸を有し、かつそれは、例えば上記ＫＲＡＢドメイン（例えば、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメイン）若しくは例えばＫＯＸ１ ＫＲＡＢ ＭｅＣＰ２と同程度に転写抑制活性及び／又はＴＲＩＭ２８との相互作用において有効である（例えば、保持する）。
本明細書で使用する同程度に有効は、野生型ＫＲＡＢドメイン（すなわち、非変異型ＫＲＡＢ）と比較して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の転写抑制活性及び／又は補助抑制因子相互作用を保持することを意味する。切り詰めなどの変異体の転写抑制因子活性及び／又は補助抑制因子相互作用は、例えば本明細書に記載の方法を用いて決定できる。例えば転写抑制因子活性は、実施例に記載のＥＧＦＰレポーターシステム（複数可）を用いて決定できる。変異体は、各ＤＮＡ結合部分（例えばｄＣａｓ９）の発現レベルを制御しながら、同じレポーター又は内因性コンテキストに繋留できる。親ＫＲＡＢと比較した場合にレポーター又は標的遺伝子の誘導発現で検出される差異は、変異体の効果に寄与する可能性がある。共抑制因子相互作用は、例えば実施例で示されるように、アフィニティー精製質量分析（ＡＰ－ＭＳ）により決定できる。
ＺＩＭ３のＫＲＡＢドメインは、ＺＩＭ３の６２ａａ（ａａ８～６９）である。いくつかのＫＲＡＢドメインは、より長い。
一実施形態において、少なくとも１つのＫＲＡＢドメインは、ヒトＫＲＡＢドメインである。別の実施形態において、ＫＲＡＢドメインは、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５又は少なくとも７０個のアミノ酸を含む。別の実施形態において、ＫＲＡＢドメインは、１以上の変異を含む。
一実施形態において、少なくとも１つのＫＲＡＢドメインは、任意選択でタンデムの、２つ又は３つのＫＲＡＢドメインである。
ＤＮＡターゲティングドメインは、様々なＤＮＡターゲティングドメインから選択できる。例えば、ＤＮＡターゲティングドメインは、操作された又は天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１２又は他のＣａｓファミリータンパク質、又は真核生物若しくは原核生物由来の他の天然のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）（例えば、フォークヘッド、塩基性ヘリックスループヘリックス、ロイシンジッパー、ホメオドメイン、核ホルモン受容体）から選択できる。カスタムＺＦ、ＴＡＬＥ又はＣａｓファミリータンパク質の場合には、ＫＲＡＢドメインは、制御される様式でゲノム中の単一遺伝子座にもたらされてよい。天然のＤＮＡ結合ドメインの場合には、ＫＲＡＢドメインは、所定の転写因子が結合する全ての遺伝子座にもたらされ、それによって内因性ＴＦの機能を増強／置換する。
ある実施形態において、酵素的に不活性な配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ｄＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。酵素的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡを保持し、ＤＮＡ結合活性を標的とする。例えば、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａの変異は、ＲｕｖＣ１及びＨＮＨヌクレアーゼドメインに変異を導入し、不活性化をもたらす。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９であり、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ又は対応する変異を含み、ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡ結合活性を保持する。本開示の範囲内の他の酵素的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、当業者により同定できる。
例示的な異種転写抑制因子核酸は、配列番号１４、１６及び１７で提供される。ある実施形態において、異種転写抑制因子は、上記核酸によってコードされるアミノ酸配列、又は配列番号１４、１６又は１７のＤＮＡターゲティングドメイン及びＫＲＡＢドメイン部分によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。このようなポリペプチドのコードされるポリペプチド（融合体又は発現され及び活性化された場合）の活性は、例えば配列番号１４、１６又は１７と同じくらい有効である（例えば、同じくらい有効な転写抑制を提供する）。
ある実施形態において、転写抑制因子は、誘導剤の存在下で誘導される転写抑制を提供する第１及び第２の相互作用構成要素（例えば、誘導タンパク質二量体化ドメイン）を含む。当業者は、一緒に使用され得る誘導性二量体化ドメインなどの適切な相互作用構成要素を容易に特定し選択できる。タンパク質二量体化ドメインと誘導剤の任意の適切な誘導の組み合わせを用いてよく、例えばＡＢＩ１とＰＹＬ１の二量体化を、アブシジン酸の添加により誘導してよい。他の誘導システムは、ラパマイシン、ジベレリン酸／ジベレリンによる誘導に基づくシステム、及び分割ｄＣａｓ９ベースのシステムを含む。例えばＧＩＤ１とＧＡＩの二量体化は、ジベレリンによって誘導でき、ＦＫＢＰとＦＲＢの二量体化は、ラパマイシン又はその類似体、例えばラパログで誘導できる。他の誘導剤は、オーキシン処理がＴＩＲ１ロイシンリッチリピート領域（ＬＲＲ）とオーキシン誘導デグロン（ＡＩＤ）配列の相互作用をもたらすオーキシンベースの二量体化を誘導するオーキシン、又はＥＲ ＬＢＤがタモキシフェンでの処理まで細胞質中にコンストラクトを保持する、受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）融合体に対するタモキシフェン及び関連分子エストロゲン、を含み得る。
ある実施形態において、ＫＲＡＢドメインは、リンカーを介してＤＮＡターゲティングドメインに融合される。ある実施形態において、２以上のＫＲＡＢドメインは、１以上のリンカーを介して共に融合される。例えば、グリシン及びグリシンセリンリンカーを使用できる。実施例に記載の転写抑制因子は、ＫＲＡＢドメインがｄＣａｓ９のＣ末端に融合される場合Ｇｌｙ４リンカーを用い、ＫＲＡＢドメインがｄＣａｓ９のＮ末端に融合される場合Ｇｌｙ３ＳｅｒＧｌｙ３Ｓｅｒを用いた。他のリンカーも使用できる。
ある実施形態において、転写抑制因子は、１以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。任意の適切なＮＬＳを使用できる。任意選択で、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳである。１以上のＮＬＳは、１以上のＮ末端ＮＬＳ、１以上のＣ末端ＮＬＳ、１以上の内部ＮＬＳ、及び／又はそれらの組み合わせであり得る。
本明細書に記載のように、転写抑制因子は、核酸によってコードされ、かつ／又は発現コンストラクトから発現され得る。したがって、本開示の一態様は、本明細書に記載の転写抑制因子をコードする核酸である。例えば、核酸は、配列番号１４、１６又は１７のいずれか１つの核酸、配列番号１４、１６又は１７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する配列であり得、異種転写抑制因子は、例えば本明細書に記載のアッセイで評価した場合、例えば配列番号１４、１６又は１７とほぼ同じくらい効果的に、例えば、少なくとも８０％効果的に、少なくとも８５％効果的に、又は少なくとも９０％効果的に転写を抑制する。配列同一性は、例えばＤＮＡターゲティングドメイン及びＫＲＡＢドメインに対してである。他の部分、リンカー、ＮＬＳなどは、完全に異なり得る。
ある関連する態様は、プロモーター及び転写終結部位に作用可能に連結される転写抑制因子をコードする核酸を含む発現コンストラクトである。任意の適切なプロモーターが使用され得る。適切なプロモーターは、当業者により特定でき、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１Ａ、又はＰＧＫを含み得る。例えば、配列番号１５のプロモーター及びエンハンサー配列を発現コンストラクトに用いることができる。誘導プロモーターも使用してよい。
一実施形態において、コンストラクトは、ベクターである。任意の適切なベクターを使用してよい。適切なベクターは、当業者により特定でき、ウイルスベクター、任意選択でレンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターを含み得る。ベクターはまた、自己複製ウイルスＲＮＡレプリコン又はプラスミドであり得る。
適切なベクターは、例えば、目的の核酸（例えば、ｇＲＮＡ又は抑制因子又はその構成要素）を発現するためのプロモーター、ｐｏｌｙＡテール、発現の安定性を増大させるためのＷＰＲＥのような３’ＵＴＲエレメント、インシュレーター配列、レンチウイルスパッケージングシグナル、及び／又は抗生物質耐性マーカーを含み得る。プロモーターなどの構成要素は、真核生物プロモーターである。核酸は、プロモーター配列、任意選択で真核生物プロモーター配列、及び他のエレメントに作用可能に連結できる。さらなる適切な構成要素は、当業者により特定できる。
別の実施形態において、転写抑制因子、核酸、コンストラクト、又はベクターは、細胞中にある。任意の適切な細胞を用いてよく、所望の適用に基づいて当業者により決定できる。細胞は、任意の生物、任意選択で哺乳動物由来であり得る。任意選択で細胞は、ヒト細胞又はげっ歯類細胞などの哺乳動物細胞であり、任意選択でマウス細胞である。任意選択で、細胞は、細胞株である。細胞株は、任意の適切な細胞株であってよい。細胞は、初代細胞であり得る。ある実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態において、細胞は、疾患細胞であり、任意選択で癌細胞である。さらに別の実施形態において、細胞は、幹細胞であり、任意選択で人工多能性幹細胞である。
転写抑制因子、核酸、コンストラクト、又はベクターは、任意の適切な方法で、例えばトランスフェクションによって細胞中に導入され得る。適切なトランスフェクション試薬及び方法は、当技術分野で日常的に実施されており、当業者により特定できる。任意選択で、コンストラクトは、ウイルスベクター、任意選択でレンチウイルスベクターであり、形質導入によって細胞内に導入される。適切な形質導入法は、当技術分野で日常的に実施されており、当業者により特定できる。
いくつかの実施形態において、細胞は、異種転写抑制因子を安定に発現し、任意選択で細胞は、安定に形質導入され、例えば異種転写抑制因子をコードする核酸を含むウイルスを用いて調製される。
別の態様は、本明細書に記載の転写抑制因子、転写抑制因子をコードする核酸、又は上記核酸を含むコンストラクト若しくはベクター又は転写抑制因子を発現する細胞を含む転写抑制システムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓに基づくシステムの場合、システムは、少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。誘導性二量体化ドメインに基づくシステムの場合、システムは、任意選択で少なくとも１つの誘導剤を含む。
本明細書に記載の異種転写抑制因子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のコンストラクト、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の細胞及び／又は本明細書に記載の転写抑制システムを含む組成物も、提供される。組成物は、ＢＳＡなどの担体、又は組成物成分に応じて適切な希釈剤、任意選択で水又は緩衝生理食塩水を含んでよい。組成物は、転写抑制因子、同じ又は異なるエレメントを含む核酸、コンストラクト、ベクター又は細胞などの複数の構成要素を含んでよい。
本明細書でまた提供されるのは、例えば標的遺伝子の転写を抑制するための又は本明細書に記載の方法を実行するためのキットであり、キットは、本明細書に記載の転写抑制因子、本明細書に記載の転写抑制因子をコードする核酸、発現コンストラクト、若しくはベクター、又は本明細書に記載の転写抑制因子を発現する細胞、及び任意選択で転写抑制因子、核酸、発現コンストラクト、ベクター、細胞若しくは組成物を収容するバイアルを含む。キットは、前述の構成要素の１以上の複数を含み得る。任意選択で、キットは、ｇＲＮＡ発現コンストラクト（例えば、プロモーター配列に作用可能に連結されたｇＲＮＡをコードする核酸、任意選択で真核生物プロモーター配列）、誘導剤、及び／又は本明細書に記載の方法を実行するための説明書を含む。
細胞における標的遺伝子の転写を抑制する方法も本明細書に記載される。実施例で実証されるように、本開示の転写抑制因子は、細胞内の標的遺伝子の転写を抑制するプロモーターなどのゲノム遺伝子座に標的化され得る。
本明細書に記載されるように、転写調節のための別のレベルの制御を、例えばラパログ又はアブシジン酸による化学的に誘導される二量体化と共に加えることができる。この場合、一方の半分（例えば、ＤＮＡ結合部分）は、ＦＫＢＰ又はＰＹＬ１に融合され、残りの半分（例えば、ＫＲＡＢドメイン）は、ＦＲＢ又はＡＢＩ１に融合される。ラパログ又はアブシジン酸による処理は、それぞれ、ＦＫＢＰとＦＲＢ又はＰＹＬ１とＡＢＩ１の間の相互作用を誘導し、一時的に調節された遺伝子発現をもたらす。実施例に示すように、ＡＢＩ１とＰＹＬ１を含む異種転写抑制因子の二量体化は、アブシジン酸の添加により誘導され得る。当業者は、一緒に使用され得る適切な誘導性二量体化ドメイン及び誘導剤を容易に特定し選択できる。タンパク質二量体化ドメインと誘導剤の任意の適切な誘導の組み合わせを用いてもよく、例えばＡＢＩ１とＰＹＬ１の二量体化は、アブシジン酸の添加により誘導され得る。他の誘導システムは、ラパマイシン、ジベレリン酸／ジベレリンによる誘導に基づくシステム、及び分割ｄＣａｓ９ベースのシステムを含む。例えば、ＧＩＤ１とＧＡＩの二量体化は、ジベレリンによって誘導でき、ＦＫＢＰとＦＲＢの二量体化は、ラパマイシン又はその類似体、例えばラパログで誘導できる。ＳｕｎＴａｇシステム（Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら、２０１４）などの高次多量体化システムもまた、本明細書で企図される。
ＤＮＡターゲティングドメインとＫＲＡＢドメインの間の相互作用は、他の誘導システムを用いて制御されてもよい。他のシステム（二量体化に依存しない）は、グラゾプレビル誘導性安定化（Ｔａｇｕｅら ２０１８）又はエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン変異体を用いるタモキシフェン調節性核局在化を含む。グラゾプレビル誘導性安定化の場合、ＤＮＡターゲティングドメインとＫＲＡＢドメインは、自己切断ＮＳ３プロテアーゼドメインによって連結される。グラゾプレビル（ＮＳ３活性を阻害する）の存在下でのみ、ＤＮＡ結合ドメインとＫＲＡＢドメインは一緒にとどまり、遺伝子発現を調節する。
したがって、本開示の一態様は、細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法であり、方法は、本明細書に記載の転写抑制因子を細胞中に導入すること、及びＤＮＡターゲティングドメインが転写抑制因子を標的部位に導きかつ少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが標的遺伝子の転写を抑制するように適切な条件下で細胞を培養することを含む。転写抑制因子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを含む、ある実施形態において、本方法は、細胞内の所望のゲノム遺伝子座を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを細胞中に導入すること、及び少なくとも１つのｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と会合しかつＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をガイドして、少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが標的遺伝子の転写を抑制するように転写抑制因子をＣＲＩＳＰＲ標的部位にガイドするように、適切な条件下で細胞を培養することをさらに含む。転写抑制因子がＤＮＡターゲティングドメインの各々に及びＫＲＡＢドメイン中に誘導性二量体化ドメインを含む実施形態において、本方法は、少なくとも１つの誘導剤を細胞に導入すること、及び少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが標的遺伝子の転写を抑制するように、第１と第２の誘導性二量体化ドメインが会合する適切な条件下で細胞を培養することをさらに含む。ある実施形態において、細胞は対象中にある。したがって、ある実施形態において、本方法は、動物モデルにおける標的遺伝子の発現を抑制するためである。例えば、本方法は、マウス又は他のげっ歯類モデルにおいて、及びヒトなどの哺乳動物において、エキソビボ又はインビボ適用において使用できる。例えば、システムは、ＣＡＲ－Ｔ回路で、又はＡＡＶ若しくは脂質ナノ粒子ベースの送達後の遺伝子発現の制御において使用できる。
本明細書に記載の方法を用いて、細胞生存率又は目的の表現型にとって重要である１以上のゲノム遺伝子座を特定又はスクリーニングできる。例として、本明細書に記載の方法を用いて、ジフテリア毒素などの目的の毒素に対する耐性又は感受性に重要である遺伝子又はその調節エレメントをスクリーニングできる。別の例では、本明細書に記載の方法を用いて、ＣＤ８１などの目的のタンパク質の発現に重要である調節エレメントを特定できる。さらなる例では、本明細書に記載の方法を、ある条件下、例えば経時的な薬物処理下で、細胞集団で過剰に又は過小に現れるｇＲＮＡをスクリーニングすることにより細胞型中で必須の又は必須でない遺伝子に対するハイスループットスクリーニング方法において使用できる。それらは、ＫＲＡＢドメインベースの抑制に応答する（又は応答しない）調節エレメントを特定するために、又は癌細胞の増殖に必須の調節エレメントを特定するために用いられてよい。他の適用は、当業者により決定できる。
上の開示は、本出願を一般的に説明する。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単なる例示を目的として記載されており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。形式の変更及び同等物の置換は、状況が示唆するか又は都合よくさせる可能性があるので企図される。本明細書では特定の用語が使用されるが、そのような用語は、説明の意味で意図されており、限定を目的とするものではない。
以下の非限定的な例は、本開示の例示である。
ＩＩＩ．実施例
実施例１．非常に強力なＫＲＡＢドメインの同定
ヒトゲノムは、３５０を超えるＫＲＡＢドメインタンパク質をコードする［１１～１３］。ＫＲＡＢドメインは、ｄＣａｓ９に融合された場合、遺伝子発現をサイレンスするそれらの能力において異なると仮定された。５７個のヒトＫＲＡＢドメインを、ｄＣａｓ９のＮ末端に個々に融合し、２つの異なるゲノム統合レポーターコンストラクトのいずれかにリクルートされた場合の活性についてアッセイした。一方で、それらは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でＥＧＦＰ発現を促進するＳＶ４０プロモーターにリクルートされ［１４］、他方では、Ｋ５６２細胞中でＰＧＫ１－ＥＧＦＰ－ｐＡレポーターのポリアデニル化部位の下流にある７ｘＴｅｔＯアレイに繋留された［１５］（図１ａ）。ＫＲＡＢドメインは、ほぼ完全なサイレンシング～まったく変化しないにわたる、著しく異なる効果を有した（図１ｂ、ｃ及び図５）。この違いは、ｄＣａｓ９融合体の発現レベルにより説明されなかった（図３）。さらに、結果は、２つのレポーター間で一致しており（Ｒｓｑ＝０．５９；図１Ａ）、効果が細胞型特異的でなかったことを示した（図９参照）。ＫＲＡＢはまた、ｄＣａｓ９のＣ末端に融合され、同様の結果をもたらした（実施例５及び図３参照）。
興味深いことに、ＫＯＸ１からのＫＲＡＢドメインは、ＺＩＭ３遺伝子からのものなどの他のいくつかのＫＲＡＢドメインと比較して特に強力な抑制因子ではなかった（図１ｂ、ｃ及び図５）。ＫＯＸ１ ＫＲＡＢのみよりも強力であったＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２融合体（図１ｂ、ｃ及び図５）でさえ、レポーターを完全にサイレンスできなかった。次いで、以前に報告されたレンチウイルスＫＯＸ１－ｄＣａｓ９コンストラクト［９，１６］をアッセイすることにより、結果がベクター設計によるものではないと判断された（図１Ｂ及び図９）。以前に報告されたコンストラクトの効力のわずかな改善は、注釈付きＫＲＡＢドメインへのＮ末端における追加の９つのアミノ酸の存在による可能性があった。ベクター設計においてＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインに隣接配列を追加すると、その活性はわずかに改善したが、それは、多くの他のＫＲＡＢドメインよりも明らかに弱いままであった。
ＫＲＡＢドメインは、ヘテロクロマチン誘導タンパク質複合体の足場として作用するＴＲＩＭ２８／ＫＡＰ１と相互作用することによってサイレンシングを誘導する［１７］。しかし、全てのＫＲＡＢドメインタンパク質がＴＲＩＭ２８と相互作用するわけではない［１０，１５］。ＴＲＩＭ２８結合とサイレンシングの関係を評価するために、ＫＲＡＢ活性を、全長ＫＲＡＢドメインタンパク質を用いて３つの独立したアフィニティー精製／質量分析データセットで回収したＴＲＩＭ２８ペプチドの数と比較した［１０，１５，１６］。いずれの場合も、ＫＲＡＢ／ＴＲＩＭ２８相互作用の強さとレポーターアッセイにおける抑制の程度の間に有意な正の相関があった（図１ｄ及び図３）。４９のＫＲＡＢ－ＥＧＦＰ融合体とＴＲＩＭ２８の相互作用を次いで、ペアワイズ定量的相互作用アッセイであるＬＵＭＩＥＲを用いてプロファイルした［１４］。再び、有意な正の相関があった（それぞれ、Ｋ５６２とＨＥＫ２９３ＴについてＲｓｑ＝０．４６と０．２５；図１ｅ）。そのため、ＴＲＩＭ２８との相互作用強度は、ＫＲＡＢドメインのサイレンシング活性の主要な決定要因であるように思われる。興味深いことに、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２融合体は、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢのみよりもＴＲＩＭ２８とより強く相互作用し（図１ｅ）、ＣＲＩＳＰＲｉにおけるＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２融合体の効力の向上は、ＴＲＩＭ２８相互作用の増強によるものである可能性があることを示唆した。
方法は、実施例４に記載されるとおりである。
実施例２－時間的動態の特性評価
ＫＲＡＢドメイン活性における差は、それらの固有の効力により又はそれらの別々の時間的動態によりのいずれかで説明され得る。これらの選択肢を区別するために、化学的に誘導される二量体化システムを使用した。植物タンパク質ＡＢＩ１とＰＹＬ１の相互作用は、アブシジン酸（ＡＢＡ）によって可逆的に誘導される（図１ｆ）。ＳＶ４０プロモーター上の２つの部位を標的とするＡＢＩ１－ｄＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現するクローンＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター細胞株を、作製した。これらの細胞を次いで、ＰＹＬ１に融合されたＺＩＭ３又はＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインのいずれかに感染させ、ＡＢＡで２０日間処理した（図１ｇ、実線）。ＺＩＭ３とＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインの両方は、同様の動態で抑制を誘導したが、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢは、より低い発現レベルにもかかわらず、より高いレベルの抑制に達した（図１ｇ、図２ｃ、及び図９）。ＡＢＡを９日後にやめた場合、抑制解除が、両方のＫＲＡＢドメインで同様の動態で起こった（図１ｇ、破線）。そのため、ＫＲＡＢドメインの効力における違いは、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ誘導性抑制のより遅い動態によるものではない。しかし、４０日のサイレンシングとそれに続くＡＢＡ除去後に、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＰＹＬ１発現細胞は、ＥＧＦＰ発現をほぼ完全に回復したが、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ－ＰＹＬ１発現細胞では、ＥＧＦＰ発現は元のレベルの１０％にしか達しなかった（図１ｈ）。これらの結果は、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢの長期リクルートは発現の永続的なサイレンシングを誘導でき、一方でＫＯＸ１ ＫＲＡＢは主に可逆的な機構を介して機能しているように見えることを示唆する。これは、ＫＲＡＢドメインが可逆的機構と不可逆的機構の両方を介してサイレンシングを媒介できることを示す以前の研究と一致する。
実施例３．ＣＲＩＳＰＲｉ適用におけるＺＩＭ３ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９融合体の評価
非常に強力なＫＲＡＢドメインを、ＣＲＩＳＰＲｉの現行バージョンを上回る能力について試験した。ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインは、両方の細胞株において、及び最も強力なＴＲＩＭ２８相互作用物質の中で試験された最強の抑制因子であった。まず、ＺＩＭ３－ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９、ＫＯＸ１－ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９、ＫＯＸ１－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２－ｄＣａｓ９及び陰性対照のＮａｎｏｌｕｃ－ｄＣａｓ９を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で５つの内因性プロモーターにリクルートし、サイレンシングを、ｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。５例中４例において、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢは、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ又はＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２よりも著しく良好に発現をサイレンスした（図２Ａ、図３、及び図６）。これらの違いがタンパク質レベルに変換されるかどうかを試験するために、これらのコンストラクトを、細胞表面抗原であるＣＤ８１のプロモーターに標的化した。ＺＩＭ３ ＫＲＡＢは、他の２つのコンストラクトよりも最大で１０倍良好にＣＤ８１表面タンパク質発現を低減できた（図２Ｂ）。
ジフテリア毒素（ＤＴＡ）の毒性を打ち消すことに対するＫＲＡＢコンストラクトの効果を、アッセイした。ＤＴＡ毒性は、毒素の細胞表面受容体であるＨＢ－ＥＧＦに完全に依存する［１８］。示されるように、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）の受容体であるＨＢＥＧＦのｄＣａｓ９－ＺＩＭ３によるサイレンシングは、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ又はＫＯＸ１－ＭｅＣＰ２による抑制よりも著しく高いＤＴＡに対する耐性をもたらす。特に、少量の受容体でさえ毒素エンドサイトーシスに十分であり、細胞死をもたらす。コンストラクトを最初に、５つのｇＲＮＡのプールを用いてＨＢ－ＥＧＦプロモーターに標的化した。この場合、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢの効果がＨＢ－ＥＧＦノックアウト細胞の効果に最も近かったものの、全てのＫＲＡＢコンストラクトが、ＤＴＡに対し細胞を著しく耐性にした（図２Ｃ）。しかし、違いは、各ｇＲＮＡを別々に試験した場合より顕著であった。１つの完全に不活性なｇＲＮＡを除き、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢが最も強力なエフェクターであった。３つのｇＲＮＡでは、その効果は、ＨＢ－ＥＧＦ ＫＯ細胞とほとんど区別がつかなかった（図２Ｃ）。さらに、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢは、他の２つのコンストラクトよりもｇＲＮＡ選択に対し感受性が低いように見えた。特に、ＨＢ－ＥＧＦ ｇＲＮＡ ＃２は、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢでは活性を示さず、ＭｅＣＰ２の添加により緩やかに改善され、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢでは十分に有効であった（図２Ｃ）。
ｇＲＮＡ位置に対するＫＲＡＢコンストラクトの感受性も試験した。ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ及びＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２を、マウス胚性線維芽細胞中でＧＦＰレポーターの上流及び下流に標的化した。どちらのコンストラクトも、プロモーターに向けられるとＧＦＰを部分的にサイレンスし、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２はＺＩＭ３よりもわずかに効率的であった。しかし、レポーターの下流に向けられた場合、ＺＩＭ３のみがＧＦＰ発現をサイレンスし、ＺＩＭ３がＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２よりも遠位部位からより効果的に遺伝子発現をサイレンスできることを実証した。
最後に、３つのＫＲＡＢエフェクターコンストラクトの性能を、大規模な不偏スクリーニングで調査した。細胞生存率ドロップアウトスクリーニングを、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２－ｄＣａｓ９、又はＮａｎｏｌｕｃ－ｄＣａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した。これらの細胞を、１遺伝子あたり３つのｇＲＮＡで１８，９０１遺伝子を標的とする最近記載されたＤｏｌｃｅｔｔｏ Ｓｅｔ Ａ ｇＲＮＡライブラリーに感染させ、２１日後にｇＲＮＡ欠乏を測定した。各コンストラクトによるゴールドスタンダードの必須遺伝子と必須でない遺伝子を標的とするｇＲＮＡの相対的な欠乏を、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線により比較した。以前に報告されたように、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、ｇＲＮＡレベル又は遺伝子レベルで計算したかどうかにかかわらず、ＲＯＣ下面積（ＡＵＲＯＣ）に基づきＫＯＸ１ ＫＲＡＢ単独よりも効率的であった（ｇＲＮＡレベル０．６２対０．７０、遺伝子レベル０．６６対０．７５；図２Ｄ、Ｅ）。対照的に、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢは、０．８４（ｇＲＮＡレベル）及び０．９０（遺伝子レベル；図２Ｄ、Ｅ）のＡＵＲＯＣでいずれのコンストラクトよりも顕著に優れていた。本明細書で報告するＡＵＲＯＣ値は、Ｋ５６２及びＡ３７５９のような他の細胞株でのＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングについて報告されたものよりもいくぶんか低いが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で以前に実施されたスクリーニングと一致していることに留意されたい［８］（図２Ｄ、Ｅ）。より低い効率は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＲＩＭ２８のより低い発現レベルが原因である可能性がある（図３）。それにもかかわらず、これらの結果は、レポーター遺伝子と個々の内因性遺伝子の初期結果：ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインは非常に強力な転写抑制因子である、を強く支持する。
まとめると、標的遺伝子サイレンシングにおいて著しくより有効であり、かつ現在存在するシステムよりもｇＲＮＡ選択に対して感受性が低い、非常に強力なＫＲＡＢドメインが、本明細書に記載される。ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ抑制因子は、非常に堅牢な遺伝子サイレンシングを必要とする、又は遺伝子相互作用プロファイリング若しくはＰｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑなどの、各遺伝子を標的とする複数のｇＲＮＡの要件によって制限されるアプリケーションにおいて特に価値がある可能性がある［１９～２１］。
実施例４．
方法：
細胞培養
ＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター細胞株（スタンフォード大学のＬｅｉ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｑｉ研究室からの寄贈）を含む全てのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター細胞株はもともとレンチウイルスのランダム組込みで作製されたため、クローン株を、ＥＧＦＰとその標的化ｇＲＮＡの均一に高い発現レベルを確実にするために作製した。Ｋ５６２レポーター細胞（ＩＲＣＣＳ Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ科学研究所のＡｎｇｅｌｏ Ｌｏｍｂａｒｄｏ研究室からの寄贈）を、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ（ＩＭＤＭ）で維持した。Ｋ５６２細胞を、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれたＥＧＦＰ発現カセットの下流のＴｅｔＯアレイを標的とする単一ｇＲＮＡに感染させた。これらの細胞を次いで、ｇＲＮＡ発現の代理として使用される同じ高ＥＢＦＰ２＋細胞を常に選択しながら、その後のサイレンシング実験に使用した。これらの細胞を次いで、ｄＣａｓ９に融合された各抑制因子変異体を含有するレンチウイルスで、高感染多重度にて形質導入した。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２レポーター細胞を、それぞれ６及び１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンで２ラウンド選択のために処理し、フローサイトメトリーでのレポーターの測定の前に３週間維持した。全ての細胞株を、マイコプラズマ混入について日常的に試験した。
プラスミド設計
個々の抑制因子を、Ｎ末端のＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）及び２つのＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳを有するＣ末端のヒトコドン最適化された化膿連鎖球菌ｄＣａｓ９を有するゲートウェイ適合性レンチウイルスベクター中にクローニングした。構成的にＥＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を最初に、以前に説明したように標的化した。Ｃａｓ９についてのウェスタンブロットプロービングを、ＨＥＫ２９３Ｔ安定細胞株のサブセットで実施して、発現レベルの変動を考慮した。Ｋ５６２レポーター株を試験する場合、Ｃ末端Ｐ２Ａ－ｄｓＲｅｄを、発現の代理としてｄＣａｓ９に付加し、高ｄｓＲｅｄ＋細胞のみを、フローサイトメトリーによるその後の測定中にゲートした。各ＫＲＡＢドメインを、ＰＣＲ増幅するか又は直接合成し、内因性タンパク質から取られ可能な限りＵｎｉＰｒｏｔにより注釈をつけられるように、３０個の追加のアミノ酸をＫＲＡＢドメインに隣接させた。個々の内因性遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを、Ｕ６ベースのピューロマイシン耐性ｐＬＣＫＯ中にクローニングした。レポーターを標的とするｓｇＲＮＡを、改変ｐＬＣＫＯ中にクローニングしてｈＰＧＫプロモーター由来のＥＢＦＰ２を共発現させた。
ウイルス産生
小規模なウイルス生産のために、レンチウイルスを、８：６：１の比率で目的のコンストラクト、ｐｓＰＡＸ２、及びｐＶＳＶ－Ｇを６ウェルプレート上の低継代ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトすることにより作製した。トランスフェクションを、製造業者のプロトコルに従いリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて実施した。プールしたｇＲＮＡライブラリーの大規模生成のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以前に記載されたように［２９］ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Ｒｏｃｈｅ）を用いて複数の１５ｃｍディッシュ上でトランスフェクトした。トランスフェクション後６～８時間の時点で、培地を、収集培地（ＤＭＥＭ＋１．１ｇ／１００ｍＬ ＢＳＡ）に交換し、ウイルスを、０．４５μｍフィルターを通過させることによりトランスフェクション後３６時間で集めた。
ＲＴ－ｑＰＣＲ
抑制因子ｄＣａｓ９融合体を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、４８ウェルプレートで各個々のｇＲＮＡ又はｇＲＮＡのプールで技術的反復として独立に感染させた。感染後２４時間の時点で、細胞を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択し、２４ウェルプレート上で９日間継代した。全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いて抽出した。ＬｕｎａユニバーサルワンステップＲＴ－ｑＰＣＲキット（ＮＥＢ）を、サイクル条件：５５℃で１０分、９５℃で１分、９５℃で１０秒と６０℃で３０秒を４０サイクル（プレート読み取り）、その後６０～９５℃の融解曲線、で５０ｎｇの全ＲＮＡに使用した。プライマーを、エクソン－エクソン接合部にまたがるように設計し、発現を、２－ΔΔＣｔ法によりハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａに正規化した。
ジフテリア毒素に対する感受性
抑制因子ｄＣａｓ９融合体を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートで各個々のｇＲＮＡの又はｇＲＮＡの等モルプールで形質導入した。感染後２４時間の時点で、細胞を、１０ｃｍディッシュ上で継代し、１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した。選択が完了した後、細胞を、９６ウェルプレートに播種し、２４時間後の翌日、４０％コンフルエントになったときに毒素処理を行った。ジフテリア毒素を、適用直前に保存緩衝液で段階希釈した。播種した細胞を、段階希釈したジフテリア毒素で４８時間処理した。毒素含有培地を除去し、細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄し、９０分及び１８０分間１：５の比率でアラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）試薬を含む新鮮な培地とさらにインキュベートした。細胞生存率を、プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてアラマーブルー色素蛍光を測定することにより記録した。ＨＢ－ＥＧＦノックアウト細胞株を、ＴＫＯｖ３ライブラリーからのＨＢＥＧＦを標的とするｇＲＮＡを有するｐｘ４５９プラスミドをトランスフェクトすることにより作製した。トランスフェクトした細胞を、１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した。ノックアウトを、サーベイヤーアッセイ（ｓｕｒｖｅｙｏｒ ａｓｓａｙ）により確認した。
ＣＲＩＳＰＲｉ
各細胞株のウイルス力価を、様々な範囲のウイルス量（０、５０、１００、１５０、２００、２５０及び５００μｌ）で、１５ｃｍディッシュ上で測定した。各抑制因子－ｄＣａｓ９誘導体の異種発現を有する検証済みＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、約３０％の生存率をもたらす用量で形質導入した。選択を、形質導入後２４時間の時点で１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで行い、４８～７２時間以内に完全選択に至った（Ｔ０）。約３０％の感染効率で、十分な細胞が形質導入されて、各ｄＣａｓ９変異体について５００倍超の初期の代表を達成した。細胞を、２つの技術的反復で継代し維持し、一方で全体を通して２５０倍のカバレッジを維持した。細胞を、選択Ｔ１４及びＴ２１後にペレット化し、ゲノムＤＮＡ単離のためにドライアイス上で瞬間凍結した。
ＬＵＭＩＥＲ
Ｃ末端でのＮＬｕｃタグ付きＴＲＩＭ２８を安定に発現する２９３Ｔ細胞を、ポリエチレンイミンを用いてＥＧＦＰ－３ｘＦＬＡＧでＣ末端にタグ付けされたＫＲＡＢドメインでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＨＥＮＧ緩衝液に溶解し、モノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体でコートした３８４ウェルプレートに移した。プレートを、冷中で３時間インキュベートし、ＨＥＮＧ緩衝液で洗浄し、発光を、プレートリーダーを用いて測定した。その後、ＨＲＰコンジュゲート抗ＦＬＡＧ抗体に対するＥＬＩＳＡシグナルを、発現の対照として測定した。
実施例５
次に、ＺＩＭ３とＫＯＸ１の間に見られる効力の差が融合タンパク質の配向によるものであるかどうかを試験した。発明者らは、ｄＣａｓ９のＣ末端でＫＯＸ１－ＫＲＡＢ、ＫＯＸ１－ＭｅＣＰ２又はＺＩＭ３－ＫＲＡＢのいずれかに融合されたｍＣｈｅｒｒｙを挿入することにより、元のＣＲＩＳＰＲｉプラスミド（２７）を改変した。プロモーターを標的とする単一ｇＲＮＡを発現するＳＶ４０－ＥＧＦＰ細胞を、各抑制因子で形質導入した。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢの代理である、同様のレベルのｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞を、感染の２週間後にゲートした。ＺＩＭ３ ＫＲＡＢは、広く使用される骨格中のｄＣａｓ９のＣ末端に融合された場合でも、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ又はＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２融合体よりも強力であった。結果を図３に示す。さらなる方法は、実施例４に記載されるとおりである。
実施例６
誘導システム
ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ抑制因子の性能を、［１４］に記載の誘導抑制システムにおいて試験した。Ｋ５６２レポーター細胞を、ＡＢＩ－ｄＣａｓ９と、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれたＥＧＦＰ発現カセットの下流のＴｅｔＯアレイを標的とする単一ｇＲＮＡで形質導入した。これらの細胞を次いで、ＰＹＬ１に融合されたＺＩＭ３又はＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインのいずれかを含有するレンチウイルスに、高い感染多重度で感染させた。２ラウンドの選択後、細胞を、１００μＭのアブシジン酸で処理し、５及び１４日のリクルート後のＥＧＦＰレベルを、フローサイトメトリーにより測定した（図７）。直接融合体を用いた以前の実験と同様に、ＺＩＭ３－ＰＹＬ１は、ＫＯＸ１－ＰＹＬ１と比較して優れたサイレンシングを示した。さらなる方法は、実施例４に記載されるとおりである。
実施例７－オフターゲット効果のＫＲＡＢ媒介サイレンシングの評価
オンターゲット遺伝子のより強力な抑制は、潜在的なオフターゲットに対しより顕著な効果をもたらし得る。これを、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２又はＮａｎｏｌｕｃに融合されたｄＣａｓ９での感染後３０日目に、ＳＶ４０－ＥＧＦＰレポーター細胞のトランスクリプトームを配列決定することによって評価した。ＺＩＭ３ ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９感染細胞では、ＥＧＦＰ自体に加えて１０個の遺伝子が、著しく下方制御又は上方制御された（図８）。これは、実際には、他のどのコンストラクトよりも影響を受ける遺伝子が少なかった（図８）。さらに、１０個の遺伝子のいずれも、転写開始部位から２ｋｂ以内に予測されるｇＲＮＡオフターゲットを含まず、ＺＩＭ３ ＫＲＡＢドメインの増加された有効性はオフターゲット遺伝子のさらなるサイレンシングをもたらさないことを示唆する。さらなる方法は、実施例４に記載されるとおりである。
配列表
ｄＣａｓ９配列番号１
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＡＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

ＺＩＭ３のＫＲＡＢドメイン（配列番号２）
ＶＴＦＥＤＶＴＶＮＦＴＱＧＥＷＱＲＬＮＰＥＱＲＮＬＹＲＤＶＭＬＥＮＹＳＮＬＶＳＶＧＱＧＥＴＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＱＧＫＥＰＷＬ

Figure 2023537158000002
Figure 2023537158000003

ＣＭＶプロモーター＋エンハンサー


５’－Ｎ１ＮＧＧ－３’
Ｎ１は１５～２５、１６～２４、１７～２３、１８～２２、又は１９～２１ヌクレオチド長、任意選択で２０ヌクレオチド長又は１５と２５を含む１５～２５の任意の数である。

Figure 2023537158000008
Figure 2023537158000009

Claims (21)

  1. ＤＮＡターゲティングドメイン、任意選択でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、好ましくは酵素不活性のＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９タンパク質、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔ－抑制因子又はＴＡＬＥ；及びＺＩＭ３－ＫＲＡＢ、ＺＩＭ２－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ５５４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ２６４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３２４－ＫＲＡＢ、ＺＮＦ３５４Ａ－ＫＲＡＢ、ＺＦＰ８２－ＫＲＡＢ、及びＺＮＦ６６９－ＫＲＡＢからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＢドメイン
    を含む異種転写抑制因子。
  2. 少なくとも１つの相互作用構成要素をさらに含む、請求項１に記載の転写抑制因子。
  3. 前記ＤＮＡターゲティングドメイン及びＫＲＡＢドメインが、単一ポリペプチドのドメインである、請求項１又は請求項２に記載の転写抑制因子。
  4. 前記ＤＮＡターゲティングドメインと第１の相互作用構成要素を含む第１のポリペプチド、及び
    ＫＲＡＢドメインと第２の相互作用構成要素を含む第２のポリペプチド
    を含み、
    前記第１及び第２の相互作用構成要素が、適切な条件下で相互作用する、請求項２に記載の転写抑制因子。
  5. 前記第１及び第２の相互作用構成要素が、誘導条件下で相互作用する誘導性ヘテロ二量体対、任意選択でＡＢＩ１とＰＹＬ１を形成する、請求項４に記載の転写抑制因子。
  6. 前記ＤＮＡターゲティングドメインが、酵素的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、任意選択でｄＣａｓ９又はｄＣａｓ１２ａである、請求項１～５のいずれか一項に記載の転写抑制因子。
  7. 前記少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが、配列番号４～１０又は１９のＫＲＡＢドメインのいずれか１つから選択される、任意選択でＺＩＭ２－ＫＲＡＢである、請求項１～６のいずれか一項に記載の転写抑制因子。
  8. １以上の核局在シグナル（ＮＬＳ）、任意選択でＳＶ４０ ＮＬＳをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の転写抑制因子。
  9. 前記転写抑制因子が、配列番号１４、１６若しくは１７のアミノ酸配列、又はそのＤＮＡターゲティングドメイン及びＫＲＡＢドメイン部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％のアミノ酸配列を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の転写抑制因子。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の転写抑制因子をコードする単離核酸。
  11. １以上のプロモーター及び１以上の転写終結部位に作用可能に連結された請求項１０に記載の核酸を含む発現コンストラクト。
  12. 請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載の発現コンストラクトを含むベクターであって、任意選択でアデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、ベクター。
  13. 請求項１～９のいずれか一項に記載の転写抑制因子、請求項１０に記載の核酸、請求項１に記載の発現コンストラクト、又は請求項１２に記載のベクターを含む細胞。
  14. ａ）前記ＤＮＡターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の異種転写抑制因子、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現コンストラクト、請求項１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の細胞；かつ任意選択で
    ｂ）少なくとも１つのｇＲＮＡ及び／又は少なくとも１つの誘導剤
    を含む転写抑制システム。
  15. 前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、遺伝子の調節エレメントを標的とし、任意選択で前記調節エレメントが、プロモーター領域、エンハンサー領域、又は遠位調節部位である、請求項１４に記載の転写抑制システム。
  16. 細胞中で標的遺伝子の転写を抑制する方法であって、
    ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の転写抑制因子、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現コンストラクト、又は請求項１２に記載のベクターを前記細胞中に導入すること；及び
    ｂ）前記少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが前記標的遺伝子の転写を抑制するような適切な条件下で細胞を培養すること
    を含む、方法。
  17. 前記ＤＮＡターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含み、少なくとも１つのｇＲＮＡを前記細胞に導入すること、かつ前記少なくとも１つのｇＲＮＡが前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と会合してＣＲＩＳＰＲ標的部位に前記転写抑制因子を導くような適切な条件下で前記細胞を培養することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. スクリーニング方法であって、
    ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の転写抑制因子、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現コンストラクト、又は請求項１２に記載のベクターを複数の細胞中に導入することであって、前記ＤＮＡターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質；及び複数のｇＲＮＡを含む、導入すること；又は請求項１３に記載の細胞集団中に複数のｇＲＮＡを導入することであって、前記ＤＮＡターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、導入すること；
    ｂ）１以上のｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と会合しかつ少なくとも１つのＫＲＡＢドメインが標的遺伝子の転写を抑制するように転写抑制因子をＣＲＩＳＰＲ標的部位に導くように複数の細胞を培養すること；
    ｃ）任意選択である量の試験薬又は毒素で処理すること；
    ｄ）任意選択でｇＲＮＡのドロップアウト又は濃縮を可能にするために一定期間複数の細胞を培養すること；並びに
    ｅ）複数の細胞、又はそのサブセットを収集すること
    を含む、方法。
  19. 前記複数の細胞又はそのサブセットにおいて過剰に又は過小に現れる１以上のｇＲＮＡを識別することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１～９のいずれか一項に記載の転写抑制因子、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現コンストラクト、請求項１２に記載のベクター、又は請求項１３に記載の細胞を含む組成物。
  21. バイアル及び請求項１～９のいずれか一項に記載の異種転写抑制因子、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現コンストラクト、請求項１２に記載のベクター、請求項１３に記載の細胞、又は請求項２０に記載の組成物及び任意選択で誘導剤、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ発現コンストラクトの１以上を含むキット。
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