CN112852810B - 一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用 - Google Patents

一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用。所述真核基因表达启动子具有如(I)、(II)或(III)所述的核苷酸序列中的任意一个：(I)编码RPS家族表达启动子的核苷酸序列；(II)如(I)所述的核苷酸序列经修饰、取代或突变至少一个核苷酸获得的核苷酸序列；(III)与(I)所述的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列。本发明中提供的表达启动子不含潜在起始翻译序列，从根本上消除了非目的翻译起始；同时，所述启动子能够驱动外源基因的表达，利用其构建的表达载体在不同细胞中均能实现目的基因的高效表达，因此，该启动子在临床基因治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用，尤其涉及一种可用于基因治疗的新型真核基因表达启动子及其载体。
背景技术
真核基因的外源表达不仅是生命科学研究领域的基本基因操作手段，也是临床基因治疗用的主要策略。启动子(Promoter)是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游且本身不被转录。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用：启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。
当前已有不少启动子被应用到基因操作中，如CMV、EF1apro、UBC promoter、PGKpromoter、肝脏特异的Alb启动子、造血细胞特异的Vav启动子等。然而，这些启动子往往存在以下缺陷：
(1)在不同种细胞类型中表达差异极大，比如CMV在胚胎干细胞ESC中活性很低；
(2)UBC启动子的整体表达效率比CMV和EF1a启动子都要孱弱；
(3)EF1α启动子可在多数种类细胞中稳定表达，尤其是某些CMV启动子会发生沉默的细胞，如干细胞等；虽然EF1a启动子比较高效，但是启动子区域较大，转录调控因子不集中，为确保启动子活性，大片段的内含子区域被保留，在内含子中存在许多ATG序列，导致不正确的翻译起始。例如，在clontech公司的慢病毒载体上EF1a启动子长达1kb有余，并且根据经验，EF1a启动子在长期培养中会被沉默。
因此，本领域中亟需寻找和遴选更加精简更加高效更加稳定的启动子，用于外源基因的表达研究。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用。所述真核基因表达启动子能够在多种细胞中进行高效表达，在临床基因治疗领域具有广泛的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种真核基因表达启动子，所述真核基因表达启动子具有如(I)、(II)或(III)所述的核苷酸序列中的任意一个：
(I)编码RPS家族表达启动子的核苷酸序列；
(II)如(I)所述的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个核苷酸获得的核苷酸序列；
(III)与(I)所述的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列。
本发明从RNA-seq以及ChIP-seq数据入手，筛选得到了一种更优的真核基因表达启动子，长度相较于现有启动子较短，且非常适合用于基因工程操作。经研究发现，其具有与EF1a启动子相当的表达效率，并且在若干细胞类型中具有更高更稳定的表达强度，时间尺度的表达稳定性也明显优于EF1a启动子，由该启动子驱动外源基因表达为基因治疗提供了新的研究技术和工具。
本发明中，所述真核基因表达启动子采用如下方式筛选得到：
(1)分析HSC细胞、K562细胞和MSC细胞等细胞的RNA-seq数据并进行表达筛选。其中，EF1a、RPS6、RPS18、RPS27、FTL、HSP90AB1、HIST1H2BK、HBG、HBE1、ATP5B、ACTB以及众多线粒体基因的表达丰度较高，排前100位；
(2)利用ReMap数据库进行分析，在经过逐一分析启动子区转录调控信息之后，发现RPS家族基因启动子的转录调控元件更加集中，可能更适合驱动外源基因表达；
本发明中，以EF1a(EEF1A1)和RPS6基因的启动子区域转录调控分析(如图1(A)和图1(B)所示)为例，对启动子区转录调控信息的分析过程进行简单描述：
其中，如图1(A)所示，EF1a promoter的转录调控区域自上游启动子，深入至第一号内含子内部，显示出三个主要区域，起主要激活调控作用的顺式元件全长约1.5kb；以clontech公司的慢病毒载体pLenti为例，其EF1apro长度为939bp；
相比较而言，如图1(B)所示，核糖体蛋白RPS6基因的启动子调节区域比较集中，仅有1个主要调控区域，集中在近端启动子和第一内含子上部。
有鉴于此，商业化的慢病毒载体上装载的EF1a启动子必然囊括较长的内含子区域，该区域中含有9个以上的“ATG”序列，这序列可能导致翻译不正常起始，从而导致翻译失效；而本发明中创新设计的RPS6启动子仅600bp，囊括了近端启动子区域和部分内含子区域，其中潜在的“ATG”序列均进行突变进化，从而从根本上消除潜在的非目的翻译起始。
作为本发明优选的技术方案，所述RPS家族表达启动子包括RPS27启动子、RPS18启动子或RPS6启动子中的任意一种，优选为RPS6启动子(RPS6promoter，RPS6pro)。
然而，RPS27启动子调控区域深入内含子过长；RPS18启动子与其他启动子呈现融合状态；因此，经过多轮多因素综合分析，本发明中以RPS6启动子作为最优选项被遴选出来，进行了下一步功能研究。
优选地，所述真核基因表达启动子具有编码RPS6启动子的核苷酸序列和/或RPS6启动子经修饰、取代、缺失或添加至少一个核苷酸获得的核苷酸序列。
本发明中，所述RPS6启动子为RPS6基因近端最具转录调控活性的区域，其序列如SEQ ID NO.1所示：
CCACCGCGCCCGGCCTTGCCCTCCTATTTTGGTACCGTCAGATGCAAAGTGCCTGGGACAGAAGTGGGGCTCCGCTGGCGCCCAGCTCCAAAACCCAGGCAGCGTGGAAAAGACTAGACAGGGAAGGGGTTAGCCCTCAGAATTACACGCGGGTTTGCCTTACCAGACTACCACCACTGGCACAACCTCAGACCCACACCCAACCGACTTTACCTCCCAGGCCCTGATTAATCTCGCCCGGAAGTACCGCCCACCCATGCTCACTTCCGCTATCCCGTACTTCTGCTCATCTCGCGAGAACTGAAAGCGCCTATGTGACCTGCGCTAAGCGGAAGTTGGCCCTCTTTTCCGTGGCGCCTCGGAGGCGTTCAGCTGCTTCAAGATGAAGGTAGGTGATGGTGGCGAGTGTTAGACTGGGTTTGGGGAACGTGAATCGAGTCCCAGAACGCGGCATTGCCTCAGTTCCAGCACTCCAGGATCCTGGCTTTAGGTGGAGAAGGGTCTCAAGTAGGAGAAGGCTCGCCTTTCTGGGGCATGGAGCTTTTTGGCCGAACGGATGGCAGGCGATTGCGGCTGGAGCCGCGGCGGGCCGGGAGCGCC；
其中下划线表示序列中的“ATG”位点与第一内含子剪切位点“GTAGGTG”。
由于SEQ ID NO.1序列中存在多个ATG序列，可能导致非正常翻译起始。同时还存在内含子剪切的位点，需要同时进行突变消除。
因此本发明中，优选地，所述真核基因表达启动子具有RPS6启动子经取代四个核苷酸后的核苷酸序列。
优选地，所述取代发生的位点分别为T384A、A396G、A535G和A557G。
优选地，所述RPS6启动子的389-395位点由GTAGGTG替换为ACCTACG。
该处为第一内含子剪接的供体信号位点，为彻底消除可能存在的内含子剪接，将该位点进行突变。
优选地，所述真核基因表达启动子包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。经过优化设计后RPS6 promoter序列SEQ ID NO.2如下：
CCACCGCGCCCGGCCTTGCCCTCCTATTTTGGTACCGTCAGATGCAAAGTGCCTGGGACAGAAGTGGGGCTCCGCTGGCGCCCAGCTCCAAAACCCAGGCAGCGTGGAAAAGACTAGACAGGGAAGGGGTTAGCCCTCAGAATTACACGCGGGTTTGCCTTACCAGACTACCACCACTGGCACAACCTCAGACCCACACCCAACCGACTTTACCTCCCAGGCCCTGATTAATCTCGCCCGGAAGTACCGCCCACCCATGCTCACTTCCGCTATCCCGTACTTCTGCTCATCTCGCGAGAACTGAAAGCGCCTATGTGACCTGCGCTAAGCGGAAGTTGGCCCTCTTTTCCGTGGCGCCTCGGAGGCGTTCAGCTGCTTCAAGAAGAAGACCTACGGTGGTGGCGAGTGTTAGACTGGGTTTGGGGAACGTGAATCGAGTCCCAGAACGCGGCATTGCCTCAGTTCCAGCACTCCAGGATCCTGGCTTTAGGTGGAGAAGGGTCTCAAGTAGGAGAAGGCTCGCCTTTCTGGGGCGTGGAGCTTTTTGGCCGAACGGGTGGCAGGCGATTGCGGCTGGAGCCGCGGCGGGCCGGGAGCGCC；
其中，下划线表示序列中消除ATG位点后得到的序列以及与消除第一内含子剪切位点后得到的序列。SEQ ID NO.2序列经优化，消除了所有内源性ATG位点，并且消除了第一个内含子剪切位点。
第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含如第一方面所述的真核基因表达启动子。
优选地，所述表达载体包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、5′LTR、3′LTR、真核基因或WPRE调控元件中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包含至少一个拷贝的如第二方面所述的表达载体。
优选地，所述重组细胞包括293T细胞、HEL细胞或MSC细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明还提供如第一方面所述的真核基因表达启动子、如第二方面所述的表达载体或如第三方面所述的重组细胞在真核基因表达和/或基因治疗中的应用。
本发明所述的真核基因表达启动子在高剂量慢病毒感染下，可以在MSC细胞中得到更高的阳性率和更高的荧光强度，因此，在间充质干细胞中，所述真核基因表达启动子具有更高的转录活性，奠定了其在MSC源细胞基因治疗中的潜在应用价值。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)筛选并利用高效稳定的组成型表达启动子，是进行科学研究和临床基因治疗的重要手段，除了已广泛应用的CMV、SV40、EF1a、UBC等，本发明提供了一种可用于基因治疗的新型真核基因表达启动子，其中，以RPS6启动子为典型，RPS家族蛋白的启动子均可以作为外源基因表达的高效启动子；
(2)本发明中提供的RPS6 promoter仅600bp，囊括了近端启动子区域和部分内含子区域，并对潜在的“ATG”序列均进行突变进化，从而从根本上消除潜在的非目的翻译起始；同时，对第一外显子和第一内含子剪接位点进行突变进化，清除内含子剪切信号；
(3)本发明中同时验证了以RPS6为启动子构建真核基因表达载体后，在不同细胞中目的蛋白的表达量，其表达效果较好，说明RPS6启动子能够驱动外源基因的表达，在临床基因治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1(A)为EF1a启动子区域转录调控分析图。
图1(B)为RPS6基因的启动子区域转录调控分析图。
图2为利用RPS6启动子构建的慢病毒载体的结构示意图。
图3为利用EF1a启动子构建的慢病毒载体的结构示意图。
图4为实施例2中分别使用RPS6pro-LV和EF1apro-LV转染慢病毒后病毒滴度对比图。
图5为实施例2中使用含有RPS6pro-LV和EF1apro-LV的慢病毒分别感染293T细胞后得到的GFP阳性细胞的数量对比图。
图6为实施例2中使用3μL病毒293T细胞感染2天后得到的GFP阳性细胞的FACS结果图。
图7为实施例2中使用含有RPS6pro-LV和EF1apro-LV的慢病毒分别感染293T细胞后检测得到的平均荧光强度对比图。
图8为实施例3中分别使用含有RPS6pro-LV和EF1apro-LV的慢病毒感染293T细胞、HEL细胞和MSC细胞后GFP阳性率的检测结果对比图。
图9为实施例3中在HEL细胞中感染不同剂量病毒后GFP阳性率的检测结果对比图。
图10为实施例3中在MSC细胞中感染不同剂量病毒后GFP阳性率的检测结果对比图。
图11为实施例3中使用30μL病毒感染MSC细胞后得到的荧光显微观察结果图，其中I图为EF1apro-LV，II图为RPS6pro-LV。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
将突变进化的RPS6启动子(SEQ ID NO.2)克隆至慢病毒载体，如图2所示，所述慢病毒载体上依次包括5′LTR、U6pro、shRNA、RPS6pro、GFP(绿色荧光蛋白)、P2A-T2A、Puro、WPRE调控元件和3′LTR；
其中，RPS6启动子(SEQ ID NO.2)的序列为：
CCACCGCGCCCGGCCTTGCCCTCCTATTTTGGTACCGTCAGATGCAAAGTGCCTGGGACAGAAGTGGGGCTCCGCTGGCGCCCAGCTCCAAAACCCAGGCAGCGTGGAAAAGACTAGACAGGGAAGGGGTTAGCCCTCAGAATTACACGCGGGTTTGCCTTACCAGACTACCACCACTGGCACAACCTCAGACCCACACCCAACCGACTTTACCTCCCAGGCCCTGATTAATCTCGCCCGGAAGTACCGCCCACCCATGCTCACTTCCGCTATCCCGTACTTCTGCTCATCTCGCGAGAACTGAAAGCGCCTATGTGACCTGCGCTAAGCGGAAGTTGGCCCTCTTTTCCGTGGCGCCTCGGAGGCGTTCAGCTGCTTCAAGAAGAAGACCTACGGTGGTGGCGAGTGTTAGACTGGGTTTGGGGAACGTGAATCGAGTCCCAGAACGCGGCATTGCCTCAGTTCCAGCACTCCAGGATCCTGGCTTTAGGTGGAGAAGGGTCTCAAGTAGGAGAAGGCTCGCCTTTCTGGGGCGTGGAGCTTTTTGGCCGAACGGGTGGCAGGCGATTGCGGCTGGAGCCGCGGCGGGCCGGGAGCGCC。
同时，本实施例中还构建了包含EF1apro的慢病毒载体(如图3所示)，所述慢病毒载体上依次包括5′LTR、U6pro、shRNA、EF1apro、GFP(绿色荧光蛋白)、P2A-T2A、Puro、WPRE调控元件和3′LTR，方便后续进行平行实验，对比分析RPS6启动子的转录活性。
实施例2
本实施例用于验证RPS6pro-LV的表达效率。
(1)使用同样质量的质粒转染293T包装病毒，同样体积浓缩，1μL病毒感染1million 293T细胞，2天后使用FACS检测；
以293T的MOI为1，以此计算滴度，所得结果如图4所示，由图可知，RPS6pro-LV的滴度略高于EF1apro-LV，但是无明显的统计学差异ns(no significance)；
(2)使用293T细胞分别感染不同剂量(1μL、3μL、10μL)病毒，2天后使用FACS检测；
所得结果如图5所示，RPS6pro-LV具有与EF1apro-LV一致的阳性率，在病毒剂量为3μL，其GFP阳性的细胞数量明显高于EF1apro-LV。
其中，图6中使用FACS结果图展示了3μL病毒感染2天后，典型阳性率的比较图。
(3)检测293T细胞的荧光强度，所得结果如图7所示，RPS6pro-LV与EF1apro-LV的平均荧光强度基本一致。
因此，本实施例中可以证明在293T中，RPS6pro-LV具有与EF1apro-LV相当的表达效率。
实施例3
本实施例用于研究RPS6pro-LV在不同细胞中的表达效率。
(1)在293T细胞、HEL细胞和MSC细胞中同时感染10μL剂量病毒，2天后检测GFP阳性率。
所得结果如图8所示，在三种细胞中，RPS6pro-LV的表达量均高于EF1apro-LV，并且在HEL细胞中，两种的GFP阳性率具有显著差异；
(2)在HEL细胞中感染不同剂量(1μL、10μL、30μL、100μL)病毒，检测GFP阳性率；
所得结果如图9所示；较低剂量(1μL和10μL)下，RPS6pro的阳性率更好，均与EF1apro有显著的差异；
(3)在MSC细胞中感染不同剂量(1μL、10μL、30μL、100μL)病毒，检测GFP阳性率；
所得结果如图10所示；在感染量为1μL时RPS6pro比EF1apro的阳性率低，但在感染量为30μL时阳性率比EF1apro-LV高。
同时，30μL剂量下感染MSC的荧光显微观察结果如图11所示，RPS6pro-LV的亮度更亮；其中I图为EF1apro-LV，II图为RPS6pro-LV；由荧光显微观察结果也可知，在30μL剂量下RPS6pro-LV在MSC细胞中具有更好的表达效率。
上述实验结果显示，EF1apro-LV和RPS6pro-LV在慢病毒包装293T细胞上没有差异；RPS6pro-LV在中等剂量病毒(3μL)下具有略高的转导效率，而GFP阳性细胞的平均荧光强度也没有明显差异；
在其他细胞类型感染实验中发现，RPS6pro-LV对HEL细胞在较低剂量下具有较好的感染效率；
更重要的是，高剂量慢病毒感染下(30μL)，RPS6pro-LV病毒可以在MSC细胞中得到更高的阳性率和更高的荧光强度，提示在间充质干细胞中，RPS6pro具有更高的转录活性，奠定了其在MSC源细胞基因治疗中的潜在应用价值。
此外，本发明中还设计构建了ACTB和GAPDH启动子，然而ACTB和GAPDH的启动子调控区域较复杂，GFP的荧光表达较EF1a启动子明显偏弱很多，基本不适合用于基因操作，相比之下，RPS启动子功能专一，对基因的表达调控具有更好的稳定性，更适合基因操作。
综上所述，从RNA-seq以及ChIP-seq数据入手，遴选得到了一种更优的真核基因表达启动子，所述启动子非常适合用于基因工程操作，与EF1a相比具有相当的表达效率，在若干细胞类型中具有更高更稳定的表达强度。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）
<120> 一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用
<130> 20210115
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gaagtaccgc ccacccatgc tcacttccgc tatcccgtac ttctgctcat ctcgcgagaa 300
ctgaaagcgc ctatgtgacc tgcgctaagc ggaagttggc cctcttttcc gtggcgcctc 360
ggaggcgttc agctgcttca agaagaagac ctacggtggt ggcgagtgtt agactgggtt 420
tggggaacgt gaatcgagtc ccagaacgcg gcattgcctc agttccagca ctccaggatc 480
ctggctttag gtggagaagg gtctcaagta ggagaaggct cgcctttctg gggcgtggag 540
ctttttggcc gaacgggtgg caggcgattg cggctggagc cgcggcgggc cgggagcgcc 600

Claims (5)

1.一种真核基因表达启动子，其特征在于，所述真核基因表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的真核基因表达启动子。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括如5′LTR、3′LTR、真核基因或WPRE调控元件中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含至少一个拷贝的如权利要求2或3所述的表达载体；
所述重组细胞为293T细胞、HEL细胞或MSC细胞中的任意一种或至少两种的组合。
5.如权利要求1所述的真核基因表达启动子、如权利要求2或3所述的表达载体或如权利要求4所述的重组细胞在真核基因表达中的非疾病诊断和非疾病治疗目的的应用。
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