KR20230128466A - 안정한 세포주를 사용한 생물학적 제제의 생산을 위한엄격하게-조절된 유도성 발현 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 재조합 단백질, 백신, 또는 바이러스 벡터와 같은 생물학적 제제의 생산을 포함하는, 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 생산에 유용한 엄격하게 조절되는 유도성 발현 시스템에 관한 것이다. 또한, 상기 RNA 또는 단백질의 생산에 유용한 세포주 및 키트뿐만 아니라 상기 세포주를 제조하는 방법 및 상기 RNA 또는 단백질의 생산을 유도하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 7일에 출원된 미국 가출원 제63/134,816호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록의 포함
2022년 1월 5일에 생성된 서열 목록 "P61102PC00 Sequence Listing_ST25"(26,894 바이트)의 컴퓨터 판독 가능 형태는 본원에 참조로서 포함된다.
분야
본 개시는 포유동물 세포에서 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 발현을 위한 유전자 발현 시스템에 관한 것이다. 또한 포유동물 세포에서 재조합 단백질, 백신, 또는 바이러스 벡터와 같은 생물학적 제제의 유도성 생산을 위한 세포주 및 방법이 개시된다.
재조합 단백질, 백신 및 바이러스 벡터와 같은 다양한 생물학적 생성물은 종종 임상 적용을 위해 배양된 포유동물 세포를 사용하여 생산된다. 트랜스펙션 또는 감염의 필요 없이 이러한 생물학적 생성물을 효율적으로 생산할 수 있는 능력을 갖는 세포주의 이용가능성은 제조 공정을 크게 용이하게 한다. 그러나, 이러한 생물학적 생성물을 구성하는 성분들 중 일부 성분이 세포독성이기 때문에 이러한 세포주를 생성하는 것은 종종 어렵다. 결과적으로, 이러한 성분의 구성적 합성은 세포가 적절하게 성장하는 것을 방지한다. 이러한 세포는 불안정하거나 적은 양의 생성물을 생산한다. 따라서, 이들은 제조에 적합하지 않다.
안정한 세포주를 사용하여 세포독성인 생물학적 생성물을 생산하기 위해, 이들의 유전자의 전사는 테트라사이클린 유전자-스위치(Gossen and Bujard, 1992), 쿠메이트 유전자-스위치(Mullick et al., 2006) 또는 쿠메르마이신 유전자-스위치(Zhao et al., 2003)와 같은 유도성 발현 시스템을 사용하여 조절될 필요가 있다. 이러한 유도성 발현 시스템으로, 생물학적 생성물을 인코딩하는 유전자의 전사는 세포의 분리 및 성장 동안 불활성이다(발현 시스템은 억제됨(turn off)). 생물학적 생성물의 합성이 필요할 때, 유도 인자(예를 들어, 독시사이클린 또는 쿠메이트)를 첨가함으로써 전사가 활성화된다(발현 시스템이 촉진됨(turn on)). 유도성 발현 시스템을 사용하기 위해, 세포는 전사활성제(transactivator) 및/또는 리프레서(repressor)와 같은, 유전자-스위치의 조절 요소를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 이들의 염색체에 통합시켜야 한다.
여러 유도성 발현 시스템이 개발되었다(예를 들어, 쿠메이트, 테트라사이클린 및 쿠메르마이신 유전자-스위치). 일부 유도성 발현 시스템의 주요 단점은 이들의 누출성(leakiness)(관심 유전자가 유도 없이 낮은 수준으로 전사됨) 및/또는 중등의 효능(modest efficacy)(유도될 때, 발현 시스템이 약한 유전자 발현만을 부여함)이다.
본 개시는 표적 유전자 발현의 이중 조절 및 감소된 누출을 제공하기 위해 쿠메르마이신 유전자-스위치(Zhao et al., 2003)를 쿠메이트 유전자-스위치(Mullick et al., 2006)와 조합함으로써 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 발현을 위한 발현 시스템을 제공한다. 본 발명자들은 구성적 프로모터에 의해 조절된 CymR에 대한 유전자, 및 쿠메이트-유도성 프로모터의 제어 하의 λR-GyrB에 대한 유전자를 사용하여, 이러한 이중 스위치 발현 시스템을 입증하였다. 따라서, λR-GyrB의 전사는 쿠메이트 유전자-스위치에 의해 제어되었다. 쿠메이트의 부재 하에, CymR 리프레서는 쿠메이트-유도성 프로모터, CMV5CuO에 결합하고, λR-GyrB의 전사를 방지하였다. λR-GyrB 유전자의 전사(및 이에 따른 λR-GyrB 전사활성제의 생산)는 쿠메이트의 첨가에 의해 유도되었으며, 쿠메이트는 CMV5CuO 프로모터로부터 CymR을 방출시켰다. 이러한 유전자 발현 시스템에서, 생산될 생물학적 생성물(들)을 인코딩하는 유전자(들)의 전사는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 12xlambda-CMVmin(또는 12xlambda-TPL, 또는 이들 프로모터의 변이체)에 의해 조절되었다. 이러한 프로모터는 λR-GyrB의 이량체의 결합에 의해 활성화되었다. λR-GyrB는 쿠메르마이신의 존재 하에 이량체를 형성하였다. 쿠메르마이신의 부재 하에, λR-GyrB는 단량체로서 남아 있을 것이고, 12xlambda-CMVmin에 결합하지 않을 것이고, 결과적으로 12xlambda-CMVmin으로부터 전사를 활성화시키지 않을 것이다. 요약하면, 이중 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치에서, 유도는 2개의 유도 인자, 쿠메이트(CymR에 의한 억제를 해제하고 λR-GyrB의 합성을 허용함), 및 쿠메르마이신을 첨가함으로써 달성되었으며, 이는 λR-GyrB의 이량체화 및 12xlambda-CMVmin으로부터의 전사를 허용하였다.
본 개시의 양태는 구성적 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 쿠메이트 리프레서 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 발현 카세트; 쿠메이트-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 발현 카세트; 및 (i) 쿠메르마이신-유도성 프로모터, 클로닝 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 분자로서, 클로닝 부위는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산의 삽입을 위한 것인, 핵산 분자, 또는 (ii) 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제3 발현 카세트를 포함하는, 유도성 발현 시스템을 포함한다.
일 구현예에서, 구성적 프로모터는 인간 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 인간 신장 인자 1 알파(EF1A) 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 베타-액틴 프로모터, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 하이브리드 CMV 인핸서/베타-액틴 프로모터(CAG), 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 쿠메이트 리프레서 단백질은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나, 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된다.
일 구현예에서, 쿠메이트-유도성 프로모터는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일 구현예에서, 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나, 서열번호 13에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 서열번호 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나, 서열번호 10에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 트리파타이트 리더(TPL) 및/또는 주요 후기 프로모터(MLP) 인핸서를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 서열번호 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 인간 베타-글로빈 인트론을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 서열번호 12에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 재조합 단백질을 인코딩한다.
일 구현예에서, 발현 시스템은 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제2 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제4 발현 카세트를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 발현 시스템은 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제3 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제5 발현 카세트를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 제4 및/또는 제5 발현 카세트의 프로모터는 쿠메르마이신-유도성 프로모터이다.
일 구현예에서, 제4 및/또는 제5 발현 카세트의 프로모터는 구성적 프로모터이다.
일 구현예에서, 발현 시스템은 바이러스 벡터의 하나 이상의 성분을 인코딩한다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 렌티바이러스 REV 단백질을 인코딩하며, 제4 발현 카세트의 프로모터는 쿠메르마이신-유도성 프로모터이며, 제4 발현 카세트는 바이러스 외피 단백질을 인코딩하며, 제5 발현 카세트는 렌티바이러스 Gag/pol을 인코딩한다. 일 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 VSVg, 선택적으로 VSVg-Q96H-I57L이다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 바이러스 외피 단백질을 인코딩하며, 제4 발현 카세트의 프로모터는 쿠메르마이신-유도성 프로모터이며, 제4 발현 카세트는 렌티바이러스 Gag/pol을 인코딩하며, 제5 발현 카세트는 렌티바이러스 REV 단백질을 인코딩한다. 일 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 VSVg, 선택적으로 VSVg-Q96H-I57L이다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 Rep40 또는 Rep52를 인코딩하며, 제4 발현 카세트는 Rep68 또는 Rep78을 인코딩하며, 제4 발현 카세트는 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 Rep52를 인코딩하며, 제4 발현 카세트는 Rep68을 인코딩하며, 제5 발현 카세트는 Rep78을 인코딩하며, 제4 및 제5 발현 카세트는 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 항체 중쇄 또는 이의 일부를 인코딩하며, 제4 발현 카세트는 항체 경쇄 또는 이의 일부를 인코딩한다.
본 개시의 또 다른 양태는 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 포유동물 세포에 본원에 기재된 발현 시스템 및 선택 가능한 마커를 도입하는 단계, 및 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 발현 시스템을 보유하는 세포를 선택하고, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 선택 가능한 마커 및 발현 시스템을 보유하는 개별 세포를 분리하는 단계; 및 개별 세포를 배양하여 선택 가능한 마커 및 발현 시스템을 보유하는 세포의 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 a) 포유동물 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; b) 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; c) 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계; d) 제1 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계; e) 제1 세포 집단의 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; f) 제2 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; g) 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계; h) 제2 개별 세포를 배양하여 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득하는 단계; i) 제2 세포 집단의 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 제3 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; j) 제3 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제3 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; k) 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 개별 세포를 분리하는 단계; I) 제3 개별 세포를 배양하여 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 세포 집단을 수득함으로써, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 발현 시스템의 제4 발현 카세트, 및 선택적으로 제5 발현 카세트는 단계 i)에서 또는 단계 l) 후에 세포에 도입된다.
일 구현예에서, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법은 a) 포유동물 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트, 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트, 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; b) 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; c) 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계; d) 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계; e) 제1 세포 집단의 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; f) 제2 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제3 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; g) 제3 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계; h) 제2 개별 세포를 배양하여 제3 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득함으로써, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 발현 시스템의 제4 발현 카세트, 및 선택적으로 본원에 기재된 발현 시스템의 제5 발현 카세트는 단계 e)에서 또는 단계 h) 후에 세포에 도입된다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 발현 시스템 또는 발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트는 트랜스펙션, 형질도입, 감염, 전기천공, 소노포레이션, 뉴클레오펙션, 또는 미세주입에 의해 세포에 도입된다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 발현 시스템을 포함하거나 본원에 기재된 방법에 의해 생성된, 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 세포는 인간 세포, 선택적으로 인간 배아 신장(HEK)-293 세포 또는 이의 파생물, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 이의 파생물, VERO 세포 또는 이의 파생물, HeLa 세포 또는 이의 파생물, A549 세포 또는 이의 파생물, 줄기 세포 또는 이의 파생물, 또는 뉴런 또는 이의 파생물이다.
또 다른 양태는 관심 RNA 또는 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 본원에 기재된 발현 시스템을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, 세포의 발현 시스템의 제3 발현 카세트는 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하며, 관심 RNA 또는 단백질이 생산된다.
일 구현예에서, 쿠메이트 이펙터 분자는 쿠메이트이며, 선택적으로 쿠메이트는 약 1 내지 약 200 ㎍/㎖, 약 50 내지 약 150 ㎍/㎖, 또는 약 100 ㎍/㎖의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 쿠메르마이신 이펙터 분자는 쿠메르마이신이며, 선택적으로 쿠메르마이신은 약 1 내지 약 30 nM, 약 5 내지 약 20 nM, 또는 약 10 nM의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 세포는 현탁액에서 및/또는 혈청의 부재 하에 성장한다.
일 양태는 본원에 기재된 발현 시스템을 포함하는 바이러스 패키징 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 렌티바이러스 패키징 세포이다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 아데노-관련 바이러스(AAV) 패키징 세포이다.
일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 관심 유전자를 보유하는 바이러스 작제물을 추가로 포함한다.
또 다른 양태는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 방법은 본원에 기재된 바이러스 패키징 세포에 관심 유전자를 보유하는 바이러스 작제물을 도입하는 단계; 및 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 세포를 배양함으로써, 바이러스 벡터를 생산하는 단계를 포함하는, 방법을 포함한다.
일 구현예에서, 쿠메이트 이펙터 분자는 쿠메이트이고/거나 쿠메르마이신 이펙터 분자는 쿠메르마이신이다.
일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 현탁액에서 및/또는 혈청의 부재 하에 성장한다.
일 구현예에서, 선택 가능한 마커는 바이러스 작제물을 갖는 바이러스 패키징 세포에 도입되며, 방법은 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택하기 위해 선택적 압력을 가함으로써, 바이러스 작제물을 보유하는 세포를 선택하는 단계, 및 선택적으로 바이러스 작제물을 포함하는 개별 세포를 분리하는 단계 및 바이러스 작제물을 포함하는 개별 세포를 배양하여 바이러스 작제물을 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 렌티바이러스 패키징 세포이며, 바이러스 작제물은 렌티바이러스 작제물이다.
일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 AAV 패키징 세포이며, 바이러스 작제물은 AAV 작제물이다.
추가 양태는 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 포유동물 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트, 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트, 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 및 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 개별 세포를 분리하는 단계; 및 개별 세포를 배양하여 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 세포주를 생성함으로써, 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성하는 방법은 포유동물 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계; 제1 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계; 제1 세포 집단의 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 제2 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계; 및 제2 개별 세포를 배양하여 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득함으로써, 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트를 포함하는 포유동물 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 세포는 인간 세포, 선택적으로 인간 배아 신장(HEK)-293 세포 또는 이의 파생물이다.
추가 양태는 관심 RNA 또는 단백질을 생산하는 방법으로서, 세포에 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트, 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트, 본원에 기재된 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 발현 시스템의 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 선택적으로, 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 포함하는 개별 세포를 분리하는 단계; 및 개별 세포를 배양하여 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 포함하는 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, 관심 RNA 또는 단백질이 생산되는, 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 쿠메이트 이펙터 분자는 쿠메이트이고/거나 쿠메르마이신 이펙터 분자는 쿠메르마이신이다. 일 구현예에서, 세포는 현탁액에서 및/또는 혈청의 부재 하에 성장한다.
본 개시의 또 다른 양태는 본원에 기재된 발현 시스템을 포함하는 키트를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 플라스미드; 본원에 기재된 발현 시스템의 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 플라스미드; 및 본원에 기재된 발현 시스템의 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 플라스미드를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 세포, 및 본원에 기재된 발현 시스템의 제3 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함한다.
일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 쿠메르마이신-유도성 프로모터, 클로닝 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하며, 여기서, 클로닝 부위는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 작동 가능한 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 삽입을 위한 것이다. 일 구현예에서, 제3 발현 카세트는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 세포는 본원에 기재된 발현 시스템의 제3, 제4, 및/또는 제5 발현 카세트를 추가로 포함하며, 여기서, 제3, 제4, 및/또는 제5 발현 카세트는 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩한다.
일 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 발현 시스템을 포함하는 바이러스 패키징 세포, 및 바이러스 작제물을 포함한다.
일 구현예에서, 키트는 쿠메이트 이펙터 분자, 선택적으로 쿠메이트, 및/또는 쿠메르마이신 이펙터 분자, 선택적으로 쿠메르마이신을 추가로 포함한다.
앞의 섹션은 단지 예로서 제공되고, 본 개시 및 첨부된 청구항들의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 개시의 조성물 및 방법과 관련된 추가적인 목적 및 이점은 본 발명의 청구범위, 설명, 및 실시예에 비추어 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 본 개시의 다양한 양태 및 구현예는 다수의 조합으로 이용될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 의해 명백히 고려된다. 이러한 추가적인 이점, 목적 및 구현예는 본 개시의 범위 내에 명백히 포함된다. 본 개시의 배경을 분명히 하기 위해, 및 특별한 경우에, 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본원에서 사용되는 간행물 및 다른 자료는 참조로서 포함되고, 편의상 첨부된 참조 섹션에 열거된다.
본 개시의 추가 목적, 특징 및 이점은 본 개시의 예시적인 구현예를 나타내는 첨부 도면과 함께 취해진 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 구현예의 유전자 조절 메커니즘의 개략도를 도시한다. A) 293SF-CymR/λR-GyrB 세포는 쿠메이트 유전자-스위치(CymR)의 리프레서를 구성적으로 생산하도록 조작되었다. 세포는 또한 CMV5CuO 프로모터의 제어 하에 쿠메르마이신 키메라 전사활성제(λR-GyrB)에 대한 유전자를 함유한다. 쿠메이트의 부재 하에, CymR은 CMV5CuO 프로모터에 결합하고, λR-GyrB의 전사를 방지한다. 쿠메이트의 첨가는 프로모터로부터 CymR을 방출하며, λR-GyrB는 전사될 수 있다. B) 쿠메르마이신의 존재 하에, λR-GyrB는 12xlambda 오퍼레이터(12xλOp)에 결합하고 관심 이식 유전자의 전사를 활성화시키는 이량체를 형성한다. 노보비오신은 세포에 첨가되어 λR-GyrB 이량체를 해리시키고 전사를 방지할 수 있다.
도 2는 293SF-CymR, 293SF-CymR/λR-GyrB 및 293SF-CymR/rcTA 세포를 제조하는 데 사용된 작제물의 다이어그램을 도시한다. A) 293SF-CymR, 293SF-CymR/λR-GyrB 및 293SF-CymR/rcTA 세포를 제조하는 데 사용된 CymR 작제물. CymR 리프레서의 코딩 서열은 강한 구성적 프로모터(CMV5)에 의해 제어된다. B) 293SF-CymR/λR-GyrB 세포를 제조하는 데 사용된 λR-GyrB 작제물. λR-GyrB의 코딩 서열은 CMV5CuO 프로모터에 의해 제어된다. C) 293SF-CymR/rcTA 세포를 제조하는 데 사용된 rcTA 작제물. rcTA의 코딩 서열은 CMV5CuO 프로모터에 의해 제어된다. pA: 폴리아데닐화 신호.
도 3은 본 연구에서 사용된 LV를 인코딩하는 전이 벡터의 다이어그램을 도시한다. A) LV-CMV5CuO-GFP에 대한 전이 벡터. B) LV-12xlambda-TPL-GFP에 대한 전이 벡터. C) LV-CR5-GFP에 대한 전이 벡터. D) LV-CMV-GFP에 대한 전이 벡터. 주석: A), B) 및 C)에 제시된 전이 벡터는 조건부 자가-불활성화 렌티바이러스(cSIN)를 생산한다. 5'LTR 및 3'LTR: 각각 렌티바이러스의 5' 또는 3' 말단에 위치한 긴 말단 반복부; CMV: CMV 프로모터; R: LTR의 R 영역; U5: LTR의 U5 영역: Tet: 테트라사이클린 프로모터; ψ: 캡슐화 신호; RRE: Rev 반응 요소; cPPT: 중앙 폴리퓨린 트랙; GFP: 녹색 형광 단백질; WPRE: 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소; SD 및 SA: 각각 스플라이스 공여자 및 수용체; CMV5CuO 및 CR5 쿠메이트 조절된 프로모터; 12xλ-TRL: 12xLambda-TPL 쿠메르마이신 조절된 프로모터
도 4는 293SF-CymR/rcTA 세포에서 유전자 조절의 메커니즘의 개략도를 도시한다. A) 293SF-CymR/rcTA 세포는 쿠메이트 유전자-스위치(CymR)의 리프레서를 구성적으로 생산하도록 조작되었다. 세포는 또한 CMV5CuO 프로모터의 제어 하에 역전사활성제(rcTA)에 대한 유전자를 함유한다. 쿠메이트의 부재 하에, CymR은 CMV5CuO 프로모터에 결합하고, rcTA 유전자의 전사를 방지한다. 쿠메이트의 첨가는 프로모터로부터 CymR을 방출하고, rcTA의 전사를 가능하게 한다. B) 쿠메이트의 존재 하에, rcTA는 CR5 프로모터에 결합하고, 관심 이식 유전자의 전사를 활성화시킨다(리포터).
도 5는 이중 쿠메르마이신/쿠메이트 유전자-스위치가 쿠메이트 유전자-스위치와 비교하여 더 나은 유도 수준을 제공한다는 것을 도시한다. A) 293SF-CymR의 클론(198-2, 198-10, 169-4, 169-C1, CA7), B) 293SF-CymR/rcTA의 클론(G3 및 G11) 및 C) 293SF-CymR/λR-GyrB의 클론(7-2, 7-3, 7-10)은 각각 LV-CMV5CuO-GFP, LV-CR5-GFP 및 LV-12xlambda-TPL-GFP로 형질도입되었다. 형질도입 후, GFP 발현의 수준은 유세포 분석에 의해 분석되었다. 유도 인자의 부재(Off) 및 존재(On)에서의 세포 집단의 형광 지수가 비교되었다. 각 클론에 대한 온/오프 비율은 막대 위의 숫자(B,C) 또는 선(A)으로 표시된다. 293SF-CymR, 293SF-CymR/rcTA 및 29SF-CymR/λR-GyrB 클론에 대한 온/오프 비율은 각각 15 내지 30, 60 내지 100 및 2621 내지 3877이었다. 293SF는 LV로 형질도입된 293SF 세포(스위치 없음)이며; TO 및 T2는 각각 배양물에서 1주 및 8주 동안 유지된 세포이다.
도 6은 LV에 대한 패키징 세포주를 작제하는 데 사용된 발현 카세트의 다이어그램을 도시한다. LV 패키징 세포주를 작제하기 위해, 하기 성분이 293SF-CymR/λR-GyrB의 염색체에 통합되었다: i) 쿠메르마이신 유도성 프로모터, 13xlambda-TPL의 조절 하에 HIV Rev 유전자; ii) 구성적 하이브리드 CMV 인핸서/β-액틴 프로모터(CAG) 또는 11xlambda-hbgmin 프로모터에 의해 조절되는 HIV Gag/pol 유전자; 및 iii) 13xlambda-TPL에 의해 조절되는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 유전자(VSVg). 쿠메이트 및 쿠메르마이신의 첨가는 Rev, VSVg 및 Gag/pol의 전사를 유도한다(11xlambda-hgbmin에 의해 조절될 때). 주석: Rev의 존재는 미처리된 Gag/pol RNA의 핵 방출(nuclear export)에 필요하다. 따라서, Gag/pol 폴리펩타이드의 효율적인 합성은 Rev의 발현에 따른다.
도 7은 패키징 세포의 트랜스펙션 후 렌티바이러스의 생산을 도시한다. 무혈청 배지를 사용하여 현탁 배양물에서 성장한 패키징 세포의 클론은 LV-CMV-GFP에 대한 전이 벡터(플라스미드)로 트랜스펙션되었다(도 3D). 세포는 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도되며, 배양 배지가 트랜스팩션 후 3일에 수확되었다. 배양 배지에서 LV는 HEK293 세포의 형질도입 후 유세포 분석에 의해 적정되었다. 막대는 배양 배지에서 감염성 역가(ml 당 형질도입 단위[TU])이다. 트랜스펙션 효율(GFP 양성 세포의 %)은 A)에 밝은 회색 사각형을 사용하여 표시된다. A) 11xlambda-hbgmin-Gag/pol을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 생성된 패키징 세포의 클론. B) CAG-Gag/pol을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 생성된 패키징 세포의 클론. 주석: 두 패키징 세포주 모두(A 및 B)는 1.0 × 107 TU/ml 이상의 역가로 LV를 생산할 수 있는 클론을 발생시켰다.
도 8은 패키징 세포주로부터 유래된 생산자 클론에 의한 렌티바이러스 생산을 도시한다. LV 생산자 클론은, 패키징 세포(클론 3D4, 도 7B)를 LV-CMV-GFP를 인코딩하는 전이 벡터(플라스미드)로 트랜스펙션시킴으로써생성되었다(도 3D). 생성된 LV(LV-CMV-GFP)는 구성적 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현한다. 안정적으로 통합된 플라스미드를 갖는 클론은 무혈청 배지를 사용하여 현탁 배양물에서 분리 및 성장되었다. LV-CMV-GFP 생산은 쿠메이트 및 쿠메르마이신을 배양 배지에 첨가한 후 유도되었다. 배양 배지에서 LV-CMV-GFP의 역가는 HEK293 세포의 형질도입 및 유세포 분석에 의한 GFP 양성 세포의 정량화 후 유도 3일 후에 측정되었다. 역가는 비-농축된 배양 배지 ml 당 형질도입 단위(TU)로 표현된다. 주석: 여러 클론(1E9, 3E9, 2G11, 1F3, 2C8 및 1E8)은 1.0 × 108 TU/배양 배지 ml 초과의 역가로 LV-CMV-GFP를 생산한다.
도 9는 패키징 세포에서 LV 유전자 발현의 조절을 도시한다. 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도된 후 패키징 세포(클론 3D4, 도 7)에 의한 VSVg(A), Rev(B) 및 Gag(C)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 동일한 양의 세포 용해물이 각 샘플에 사용되었다. 세포는 유도 전(0) 및 유도 후 24, 48 및 72시간에 나트륨 부티레이트의 부재 또는 존재 하에 수확되었다(유도 후 18시간에 첨가됨). 293SF-CymR/λR-GyrB 세포는 음성 대조군(CT)으로 사용되었다. VSVg, Rev, Gag 폴리단백질(GAG PP) 및 p24의 위치는 화살표로 표시된다. MW: kDa의 분자량 마커. 주석: 항-VSVg 항체를 사용할 때 음성 대조군에서 비특이적 밴드(*)의 존재.
도 10은 AAV를 생산하는 데 사용된 성분의 개략도를 도시한다. A) 293SF-Rep 세포를 생성하는 데 사용된 Rep52, Rep68, 및 Rep78을 발현하는 작제물. Rep 유전자들 각각은 13xlambda-TPL 프로모터(13xλ-TRL)에 의해 제어된다. B) 293SF-Rep의 일시적 트랜스펙션에 의해 AAV를 생산하는 데 사용된 플라스미드. pCMV-CAP는 CMV 프로모터에 의해 조절되는 AAV의 CAP 유전자를 인코딩한다. pAAV-GFP는 CMV에 의해 조절되는 GFP를 생산하는 발현 벡터이다. pHelper는 아데노바이러스의 헬퍼 유전자를 보유한다.
도 11은 293SF-Rep 클론에 의한 REP 단백질 발현의 웨스턴 블롯을 도시한다. 안정적으로 트랜스펙션된 293SF-Rep 클론(클론 13, 18, 35 및 36)의 세포 용해물은 REP에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 상이한 농도의 쿠메이트 및 쿠메르마이신을 사용하여 발현이 유도되었다. 유도되지 않은 세포가 음성 대조군으로 사용되었다. Rep78, 68 및 52의 위치는 화살표로 표시된다. 주석: 유도 없이 REP의 유의한 발현이 관찰되지 않는다. MW: 분자량 마커.
도 12는 293SF-Rep 세포(클론 13)의 일시적 트랜스펙션 후 AAV 생산의 최적화를 도시한다. 현탁 배양물 및 무혈청 배지에서 성장한 293SF-Rep 세포는 상이한 양(㎍/㎖로 표현됨)의 pCMV-CAP(pVR46-CAP), pHelper 및 pAAV-GFP로 트랜스펙션되었다(도 10 참조). 트랜스펙션 후, 세포는 3일 동안 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도되었다. 생산된 AAV를 함유하는 세포 용해물은 HEK293 세포를 형질도입하기 위해 사용되었으며, 이는 후속하여 유세포 분석에 의해 분석되었다. 데이터는 세포 배양 ml 당 감염성 바이러스 입자(IVP)로 표현된다. 최상의 조건은 #5 및 #16이었으며, 이는 2.5 × 107 IVP/ml의 역가를 초래하였다.
도 13은 프로모터 12xLambda-CMVmin(서열번호 9)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 람다 오퍼레이터(12xlambdaOP) 및 CMV 최소 프로모터의 12개 복사체의 위치는 12xLambda-CMVmin의 뉴클레오타이드 서열 아래에 표시된다.
도 14는 프로모터 13xLambda-CMVmin(서열번호 10)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 람다 오퍼레이터(13xlambdaOP) 및 CMV 최소 프로모터의 13개 복사체의 위치는 13xLambda-CMVmin의 뉴클레오타이드 서열 아래에 표시된다.
도 15는 프로모터 13xLambda-TPL(서열번호 11)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 작은 인트론 내의 람다 오퍼레이터(13xlambdaOP), CMV 최소 프로모터, 아데노바이러스 트리파타이트 리더(TPL) 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 인핸서(MLP 인핸서)의 13개 복사체의 위치가 표시된다.
도 16. 프로모터 11xlambda-hbgmin(서열번호 12)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 람다 오퍼레이터(1xlambdaOP), CMV 최소 프로모터, 아데노바이러스 트리파타이트 리더(TPL), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 인핸서(MLP Enhancer), 인간 β-글로빈 인트론(hBglobin-delta 인트론) 및 키메라 인트론의 스플라이스 부위 공여체 및 수용체의 11개 복사체의 위치가 표시된다.
도 1은 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 구현예의 유전자 조절 메커니즘의 개략도를 도시한다. A) 293SF-CymR/λR-GyrB 세포는 쿠메이트 유전자-스위치(CymR)의 리프레서를 구성적으로 생산하도록 조작되었다. 세포는 또한 CMV5CuO 프로모터의 제어 하에 쿠메르마이신 키메라 전사활성제(λR-GyrB)에 대한 유전자를 함유한다. 쿠메이트의 부재 하에, CymR은 CMV5CuO 프로모터에 결합하고, λR-GyrB의 전사를 방지한다. 쿠메이트의 첨가는 프로모터로부터 CymR을 방출하며, λR-GyrB는 전사될 수 있다. B) 쿠메르마이신의 존재 하에, λR-GyrB는 12xlambda 오퍼레이터(12xλOp)에 결합하고 관심 이식 유전자의 전사를 활성화시키는 이량체를 형성한다. 노보비오신은 세포에 첨가되어 λR-GyrB 이량체를 해리시키고 전사를 방지할 수 있다.
도 2는 293SF-CymR, 293SF-CymR/λR-GyrB 및 293SF-CymR/rcTA 세포를 제조하는 데 사용된 작제물의 다이어그램을 도시한다. A) 293SF-CymR, 293SF-CymR/λR-GyrB 및 293SF-CymR/rcTA 세포를 제조하는 데 사용된 CymR 작제물. CymR 리프레서의 코딩 서열은 강한 구성적 프로모터(CMV5)에 의해 제어된다. B) 293SF-CymR/λR-GyrB 세포를 제조하는 데 사용된 λR-GyrB 작제물. λR-GyrB의 코딩 서열은 CMV5CuO 프로모터에 의해 제어된다. C) 293SF-CymR/rcTA 세포를 제조하는 데 사용된 rcTA 작제물. rcTA의 코딩 서열은 CMV5CuO 프로모터에 의해 제어된다. pA: 폴리아데닐화 신호.
도 3은 본 연구에서 사용된 LV를 인코딩하는 전이 벡터의 다이어그램을 도시한다. A) LV-CMV5CuO-GFP에 대한 전이 벡터. B) LV-12xlambda-TPL-GFP에 대한 전이 벡터. C) LV-CR5-GFP에 대한 전이 벡터. D) LV-CMV-GFP에 대한 전이 벡터. 주석: A), B) 및 C)에 제시된 전이 벡터는 조건부 자가-불활성화 렌티바이러스(cSIN)를 생산한다. 5'LTR 및 3'LTR: 각각 렌티바이러스의 5' 또는 3' 말단에 위치한 긴 말단 반복부; CMV: CMV 프로모터; R: LTR의 R 영역; U5: LTR의 U5 영역: Tet: 테트라사이클린 프로모터; ψ: 캡슐화 신호; RRE: Rev 반응 요소; cPPT: 중앙 폴리퓨린 트랙; GFP: 녹색 형광 단백질; WPRE: 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소; SD 및 SA: 각각 스플라이스 공여자 및 수용체; CMV5CuO 및 CR5 쿠메이트 조절된 프로모터; 12xλ-TRL: 12xLambda-TPL 쿠메르마이신 조절된 프로모터
도 4는 293SF-CymR/rcTA 세포에서 유전자 조절의 메커니즘의 개략도를 도시한다. A) 293SF-CymR/rcTA 세포는 쿠메이트 유전자-스위치(CymR)의 리프레서를 구성적으로 생산하도록 조작되었다. 세포는 또한 CMV5CuO 프로모터의 제어 하에 역전사활성제(rcTA)에 대한 유전자를 함유한다. 쿠메이트의 부재 하에, CymR은 CMV5CuO 프로모터에 결합하고, rcTA 유전자의 전사를 방지한다. 쿠메이트의 첨가는 프로모터로부터 CymR을 방출하고, rcTA의 전사를 가능하게 한다. B) 쿠메이트의 존재 하에, rcTA는 CR5 프로모터에 결합하고, 관심 이식 유전자의 전사를 활성화시킨다(리포터).
도 5는 이중 쿠메르마이신/쿠메이트 유전자-스위치가 쿠메이트 유전자-스위치와 비교하여 더 나은 유도 수준을 제공한다는 것을 도시한다. A) 293SF-CymR의 클론(198-2, 198-10, 169-4, 169-C1, CA7), B) 293SF-CymR/rcTA의 클론(G3 및 G11) 및 C) 293SF-CymR/λR-GyrB의 클론(7-2, 7-3, 7-10)은 각각 LV-CMV5CuO-GFP, LV-CR5-GFP 및 LV-12xlambda-TPL-GFP로 형질도입되었다. 형질도입 후, GFP 발현의 수준은 유세포 분석에 의해 분석되었다. 유도 인자의 부재(Off) 및 존재(On)에서의 세포 집단의 형광 지수가 비교되었다. 각 클론에 대한 온/오프 비율은 막대 위의 숫자(B,C) 또는 선(A)으로 표시된다. 293SF-CymR, 293SF-CymR/rcTA 및 29SF-CymR/λR-GyrB 클론에 대한 온/오프 비율은 각각 15 내지 30, 60 내지 100 및 2621 내지 3877이었다. 293SF는 LV로 형질도입된 293SF 세포(스위치 없음)이며; TO 및 T2는 각각 배양물에서 1주 및 8주 동안 유지된 세포이다.
도 6은 LV에 대한 패키징 세포주를 작제하는 데 사용된 발현 카세트의 다이어그램을 도시한다. LV 패키징 세포주를 작제하기 위해, 하기 성분이 293SF-CymR/λR-GyrB의 염색체에 통합되었다: i) 쿠메르마이신 유도성 프로모터, 13xlambda-TPL의 조절 하에 HIV Rev 유전자; ii) 구성적 하이브리드 CMV 인핸서/β-액틴 프로모터(CAG) 또는 11xlambda-hbgmin 프로모터에 의해 조절되는 HIV Gag/pol 유전자; 및 iii) 13xlambda-TPL에 의해 조절되는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 유전자(VSVg). 쿠메이트 및 쿠메르마이신의 첨가는 Rev, VSVg 및 Gag/pol의 전사를 유도한다(11xlambda-hgbmin에 의해 조절될 때). 주석: Rev의 존재는 미처리된 Gag/pol RNA의 핵 방출(nuclear export)에 필요하다. 따라서, Gag/pol 폴리펩타이드의 효율적인 합성은 Rev의 발현에 따른다.
도 7은 패키징 세포의 트랜스펙션 후 렌티바이러스의 생산을 도시한다. 무혈청 배지를 사용하여 현탁 배양물에서 성장한 패키징 세포의 클론은 LV-CMV-GFP에 대한 전이 벡터(플라스미드)로 트랜스펙션되었다(도 3D). 세포는 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도되며, 배양 배지가 트랜스팩션 후 3일에 수확되었다. 배양 배지에서 LV는 HEK293 세포의 형질도입 후 유세포 분석에 의해 적정되었다. 막대는 배양 배지에서 감염성 역가(ml 당 형질도입 단위[TU])이다. 트랜스펙션 효율(GFP 양성 세포의 %)은 A)에 밝은 회색 사각형을 사용하여 표시된다. A) 11xlambda-hbgmin-Gag/pol을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 생성된 패키징 세포의 클론. B) CAG-Gag/pol을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 생성된 패키징 세포의 클론. 주석: 두 패키징 세포주 모두(A 및 B)는 1.0 × 107 TU/ml 이상의 역가로 LV를 생산할 수 있는 클론을 발생시켰다.
도 8은 패키징 세포주로부터 유래된 생산자 클론에 의한 렌티바이러스 생산을 도시한다. LV 생산자 클론은, 패키징 세포(클론 3D4, 도 7B)를 LV-CMV-GFP를 인코딩하는 전이 벡터(플라스미드)로 트랜스펙션시킴으로써생성되었다(도 3D). 생성된 LV(LV-CMV-GFP)는 구성적 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현한다. 안정적으로 통합된 플라스미드를 갖는 클론은 무혈청 배지를 사용하여 현탁 배양물에서 분리 및 성장되었다. LV-CMV-GFP 생산은 쿠메이트 및 쿠메르마이신을 배양 배지에 첨가한 후 유도되었다. 배양 배지에서 LV-CMV-GFP의 역가는 HEK293 세포의 형질도입 및 유세포 분석에 의한 GFP 양성 세포의 정량화 후 유도 3일 후에 측정되었다. 역가는 비-농축된 배양 배지 ml 당 형질도입 단위(TU)로 표현된다. 주석: 여러 클론(1E9, 3E9, 2G11, 1F3, 2C8 및 1E8)은 1.0 × 108 TU/배양 배지 ml 초과의 역가로 LV-CMV-GFP를 생산한다.
도 9는 패키징 세포에서 LV 유전자 발현의 조절을 도시한다. 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도된 후 패키징 세포(클론 3D4, 도 7)에 의한 VSVg(A), Rev(B) 및 Gag(C)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 동일한 양의 세포 용해물이 각 샘플에 사용되었다. 세포는 유도 전(0) 및 유도 후 24, 48 및 72시간에 나트륨 부티레이트의 부재 또는 존재 하에 수확되었다(유도 후 18시간에 첨가됨). 293SF-CymR/λR-GyrB 세포는 음성 대조군(CT)으로 사용되었다. VSVg, Rev, Gag 폴리단백질(GAG PP) 및 p24의 위치는 화살표로 표시된다. MW: kDa의 분자량 마커. 주석: 항-VSVg 항체를 사용할 때 음성 대조군에서 비특이적 밴드(*)의 존재.
도 10은 AAV를 생산하는 데 사용된 성분의 개략도를 도시한다. A) 293SF-Rep 세포를 생성하는 데 사용된 Rep52, Rep68, 및 Rep78을 발현하는 작제물. Rep 유전자들 각각은 13xlambda-TPL 프로모터(13xλ-TRL)에 의해 제어된다. B) 293SF-Rep의 일시적 트랜스펙션에 의해 AAV를 생산하는 데 사용된 플라스미드. pCMV-CAP는 CMV 프로모터에 의해 조절되는 AAV의 CAP 유전자를 인코딩한다. pAAV-GFP는 CMV에 의해 조절되는 GFP를 생산하는 발현 벡터이다. pHelper는 아데노바이러스의 헬퍼 유전자를 보유한다.
도 11은 293SF-Rep 클론에 의한 REP 단백질 발현의 웨스턴 블롯을 도시한다. 안정적으로 트랜스펙션된 293SF-Rep 클론(클론 13, 18, 35 및 36)의 세포 용해물은 REP에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 상이한 농도의 쿠메이트 및 쿠메르마이신을 사용하여 발현이 유도되었다. 유도되지 않은 세포가 음성 대조군으로 사용되었다. Rep78, 68 및 52의 위치는 화살표로 표시된다. 주석: 유도 없이 REP의 유의한 발현이 관찰되지 않는다. MW: 분자량 마커.
도 12는 293SF-Rep 세포(클론 13)의 일시적 트랜스펙션 후 AAV 생산의 최적화를 도시한다. 현탁 배양물 및 무혈청 배지에서 성장한 293SF-Rep 세포는 상이한 양(㎍/㎖로 표현됨)의 pCMV-CAP(pVR46-CAP), pHelper 및 pAAV-GFP로 트랜스펙션되었다(도 10 참조). 트랜스펙션 후, 세포는 3일 동안 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도되었다. 생산된 AAV를 함유하는 세포 용해물은 HEK293 세포를 형질도입하기 위해 사용되었으며, 이는 후속하여 유세포 분석에 의해 분석되었다. 데이터는 세포 배양 ml 당 감염성 바이러스 입자(IVP)로 표현된다. 최상의 조건은 #5 및 #16이었으며, 이는 2.5 × 107 IVP/ml의 역가를 초래하였다.
도 13은 프로모터 12xLambda-CMVmin(서열번호 9)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 람다 오퍼레이터(12xlambdaOP) 및 CMV 최소 프로모터의 12개 복사체의 위치는 12xLambda-CMVmin의 뉴클레오타이드 서열 아래에 표시된다.
도 14는 프로모터 13xLambda-CMVmin(서열번호 10)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 람다 오퍼레이터(13xlambdaOP) 및 CMV 최소 프로모터의 13개 복사체의 위치는 13xLambda-CMVmin의 뉴클레오타이드 서열 아래에 표시된다.
도 15는 프로모터 13xLambda-TPL(서열번호 11)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 작은 인트론 내의 람다 오퍼레이터(13xlambdaOP), CMV 최소 프로모터, 아데노바이러스 트리파타이트 리더(TPL) 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 인핸서(MLP 인핸서)의 13개 복사체의 위치가 표시된다.
도 16. 프로모터 11xlambda-hbgmin(서열번호 12)(상부 가닥) 및 상보적 서열(하부 가닥)의 서열을 도시한다. 람다 오퍼레이터(1xlambdaOP), CMV 최소 프로모터, 아데노바이러스 트리파타이트 리더(TPL), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 인핸서(MLP Enhancer), 인간 β-글로빈 인트론(hBglobin-delta 인트론) 및 키메라 인트론의 스플라이스 부위 공여체 및 수용체의 11개 복사체의 위치가 표시된다.
하기는 본 개시를 실시하는데 있어서 당업자를 돕기 위해 제공된 상세한 설명이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이고, 본 개시를 제한하려고 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 도면 및 다른 참고문헌은 그 전체가 명백히 참조로서 포함된다.
I. 정의
본원에서 사용되는 하기 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 하기에 부여된 의미를 가질 수 있다. 그러나, 당업자에게 공지되거나 이해되는 다른 의미가 또한 가능하며, 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이고, 제한하려는 것은 아니다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 하한치의 단위의 1/10, 그러한 범위의 상한치와 하한치 사이, 및 그러한 기술된 범위의임의의 다른 기술된 또는 중간 값의 각각의 중간 값은 명세서 내에 포함된다. 임의의 하한치 내지 임의의 상한치의 범위가 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 당업자에 의해 예상되는 실험 오차 및 편차를 고려하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, "약"은 참조되는 지시된 값의 + 또는 - 10%, 또는 + 또는 - 5%를 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다.
본원에서 사용되는 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 분리되어 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다수의 요소는 동일한 방식으로, 즉, 그렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있으며, 이는 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 상관없다.
명세서 및 청구범위에서, 본원에서 사용되는 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 요소의 수 또는 목록 및 선택적으로 추가의 목록에 없는 항목 중 적어도 하나를 포함하지만, 또한 하나 초과를 포함하는 것으로 해석될 것이다. "~의 단 하나의" 또는 "~의 정확히 하나의" 또는 청구범위에서 사용될 때 "~로 구성되는"과 같이 명백하게 반대되는 용어만이 다수의 요소 또는 요소 목록의 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "중 둘 중 하나", "~중 하나", " 중 단 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배타성 용어가 뒤에 오는 경우 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 하나, 그러나, 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로서만 해석되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "보유하는(carrying)", "갖는(having)", "함유하는(containing)", "포함하는(involving)", "보유하는(holding)", "구성된(composed of)" 등과 같은 모든 전이 어구는 개방형, 즉, 비제한적으로 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "~로 구성되는(consisting of)" 및 "~로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of)"의 전이 어구만이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전이 어구일 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는 요소 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하고 요소 목록에서 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는(그러나 반드시 그러한 것은 아님), 요소의 목록에 있는 요소들 중 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있든 없든 지 간에, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외에 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다.
또한, 하나 초과의 단계 또는 활동을 포함하는 본원에 기재된 특정 방법에서, 방법의 단계 또는 활동의 순서는, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 방법의 단계 또는 활동이 언급되는 순서로 반드시 제한되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
II. 발현 시스템
본원에는 이중 쿠메르마이신/쿠메이트 유전자-스위치의 사용은 쿠메이트 스위치 단독의 사용과 비교하여 관심 단백질의 엄격하게 조절된 발현(더 높은 온/오프 비율)을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 관심 RNA 또는 단백질의 엄격하게 조절된 유도성 발현에 유용한 이중 쿠메르마이신/쿠메이트 유전자-스위치를 포함하는 발현 시스템이 제공된다. 따라서, 본원에는 a) 구성적 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 쿠메이트 리프레서 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 발현 카세트; b) 쿠메이트-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 발현 카세트; 및 c) (i) 쿠메르마이신-유도성 프로모터, 클로닝 부위, 및 폴리아데닐화 신호(여기서, 클로닝 부위는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 삽입을 위한 것임) 또는 (ii) 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 제3 발현 카세트를 포함하는, 발현 시스템이 제공된다.
용어 "발현 카세트"는 발현 카세트의 특정 부분이 RNA(예컨대, 안티센스 RNA, 긴 비-코딩 RNA 또는 렌티바이러스와 같은 바이러스의 게놈을 위한)로 및/또는 세포 기계에 의해 후속하여 단백질로 번역되는 메신저 RNA로서 전사될 수 있도록, 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 지칭한다. 용어 "발현 카세트"는 또한 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 작동 가능하게 연결된 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 삽입을 위한 클로닝 부위를 포함하는 핵산 분자를 지칭하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자" 및 이의 파생물은 비변형된 DNA 또는 RNA 또는 변형된 DNA 또는 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 개시의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 더욱 통상적으로 이중-가닥 또는 단일-과 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역으로 구성될 수 있다. 본 개시의 핵산 분자는 또한 안정성 또는 다른 이유로 변형된 하나 이상의 변형된 염기 또는 DNA 또는 RNA 백본을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어, 삼중수소화 염기 및 이노신과 같은 특이 염기를 포함한다. DNA 및 RNA에 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 따라서 "핵산 분자"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 상응하는 의미를 가질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "클로닝 부위"는 재조합 DNA 기술(클로닝)을 사용하여 관심 핵산 분자가 삽입될 수 있거나 관심 핵산 분자가 결합될 수 있는 핵산 분자의 일부를 지칭한다. 발현 카세트의 맥락에서, 클로닝 부위는 프로모터와 폴리아데닐화 신호 사이에 위치하여, 관심 핵산 분자가 프로모터 및 폴리아데닐화 부위와 작동 가능한 연결로 발현 카세트 내로 클로닝될 수 있다. 여러 클로닝 기술이 당업자에게 공지되어 있으며, 클로닝 부위는 클로닝 부위에서 관심 핵산 분자의 삽입을 가능하게 하는 필요한 특징(예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 부위(들), 재조합효소 인식 부위(들), 또는 평활 또는 돌출 말단(들))을 포함할 것이다. 클로닝 부위는 관심 핵산 분자가 삽입되게 하는, 예를 들어, 다중 클로닝 부위(MCS) 또는 복수의 독특한 제한 효소 인식 부위를 포함하는 폴리링커 영역일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 클로닝 부위는 DNA 삽입을 촉매화하기 위해, 인테그라제 또는 Cre 재조합효소와 같은 부위-특이적 재조합효소(들)를 사용하는, 재조합 클로닝에 의한 DNA 삽입을 가능하게 하는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함할 수 있다. 재조합 클로닝 시스템의 예는 Gateway®(Integrase), Creator™(Cre Recombinase), 및 Echo Cloning™(Cre Recombinase)을 포함한다. 일부 클로닝 전략의 경우, 발현 카세트 또는 벡터는 선형 분자로서 제공될 수 있어, 관심 핵산 분자의 평활 또는 돌출된 말단이, 예를 들어, 라이게이션 또는 폴리머라제 활성에 의해 발현 카세트 또는 벡터의 평활 또는 돌출 말단에 결합되어, 원형 분자를 형성할 수 있게 한다. 이러한 경우, 발현 카세트 또는 벡터의 평활 또는 돌출 말단은 함께 클로닝 부위로 간주될 수 있다. 이러한 접근법은 일반적으로 PCR 생성물을 클로닝하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 두 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 두 성분 사이의 관계를 지칭한다. 예를 들어, 관심 RNA를 인코딩하는 DNA가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경우, 프로모터는 그 안에 인코딩된 RNA의 발현을 작동시킨다.
용어 "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 일반적으로, 다운스트림(즉, 3') 서열의 전사를 개시하여 RNA를 생성하기 위해 RNA 폴리머라제에 의해 결합될 수 있는 조절 DNA 서열을 지칭한다. 적합한 프로모터는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 임의의 RNA 폴리머라제에 의해 결합되거나 인식될 수 있다. 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 일부 발현 카세트에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 구성적 프로모터의 예는 인간 유비퀴틴 C(UBC), 인간 신장 인자 1알파(EF1A), 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK), 혈관활성 장 펩타이드(VIP), 티미딘 키나제(tk), 열 충격 단백질(HSP), 아데노바이러스의 주요 후기 프로모터(MLP), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 베타-액틴, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 하이브리드 CMV 인핸서/베타-액틴 프로모터(CAG), 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 발현 카세트에서, 프로모터는 유도성 프로모터이고/거나 전사를 각각 활성화 또는 억제할 전사활성제 또는 리프레서에 대한 결합 서열을 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 쿠메이트-유도성 프로모터 및 쿠메르마이신-유도성 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "쿠메이트-유도성 프로모터"는 쿠메이트 이펙터 분자의 부재 하에서, CymR(서열번호 1 및 2) 또는 이의 기능적 변이체와 같은, 쿠메이트 리프레서 단백질에 의해 결합될 수 있는 프로모터를 지칭한다. 쿠메이트 이펙터 분자의 결합은 CymR과 같은 쿠메이트 리프레서 단백질에 의한 전사 억제를 완화시킨다. 쿠메이트-유도성 프로모터는 예를 들어, 미국 특허 제7,745,592호에 기재되어 있고, 예를 들어, CMV, VIP, tk, HSP, MLP, 및 MMTV 프로모터로부터 선택된 포유동물 프로모터, 및 적어도 하나의 CymR 오퍼레이터 서열(CuO)로부터의, 최소 프로모터 서열(예를 들어, TATA 박스 및 인접 서열)을 포함한다. CuO 서열은, 예를 들어, US7745592호에 기재된 바와 같은 CuO P1(서열번호 4) 또는 CuO P2를 포함한다. 일부 구현예에서, CuO P2(서열번호 3)와 같은 회문(palindromic) 특징을 갖는 CuO가 사용된다. 본 개시의 일부 구현예에서, CMV5-CuO(서열번호 5) 또는 이의 기능적 변이체가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "쿠메이트 이펙터 분자"는 쿠메이트 리프레서 단백질에 의한 전사 억제를 완화시키는 분자를 지칭한다. 쿠메이트 이펙터 분자는 쿠메이트, p-에틸벤조산, p-프로필벤조산, 쿠믹산, p-이소부틸벤조산, p-3차-부틸벤조산, p-N-디메틸아미노벤조산, 및 p-N-에틸아미노벤조산을 포함한다. 일 구현예에서, 쿠메이트 이펙터 분자는 쿠메이트이다.
본원에서 사용되는 용어 "쿠메르마이신-유도성 프로모터"는 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질에 의해 결합될 수 있는 프로모터를 지칭한다. 쿠메르마이신-유도성 프로모터는, 예를 들어, 미국 특허 제8,377,900호에 기재되어 있고, 예를 들어, CMV, VIP, SV40, tk, HSP, PGK, MLP, EF1a, 및 MMTV 프로모터, 및 이의 기능적 변이체로부터 선택된 구성적 포유동물 프로모터, 및 적어도 하나의 람다 오퍼레이터(lambdaOp) 서열(서열번호 6)로부터의 최소 프로모터 서열(예를 들어, TATA 박스 및 인접 서열)을 포함한다. 쿠메르마이신-유도성 프로모터는, 예를 들어, lambdaOp의 1 내지 13 복사체, 선택적으로 lambdaOp의 11, 12(서열번호 7) 또는 13(서열번호 8) 복사체, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 최소 CMV 프로모터 및 lambdaOp의 수 개의 복사체, 예컨대, 11, 12 또는 13 복사체, 예를 들어, 각각 서열번호 9 및 10 및 도 13 및 14에 제시된 바와 같은 12xlambda-CMVmin 또는 13xlambda-CMVmin, 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는 최소 CMV 프로모터, 및 예를 들어, 서열번호 11 및 도 15에 제시된 바와 같은 프로모터 13xlambda-TPL, 또는 이의 기능적 변이체에 대한 것과 같은, 아데노바이러스의 삼중 리더(TPL) 및 주요 후기 프로모터(MLP) 인핸서를 갖는 LambdaOP의 여러 복사체를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터는, 예를 들어, lambdaOp의 11개 복사체, 최소 CMV 프로모터, 아데노바이러스 TPL 및 MLP 인핸서 및 서열번호 12 및 도 16에 제시된 인간 베타-글로빈 인트론의 일부, 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 프로모터 11xlambda-hbgmin에 대한 것과 같은, 다른 다운스트림 서열과 관련된 lambdaOp의 수 개의 복사체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질"은 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 쿠메르마이신-유도성 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 지칭한다. 쿠메르마이신 이펙터 분자의 결합은 λR-GyrB와 같은 키메라 전사활성제 단백질의 이량체화, 및 쿠메르마이신-유도성 프로모터로부터의 전사 활성화를 초래한다. 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질은 예를 들어, 미국 특허 제8,377,900에 기술되어 있고, DNA 자이라제 B 서브단위(GyrB)에 λ 리프레서(λR)의 N-말단 도메인을 융합시킨 후 전사활성화 도메인(transactivation domain)으로도 지칭되는 전사 활성화 도메인(transcription activation domain)에 융합시킴으로써 작제화될 수 있다. λR의 N-말단 도메인은 이량체로서 lambdaOp에 결합한다. GyrB 도메인은 쿠메르마이신에 결합한 후 이량체를 형성하고, 따라서 λR의 N-말단 도메인의 이량체화를 촉진하고, 이는 이후 lambdaOp에 결합하고, 활성화 도메인을 통해 전사를 활성화시킬 수 있다. 단순화를 위해, 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질은 본원에서 단순히 "λR-GyrB"로 지칭될 수 있다. 적합한 전사 활성화 도메인은 전사 인자 NFκB p65, VP16, B42 및 Ga14로부터의 것들을 포함한다. 일 구현예에서, 전사활성화 도메인은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 NFkB p65로부터 유래된다. 일 구현예에서, 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질은 서열번호 13 또는 14에 제시된 서열, 또는 이의 기능적 변이체를 갖는다. 적합한 쿠메르마이신 이펙터 분자는 쿠메르마이신을 포함한다. 단백질 발현의 추가적인 억제를 제공하거나 누출 발현을 방지하기 위해, 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질의 이량체화 및 활성화는 억제제, 예컨대, 노보비오신의 첨가에 의해 억제될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리아데닐화 신호" 또는 "pA"는 일반적으로, 전사된 RNA가 절단되고 폴리아데닐화 꼬리가 첨가되는 부위로서, 메신저 RNA(mRNA)와 같은 RNA의 전사를 종결시키는 효과를 갖는, 폴리아데닐화 신호(pA)를 지칭한다. 적합한 pA는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다. pA 신호의 예는 토끼 베타-글로빈 pA(서열번호 16), 강한 소 성장 호르몬 pA(BGHpA; 서열번호 17) 및 SV40 폴리 A 신호(서열번호 18)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "기능적 변이체"는 실질적으로 동일한 방식으로 본원에 개시된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 본원에 개시된 핵산 서열 또는 단백질의 변형 또는 화학적 등가물을 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩타이드의 기능적 변이체는, 비제한적으로, 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용되는 "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 생화학적 특성(예를 들어, 전하, 소수성 및 크기)을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 폴리펩타이드의 변이체는 또한 본원에 개시된 폴리펩타이드 서열에 대한 첨가 및 결실을 포함한다. 또한, 변이체 뉴클레오타이드 서열은 이의 유사체 및 파생물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시된 핵산 서열에 대한 기능적 변이체를 포함한다. 기능적 변이체는 적어도 적당히 엄격한 혼성화 조건 하에, 상기 제시된 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"적어도 적당히 엄격한 혼성화 조건"은 용액에서 2개의 상보적인 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화를 촉진하는 조건이 선택되는 것을 의미한다. 용어 "적어도 적당히 엄격한 혼성화 조건은 엄격한 혼성화 조건 및 적당히 엄격한 혼성화 조건을 포함한다. 혼성화는 핵산 서열 분자의 전부 또는 일부에 발생할 수 있다. 혼성화 부분은 통상적으로 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30, 40 또는 50개)의 뉴클레오타이드 길이이다. 당업자는 핵산 듀플렉스 또는 하이브리드의 안정성이 나트륨 함유 완충제에서 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수인, Tm에 의해 결정된다는 것을 인지할 것이다(Tm = 81.5℃ - 16.6(Log10[Na+]) + 0.41(%(G+C) -600/I), 또는 유사한 방정식). 따라서, 하이브리드 안정성을 결정하는 세척 조건의 파라미터는 나트륨 이온 농도 및 온도이다. 공지된 핵산 분자와 유사하지만 동일하지 않은 분자를 확인하기 위해, 예를 들어, > 95% 동일성을 가지고, 최종 세척 온도가 약 5℃만큼 감소될 핵산 분자를 찾은 경우, 1% 부정합은 Tm의 약 1℃ 감소를 초래할 것으로 추정될 수 있다.
될 것이다. 이러한 고려 사항에 기초하여, 당업자는 적절한 혼성화 조건을 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 엄격한 혼성화 조건이 선택된다. 예로서, 하기 조건이 엄격한 혼성화를 달성하기 위해 사용될 수 있다: 상기 식에 기초하여 Tm - 5℃에서 5x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)/5x 덴하르트 용액/1.0% SDS에서의 혼성화, 이후 60℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS의 세척. 적당히 엄격한 혼성화 조건은 42℃에서 3x SSC에서의 세척 단계를 포함한다. 그러나, 대안적인 완충제, 염 및 온도를 사용하여 동등한 엄격성이 달성될 수 있는 것으로 이해된다. 혼성화 조건에 관한 추가 지침은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 2002] 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에서 확인될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 기능적 변이체 핵산 서열은 축퇴 코돈 치환 또는 코돈-최적화된 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "축퇴 코돈 치환"은 코돈의 제2 및/또는 제3 염기가 그 안에 인코딩된 아미노산 서열의 변화를 초래하지 않는 상이한 염기로 치환된, 변이체 핵산 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "코돈-최적화된"은 특정 유기체의 코돈 사용 편향을 반영하는 하나 이상의 축퇴 코돈 치환을 포함하는 변이체 핵산 분자를 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 기능적 변이체 핵산 또는 단백질 서열은 본원에 개시된 서열과 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열 간의 서열 동일성의 백분율을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 도입될 수 있다). 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자는 그러한 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간의 동일성 퍼센트는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 중첩 위치의 수/총 위치 수 × 100%). 일 구현예에서, 2개의 서열은 동일한 길이이다. 2개의 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 또한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 하나의 비제한적인 예는 문헌[Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]에서와 같이 변형된, 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등(1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 개시의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해, 예를 들어, 스코어 = 100, 워드 길이 = 12로 설정된 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해, 예를 들어, 스코어-50, 워드 길이 = 3으로 설정된 XBLAST 프로그램 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭핑된 정렬을 수득하기 위해, 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이, Gapped BLAST가 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST는 분자들 사이의 먼 관계(distant relationship)를 검출하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 개개 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST의)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, NCBI 웹사이트 참조). 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비제한적인 예는 문헌[Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중 잔기 테이블(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 2개의 서열 간의 동일성 퍼센트는 갭을 허용하거나 허용하지 않고 상기 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 퍼센트를 계산할 때, 통상적으로 정확한 정합(match)만이 카운팅된다.
본원에 기재된 발현 시스템은 임의의 관심 RNA 또는 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 발현 시스템은 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩한다. 관심 RNA 또는 단백질은 세포독성이거나 세포 성장 및/또는 생존력을 감소시킬 수 있다. 일 구현예에서, 관심 단백질은 재조합 단백질이다.
본원에 기재된 발현 시스템은, 예를 들어, 항체 또는 바이러스 벡터와 같은 복합 생물학적 제제의 발현을 위해 2개 이상의 관심 RNA 또는 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 발현 시스템은 추가의 관심 RNA 또는 단백질의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 추가적인 발현 카세트를 포함한다. 추가의 관심 RNA 또는 단백질은 동일한 조절 요소 또는 상이한 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 추가적인 발현 카세트(들)는 동일하거나 상이한 프로모터 및/또는 동일하거나 상이한 pA 신호를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 발현 시스템은 바이러스 벡터의 생산에 관여하는 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 인코딩한다. 본원에서 사용되는 용어 "바이러스 벡터"는 표적 세포의 형질도입이 가능한 바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 것으로 의도된다. 일반적인 바이러스 벡터는 HIV-유래 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다른 바이러스 벡터는 랍도바이러스(예컨대, 수포성 구내염 바이러스(VSV)), 또는 헤르페스 바이러스(예컨대, CMV 및 HSV-1)로부터 유래될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 발현 시스템은 바이러스 벡터의 성분을 인코딩한다. 통상적인 성분은 벡터의 캡시드 및 외피를 만드는 단백질과 같은 벡터의 구조적 성분이다. 다른 성분은 벡터 RNA 또는 DNA의 복제에 관여하는 효소이다. 이러한 효소는 또한 바이러스 RNA의 합성, 성숙 또는 수송에 관여할 수 있다. 이러한 효소는 또한 바이러스 성분의 가공 및 성숙뿐만 아니라 세포 염색체로의 바이러스 게놈의 통합에 관여할 수 있다. 바이러스 벡터의 성분인 효소는 또한 바이러스 게놈 RNA의 DNA로의 역전사에 관여할 수 있다. 벡터의 다른 성분은 바이러스 벡터의 유전자 또는 유전자 생성물의 복제, 전사, 수송 또는 번역을 조절하는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이러한 인자는 또한 세포 유전자의 발현을 활성화 또는 감소시킬 수 있으며, 이들은 바이러스에 대한 세포의 방어 기전을 조절할 수 있다. 아데노바이러스 및 렌티바이러스의 프로테아제(렌티바이러스의 gag/pol 유전자에 의해 인코딩됨), AAV의 Rep 단백질 및 VSV의 외피 당단백질(VSVg)과 같은, 바이러스 벡터의 일부 성분은 세포에 독성이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 목록은 완전한 것이 아니며, 바이러스 벡터 또는 바이러스의 다른 성분은 구성적으로 또는 너무 높은 농도로 생산되는 경우 독성이 있을 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. REV, Gag/Pol 및 VSVg와 같은 외피 단백질의 발현은 렌티바이러스 벡터의 생산에 관여한다. 따라서, 일부 구현예에서, 발현 시스템은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, REV, Gag/Pol, 및 VSVg와 같은 외피 단백질 각각을 인코딩하는 추가적인 발현 카세트를 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 바이러스 성분은 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 선택적으로, 모든 바이러스 성분은 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, Gag/Pol은 구성적 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, Gag/Pol은 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV)이다. Rep 단백질의 발현은 AAV의 생산에 관여한다. 따라서, 일부 구현예에서, 유도성 발현 시스템은 쿠메르마이신-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Rep40, Rep52, Rep68, 또는 Rep78을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, Rep40, Rep52, Rep68, 또는 Rep78을 인코딩하는 하나 이상의 추가적인 발현 카세트를 포함하며, 여기서, 적어도 하나는 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 Rep40 또는 Rep52 중 적어도 하나를 인코딩하는 발현 카세트, 및 Rep68 또는 Rep78 중 적어도 하나를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하며, 여기서, 적어도 하나는 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 예를 들어, 발현 시스템은 Rep40 및 Rep68, Rep40 및 Rep78, Rep52 및 Rep68, 또는 Rep52 및 Rep78을 포함할 수 있다. 선택적으로, 모든 바이러스 성분은 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 구현예에서, 유전자 발현 시스템은 항체 단편, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 인코딩한다. 항체 단편, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄는 별도의 발현 카세트에서 인코딩될 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 및 인간화 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있고/있거나 유전자 이식 동물에서 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 및 이들의 다량체, 다중특이적 항체 단편 및 도메인 항체를 비제한적으로 포함하는 것으로 의도된다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 다른 단편은 재조합 단백질로서 발현될 수 있다.
기본 항체 구조 단위는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있으며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄("L")(약 25 kDa) 및 하나의 중쇄("H")(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 경쇄의 아미노-말단 부분은 경쇄 가변 도메인(VL)을 형성하며, 중쇄의 아미노-말단 부분은 중쇄 가변 도메인(VH)을 형성한다. 함께, VH 및 VL 도메인은 항원 인식/결합을 주로 담당하는 항체 가변 영역(Fv)을 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단 부분은 함께 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 형성한다.
III. 방법
관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 본원에 기재된 발현 시스템은 그 안에 인코딩된 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 생산을 위해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 따라서, 본 개시의 일 양태는 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 방법은 포유동물 세포에 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 본원에 기재된 발현 시스템을 도입하는 단계, 세포에 선택 가능한 마커를 도입하는 단계, 및 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 발현 시스템을 보유하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법이다.
다양한 포유동물 세포가 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 세포는 당 분야에 잘 알려져 있고, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포, VERO 세포, HeLa 세포, A549 세포, 줄기 세포, 및 뉴런을 비제한적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 HEK293 세포, 선택적으로 미국 특허 제6,210,922호에 기재된 바와 같은 293SF-3F6 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 현탁액에서 성장되고/거나 혈청의 부재 하에 성장할 수 있다.
발현 시스템은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 적합한 방법은 트랜스펙션, 형질도입, 감염, 전기천공, 소노포레이션, 뉴클레오펙션, 및 미세주입을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 트랜스펙션에 의해 세포에 도입된다. 적합한 트랜스펙션 시약은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 양이온성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌이민(PEI), 양이온성 지질, 예컨대, 리포펙타민 및 관련 시약(Invitrogen) 및 비-리포솜 시약, 예컨대, Fugene 및 관련 시약(Promega) 또는 칼슘 포스페이트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 렌티바이러스, 레트로바이러스, AAV 및 아데노바이러스와 같은 적합한 바이러스 벡터를 이용한 형질도입에 의해 세포에 도입될 수 있다.
발현 시스템 또는 이의 성분이 도입된 세포의 선택을 가능하게 하기 위해, 선택 가능한 마커는 발현 시스템과 함께, 또는 발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트와 함께 세포에 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "선택 가능한 마커"는 핵산 작제물을 보유하는 세포에 선택적 이점을 부여하는 핵산 작제물의 요소를 지칭한다. 예를 들어, 선택 가능한 마커는 발현되고 특정 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질을 인코딩할 수 있다. 대안적으로, 선택 가능한 마커는 발현되고 특정 성장 조건 하에 세포 생존에 필수적인 단백질을 인코딩할 수 있다. 적합한 선택 가능한 마커는 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 약물-선택 가능한 마커의 예는 블라스티시딘 내성, 네오마이신 내성, 하이그로마이신 내성, 또는 퓨로마이신 내성을 포함한다.
선택 가능한 마커는 발현 카세트와 동일한 핵산 분자, 또는 상이한 핵산 분자 상에 있을 수 있다. 선택 가능한 마커가 별도의 핵산 분자에 제공되는 경우, 선택 가능한 마커를 갖는 핵산 분자는 다른 핵산 분자(들)보다 낮은 비율 또는 백분율, 예를 들어, 1:4 몰 비, 1:5 몰 비, 또는 1:10 몰 비, 또는 예를 들어, 총 핵산의 25%, 20%, 또는 10%로 제공된다. 선택 가능한 마커를 흡수하는 세포는 마커, 예를 들어, 발현 시스템 또는 이의 성분과 함께 도입된 다른 핵산을 흡수하여, 발현 시스템 또는 이의 성분을 보유하는 세포의 선택을 가능하게 할 것이다.
발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 안정한 세포주는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 개별 세포를 분리하고, 세포를 배양하여 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 세포의 집단을 생성함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 방법은 개별 세포를 분리하는 단계 및 개별 세포를 배양하여 세포의 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트는 동시에 및/또는 순차적으로 세포에 도입될 수 있다. 일 예로서, 모든 3개의 발현 카세트는 단일 단계(예를 들어, 단일 트랜스펙션 또는 단일 형질도입)에서 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 발현 카세트는 단일 단계에서 세포에 도입될 수 있으며, 제3 발현 카세트, 및 선택적으로 제4 및/또는 제5 발현 카세트가 하나 이상의 후속 단계에서 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각의 발현 카세트는 세포에 순차적으로 도입될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법은 포유동물 세포에 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계; 제1 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계; 발현 시스템의 제2 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 제1 세포 집단의 세포에 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 제2 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계; 제2 개별 세포를 배양하여 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득하는 단계; 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 제3 선택 가능한 마커를 제2 세포 집단의 세포에 도입하는 단계; 세포에 선택적 압력을 가하여 제3 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제3 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계; 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 개별 세포를 분리하는 단계; 및 제3 개별 세포를 배양하여 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 발현 시스템을 포함하는 포유동물 세포는 항체 또는 바이러스 벡터와 같은 복합 생물학적 제제의 유도성 생산에 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 방법은 추가적인 성분을 인코딩하는 하나 이상의 추가적인 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 발현 카세트는 추가적인 선택 가능한 마커와 함께 및/또는 임의의 다른 발현 카세트 및/또는 임의의 다른 추가적인 성분과 함께 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 시스템이 바이러스 벡터의 유도성 생산에 사용되는 경우, 추가적인 성분은 (RNA 또는 단백질을 인코딩하는)관심 유전자를 보유하는 바이러스 작제물을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 발현 시스템은 그 안에 인코딩된 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 생산에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시의 일 양태는 하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 유도하는 방법으로서, 방법은 a) 관심 RNA 단백질을 인코딩하는 본 개시의 발현 시스템을 포함하는 포유동물 세포를 수득하는 단계; b) 세포의 성장 배지에 유도제를 첨가하여 유도성 프로모터로부터 발현을 유도하는 단계; 및 c) 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 조건 하에 세포를 배양하여 관심 RNA 또는 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 방법이다.
발현 시스템은 쿠메이트-유도성 프로모터 및 쿠메르마이신-유도성 프로모터를 포함한다. 따라서, 적합한 유도제는 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 쿠메이트 이펙터 분자는 쿠메이트이다. 임의의 적합한 농도의 쿠메이트, 예를 들어, 약 1 내지 200 ㎍/㎖, 약 50 내지 150 ㎍/㎖, 또는 선택적으로, 약 100 ㎍/㎖의 쿠메이트가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 쿠메르마이신 이펙터 분자는 쿠메르마이신이다. 임의의 적합한 농도의 쿠메르마이신, 예를 들어, 약 1 내지 30 nM, 약 5 내지 20 nM, 또는 선택적으로, 약 10 nM의 쿠메르마이신이 사용될 수 있다. 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자는 거의 동시에 또는 순차적으로 성장 배지에 첨가될 수 있다.
IV. 물질의 조성
본 개시의 발현 시스템은 각각 핵산 분자를 포함하는 3개 이상의 발현 카세트를 포함한다. 본원에 기재된 발현 카세트는 하나 이상의 핵산 분자 또는 작제물로서 제공될 수 있다. 핵산 분자 또는 작제물은 세포의 유전 물질 내에 통합될 수 있거나, 플라스미드 내에 통합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 일 양태에서, 본원에 기재된 발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트는 발현 시스템의 발현 카세트 또는 발현 카세트들를 포함하는 하나 이상의 플라스미드의 형태로, 및/또는 발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 발현 카세트는 하나 이상의 플라스미드 상에 제공된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 발현 카세트는 세포의 유전 물질에 통합될 수 있다.
본 개시의 또 다른 양태는 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 발현에 유용한 포유동물 세포를 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 개시는 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 본원에 기재된 발현 시스템을 포함하는 포유동물 세포를 제공한다. 본원에서 사용되는 "발현 카세트를 포함하는 세포", "발현 시스템을 포함하는 세포" 또는 유사한 어구는 지시된 바와 같은 발현 카세트 또는 발현 시스템의 핵산 분자(들)가 도입된 세포를 의미한다. 핵산 분자를 세포에 도입하는 적합한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다.
일 구현예에서, 포유동물 세포는 바이러스 벡터의 유도성 생산에 유용하다. 따라서, 일 구현예에서, 포유동물 세포는 바이러스 벡터의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 추가적인 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)이다.
일 구현예에서, 포유동물 세포는 바이러스 벡터의 성분을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 패키징 세포이다. 일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는, 예를 들어, 렌티바이러스 REV, Gag/pol, 및/또는 바이러스 외피 단백질, 예컨대, VSVg, 선택적으로 VSVg-Q96H-I57L을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 패키징 세포이다. 일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 예를 들어, Rep40, Rep52, Rep68, Rep78, 또는 Rep40 또는 Rep52 중 적어도 하나와 Rep68 또는 Rep78 중 적어도 하나의 조합을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 AAV 패키징 세포이다. 예를 들어, 발현 시스템은 Rep40 및 Rep68, Rep40 및 Rep78, Rep52 및 Rep68, 또는 Rep52 및 Rep78을 포함할 수 있다.
바이러스 작제물은 DNA 또는 RNA로 제조되며, 이들은 이들이 유래된 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, AAV 및 아데노바이러스)의 유전 물질의 일부를 함유한다. 바이러스 작제물은 관심 재조합 단백질 또는 RNA를 생산할 관심 유전자를 보유 및 전달하도록 변형되었고, 예를 들어, 세포 및 유전자 요법에 의한 질환의 치료 및 또한 백신화에 사용될 수 있다. 바이러스 작제물은 또한 관심 유전자를 전달하여 세포 배양물에서 재조합 단백질 또는 RNA를 생산하는 데 사용될 수 있다. 적합한 바이러스 작제물은 당 분야에 잘 알려져 있고, 사용되는 바이러스 벡터 및 바이러스의 유형에 의존한다. 따라서, 일 구현예에서, 바이러스 패키징 세포는 관심 유전자를 보유하는 바이러스 작제물을 추가로 포함한다. 바이러스 작제물의 유형은 사용되는 바이러스 패키징 세포(또는 바이러스 벡터)에 의존할 것이다. 예를 들어, 바이러스 패키징 세포가 렌티바이러스 패키징 세포인 경우, 바이러스 작제물은 렌티바이러스 작제물이다. 바이러스 패키징 세포가 AAV 패키징 세포인 경우, 바이러스 작제물은 AAV 작제물이다.
일 구현예에서, 포유동물 세포는 항체의 유도성 생산에 유용하다. 따라서, 일 구현예에서, 포유동물 세포는 항체의 하나 이상의 추가적인 성분을 인코딩하는 발현 카세트를 포함한다.
하나 이상의 관심 RNA 또는 단백질의 맞춤형 발현을 위한 유연한 도구를 제공하기 위해, 포유동물 세포는 본원에 기재된 발현 시스템의 단지 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포는 본원에 기재된 발현 시스템의 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 "발현 준비된" 세포일 수 있다. 제3 발현 카세트는, 예를 들어, 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하기 위해 사용자에 의해 맞춤화될 수 있는 플라스미드에 혼입될 수 있고, 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 생산을 위한 세포를 생성하기 위해 발현 준비된 세포에 도입될 수 있다.
V. 키트
본원에 기재된 발현 시스템은 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 발현을 위한 키트로서 제공될 수 있다. 따라서, 양태는 관심 RNA 또는 단백질의 유도성 발현을 위한 키트를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 본 개시의 발현 시스템을 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 본 개시의 발현 시스템 및 하나 이상의 유도제를 포함하는 세포를 포함한다. 추가 구현예에서, 키트는 발현 시스템의 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 "발현 준비된" 세포, 및 쿠메르마이신-유도성 프로모터, 클로닝 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 플라스미드 및/또는 제3 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함한다.
발현 시스템이 바이러스 벡터를 생산하는 경우, 키트는 바이러스 벡터의 성분을 인코딩하는 본 개시의 발현 시스템, 및 적합한 바이러스 작제물을 포함하는 바이러스 패키징 세포를 포함할 수 있다.
하기 비제한적인 실시예는 본 개시의 예시이다:
VI. 실시예
본 개시에서, 인간 배아 신장 세포(HEK293 세포)로부터 유래된 세포주와 같은 세포주를 조작하여 쿠메이트 유전자-스위치(CymR로 공지됨) 및 쿠메르마이신 키메라 전사활성제(λR-GyrB)의 리프레서를 생산하였다. HEK293-유래된 293SF-3F6 세포는 이들이 규모 확대를 용이하게 하고 규제 준수를 위해 현탁 배양물 및 무혈청 배지에서 성장하기 때문에 본원에서 사용되었다. 생성된 세포주는 293SF-CymR/λR-GyrB로 지칭된다(도 1).
쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치에 의해 제공되는 유도 수준은 유도 전(Off) 및 유도 후(On)의 유전자 발현의 온/오프 비율을 비교함으로써 결정된 바와 같이, 리프레서 구성에서 쿠메이트-유전자 스위치와 비교하여 130배 더 높고, 역 전사활성제 구성에서 쿠메이트 유전자-스위치와 비교하여 30배 더 높았다(도 5).
렌티바이러스(LV)로부터 유래된 바이러스 벡터에 대한 패키징 및 생산자 세포를 생성하기 위해 이를 사용함으로써 복합 생물학적 약물을 제조하기 위한 신규한 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 유용성이 본원에서 입증된다. LV는 유전자 및 세포 요법 적용을 위한 매우 중요한 벡터이다(Dropulic, 2011; Escors and Breckpot, 2010; Matrai et al., 2010). 본원에 기재된 LV에 대한 패키징 및 생산자 세포는 293SF-CymR/λR-GyrB 세포로부터 유래되고, 현탁 배양물 및 무혈청 배지에서 성장할 수 있다. LV를 제조하기 위해, 세포는 수포성 구내염 바이러스(VSVg)의 외피 당단백질 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 Gag/pol 유전자에 의해 인코딩된 프로테아제와 같은 세포독성 단백질을 생산해야 한다. 이러한 유전적 요소를 함유하는 세포는 매우 엄격하게 조절되는 유도성 유전자 발현 시스템을 사용함으로써만 작제될 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV)에 대한 패키징 세포의 생성이 또한 본원에 기재된다. AAV는 유전자 및 세포 요법 적용을 위한 또 다른 중요한 바이러스 벡터이다(Balakrishnan and Jayandharan, 2014; Kotterman and Schaffer, 2014; Robert et al., 2017; Weitzman and Linden, 2011). 더욱 구체적으로, AAV의 높은 세포독성 Rep 단백질을 발현하는 세포주(293SF-Rep)를 작제하기 위한 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 사용이 본원에서 입증된다. Rep 단백질은 AAV의 복제 및 어셈블리에 필수적이다. 본원에 제시된 바와 같이, 293SF-Rep 세포는 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로의 유도 후 AAV를 생산할 수 있었다.
실시예 1. 293SF-CymR/λR-GyrB의 작제
293SF-CymR/λR-GyrB 세포주를 생성하기 위한 제1 단계는 쿠메이트 유전자-스위치(293SF-CymR)의 리프레서를 발현하는 안정한 세포주를 작제하는 것이었다.
293SF-CymR 세포주(클론 198-2)의 작제
무혈청 현탁 배양물에 적응된 HEK293 세포의 클론(클론 293SF-3F6(Cote et al., 1998))을 CymR 유전자에 대한 수용체로 사용하였다. 간략하게, 세포를 CMV5 프로모터에 의해 조절되는 CymR 유전자를 인코딩하는 플라스미드(도 2A)(본원에 개시된 제1 발현 카세트의 예) 및 퓨로마이신에 대한 내성을 인코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후, 세포를 퓨로마이신의 존재 하에 96-웰 플레이트에서 희석하였다. 내성 콜로니를 선택하고, 증폭시켰다. 클론에서 CymR의 존재는 CMV5CuO 프로모터에 의해 조절되는 LV 발현 GFP(LV-CMV5CuO-GFP, 도 3A)로 이들을 형질도입함으로써 시험하였다. LV-CMV5CuO-GFP로 형질도입하고 쿠메이트로 유도한 후 GFP 발현의 수준을 형광 현미경으로 가시화하거나, 유도된 세포와 유도되지 않은 세포를 비교함으로써 유세포 분석에 의해 정량화하였다(온/오프 비율). 최상의 온/오프 비율을 갖는 클론을 확장시키고 뱅킹하였다(LV로 유도되지도 처리되지도 않은 세포 집단의 서브세트를 세포 확장 및 세포 뱅킹에 사용하였다). 이후, 최상의 온/오프 비율을 갖는 클론(#169 및 #198)을 반고체 배지에서 낮은 세포 밀도로 플레이팅함으로써 서브클로닝하였다. 이후, 잘 분리된 콜로니를 전술한 바와 같이(Caron et al., 2009) 로봇 세포 선택기(ALS CellCellector™)를 사용하여 선택하였다. 서브클론을 증폭시키고, LV-CMV5CuO-GFP로 세포를 형질도입함으로써 CymR이 유전자 발현을 조절하는 능력에 대해 시험하였다. 최상의 서브클론 중 하나는 클론 198-2로 지칭된다.
293-CymR 세포에 λR-GyrB의 삽입
293SF-CymR 세포(클론 198-2)를 CMV5CuO 프로모터에 의해 조절되는 λR-GyrB 전사활성제를 인코딩하는 플라스미드(도 2B)(본원에 개시된 제2 발현 카세트의 예) 및 블라스티시딘에 대한 내성을 인코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후, 세포를 블라스티시딘의 존재 하에 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 내성 콜로니를 선택하고, 증폭하고, 12xlambda-TPL 프로모터에 의해 조절되는 LV 발현 GFP(LV-12xlambda-TPL-GFP, 도 3B)로 형질도입함으로써 λR-GyrB의 존재에 대해 시험하였다. 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로의 유도 후 유세포 분석에 의해 GFP 발현을 측정함으로써 가장 높은 온/오프 비율에 기초하여 최상의 클론을 선택하였다. 최상의 클론을 상기 기재된 바와 같이 증폭시키고 뱅킹하였다. 이들을 96-웰 플레이트에서 제한 희석에 의해 서브클로닝하였다. 콜로니를 선택하고, 확장하고, LV-12xlambda-TPL-GFP를 사용한 형질도입 및 유도 후 유세포 분석에 의한 분석에 의해 상기 기재된 바와 같이 λR-GyrB의 존재에 대해 시험하였다.
쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치는 쿠메이트 유전자-스위치보다 더 우수한 유도 수준을 제공한다
LV-12xlambda-TPL-GFP로 형질도입시킨 후 293SF-CymR/λR-GyrB의 최상의 클론 중 3개의 온/오프 비율을 시험함으로써 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 효능을 평가하였다. 293SF-CymR의 최상의 클론(상기 기재됨) 및 293SF-CymR/rcTA의 최상의 클론으로 수득된 온/오프 비율을 또한 비교를 위해 시험하였다. CMV에 의해 조절되는 CymR을 인코딩하는 플라스미드 및 CMV5CuO 프로모터에 의해 조절되는 역전사활성제 rcTA를 인코딩하는 플라스미드(도 2C)로 293SF-3F6 세포를 트랜스펙션시키고, 둘 모두의 유전자를 상기 기재된 바와 같은 이들의 유전자에 안정적으로 통합한 클론을 분리함으로써 293SF-CymR/rcTA의 클론을 생성하였다. 293SF-CymR/rcTA의 경우, 쿠메이트의 첨가는 (CymR에 의한 억제를 해제함으로써) rcTA 유전자의 전사를 활성화시킨다. 합성 후, rcTA는 CR5 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시킨다(Mullick et al., 2006)(도 4). 293SF-CymR/rcTA 클론을 작제하는 데 사용되는 단계의 상세한 설명은 물질 및 방법이라는 제목의 섹션에 제공된다.
세포를 각각 LV-CMV5CuO-GFP 및 LV-CR5-GFP로 형질도입하고 유도 후 유세포 분석에 의해 GFP 발현 수준을 측정함으로써 293SF-CymR 및 293SF-CymR/rcTA 클론의 온/오프 비율을 시험하였다. LV-CR5-GFP는 CR5 프로모터에 의해 조절되는 GFP 유전자를 보유한다(도 3C). 관찰된 온/오프 비율은 293SF-CymR, 293SF-CymR/rcTA 및 293SF-CymR/λR-GyrB 클론에 대해 각각 대략 30, 100 및 4000이었다(도 5). 온/오프 비율이 CymR만을 발현하는 세포 또는 CymR/rcTA 조합을 발현하는 세포와 비교하여 CymR/λR-GyrB를 발현하는 세포에 대해 293SF-CymR 및 293SF-CymR/rcTA 클론의 온/오프 비율이 130(4000/30) 및 40(4000/100)배 더 높았다는 사실은 쿠메이트/쿠메르마이신 스위치가 훨씬 더 나은 유도 수준을 제공함을 나타낸다.
실시예 2. LV의 생산을 위한 패키징 세포의 작제
복합 생물학적 생성물을 생산하기 위한 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 유용성을 입증하기 위한 한 가지 예로서, 293SF-CymR/λR-GyrB 클론 중 하나를 사용하여 LV 생산을 위한 유도성 패키징 세포주를 작제하였다. LV는 암 또는 유전 장애를 치료하기 위해 환자에게 전달되는 세포를 유전적으로 변형시키는 데 사용되기 때문에 세포 요법에 가장 중요하다(Dropulic, 2011; Milone and O'Doherty, 2018). 세포 요법 분야의 과제 중 하나는 임상 적용에 필요한 양의 양질의 LV를 합리적인 비용으로 적시에 생산하는 것이다.
LV의 생산을 촉진하기 위한 한 가지 해법은 LV의 어셈블리에 필요한 모든 유전적 요소를 함유하는 패키징 세포를 작제하는 것이다. 3세대 LV의 경우, LV를 생산하기 위해 3개의 유전자가 필요하다: Rev, Gag/Pol 및 외피 단백질(Cockrell and Kafri, 2007; Dropulic, 2011; Pluta and Kacprzak, 2009). 사용되는 가장 일반적인 외피 단백질은 VSVg이다. 패키징 세포주의 이용 가능성으로, 과학자들은 트랜스펙션의 필요 없이 LV를 생산할 수 있는 안정한 생산자 클론을 생성할 수 있다. 일시적인 트랜스펙션에 비해 생산자 클론의 장점은 재현성 및 단순성이다(트랜스펙션 및 플라스미드의 제조 없음). 현탁 배양물에 적응된 패키징 세포의 이용은 LV 생산의 규모 확대를 크게 촉진할 것이다. 또한, 무혈청 배양 배지의 사용은 더 안전하고 더 잘 특성화되는 생성물을 생성하여, cGMP 제조를 용이하게 할 것이다.
LV를 생산하는 데 필요한 유전자 중 일부(Gag/pol 및 VSVg)는 세포독성이며, 따라서 이들은 숙주 세포를 사멸시키는 것을 피하기 위해 세포 성장 및 세포 뱅킹 동안 엄격하게 불활성화되어야 한다. 이러한 이유로, LV에 대한 패키징 세포의 성공적인 작제는 효율적인 유도성 발현 시스템을 사용해야만 가능하였다(Broussau et al., 2008; Farson et al., 2001; Kafri et al., 1999; Ni et al., 2005; Pacchia et al., 2001; Sanber et al., 2015; Sparacio et al., 2001).
패키징 세포를 생성하기 위한 첫 번째 단계는 Rev, Gag/pol 및 VSVg 유전자를 보유하는 플라스미드를 작제하는 것이었다. 먼저, Rev 및 VSVg의 전사가 13xlambda-TPL 프로모터에 의해 제어되는 플라스미드를 작제하였다(도 6 및 15). 2개의 상이한 프로모터를 Gag/Pol:11xlambda-hbgmin 및 CAG 프로모터의 발현에 대해 시험하였다(도 6 및 16). CAG는 CMV 인핸서를 액틴 프로모터에 융합시킴으로써 제조된 강한 구성적 하이브리드 프로모터이다(Miyazaki et al., 1989). 후자의 경우, Gag/pol이 강한 구성적 CAG 프로모터에 의해 조절된다는 사실에도 불구하고, 이의 mRNA는 Rev 단백질의 부재 하에 세포질로 수송되어 폴리단백질로 번역될 수 없다. 이러한 이유로, Gag/pol 폴리펩타이드의 생산에는 Rev의 존재가 필요하다. 따라서, Rev 유전자의 전사는 Gag/pol 폴리펩타이드의 합성을 간접적으로 제어한다.
패키징 세포를 생산하기 위해 두 가지 전략이 사용되었다. 첫 번째 전략에서, 293SF-CymR/λR-GyrB 세포를 11xlambda-hbg-Gag/Pol, 13xlambda-TPL-Rev, 13xlambda-TPL-VSVg에 대한 플라스미드(본원에 개시된 바와 같은 제3, 제4, 및 제5 발현 카세트의 예) 및 네오마이신에 대한 내성을 인코딩하는 제4 플라스미드(본원에 개시된 바와 같은 선택 가능한 마커의 예)로 트랜스펙션시켰다. 두 번째 전략에서, 293SF-CymR/λR-GyrB 세포를 CAG-Gag/Pol, 13xlambda-TPL-Rev, 13xlambda-TPL-VSVg에 대한 플라스미드 및 하이그로마이신에 대한 내성을 인코딩하는 플라스미드(본원에 개시된 바와 같은 선택 가능한 마커의 다른 예)로 트랜스펙션시켰다.
트랜스펙션 후, 선택적 제제를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 내성 세포의 풀을 희석에 의해 나노웰에 클로닝하였다. 단일 세포로부터 유래된 내성 콜로니(플레이팅 시점에 사진을 촬영함으로써 문서화됨)를 로봇 세포 선택기(CellCelector™)를 이용하여 분리하고, 384 웰-플레이트에 옮겼다. 이후, 세포를 확장시키고, LV의 생산에 대해 시험하였다.
패키징 세포에 대한 클론을 CMV에 의해 조절되는 LV 발현 GFP(LV-CMV-GFP)(도 3D)(본원에 개시된 렌티바이러스 작제물의 예)를 인코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션시킴으로써 LV의 생산에 대해 스크리닝하였다. 트랜스펙션되지 않은 세포의 하위집단은 최상의 클론의 증폭 및 세포 뱅킹을 위해 별도로 보관하였다. 일시적 트랜스펙션 후에 생산된 LV-CMV-GFP의 역가를 HEK293 세포의 형질도입 후 유세포 분석에 의해 측정하였다. CAG-Gag/Pol 플라스미드 또는 11xlambda-hbgmin-Gag/Pol 플라스미드를 사용하는, 두 전략 모두는 배양 배지에서 ml 당 1.0 × 106 형질도입 단위(TU) 초과의 역가를 갖는 패키징 세포를 생성할 수 있었다. 여러 클론은 또한 1.0 × 107 TU/ml 초과의 역가를 생산하였다(도 7). 쿠메이트-스위치만으로 작제된 패키징 세포를 사용하여 LV를 생산하는 클론을 분리하려는 이전의 시도는 성공하지 못했다(도시되지 않음).
실시예 3. LV에 대한 안정한 생산자의 작제
패키징 세포(클론 3D4(도 7B))를 사용하여 일시적 트랜스펙션의 필요 없이 LV를 만드는 능력을 갖는 생산자 클론을 생성하였다. 간략하게, 패키징 세포 3D4를 LV-CMV-GFP를 인코딩하는 플라스미드(도 3D) 및 네오마이신에 대한 내성을 인코딩하는 플라스미드로 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후, 선택적 제제(네오마이신)를 세포에 첨가하고, 네오마이신 내성 콜로니를 희석에 의해 나노웰 플레이트에 클로닝하였다. 로봇 세포 선택기(CellCelector™)를 사용하여 콜로니를 분리하고 384 웰 플레이트로 옮겼다. 클론을 확장시키고, 유도 인자(쿠메이트 및 쿠메르마이신)를 첨가함으로써 LV-CMV-GFP의 생산에 대해 시험하였다. LV를 HEK293 세포의 형질도입 후 유세포 분석에 의해 적정하였다. 여러 클론은 배양 배지에서 1.0 × 108 TU/ml 범위의 LV-CMV-GFP를 생산할 수 있었다(도 8).
패키징 세포에서 유전자 발현의 조절
LV에 대한 패키징 세포의 맥락에서 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 효능을 확인하기 위해, LV를 생산하는 데 필요한 유전 요소(Rev, Gag 및 VSVg)의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 유도 전후에 분석하였다. 예상대로, Rev, Gag, 및 VSVg의 발현은 쿠메이트 및 쿠메르마이신의 첨가 후 강하게 유도되었으며(도 9), 유도 전에 매우 약한 발현이 검출되거나 발현이 검출되지 않았다.
실시예 4. AAV의 생산을 위한 패키징 세포의 작제
아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 바이러스 벡터를 생산하기 위한 한 가지 대중적인 방법은 기능성 AAV 입자를 조립하는 데 필요한 요소를 보유하는 3개의 플라스미드로 HEK293 세포를 일시적으로 트랜스펙션시키는 것이다(Balakrishnan and Jayandharan, 2014; Grieger and Samulski, 2012; Robert et al., 2017; Wright, 2009). 플라스미드는 i) AAV(바이러스 작제물)에 의해 전달될 유전자를 보유하는 발현 플라스미드, ii) 아데노바이러스로부터 유래된 필수 헬퍼 유전자를 인코딩하는 헬퍼 플라스미드 및 iii) AAV의 Rep 및 Cap 유전자를 함유하는 Rep-Cap 플라스미드이다. Rep는 AAV 게놈의 복제 및 패키징에 관여하는 4개의 단백질(Rep40, Rep52, Rep68 및 Rep78)을 생산한다. Cap은 AAV의 캡시드를 구성하는 구조 단백질을 인코딩한다. AAV의 생산을 촉진하기 위한 한 가지 잠재적인 접근법은 LV의 경우와 같이 AAV를 생산하는 데 필요한 요소를 함유하는 패키징 세포를 사용하는 것일 것이다. 그러나, Rep가 세포독성 단백질을 코딩하기 때문에 AAV에 대한 패키징 세포를 생성하는 것은 어렵다. 쿠메이트/쿠메르마이신 유전자-스위치의 유용성 및 효능에 대한 추가 증거로서, 이러한 유전자-스위치의 제어 하에 Rep 단백질을 생산하는 AAV(293SF-Rep)에 대한 패키징 세포를 작제하였다. AAV를 생산하기 위한 293SF-Rep 세포의 사용이 또한 입증되었다.
293SF-Rep 세포를 작제하기 위해, 293SF-CymR/λR-GyrB 세포를 각각 13xlambda-TPL 프로모터에 의해 조절되는, Rep52를 인코딩하는 플라스미드, Rep68을 인코딩하는 플라스미드 및 Rep78을 인코딩하는 플라스미드(도 10A)(본원에 개시된 제3, 제4, 및 제5 발현 카세트의 예), 및 하이그로마이신에 대한 내성을 인코딩하는 플라스미드(본원에 개시된 바와 같은 선택 가능한 마커의 예)로 트랜스펙션시켰다. 이러한 실험의 경우, Rep40은 Rep52의 존재 하에 AAV를 생산하는 데 필수적이지 않기 때문에 Rep40에 대한 플라스미드는 포함되지 않았다(Chahal et al., 2018). 트랜스펙션 후, 하이그로마이신을 배양 배지에 첨가하고, 하이그로마이신 내성 풀을 생성한 다음, 96-웰 플레이트에서 제한 희석에 의해 클로닝하였다. 하이그로마이신 내성 콜로니를 분리하고, 확장하고, 3개의 플라스미드로 일시적인 트랜스펙션에 의한 AAV의 생산에 대해 시험하였다: Cap(pCMV-CAP), 아데노바이러스 헬퍼 유전자(pHelper), 및 CMV 프로모터에 의해 조절된 GFP를 보유하는 발현 플라스미드(pAAV-CMV-GFP)에 대해(도 10B). HEK293A 세포를 AAV로 형질도입시키고, 형광 현미경을 사용하여 반-정량적으로, 또는 유세포 분석에 의해 정량적으로 GFP 양성 세포의 백분율을 스코어링함으로써 생산된 AAV의 양을 측정하였다. AAV를 생산하는 능력을 갖는 클론을 증폭시키고, 뱅킹하였다(이러한 목적을 위해 트랜스펙션되거나 유도되지 않은 세포의 하위집단을 사용하였다). 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로의 유도 후 Rep 단백질의 생산을 이러한 클론 중 일부에 대한 웨스턴 블롯에 의해 입증하였다(도 11). 상이한 비율의 플라스미드를 사용하여 클론 13으로부터 AAV의 생산을 조사하였다(도 12). 일부 조건 하에, 클론 13은 일시적 트랜스펙션에 의해 ml 당 2.5 × 107개의 AAV-CMV-GFP의 감염성 바이러스 입자(IVP)를 생산할 수 있었다. 유도의 부재 하에서, 생산된 AAV의 양은 방법의 민감도 미만이었다.
재료 및 방법
플라스미드 작제
플라스미드를 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 작제하고, 이들을 대장균의 증폭 후 상업용 키트(Qiagen Valencia, CA)를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후, 플라스미드 농도를 NanoDrop™ 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 260 nm에서 측정하였다. 플라스미드 완전성을 제한 효소로의 소화에 의해 확인하였다. 이러한 프로젝트에 필요한 플라스미드를 하기 기재된 바와 같이 생성하였다.
pBlast: pUC57에 클로닝된 블라스티시딘에 대한 내성에 대한 유전자에 대한 발현 카세트에 대한 서열을 유전자 합성 회사(GenScript)로부터 주문하였다.
pHygro: pUC57에 클로닝된 하이그로마이신에 대한 내성을 위한 발현 카세트에 대한 서열을 유전자 합성 회사(GenScript)로부터 주문하였다.
pkCMV5-CuO-mcs; 이러한 플라스미드는 제한 효소로 분해함으로써 pkCMV5-CuO-Rev(Broussau et al., 2008)로부터 Rev 유전자를 제거함으로써 제조되었다.
pKCMV5-CuO-rcTA-Hygro: rcTA 서열(Mullick et al., 2006)을 Blpl 및 Swal 분해에 의해 pAdenovatorCMV5-CuO-rcTA로부터 제거하고, Kpnl(평활화됨) 및 Blp1로의 분해에 의해 pKCMV5-CuO-Rev(Broussau et al., 2008)의 Rev 서열을 대체하여, pKCMV5-CuO-rcTA 플라스미드를 생성하기 위해 사용하였다. 하이그로마이신 발현 카세트를 Nrul 및 BssHII로의 분해에 의해 pMPG-CMV5-CymRopt-Hygro(Gilbert et al., 2014)로부터 제거하고, 말단을 채우고, AflII로 미리 분해되고 채워진 pKCMV5-CuO-rcTA 플라스미드에 라이게이션시켰다.
pKCMV5-CuO-λR-GyrB: λR-GyrB 서열을 NdeI 및 Dral 분해에 의해 pGyrb(Zhao et al., 2003)로부터 제거하고, 말단을 채웠다. λR-GyrB 서열을 함유하는 DNA 단편을 사용하여 pKCMV5-CuO-Rev(Broussau et al., 2008)의 Rev 서열을 대체하였다.
pLVR2-CR5-GFP: pRRL.cppt.CR5-GFP.WPRE(Mullick et al., 2006)로부터의 LV 벡터 서열(RSV에서 GFP로)을 Sphl 및 Sail로 분해에 의해 LVR2-GFP 플라스미드(Vigna et al., 2002) 내로 이동시켰다.
9_SG_pMA-12xlambda-CMVmin-프로테아제: 이러한 플라스미드를 GeneArt(ThermoFisher)로부터 주문하였다. 이는 12xlambda-CMVmin 프로모터의 제어 하에 있는 아데노바이러스 프로테아제 서열을 함유한다.
pME_005(pVV-13xlambda-CMVmin-VSVg-Q96-I57L): pNN02의 CMV5 프로모터를 pVR10으로부터 증폭된 12xlambda-CMVmin 단편으로 대체하였다(하기 참조). 시퀀싱은 생성된 플라스미드가 12개 복사체 대신 lambdaOp의 13개 복사체를 갖는 것으로 밝혀졌다.
pMPG-CMV5-CymR: 하이그로마이신 발현 카세트를 Nrul/Ascl(채워짐) 분해에 의해 pMPG-CMV5-CymRopt-Hygro(Gilbert et al., 2014)로부터 제거하고, 라이게이션하여 플라스미드를 재-순환화시켰다.
pMPG-Puro: 퓨로마이신 발현 카세트를 플라스미드 pTT54(Poulain et al., 2017)로부터 분리하고, 삽입물을 함유하지 않은 pMPG로부터 유래된 플라스미드(Gervais et al., 1998)에 삽입하였다.
pNN02(pVV-CMV5-VSVg-Q96-I57L): 이러한 플라스미드를 작제하기 위해, 본 발명자들은 먼저 pTT5 벡터(Durocher et al., 2002)로부터 DS 및 FR 서열을 함유하는 BglII/Bbsl 단편을 제거하고, 말단을 채우고, 플라스미드를 재순환시킴으로써 pVV-CMV5를 만들었다. 이후, GenScript로부터 주문된 VSVg 유전자(서열번호 19에 제시된 VSVg-Q96-I57L, 이는 서열번호 20에 제시된 아미노산 유전자 은행 수탁 번호 ABD73123.1에 기반하여 코돈 최적화됨)를 pVV-CMV5의 Pmel 부위에 클로닝하였다.
pNRC-LV1(pNC109): 렌티바이러스 벡터(도 3 참조, 발현 카세트[CMV-GFP] 없음)의 완전한 백본을 함유하는 3개의 DNA 단편을 유전자 합성 회사(Integrated DNA Technologies)로부터 주문한 후 Gibson 어셈블리에 의해 pMK(GeneArt™, ThermoFisher)로부터 유래된 클로닝 벡터 내에 조합하였다. 생성된 플라스미드는 pBV3으로 지칭된다. 더 높은 역가를 수득하기 위해, 단편(CMV5'UTR-HIV-1Ψ-RRE-cPPT, Genbank 수탁 번호 FR822201.1)을 유전자 합성 회사(GeneScript)로부터 주문하고, Xbal/Sall 분해에 의해 pBV3의 상동성 영역을 대체하는 데 사용하였다.
pNRC-LV1-CMV-GFPq(pNC111): CMV-GFP를 PCR에 의해 pCSII-CMV-GFPq(Broussau et al., 2008)로부터 증폭시키고, 골든 게이트 어셈블리에 의해 Esp3l 부위를 갖는 pNRC-LV1에 도입하였다.
pSB178(pKCR5-VSVg-Q96H-157L) 및 pSB174(pKCR5-Rev)는 둘 모두 CMV-B43 카세트를 쿠메이트 스위치(Mullick et al., 2006)로부터의 CR5 프로모터로 대체하도록 변형된 pKCMV-B43 벡터(Mercille et al., 1999)로부터 유래된다. VSVg-Q96H-157L(서열번호 19, 이는 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 유전자 은행 수탁 번호 ABD73123.1을 기초로 하여 코돈 최적화됨) 및 Rev(Gene bank 수탁 번호 AF033819.3)의 서열을 유전자 합성 회사(GenScript)로부터 주문하고, CR5 프로모터의 다운스트림에 클로닝하여 각각 pSB178 및 pSB174를 제조하였다.
pSB189(pkCMV5-hbgdelta-Gag/pol2): Gal/pol 유전자(HIV-1 완전한 게놈 유전자 은행 수탁 번호 AF033819.3) 및 인간 베타 글로빈의 인트론의 일부(유전자 은행 수탁 MK476503.1)를 GenScript에서 주문하였다. 두 단편 모두를 CMV-B43 카세트를 CMV5 프로모터(Massie et al., 1998a)로 대체함으로써 변형된 pKCMV-B43(Mercille et al., 1999)으로부터 유래된 플라스미드에 클로닝하였다. 클로닝 동안, CMV5의 인트론의 일부를 인간 베타-글로빈 인트론 서열로 대체하였다.
pSB201(pMPG/TK*/Neo): Ascl 분해에 의해 pMPG/TK*neo/CymR-nls(Mullick et al., 2006)로부터 CymR-nls 카세트를 제거함으로써 플라스미드를 생성하였다.
pSB211(pCAG-Gag/poll1b): Gag/Polllb 서열(GeneBank 수탁 번호 EU541617.1)을 유전자 합성 회사(Genscript)로부터 주문하고, CMV-B43 카세트를 CAG 프로모터(Blain et al., 2010)로 대체함으로써 변형된 pKCMV-B43(Mercille et al., 1999)으로부터 유래된 플라스미드에 클로닝하였다.
pSB213(p11xlambda-hbgmin-Gag/poll1b): 12lambda-hbgmin 프로모터 및 인트론을 BamHl(채워짐)로의 분해에 의해 pVR28로부터 추출하고, XhoI(채워짐) 및 EcoRl(채워짐)로의 분해에 의해 pSB211의 CAG 프로모터(pCAG-Gag/poll1b)를 대체하는 데 사용하였다. 프로모터를 시퀀싱한 후, 클로닝 동안 하나의 lambdaOp 반복부가 손실되었고 11개의 lambdaOp 반복부(12개 대신)가 프로모터에 남아 있는 것으로 나타났다. 생성된 프로모터(11xlambda-hbgmin)의 개략도는 도 16에 도시되어 있다.
pTet07-CMV5-CuO-GFP: CMV5-CuO 서열을 먼저 Spel 및 BamHl로의 분해에 의해 pRRL.cppt.CMV5-CuO-rcTA(Mullick et al., 2006)로부터 추출하고, 말단을 채우고, 이전에 Xbal로 분해되고 평활화된 pNEB193mcs(NEB)에 라이게이션시켜, pNEB-CMV5-CuO를 생성하였다. pNEB-CMV5-CuO로부터의 CMV5-CuO 서열을, Pacl 및 Blpl로 두 DNA 모두의 소화 후, 다음으로 pTet07-CSII-5-GFP(하기 기재됨)에 라이게이션하였다.
pTet07-CSII-CMV-mcs: Xho1 부위에 BspEI 링커(TCGATCCGCA)를 삽입함으로써 플라스미드 LVR2-GFP(Vigna et al., 2002)를 먼저 변형시켰다. 이후, Tet07 오퍼레이터를 함유하는 3'LTR을 BspEl 및 Pmel로의 소화에 의해 이러한 작제물로부터 제거하고, (미리 평활화된) BspEl 및 Bsml로 미리 소화된 pCSII-CMV-mcs(Miyoshi et al., 1998)에 라이게이션시켰다.
pTet07-CSII-mcs: pTet07-CSII-5-mcs의 CR5 프로모터를 Pacl 및 Agel로의 소화에 의해 제거하여 빈 LV 백본을 생성하였다.
pTet07-CSII-5-mcs 및 pTet07-CSII-5-GFP: Tet07-CSII-CMV-mcs 및 Tet07-CSII-CMV-GFP(Broussau et al., 2008)로부터의 CMV 프로모터를 CR5 프로모터로 대체하고, Pacl 부위를 프로모터의 5' 말단에 삽입하여 향후 작제물에서 프로모터를 용이하게 변경시켰다. 간략하게, 본 발명자들은 먼저 주형으로서 pCSII-CMV mcs(Miyoshi et al., 1998)로부터 유래된 플라스미드를 사용하여 제1 CMV 프로모터(5'LTR의 5' 말단에서)의 Snabl 부위로부터 부분을 cppt 서열로 덮는 PCR 단편을 증폭시켰다. 제2 PCR을 수행하여 pRRL.cppt.CR5-GFP.WPRE(Mullick et al., 2006)로부터 CR5 프로모터를 증폭시켰다. Pacl 부위는 제1 단편의 3' 말단에 및 제2 단편의 5' 말단에 포함된다. PCR 생성물을 어닐링하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 5'LTR의 5'에서 CMV로부터 mcs까지의 부분을 함께 덮는 하나의 단편을 생성하였다. 이러한 단편을 다음으로 Snabl 및 Agel로의 소화에 의해 Tet07-CSII-CMV-mcs 및 Tet07-CSII-CMV-GFP 플라스미드에 삽입하였다. 시퀀싱은 CR5 프로모터의 6개 CuO 복사체 중 5개가 클로닝 동안 결실된 것으로 나타났다.
pTet07-CSII-12xlambda-TPL-GFPq: pVR9로부터의 12xlambda-TPL-GFPq 서열을 먼저 BamHl로의 소화에 의해 pUC19에 삽입하여 pUC19-12xlambda-TPL-GFPq를 생성하였다. 12xlambda-TPL-GFPq 서열을 다음으로, EcoRl로의 소화 후, Tet07-CSII-mcs에 라이게이션시켰다.
pVR1(pKC_12xlambda-CuO-TPL-MC): 12xlambda-CuO 프로모터를 GenScript로부터 주문하였고, Kpnl/Agel로의 소화에 의해 pKCMV5-CuO-MSC의 CMV-CuO 프로모터 영역을 대체하는 데 사용하였다.
pVR2: (pKC_12xlambda-CuO-msc-PolyA)를, GenScript에 의해 합성된 12xlambda-TATA-CuO를 CMV5-CuO 프로모터 대신 pKCMV5-CuO-mcs의 Acc65l/BglII 부위에 도입함으로써 생성하였다.
pVR5(pKC_12xlambda-CuO-TPL-GFPq): pAd-CMV5-GFPq(Massie et al., 1998b)를 BamHl로 분해시킴으로써 수득된 GFP 유전자를 BglII로 분해된 pVR1에 라이게이션시켰다.
pVR6(pKC_12xlambda-CuO-GFPq): BamHl로 분해된 pAdCMV5-GFPq(Massie et al., 1998b)로부터의 GFPq를 BglII-분해된 pVR2에 서브클로닝함으로써 수득하였다.
pVR9(pKC_12xlambda-TPL-GFPq): 9_SG_pMA-12xlambda-CMVmin-프로테아제의 12xlambda-CMVmin 프로모터를 PCR에 의해 증폭시키고, Agel/Kpnl로 미리 분해된, pVR5에 삽입하여, pVR5의 12xlambda-CuO 단편을 대체하였다.
pVR10(pKC_12xlambda-CMVmin-GFP): pVR6의 Kpnl-Agel 단편(12xlambda-CuO 함유)을, 주형으로서 9_SG_pMA-12Vxlambda-CMVmin-프로테아제를 사용하여 PCR에 의해 이전에 증폭된 유사하게 분해된 12xlambda-CMVmin 단편으로 대체함으로써 제조하였다.
pVR17(pVV-13xlambda-CMVmin-MCS): 이를, Sall 및 HindII로의 분해에 의해 pME_005로부터 CMVmin-VSVg 단편을 제거하고, 이를 주형으로서 플라스미드 pVR10을 사용하여 PCR에 의해 수득된 CMVmin 프로모터를 함유한 DNA 단편으로 대체함으로써 수득하였다.
pVR19(pVV-13xlambda-TPL-VSVg-Q96H_I57L): 이를, pSB178로부터의 VSVg(TPL-VSVg)의 cDNA를 함유하는 SacI/HindIII 단편을 유사하게 분해된 pVR17(pVV-13min-mcsbda-CMV)로 서브클로닝함으로써 수득하였다.
pVR21(pVV-13xlambda-TPL-Rev): Stul/Nhel 제한 부위를 사용하여 pSB174로부터의 Rev 서열(TPL-Rev)을 pVR17로 서브클로닝함으로써 수득하였다.
pVR28(pK-12xlambda-hbgmin_ex_Gag-Pol): CMV 프로모터/인핸서 및 TPL을 인코딩하는 pSB189의 AfllII/Xho1 단편을 pVR9로부터의 12xlambda 프로모터 및 TPL을 함유하는 AfllII/Xho1 단편으로 대체하였다.
pVR41, pVR42, pVR43 및 pVR44: 13xlambda-TPL 프로모터의 제어 하에 배치된, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 각각 인코딩하는 AAV2 유전자를 함유하는 플라스미드. 플라스미드를 하기와 같이 생성하였다: Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 인코딩하는 인간-최적화된 AAV2 유전자를 GenScript에 의해 합성하고, 각각을 pUC57의 EcoRV 부위에 서브클로닝하여 각각 18_SG, 19_SG, 20_SG 및 21_SG를 생성시켰다. Rep68 및 Rep78 서열 내의 내부 P19 프로모터의 TATA 박스를 변형시켜 TATTTAAGC 서열을 TACCTCTCA 서열로 변경함으로써 이의 활성을 감소시켰다. pUC57-Rep 클론을 BglII/Not1로 분해하고, Rep 유전자를 인코딩하는 단편을 VSVg 대신 유사하게-분해된 pVR19(pVV-13xlambda-TPL-VSVg)로 서브클로닝하여 pVR41(pVV-13xlambda-TPL-Rep78), pVR42(pVV-13xlambda-TPL-Rep68), pVR43(pVV-13xlambda-TPL-Rep52) 및 pVR44(pVV-13xlambda-TPL-Rep40)를 생성시켰다.
pVR46-Cap: CMV5 프로모터에 의해 조절되는 AAV2의 CAP 유전자를 인코딩한다. 이러한 플라스미드를 작제하기 위해, AAV2의 CAP 유전자 및 이의 업스트림 비번역 영역을 pTT3의 CMV5 프로모터(Massie et al., 1998a) 후에 클로닝하여 pTT3CAP1을 생성하였다. CMV5 프로모터의 스플라이스 수용체 부위 및 Cap 유전자의 스플라이스 공여체 부위를 이후 AleI/Swal로 분해하고 말단을 라이게이션함으로써 제거하였다.
세포 배양물
293SF-CymR 및 293SF-CymR/rcTA를 6 mM L-글루타민(Hyclone)이 보충된 SFM4-Transfx-293 배지(Hyclone)에서 배양하였다. 반고체 배지에서 서브-클로닝을 ClonaCell™ FLEX 메틸셀룰로스(StemCell Technology), 2x SFM4-Transfx-293(Hyclone), 6 mM L-글루타민, 2.5% ClonaCell™ ACF CHO 보충물(StemCell Technology)의 혼합물로 수행하였다. 293SF-CymR/λR-GyrB를 6 mM L-글루타민 및 10 mg/ml rTransferin(Biogems)이 보충된 저칼슘-SFM 배지(LC-SFM)(Gibco)에서 현상하였고, SFM4-Transfx-293에서 현탁액으로 확장시켰다. 세포주 293SF-PacLVIIIB-L 및 293SF-LVPIIIB-GFP를 6 mM L-글루타민 및 10 mg/ml rTransferin이 보충된 50% LC-SFM 및 4 mM L-글루타민 및 0.1% Kollipho®이 보충된 50% Hycell™ TransFx-H(Hyclone)의 혼합물에서 현상시키고, 100% Hycell™ TransFx-H에서 현탁액으로 유지시켰다. 현탁 배양을 위해, 세포를 진탕 플라스크에서 110 rpm에서 성장시켰다. 293A(American Type Culture Collection), 293rtTA(Broussau et al., 2008) 및 293rcTA(Mullick et al., 2006)를 5% 우태아 혈청(Hyclone)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(Hyclone)에서 성장시켰다. 모든 세포주는 5% CO2 가습 대기에서 37℃로 유지시켰다.
렌티바이러스의 생산 및 적정
LV-CMV5CuO-GFP, LV-12xlambda-TPL-GFP 및 LV-CR5-GFP를, LC-SMF + 1% FBS에서의 정적 조건 및 1 ㎍/㎖의 독시사이클린 및 50 ㎍/㎖의 쿠메이트의 첨가에서, pTet07-CSII-CMV5-CuO-GFP, pTet07-CSII-12xlambda-TPL-GFP 및 pLVR2-CR5-GFP, 각각으로의 일시적 트랜스펙션에 의해 상기 기재된 바와 같이(Broussau et al., 2008) 293SF-PacLV #29-6을 사용하여 생산하였다. 생산된 LV를 수크로스 쿠션 상에서 초원심분리에 의해 농축시키고(Gilbert et al., 2007), 현탁액을 사용하여 신선한 293SF-PacLV #29-6을 형질도입하여 각 LV에 대한 생산자 세포주의 풀을 생성시켰다. 풀을 LC-SFM + 1% FBS의 현탁액에서 증폭시키고, 1 ㎍/㎖의 독시사이클린 및 50 ㎍/㎖의 쿠메이트를 첨가하여 LV 생산을 유도하였다. 생산된 LV를 48h 및 72h에 수확하고, 수크로스 쿠션 상에서 초원심분리에 의해 농축시키고, -80℃에서 동결시켰다. 각각 293A, 293rtTA 및 293rcTA 세포를 형질도입함으로써 LV CMV5CuO-GFP, 12xlambda-TPL-GFP 및 CR5-GFP를 적정하고, GFP 발현 세포의 백분율을 전술한 바와 같이 유세포 분석에 의해 분석하였다(Broussau et al., 2008).
세포주의 생성
293SF-CymR
SFM4-TransFx-293에서 성장한 293SF-3F6 세포주(Cote et al., 1998)를 9:1의 DNA 비율을 사용하여 pMPG-CMV5-CymR-opt 및 pMPG-Puro를 갖는 Lipofectamine™ 2000 CD(Invitrogen)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. 두 DNA 모두를 미리 MfeI로 분해하였다. 48시간 후, 세포를 0.4 ㎍/㎖의 퓨로마이신(Sigma)을 함유하는 SFM4-Transfx-293 배지에서 5,000개 및 10,000개 세포/웰로 96웰 플레이트에서 희석하였다. 1000개 세포/ml 및 3000개 세포/ml로 반-고체 배지에서 세포를 플레이팅함으로써 선택된 세포 클론을 서브-클로닝하였다. 콜로니를 로봇 세포 선택기인 CellCeletor™(ALS, Germany)를 사용하여 분리하고, 96 웰 플레이트로 옮겼다. CymR의 존재에 대해 클론을 스크리닝하기 위해, 각 클론을 2개의 집단으로 나누었다. 한 집단은 GFP 발현의 분석에 사용된 반면, 다른 집단은 클론 확장 및 뱅킹을 위해 그대로 유지되었다. CMV5CuO 프로모터(LV-CMV5CuO-GFP)에 의해 조절되는 LV 발현 GFP로 형질도입 후 GFP 발현에 대해 클론을 분석하였다. 형질도입을 먼저 96웰 플레이트에서 수행하고, 세포를 100 ㎍/㎖의 쿠메이트(Sigma-Aldrich)로 유도하였다. GFP 강도에 대해 클론을 선택하고, 다음에 온/오프 조건(유도제 유무) 하에 GFP 발현에 대해 제2 스크리닝을 수행하였다.
293SF-CymR-rcTA
293SF-3F6 세포를 pMPG-CMV5-CymR-opt 및 pMPG-Puro 플라스미드(비 9:1)와 함께 Lipofectamine™ 2000 CD를 사용하여 트랜스펙션시켰다. 두 DNA 모두를 미리 MfeI로 분해하였다. 2일 후, 세포를 0.4 ㎍/㎖ 퓨로마이신의 존재 하에, 96-웰 플레이트에서 웰 당 5000개 및 10000개 세포로 희석하였다. 퓨로마이신 내성 콜로니를 48- 또는 24-웰 플레이트로 옮겼다. 세포가 50 내지 80%의 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때, 이들을 25 ㎠ 플라스크에서 함께 조합하여 5개의 상이한 풀(C, D, E, F, G)을 형성하였다. 이러한 시점부터, 더 이상 퓨로마이신을 배지에 첨가하지 않았다. 풀을 함께 혼합하여 풀 CDEFG를 형성하였다.
풀 CDEFG를 선형화된(XmnI) pkCMV5-CuO-rcTA-Hygro 플라스미드의 1:1 복합체와 함께 PEIpro®(Polyplus Transfection)로 트랙스펙션하였다. 24시간의 인큐베이션 후, 세포를 웰 당 1500개 세포를 사용하여 96-웰 플레이트에서 25 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B(Invitrogen)를 함유하는 배지에 옮겼다. 콜로니를 풀링하고, 원심분리하고, 25 ㎍/㎖의 하이그로마이신을 함유하는 신선한 배지에 재현탁시켜 상이한 미니-풀(문자 A 내지 H)을 형성하였다.
풀 C, F, G 및 H를 반고체 배지에 완전히 분산된 세포로서 플레이팅하였다. 자동화된 TiSSM 방법(반-고체 배지에서의 트랜스펙션)에 의해 rcTA의 존재 및 수준에 대해 반고체 배지 중의 콜로니를 스크리닝하고, CellCeletor™에 의해 96 웰 플레이트에서 양성 콜로니를 분리하였다. 간략하게는, CellCelector™를 사용하여 스캐닝함으로써 콜로니를 확인하였다. PEI MAX®(Polysciences) 및 CR5 프로모터(pkCR5.DsRed)의 제어 하에 DsRed 형광 단백질을 인코딩하는 리포터 플라스미드(Clontech Laboratories)의 3:1 복합체를 CellCelector™ 로봇 팔로 각 콜로니에 침착시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에, 콜로니로부터 염기성 DsRed 형광을 검출하기 위해 스캔을 수행하였다(OFF 수준). 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 쿠메이트 유도 인자(Sigma-Aldrich, Cat No. 268402, Lot No. 13613HB)를 함유하는 액체 SFM4 배지 오버레이를 반-고체 배지 층에 적용하여 밤새 확산시켰다. 트랜스펙션 48시간 후(유도 후 24시간), DsRed 형광(ON 수준)을 측정하기 위해 두 번째 스캔을 수행하였다. 이후, OFF 및 ON 이미지를 비교하여 높은 유도 특성을 갖는 콜로니를 확인하고, 이러한 콜로니를 선택하고, CellCeletor™에 의해 개별 웰(96-웰 플레이트)에 침착시켰다. TiSSM으로부터 분리된 클론을 24-웰 플레이트로 및 25 ㎠ 플라스크 내로 점진적으로 옮기고, 이후 뱅킹하였다.
293SF-CymR/λR-GyrB
293SF-CymR(클론 198-2)을 PEIpro®에 의해 9:1의 DNA 비로 플라스미드 pKCMV5-CuO-λR-GyrB 및 pBlast로 트랜스펙션시켰다. DNA를 각각 XmnI 및 Xbal로 미리 분해하였다. 트랜스펙션 48시간 후에, 세포를 7 ㎍/㎖의 블라스티시딘(Enzo)을 함유하는 LC-SFM 배지로 희석하고, 1000개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 옮겼다. 1주 후, 블라스티시딘 농도는 10 ㎍/㎖로 증가하였다. 선택된 클론을 선택 없이 LC-SFM 배지에서 0.3 세포/웰 및 1.0 세포/웰로 96 웰에서 제한 희석에 의해 서브-클로닝하였다. 유전자 발현을 조절하는 능력에 대해 클론을 스크리닝하기 위해, 각 클론을 2개의 집단으로 나누었다. 하나의 집단은 GFP 발현의 분석에 사용된 반면, 다른 하나는 클론 확장 및 뱅킹을 위해 변형되지 않은 채로 유지되었다. 12xlambda-TPL(LV-12xlambda-TPL-GFP)에 의해 조절되는 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입 후 GFP 발현에 대해 클론을 분석하였다. 형질도입을 먼저 96 웰 플레이트에서 수행하고, 세포를 100 ㎍/㎖ 쿠메이트(Sigma-Aldrich) 및 10 nM 쿠메르마이신(Promega)으로 유도하였다. GFP 강도에 대해 클론을 선택하고, 다음에 온/오프 조건(유도제 유무) 하에 GFP 발현에 대해 제2 스크리닝을 수행하였다.
쿠메이트 및 쿠메이트/쿠메르마이신 스위치의 유도 용량의 비교.
293SF-CymR, 293SF-CymR/rcTA 및 293SF-CymR/λR-GryB의 클론을 8 ㎍/㎖의 폴리브렌의 존재 하에 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 293SF-CymR 및 293SF-CymR/rcTA를 20 TU의 MOI에서 각각 LV-CMV5CuO-GFP 및 LV-CR5-GFP로 형질도입하고, 세포를 다음날 100 ㎍/㎖의 쿠메이트를 첨가하여 유도하였다. 293SF-CymR/λR-GyrB 클론을 5의 MOI에서 LV-12xlambda-TPL-GFP로 형질도입하고 다음날 100 ㎍/㎖의 쿠메이트 및 10 nM의 쿠메르마이신을 첨가하여 세포를 유도하였다. 세포를 고정시키고 형질도입 72시간 후에 유세포 분석을 위해 처리하였다.
렌티바이러스 벡터에 대한 패키징 세포(293SF-PacLVIIIA)
293SF-CymR/λR-GyrB 클론 7-2를 각각 40%, 25%, 25% 및 10%의 DNA 비율로 pSB213(p11xlambda-hbgmin-Gag/polIIb), pVR19(pVV-13xlambda-TPL-VSVg-Q96H-I57L), pVR21(pVV-13xlambda-TPL-Rev) 및 pHygro와 함께 PEIpro®를 사용하여 현탁액으로 트랜스펙션시켰다. 플라스미드를 각각 BspHI, Zral, XmnI 및 XmnI로 분해하였다. 트랜스펙션 36시간 후에, 세포를 65 ㎍/㎖의 하이그로마이신을 함유하는 배지로 0.35 × 106개 세포/ml로 희석하였다. 4일 및 8일 후, 세포를 50 ㎍/㎖의 하이그로마이신 농도로 나노웰(ALS Automated Lab Solutions GmbH, Jena, Germany)에 4.7개 세포/나노웰로 플레이팅하였다. 현탁액에서의 선택을 병행하여 계속하였다. 205개(현탁 상태에서 4일 선택부터) 및 171개(현탁 상태에서 8일 선택부터) 내성 콜로니를 함께 풀링하여 2개의 별개의 미니-풀을 형성시켰다. 미니-풀 및 현탁액으로 수득된 풀을 0.6 세포/나노웰의 세포 밀도로 나노웰 플레이트에 희석하여 클로닝하였다. 나노웰에서 분리된 세포를 CellCeletor™(Robotic cell picker)의 카메라 시스템을 사용하여 0일에 기록하였다. 총 366개의 콜로니를 CellCeletor™를 사용하여 분리하고, 384 웰 플레이트로 옮겼다.
렌티바이러스 벡터에 대한 패키징 세포(293SF-PacLVIIIB)
293SF-CymR/λR-GyrB 클론 7-2를 각각 40%, 25%, 25% 및 10%의 DNA 비율로 pSB211(pCAG-Gag/polIIb), pVR19(pVV-13xlambda-TPL-VSVg-Q96H-I57L), pVR21(pVV-13xlambda-TPL-Rev) 및 pHygro를 사용하여 PEIpro®로 현탁액에서 트랜스펙션시켰다. 플라스미드를 각각 BspHI, Zral, XmnI 및 XmnI로 분해하였다. 트랜스펙션 36시간 후에, 세포를 80 ㎍/㎖의 하이그로마이신을 함유하는 배지로 0.5 × 106개 세포/ml로 희석하였다. 8일 후, 세포를 50 또는 25 ㎍/㎖의 하이그로마이신 농도로 1.4 세포/나노웰로 나노웰 플레이트에 플레이팅하였다. 173개의 내성 콜로니를 함께 풀링하여 미니-풀을 형성하였다. 미니-풀을 6일 후에 20 ㎍/㎖ 하이그로마이신이 보충된 배지에서 0.6 세포/나노웰의 세포 밀도로 나노웰 플레이트에 희석함으로써 클로닝하였다. 나노웰에서 단일 세포의 존재를 입증하는 사진은 CellCeletor™(Robotic cell picker)의 카메라 시스템을 사용하여 0일에 수득되었다. 348개의 콜로니를 CellCeletor™를 사용하여 분리하고 384 웰 플레이트로 옮겼다.
렌티바이러스 벡터에 대한 생산자 세포(293SF-LVPIIIB-GFP)
패키징 세포 293SF-PacLVIIIB, 클론 3D4를 4:1의 DNA 비의 플라스미드 pNC111(pNRC-LV1-CMVGFP) 및 pSB201(pMPG/TKneo)로 PEIpro®를 사용하여 현탁액으로 트랜스펙션시켰다. 플라스미드를 각각 Fspl 및 Xbal로 미리 소화시켰다. 트랜스펙션 36시간 후에, 세포를 400 ㎍/㎖의 제네티신(Gibco)을 함유하는 배지로 0.5 × 106개 세포/ml로 희석하였다. 선택 18일 후, 클로닝을 위해 세포를 0.6 세포/나노웰의 세포 밀도로 나노웰에서 희석하였다(G418 없음). 나노웰에서 단일 세포의 존재를 입증하는 사진을 CellCeletor™의 카메라 시스템을 사용하여 0일에 수득하였다. 380개의 콜로니를 CellCeletor™를 사용하여 분리하고, 384 웰 플레이트로 옮겼다.
패키징 세포(293SF-PacLVIIIA, 293SF-PacLVIIIB) 및 생산자 세포(293SF-LVPIIIB-GFP)로부터의 클론의 스크리닝.
클론을 GFP(LV-CMV-GFP)를 발현하는 렌티바이러스의 생산에 대해 분석하였다. 이들을 먼저 96웰 플레이트에서, 이후 24웰 플레이트에서 및 마지막으로 6웰 플레이트 현탁액에서 시험하였다. 패키징 세포로부터의 클론을 pCSII-CMV-GFP로 트랜스펙션시키고(Broussau et al., 2008), 쿠메이트/쿠메르마이신 및 나트륨 부티레이트를 첨가함으로써 유도하였다. 생산자로부터의 클론(293SF-LVPIIIB-GFP)은 트랜스펙션되지 않았지만 쿠메이트/쿠메르마이신 및 나트륨 부티레이트로 유도되었다. 생산된 LV(LV-CMV-GFP)를 293A 세포의 형질도입에 의해 적정하고, GFP 수준을 96- 및 24-웰 플레이트에서 생산된 LV에 대한 형광 현미경 관찰에 의해 평가하고, 기술된 바와 같이(Broussau et al., 2008) 6-웰 플레이트에서 생산된 LV에 대해 유세포 분석에 의해 적정하였다.
Gag/pol, VSVg 및 REV에 대한 웨스턴 블롯팅
293SF-PacLVIIIB, 클론 3D4로부터의 세포를 p24, VSVg 및 REV 단백질의 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 유도 당일에, 2,500만 세포를 원심분리하고, 125 ml 진탕 플라스크에서 1.0 × 106개 세포/mL의 최종 농도로 25 ml의 HyCell™ 배지에 재현탁시켰다. 80 ㎍/㎖의 쿠메이트 및 10 nM의 쿠메르마이신을 사용하여 1시간 후에 유도를 수행하였다. 음성 대조군으로서, 5백만 개의 293SFCymR/λR-GyrB 세포를 원심분리하고, -80℃에서 옮겼다. 유도 18시간 후에 8 mM의 나트륨 부티레이트를 첨가하거나 첨가하지 않고 2개의 세포 그룹을 제조하였다. 5 ml의 세포 배양물을 유도 후 0, 24, 48, 72h에 수확하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 세포 펠렛을 -80℃로 옮겼다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포를 해동시키고, RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.25% Na 데옥시콜레이트)로 용해시켰다. 얼음 상에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 초음파처리하고, 용해물을 원심분리에 의해 정화시켰다. 단백질 농도를 BIO RAD DC™ 단백질 검정(Bio-Rad Laboratories)에 의해 결정하였다. 동일한 양의 총 단백질을 NuPAGE™ 4 내지 12% Bis-Tris Gel(Invitrogen)을 통해 분리하고, 항-HIV1 REV 마우스 모노클로날 항체(ab85529, abeam), 토끼 다클론 HIV p24 Ab(ProSci Catalog # 7313), 토끼 다클론 항-VSVg 태그 항체(ab83196, abeam), 이어서 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 당나귀 항 토끼 면역글로불린 (Ig)G 항체 또는 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 양 항 마우스 면역글로불린 (Ig)G 항체(GE Healthcare UK Limited)를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 신호는 ECL™ 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Perkin Elmer, Inc)을 사용하여 화학발광에 의해 밝혀졌고, 디지털 이미징 시스템(ImageQuant™ LAS 4000 미니 생체분자 이미저, GE Healthcare)으로 분석하였다.
293SF-Rep 세포의 생성
293SF-CymR/λR-GyrB를 4 mM 글루타민 및 0.1% Koliphore®가 보충된 Hycell™ 배지에서 PEIpro®를 사용하여 각각 55%, 30%, 15% 및 10%의 비율로 pVR43, pVR42, pVR41 및 pUC57-TK-Hygro로 트랜스펙션시킴으로써 Rep 52, 68 및 78을 발현하는 세포의 풀을 생성하였다. 트랜스펙션 전에, Rep-암호화 플라스미드를 SpeI로 선형화하고 pUC57-TK-Hygro를 Xmnl로 선형화하였다. 트랜스펙션 48시간 후에, 세포를 원심분리하고, 하이그로마이신을 함유하는 배지(40 또는 50 ㎍/㎖)에 재현탁시켜 0.5 × 106개 세포/ml의 최종 농도를 제공하였다. 생존력 및 세포 성장을 주기적으로 모니터링하였다. 배양 약 3주 후에 풀의 세포로부터 동결된 바이알의 작은 뱅크를 제조하였다.
세포 은행의 하나의 바이알을 선택 없이 4 mM 글루타민 및 0.1% Kollipho®가 보충된 Hycell™ 배지에서 해동시켰다. 40 ㎍/㎖의 선택 하이그로마이신을 해동 2일 후에 첨가하였다. 세포를 96웰 플레이트에서 서브클로닝하기 전에 선택으로 3회 희석하였다. 서브클로닝을 선택 없이 2개의 배지에서 수행하였다: 4 mM 글루타민 및 0.1% Kollipho®가 보충된 Hycell™, 및 6 mM 글루타민 및 10 mg/ℓ의 트랜스페린 10 mg/L이 보충된 HSFM.
96 웰로부터의 콜로니를 24 웰 플레이트로 옮겼다. 웰이 컨플루언트가 되었을 때, 세포 집단의 1/3을 다른 24웰 플레이트로 옮겨서 일시적 트랜스펙션에 의한 AAV의 생산을 시험하였다. 트랜스펙션을 위해, 배양 배지를 신선한 배지로 교체하고, 세포를 1 ㎍/㎖의 플라스미드 및 2 ㎍/㎖의 PEIpro®를 사용하여 트랜스펙션시켰다. ptt3CAP1, pHelper(CellBiolab) 및 pAAV-GFP(CellBiolab)의 혼합물을 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 4시간 후에 50 ㎍/㎖의 쿠메이트 및 10 nM의 쿠메르마이신으로 유도를 수행하였다. 트랜스펙션 72시간 후에 수확을 수행하고, BalanCD® 배지를 사용하여 293SF-3F6 세포에서 AAV에 대한 표준 유전자 전달 검정(하기 기재됨)을 사용하여 적정을 수행하였다. AAV를 생산할 수 있는 클론을 증폭시키고 동결된 세포의 바이알을 제조하였다.
Rep 발현의 웨스턴 블롯 분석
293SF-Rep 클론(#13, 18, 35 및 36)으로부터의 세포를 40 ㎍/㎖의 하이그로마이신이 보충된 HyCell™ 배지에 적응시켰다. 클론을 유도 없이 또는 상이한 농도의 쿠메이트 및 쿠메르마이신으로 유도한 후에 REP 단백질의 존재에 대해 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 250만 세포를 원심분리하고 6웰 플레이트에서 1.0 × 106개 세포/mL의 농도로 2.5 ml의 신선한 HyCell™ 배지에 재현탁시켰다. 세포를 하기 농도의 쿠메이트(㎍/㎖) 및 쿠메르마이신(nM)으로 유도하였다: 0.5 ㎍/㎖/1 nM; 5 ㎍/㎖/1 nM; 또는 50 ㎍/㎖/10 nM. 세포 배양물을 유도 후 72h에 원심분리에 의해 수확하고, 세포 펠렛을 -80℃로 옮겼다. 세포 펠렛을 해동하고 300 ㎕의 RIPA(50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.25% Na 데옥시콜레이트)를 사용하여 용해시켰다. 얼음 상에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 초음파처리하고, 용해물을 원심분리에 의해 정화시켰다. 단백질 농도는 BIO-RAD DC™ 단백질 검정(Bio-Rad Laboratories)에 의해 결정되었다. 동일한 양의 총 단백질(30 ㎍)을 NuPAGE™ 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen)을 통해 이동시키고, 마우스 모노클로날 IgG1 항-REP AAV(ARP American Research Products, Inc. 카탈로그 번호 03-61069), 이어서 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 양 항 마우스 면역글로불린 (Ig)G 항체(GE Healthcare UK Limited)를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 신호는 ECL™ 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Perkin Elmer, Inc)을 사용하여 화학발광에 의해 밝혀지고 디지털 영상화 시스템(ImageQuant™ LAS 4000 미니 생체분자 이미저, GE Healthcare)으로 분석되었다.
29SF-Rep 세포 및 유전자 전달 검정을 이용한 AAV의 생산
293SF-Rep 세포(클론 13)를 원심분리하여(5분 동안 300 x g) 하이그로마이신을 제거하고(클론에 대한 선택을 유지하기 위해 사용됨), 최종 트랜스펙션 2h 전에 6-웰 플레이트에서 1.0 × 106개 세포/mL의 밀도를 갖도록 Hycell™ TransFx-H(하이클론)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 1 ㎍/㎖의 DNA(Cell Biolabs로부터의 상이한 비율의 pAAV-GFP 및 pHelper, 및 pVR46-Cap(도 12)를 사용함) 및 2 ㎍/㎖의 PEIpro®(Polyplus)로 트랜스펙션시키고, dbn도 인자를 첨가하기 4시간 전에 인큐베이션하였다. 두 유도 인자 모두를 갖는 플라스미드 혼합물을 제조하고, 트랜스펙션된 세포에 첨가하여 10 nM의 쿠메르마이신 및 50 ㎍/㎖의 쿠메이트를 갖도록 하였다. 유도된 세포를 2 mM의 MgCl2(Sigma-Aldrich), 0.1%의 Triton™ X-100(Sigma-Aldrich) 및 2.5 U/mL의 벤조나제(MilliporeSigma)의 최종 농도의 용해 용액과 함께 3일 인큐베이션 후 용해시켰다. 2h의 용해 후, MgSO4를 37.5 mM의 최종 농도로 첨가하여 바이러스 입자를 안정화시켰다. 이어서, 용해된 세포를 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 수확하고 동결시켰다. 생산된 AAV의 역가를 BalanCD® HEK293 배지(FUJIFILM Irvine Scientific)에서 세포를 사용하여 측정하였다. 293SF-Rep 세포를 12-웰 플레이트에서 0.5 × 106개 세포/mL로 플레이팅하고, 루시페라제(HD-LUC, △E1, △E3)를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Umana et al., 2001)로 5의 감염 다중도(MOI)로 감염시켰다. AAV를 함유하는 세포 용해물을 1:10 내지 1:300으로 희석하고 감염된 세포에 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 후, 총 세포 밀도 및 생존력을 기록하고, 293SF-Rep 세포를 2% 포름알데하이드(Polysciences Inc.)로 고정하고, 유세포 분석기(BD LSRFortessa™)에서 분석하였다. 희석 인자를 고려하여, 단일 세포의 GFP %(10000개 이벤트)를 사용하여 감염성 바이러스 입자(IVP)/ml의 역가를 계산하였다.
본 출원이 실시예를 참조하여 설명되었지만, 청구범위는 실시예에 기재된 구현예에 의해 제한되어서는 안되고, 전체적으로 설명과 일치하는 가장 넓은 해석이 제공되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 출원의 용어가 본원에 참조로 포함되는 문헌에서 상이하게 정의되는 것으로 밝혀진 경우, 본원에 제공된 정의는 용어에 대한 정의로서 역할을 하는 것이다.
서열의 표
CymR 유전자(서열번호 1) 슈도모나스 푸티다
CymR 단백질(서열번호 2) 슈도모나스 푸티다
CMV5-CuO로부터의 CuO(P2)(서열번호 3) 슈도모나스 푸티다
CuO(P1)(서열번호 4) 슈도모나스 푸티다
CMV5-CuO(서열번호 5) 합성
1xlambdaOP(서열번호 6) 박테리오파지
12xlambdaOP(서열번호 7) 합성
13xlambdaOP(서열번호 8) 합성
12xlambdaCMVmin(서열번호 9) 합성
13xlambdaCMVmin(서열번호 10) 합성
13xlambda-TPL(서열번호 11) 합성
11xlambda-hbgmin(서열번호 12) 합성
λR-GyrB 유전자(서열번호 13) 합성
λR-GyrB 유전자(서열번호 14) 합성
마우스 NF-κB의 p65 서브유닛의 C-말단 부분(서열번호 15)
토끼 β-글로빈 폴리A(서열번호 16)
bGH(소 성장 호르몬) 폴리A(서열번호 17)
SV40 폴리(A) 신호(서열번호 18) 시미안 바이러스 40
코돈 최적화된 VSVg-Q96-I57L(서열번호 19) 합성
VSVg-Q96-I57L 아미노산(서열번호 20) 수포성 구내염 바이러스
참고문헌:
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<400> 1
atgagcccca agaggagaac ccaggccgag agagccatgg agacccaggg caagctgatc 60
gccgctgccc tgggcgtgct gagagagaag ggctacgccg gcttcagaat cgccgacgtg 120
cctggagccg ccggagtgag cagaggcgcc cagagccacc acttccctac caagctggag 180
ctgctgctgg ccaccttcga gtggctgtac gagcagatca ccgagaggag cagagccaga 240
ctggccaagc tgaagcccga ggacgatgtg atccagcaga tgctggatga tgccgccgag 300
ttcttcctgg acgacgactt cagcatcagc ctggacctga tcgtggccgc cgacagagac 360
cccgccctga gagagggcat ccagaggacc gtggagcgga acagattcgt ggtggaggac 420
atgtggctgg gagtgctggt gtccagaggc ctgagcagag atgacgccga ggacatcctg 480
tggctgatct tcaactctgt gaggggcctg gctgtgagaa gcctgtggca gaaggacaag 540
gagagattcg agagagtgcg gaacagcacc ctggagatcg ccagagagcg ctacgccaag 600
tttaaacggt ga 612
<210> 2
<211> 203
<212> PRT
<213> Pseudomonas putida
<400> 2
Met Ser Pro Lys Arg Arg Thr Gln Ala Glu Arg Ala Met Glu Thr Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Ile Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu Lys Gly Tyr
20 25 30
Ala Gly Phe Arg Ile Ala Asp Val Pro Gly Ala Ala Gly Val Ser Arg
35 40 45
Gly Ala Gln Ser His His Phe Pro Thr Lys Leu Glu Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Phe Glu Trp Leu Tyr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Ser Arg Ala Arg
65 70 75 80
Leu Ala Lys Leu Lys Pro Glu Asp Asp Val Ile Gln Gln Met Leu Asp
85 90 95
Asp Ala Ala Glu Phe Phe Leu Asp Asp Asp Phe Ser Ile Ser Leu Asp
100 105 110
Leu Ile Val Ala Ala Asp Arg Asp Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Arg Thr Val Glu Arg Asn Arg Phe Val Val Glu Asp Met Trp Leu Gly
130 135 140
Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Ser Arg Asp Asp Ala Glu Asp Ile Leu
145 150 155 160
Trp Leu Ile Phe Asn Ser Val Arg Gly Leu Ala Val Arg Ser Leu Trp
165 170 175
Gln Lys Asp Lys Glu Arg Phe Glu Arg Val Arg Asn Ser Thr Leu Glu
180 185 190
Ile Ala Arg Glu Arg Tyr Ala Lys Phe Lys Arg
195 200
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Pseudomonas putida
<400> 3
aacaaacaga caatctggtc tgtttgta 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Pseudomonas putida
<400> 4
agaaacaaac caacctgtct gtatta 26
<210> 5
<211> 1101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggca agcttgccgg 480
gtcgaggtag gcgtgtacgg tgggaggcct atataagcaa ccggtataat acaaacagac 540
cagattgtct gtttgttacc ggtgtttagt gaaccgggcg cgcctcatat cgcctggaga 600
cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccgcggt 660
cactctcttc cgcatcgctg tctgcgaggg ccagctgttg ggctcgcggt tgaggacaaa 720
ctcttcgcgg tctttccagt actcttggat cggaaacccg tcggcctccg aacggtactc 780
cgccaccgag ggacctgagc cagtccgcat cgaccggatc ggaaaacctc tcgagaaagg 840
cgtctaacca gtcacagtcg caaggtaggc tgagcaccgt ggcgggcggc agcgggtggc 900
ggtcggggtt gtttctggcg gaggtgctgc tgatgatgta attaaagtag gcggtcttga 960
gccggcggat ggtcgaggtg aggtgtggca ggcttgagat ccagctgttg gggtgagtac 1020
tccctctcaa aagcgggcat gacttctgcg ctaagattgt cagtttccaa aaacgaggag 1080
gatttgatat tcacctggcc c 1101
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> bacteriophage
<400> 6
tcgagtttac ctctggcggt gatag 25
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac 60
ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt 120
gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag 180
tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg 240
gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag 300
<210> 8
<211> 325
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac 60
ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt 120
gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag 180
tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg 240
gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag 300
tcgagtttac ctctggcggt gatag 325
<210> 9
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac 60
ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt 120
gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag 180
tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg 240
gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag 300
tcgactctag ataggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagct 348
<210> 10
<211> 373
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac 60
ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt 120
gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag 180
tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg 240
gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag 300
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgac tctagatagg cgtgtacggt gggaggccta 360
tataagcaga gct 373
<210> 11
<211> 904
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac 60
ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt 120
gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag 180
tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg 240
gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag 300
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgac tctagatagg cgtgtacggt gggaggccta 360
tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt 420
tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc ggtcactctc ttccgcatcg 480
ctgtctgcga gggccagctg ttgggctcgc ggttgaggac aaactcttcg cggtctttcc 540
agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta ctccgccacc gagggacctg 600
agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa aggcgtctaa ccagtcacag 660
tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt ggcggtcggg gttgtttctg 720
gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct tgagacggcg gatggtcgag 780
gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag tactccctct caaaagcggg 840
cattacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga tattcacctg 900
gccc 904
<210> 12
<211> 1372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac 60
ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt 120
gatagtcgag tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag 180
tttacctctg gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgag tttacctctg 240
gcggtgatag tcgagtttac ctctggcggt gatagtcgac tctagatagg cgtgtacggt 300
gggaggccta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatccctgga gacgccatcc 360
acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatca acctaagctt ccaaccggtg 420
tttagtgaac cgggcgcgcc tcatatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 480
catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggtcact ctcttccgca tcgctgtctg 540
cgagggccag ctgttgggct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtactc 600
ttggatcgga aacccgtcgg cctccgaacg gtactccgcc accgagggac ctgagcgagt 660
ccgcatcgac cggatcggaa aacctctcga gaaaggcgtc taaccagtca cagtcgcaag 720
gtaggctgag caccgtggcg ggcggcagcg ggtggcggtc ggggttgttt ctggcggagg 780
tgctgctgat gatgtaatta aagtaggcgg tcttgagacg gcggatggtc gaggtgaggt 840
gtggcaggct tgagatccag ctgttggggt gagtactccc tctcaaaagc gggcattact 900
tctgcgctaa gattgtcagt ttccaaaaac gaggaggatt tgatattcac ctggcccgat 960
ctggccatac acttaacgta cacatattga ccaaatcagg gtaattttgc atttgtaatt 1020
ttaaaaaatg ctttcttctt ttaatatact tttttgttta tcttatttct aatactttcc 1080
ctaatctctt tctttcaggg caataatgat acaatgtatc atgcctcttt gcaccattct 1140
aaagaataac agtgataatt tctgggttaa ggcaatagca atatttctgc atataaatat 1200
ttctgcatat aaattgtaac tgatgtaaga ggtttcatat tgctaatagc agctacaatc 1260
cagctaccat tctgctttta ttttatggtt gggataaggc tggattattc tgagtccaag 1320
ctaggccctt ttgctaatca tgttcatacc tcttatcttc ctcccacagc tc 1372
<210> 13
<211> 1674
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 13
atgagcacaa aaaagaaacc attaacacaa gagcagcttg aggacgcacg tcgccttaaa 60
gcaatttatg aaaaaaagaa aaatgaactt ggcttatccc aggaatctgt cgcagacaag 120
atggggatgg ggcagtcagg cgttggtgct ttatttaatg gcatcaatgc attaaatgct 180
tataacgccg cattgcttgc aaaaattctc aaagttagcg ttgaagaatt tagcccttca 240
atcgccagag aaatctacga gatgtatgaa gcggttggga tgcagccgtc acttagaagt 300
gagtatgagt accctgtttt ttctcatgtt caggcaggga tgttctcacc tgagcttaga 360
acctttacca aaggtgatgc ggagagatgg gtagatatct cgaattctta tgactcctcc 420
agtatcaaag tcctgaaagg gctggatgcg gtgcgtaagc gcccgggtat gtatatcggc 480
gacacggatg acggcaccgg tctgcaccac atggtattcg aggtggtaga taacgctatc 540
gacgaagcgc tcgcgggtca ctgtaaagaa attatcgtca ccattcacgc cgataactct 600
gtctctgtac aggatgacgg gcgcggcatt ccgaccggta ttcacccgga agagggcgta 660
tcggcggcgg aagtgatcat gaccgttctg cacgcaggcg gtaaatttga cgataactcc 720
tataaagtgt ccggcggtct gcacggcgtt ggtgtttcgg tagtaaacgc cctgtcgcaa 780
aaactggagc tggttatcca gcgcgagggt aaaattcacc gtcagatcta cgaacacggt 840
gtaccgcagg ccccgctggc ggttaccggc gagactgaaa aaaccggcac catggtgcgt 900
ttctggccca gcctcgaaac cttcaccaat gtgaccgagt tcgaatatga aattctggcg 960
aaacgtctgc gtgagttgtc gttcctcaac tccggcgttt ccattcgtct gcgcgacaag 1020
cgcgacggca aagaagacca cttccactat gaaggcggcc catggatggg ccctaaaaag 1080
aagcgtaaag tcgccatcga tcagctcacc atggtgtttc cttctgggca gatctcaaac 1140
caggccctgg ccttagcacc gtcctctgcc ccagtccttg cccagaccat ggtcccttcc 1200
tcagccatgg tacctctggc tcagccccca gctcctgccc cagttctaac cccgggtcct 1260
ccccagtccc tgtctgcacc tgttccaaag agcacccagg ctggggaagg cacgctgtcg 1320
gaagccctgc tgcacctgca gtttgatgct gatgaagact tgggggcctt gcttggcaac 1380
agcacagacc caggagtgtt cacagacctg gcatctgtgg acaactcaga gtttcagcag 1440
ctcctgaacc agggtgtgtc catgtctcac tccacagctg agcccatgct gatggagtac 1500
cctgaagcta taactcgcct ggtgacaggg tcccagaggc cccctgaccc agctcccaca 1560
cccctgggga cctcggggct tcccaatggt ctctccggag atgaagactt ctcctccatt 1620
gcggacatgg acttctctgc tctgctgagt cagatcagct ccagcggcca ataa 1674
<210> 14
<211> 557
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 14
Met Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu
20 25 30
Ser Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val
35 40 45
Gly Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala
50 55 60
Leu Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser
65 70 75 80
Ile Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Gly Met Gln Pro
85 90 95
Ser Leu Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Pro Val Phe Ser His Val Gln Ala
100 105 110
Gly Met Phe Ser Pro Glu Leu Arg Thr Phe Thr Lys Gly Asp Ala Glu
115 120 125
Arg Trp Val Asp Ile Ser Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Ile Lys Val
130 135 140
Leu Lys Gly Leu Asp Ala Val Arg Lys Arg Pro Gly Met Tyr Ile Gly
145 150 155 160
Asp Thr Asp Asp Gly Thr Gly Leu His His Met Val Phe Glu Val Val
165 170 175
Asp Asn Ala Ile Asp Glu Ala Leu Ala Gly His Cys Lys Glu Ile Ile
180 185 190
Val Thr Ile His Ala Asp Asn Ser Val Ser Val Gln Asp Asp Gly Arg
195 200 205
Gly Ile Pro Thr Gly Ile His Pro Glu Glu Gly Val Ser Ala Ala Glu
210 215 220
Val Ile Met Thr Val Leu His Ala Gly Gly Lys Phe Asp Asp Asn Ser
225 230 235 240
Tyr Lys Val Ser Gly Gly Leu His Gly Val Gly Val Ser Val Val Asn
245 250 255
Ala Leu Ser Gln Lys Leu Glu Leu Val Ile Gln Arg Glu Gly Lys Ile
260 265 270
His Arg Gln Ile Tyr Glu His Gly Val Pro Gln Ala Pro Leu Ala Val
275 280 285
Thr Gly Glu Thr Glu Lys Thr Gly Thr Met Val Arg Phe Trp Pro Ser
290 295 300
Leu Glu Thr Phe Thr Asn Val Thr Glu Phe Glu Tyr Glu Ile Leu Ala
305 310 315 320
Lys Arg Leu Arg Glu Leu Ser Phe Leu Asn Ser Gly Val Ser Ile Arg
325 330 335
Leu Arg Asp Lys Arg Asp Gly Lys Glu Asp His Phe His Tyr Glu Gly
340 345 350
Gly Pro Trp Met Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ile Asp Gln
355 360 365
Leu Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Asn Gln Ala Leu Ala
370 375 380
Leu Ala Pro Ser Ser Ala Pro Val Leu Ala Gln Thr Met Val Pro Ser
385 390 395 400
Ser Ala Met Val Pro Leu Ala Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Val Leu
405 410 415
Thr Pro Gly Pro Pro Gln Ser Leu Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Thr
420 425 430
Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Phe
435 440 445
Asp Ala Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro
450 455 460
Gly Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln
465 470 475 480
Leu Leu Asn Gln Gly Val Ser Met Ser His Ser Thr Ala Glu Pro Met
485 490 495
Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ser Gln
500 505 510
Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Thr Pro Leu Gly Thr Ser Gly Leu Pro
515 520 525
Asn Gly Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp
530 535 540
Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser Ser Gly Gln
545 550 555
<210> 15
<211> 181
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Pro Ser Gly Gln Ile Ser Asn Gln Ala Leu Ala Leu Ala Pro Ser Ser
1 5 10 15
Ala Pro Val Leu Ala Gln Thr Met Val Pro Ser Ser Ala Met Val Pro
20 25 30
Leu Ala Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gln Ser Leu Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Thr Gln Ala Gly Glu Gly
50 55 60
Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Phe Asp Ala Asp Glu Asp
65 70 75 80
Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Gly Val Phe Thr Asp
85 90 95
Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly
100 105 110
Val Ser Met Ser His Ser Thr Ala Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro
115 120 125
Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ser Gln Arg Pro Pro Asp Pro
130 135 140
Ala Pro Thr Pro Leu Gly Thr Ser Gly Leu Pro Asn Gly Leu Ser Gly
145 150 155 160
Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu
165 170 175
Ser Gln Ile Ser Ser
180
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 16
aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56
<210> 17
<211> 225
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 17
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 18
<211> 122
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 18
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 19
<211> 1536
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 19
atgaaatgtc tgctgtacct ggcattcctg tttatcggag tcaactgcaa gtttactatc 60
gtcttccccc acaatcagaa aggcaattgg aagaacgtgc caagcaatta ccactattgc 120
cccagctcct ctgacctgaa ctggcataat gatctgatcg gcaccgccct gcaggtcaag 180
atgcccaaat cccacaaggc catccaggct gacgggtgga tgtgccatgc ttctaaatgg 240
gtgaccacat gtgacttccg gtggtacgga ccaaagtata tcactcatag cattcgctcc 300
ttcaccccct ccgtggagca gtgcaaagag tctattgaac agaccaagca ggggacatgg 360
ctgaaccctg gatttccccc tcagtcctgt gggtacgcca cagtcactga cgctgaggca 420
gtgatcgtcc aggtgacacc acaccatgtc ctggtggacg agtatactgg ggaatgggtg 480
gattcacagt tcattaacgg aaaatgcagc aattacatct gtcctacagt ccacaactct 540
actacctggc atagtgatta taaggtgaaa ggcctgtgcg atagcaatct gatctccatg 600
gacattactt tctttagtga ggatggcgaa ctgagttcac tggggaagga gggaaccggc 660
tttcggagca attacttcgc atatgaaaca ggcgggaaag cctgcaagat gcagtactgt 720
aaacactggg gagtccgcct gccatctggc gtgtggttcg agatggcaga caaggatctg 780
tttgccgctg cacgattccc agagtgcccc gaaggcagct ccatctctgc ccccagtcag 840
acttcagtgg acgtgagcct gattcaggat gtggagagaa tcctggacta cagtctgtgc 900
caggaaacct ggtcaaaaat tagggctggc ctgcctatct caccagtgga cctgagctat 960
ctggctccca aaaaccctgg gactggaccc gccttcacca tcattaatgg gacactgaag 1020
tacttcgaga cccggtatat cagagtggac attgccgctc ctatcctgag ccgaatggtg 1080
ggcatgatct ccgggacaac taccgagcgg gaactgtggg acgattgggc tccttacgag 1140
gatgtcgaaa ttggaccaaa cggcgtgctg aggacatcta gtggctacaa atttcctctg 1200
tatatgatcg gccacgggat gctggactct gatctgcatc tgtcaagcaa ggcacaggtg 1260
ttcgagcacc cccatatcca ggacgcagcc tctcagctgc ctgacgatga aagtctgttc 1320
tttggggata ccggactgag caaaaatcca attgagctgg tggaaggatg gttttcctct 1380
tggaagagtt caatcgcctc cttctttttc atcattggac tgatcattgg cctgttcctg 1440
gtcctgcggg tgggcattca cctgtgcatc aagctgaaac ataccaagaa aagacagatt 1500
tacaccgaca ttgagatgaa cagactgggc aagtga 1536
<210> 20
<211> 511
<212> PRT
<213> Vesicular stomatitis virus
<400> 20
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn
20 25 30
Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp
35 40 45
His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser
50 55 60
His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp
65 70 75 80
Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His
85 90 95
Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile
100 105 110
Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln
115 120 125
Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln
130 135 140
Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val
145 150 155 160
Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr
165 170 175
Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu
180 185 190
Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp
195 200 205
Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn
210 215 220
Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys
225 230 235 240
Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala
245 250 255
Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly
260 265 270
Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile
275 280 285
Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp
290 295 300
Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn
325 330 335
Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala
340 345 350
Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr
355 360 365
Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile
370 375 380
Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu
385 390 395 400
Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser
405 410 415
Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln
420 425 430
Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys
435 440 445
Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser
450 455 460
Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu
465 470 475 480
Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys
485 490 495
Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
500 505 510
Claims (62)
- 유도성 발현 시스템으로서,
a) 구성적 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 쿠메이트 리프레서 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 발현 카세트;
b) 쿠메이트-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질(coumermycin chimeric transactivator protein)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 발현 카세트; 및
c) 제3 발현 카세트로서,
i) 쿠메르마이신-유도성 프로모터, 클로닝 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 분자로서, 클로닝 부위는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 작동 가능한 연결로 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 삽입을 위한 것인, 핵산 분자, 또는
ii) 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 제3 발현 카세트를 포함하는, 유도성 발현 시스템. - 제1항에 있어서, 구성적 프로모터가 인간 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 인간 신장 인자 1 알파(EF1A) 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 베타-액틴 프로모터, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 하이브리드 CMV 인핸서/베타-액틴 프로모터(CAG), 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 발현 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 쿠메이트 리프레서 단백질이 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나, 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠메이트-유도성 프로모터가 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠메르마이신 키메라 전사활성제 단백질이 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나, 서열번호 13에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 갖는 핵산 분자에 의해 인코딩되는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터가 서열번호 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나, 서열번호 10에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터가 트리파타이트 리더(TPL) 및/또는 주요 후기 프로모터(MLP) 인핸서를 추가로 포함하는, 발현 시스템.
- 제7항에 있어서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터가 서열번호 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터가 인간 베타-글로빈 인트론을 추가로 포함하는, 발현 시스템.
- 제9항에 있어서, 쿠메르마이신-유도성 프로모터가 서열번호 12에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 발현 카세트가 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 발현 시스템.
- 제11항에 있어서, 제3 발현 카세트가 재조합 단백질을 인코딩하는, 발현 시스템.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제2 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제4 발현 카세트를 추가로 포함하는, 발현 시스템.
- 제13항에 있어서, 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제3 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제5 발현 카세트를 추가로 포함하는, 발현 시스템.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 제4 및/또는 제5 발현 카세트의 프로모터가 쿠메르마이신-유도성 프로모터인, 발현 시스템.
- 제15항에 있어서, 제4 및/또는 제5 발현 카세트의 프로모터가 구성적 프로모터인, 발현 시스템.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시스템이 바이러스 벡터의 하나 이상의 성분을 인코딩하는, 발현 시스템.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 발현 카세트가 렌티바이러스 REV 단백질을 인코딩하며, 제4 발현 카세트의 프로모터가 쿠메르마이신-유도성 프로모터이며, 제4 발현 카세트가 바이러스 외피 단백질을 인코딩하며, 제5 발현 카세트가 렌티바이러스 Gag/pol을 인코딩하는, 발현 시스템.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 발현 카세트가 바이러스 외피 단백질을 인코딩하며, 제4 발현 카세트의 프로모터가 쿠메르마이신-유도성 프로모터이며, 제4 발현 카세트가 렌티바이러스 Gag/pol을 인코딩하며, 제5 발현 카세트가 렌티바이러스 REV 단백질을 인코딩하는, 발현 시스템.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 바이러스 외피 단백질이 VSVg, 선택적으로 VSVg-Q96H-I57L인, 발현 시스템.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 발현 카세트가 Rep40 또는 Rep52를 인코딩하며, 제4 발현 카세트가 Rep68 또는 Rep78을 인코딩하며, 제4 발현 카세트가 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 발현 시스템.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 발현 카세트가 Rep52를 인코딩하며, 제4 발현 카세트가 Rep68을 인코딩하며, 제5 발현 카세트가 Rep78을 인코딩하며, 제4 및 제5 발현 카세트가 쿠메르마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 발현 시스템.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 발현 카세트가 항체 중쇄 또는 이의 일부를 인코딩하며, 제4 발현 카세트가 항체 경쇄 또는 이의 일부를 인코딩하는, 발현 시스템.
- 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 방법은
a) 포유동물 세포에 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템 및 선택 가능한 마커를 도입하는 단계; 및
b) 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 발현 시스템을 보유하는 세포를 선택하고 관심 바이러스 벡터, RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제24항에 있어서, c) 발현 시스템을 포함하는 개별 세포를 분리하는 단계; 및 d) 개별 세포를 배양하여 발현 시스템을 포함하는 세포의 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 방법은
a) 포유동물 세포에 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
b) 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
c) 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계;
d) 제1 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계;
e) 제1 세포 집단의 세포에 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제2 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
f) 세포에 선택적 압력을 가하여 제2 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
g) 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계;
h) 제2 개별 세포를 배양하여 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득하는 단계;
i) 제2 세포 집단의 세포에 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 제3 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
j) 세포에 선택적 압력을 가하여 제3 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제3 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
k) 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 개별 세포를 분리하는 단계;
l) 제3 개별 세포를 배양하여 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 세포 집단을 수득함으로써, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제26항에 있어서, 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제4 발현 카세트, 및 선택적으로 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제5 발현 카세트가 단계 i)에서 또는 단계 l) 후에 세포에 도입되는, 방법.
- 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성하는 방법으로서, 방법은
a) 포유동물 세포에 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제1 발현 카세트, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제2 발현 카세트, 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
b) 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
c) 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계;
d) 제1 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계;
e) 제1 세포 집단의 세포에 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
f) 세포에 선택적 압력을 가하여 제2 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
g) 제3 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계;
h) 제2 개별 세포를 배양하여 제3 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득함으로써, 관심 RNA 또는 단백질의 생산을 위한 포유동물 세포를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제28항에 있어서, 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제4 발현 카세트, 및 선택적으로 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제5 발현 카세트가 단계 e)에서 또는 단계 h) 후에 세포에 도입되는, 방법.
- 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시스템 또는 발현 시스템의 하나 이상의 발현 카세트가 트랜스펙션, 형질도입, 감염, 전기천공, 소노포레이션, 뉴클레오펙션, 또는 미세주입에 의해 세포에 도입되는, 방법.
- 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, 세포.
- 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템을 포함하는, 세포.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 세포가 인간 세포, 선택적으로 인간 배아 신장(HEK)-293 세포 또는 이의 파생물인, 세포.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 이의 파생물, VERO 세포 또는 이의 파생물, HeLa 세포 또는 이의 파생물, A549 세포 또는 이의 파생물, 줄기 세포 또는 이의 파생물, 또는 뉴런 또는 이의 파생물인, 세포.
- 관심 RNA 또는 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포의 발현 시스템의 제3 발현 카세트는 관심 RNA 또는 단백질을 인코딩하며, 관심 RNA 또는 단백질이 생산되는, 방법.
- 제35항에 있어서, 쿠메이트 이펙터 분자가 쿠메이트이며, 선택적으로 쿠메이트가 약 1 내지 약 200 ㎍/㎖, 약 50 내지 약 150 ㎍/㎖, 또는 약 100 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 쿠메르마이신 이펙터 분자가 쿠메르마이신이며, 선택적으로 쿠메르마이신이 약 1 내지 약 30 nM, 약 5 내지 20 약 nM, 또는 약 10 nM의 농도로 존재하는, 방법.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 현탁액에서 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는, 방법.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항의 발현 시스템을 포함하는, 바이러스 패키징 세포(virus packaging cell).
- 제39항에 있어서, 바이러스 패키징 세포가 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 발현 시스템을 포함하는 렌티바이러스 패키징 세포인, 바이러스 패키징 세포.
- 제39항에 있어서, 바이러스 패키징 세포가 제21항 또는 제22항의 발현 시스템을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 패키징 세포인, 바이러스 패키징 세포.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 유전자를 보유하는 바이러스 작제물을 추가로 포함하는, 바이러스 패키징 세포.
- 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 방법은
a) 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 바이러스 패키징 세포에 관심 유전자를 보유하는 바이러스 작제물을 도입하거나, 제42항의 바이러스 패키징 세포를 수득하는 단계; 및
b) 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 세포를 배양함으로써, 바이러스 벡터를 생산하는 단계를 포함하는, 방법. - 제43항에 있어서, 쿠메이트 이펙터 분자가 쿠메이트이고/거나 쿠메르마이신 이펙터 분자가 쿠메르마이신인, 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 바이러스 패키징 세포가 현탁액에서 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는, 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 가능한 마커가 바이러스 작제물과 함께 세포에 도입되며, 방법이 선택적인 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택하는 단계, 및 선택적으로 바이러스 작제물을 포함하는 개별 세포를 분리하는 단계 및 바이러스 작제물을 포함하는 개별 세포를 배양하여 바이러스 작제물을 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 제40항의 렌티바이러스 패키징 세포이며, 바이러스 작제물이 렌티바이러스 작제물인, 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 제41항의 AAV 패키징 세포이며, 바이러스 작제물이 AAV 작제물인, 방법.
- 발현-준비된 포유동물 세포주(expression-ready mammalian cell line)를 생성하는 방법으로서, 방법은
a) 포유동물 세포에 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제1 발현 카세트, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제2 발현 카세트, 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
b) 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 발현 시스템의 제1 및 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
c) 개별 세포를 분리하는 단계; 및
d) 개별 세포를 배양하여 세포주를 생성함으로써, 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성하는 방법으로서, 방법은
a) 포유동물 세포에 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
b) 세포에 선택적 압력을 가하여 제1 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제1 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
c) 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 개별 세포를 분리하는 단계;
d) 제1 개별 세포를 배양하여 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 세포 집단을 수득하는 단계;
e) 제1 세포 집단의 세포에 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제2 발현 카세트 및 제2 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
f) 세포에 선택적 압력을 가하여 제2 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 제2 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
g) 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 개별 세포를 분리하는 단계; 및
h) 제2 개별 세포를 배양하여 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 세포 집단을 수득함으로써, 발현-준비된 포유동물 세포주를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제2 발현 카세트를 포함하는, 포유동물 세포.
- 제51항에 있어서, 세포가 인간 세포, 선택적으로 인간 배아 신장(HEK)-293 세포 또는 이의 파생물인, 포유동물 세포.
- 관심 RNA 또는 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은
a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제1 발현 카세트 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템의 제2 발현 카세트를 포함하는 세포에, 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제3 발현 카세트 및 선택 가능한 마커를 도입하는 단계;
b) 세포에 선택적 압력을 가하여 선택 가능한 마커를 보유하는 세포를 선택함으로써, 발현 시스템의 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 보유하는 세포를 선택하는 단계;
c) 선택적으로 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 포함하는 개별 세포를 분리하는 단계; 및 개별 세포를 배양하여 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 포함하는 세포의 집단을 생성하는 단계;
d) 쿠메이트 이펙터 분자 및 쿠메르마이신 이펙터 분자의 존재 하에 제1, 제2, 및 제3 발현 카세트를 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 관심 RNA 또는 단백질이 생산되는 단계를 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서, 쿠메이트 이펙터 분자가 쿠메이트이고/거나 쿠메르마이신 이펙터 분자가 쿠메르마이신인, 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 세포가 현탁액에서 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는, 방법.
- 키트로서,
a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 플라스미드;
b) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 플라스미드; 및
c) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 플라스미드를 포함하는, 키트. - 제51항 또는 제52항의 세포, 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 시스템의 제3 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함하는, 키트.
- 제56항 또는 제57항에 있어서, 제3 발현 카세트가 쿠메르마이신-유도성 프로모터, 클로닝 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하며, 클로닝 부위는 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와의 작동 가능한 연결로 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 삽입을 위한 것인, 키트.
- 제56항 또는 제57항에 있어서, 제3 발현 카세트가 쿠메르마이신-유도성 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 제1 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 키트.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 세포, 및 바이러스 작제물을 포함하는, 키트.
- 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠메이트 이펙터 분자, 선택적으로 쿠메이트, 및/또는 쿠메르마이신 이펙터 분자, 선택적으로 쿠메르마이신을 추가로 포함하는, 키트.
- 제31항 내지 제34항 및 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 세포, 및 쿠메이트 이펙터 분자, 선택적으로 쿠메이트, 및/또는 쿠메르마이신 이펙터 분자, 선택적으로 쿠메르마이신을 포함하는, 키트.
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