CN109943586A - 一种植物circRNA过表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物circRNA过表达载体，所述过表达载体至少包括载体骨架，目的circRNA基因及辅助成环序列，所述辅助成环序列包括上游环化序列和下游环化序列，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为一对内含子反向互补序列；所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：上游环化驱动序列‑目的circRNA基因‑下游环化驱动序列。本发明构建的植物circRNA过表达载体能够有效地过表达植物circRNA。操作简单，为葡萄circRNA的研究功能提供了有效的研究方法，也为其他植物物种circRNA的过表达提供参考方法。

Description

一种植物circRNA过表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种植物circRNA过表达载体及其构建方法。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA(linear RNA，含5’和3’末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，调控miRNA表达。截止目前，已知晓circRNA广泛分布于多种植物物种中，但其功能研究鲜有报道。其中部分原因是缺乏适于植物的高效且精确表达circRNA的方法。因此，通用且高效率的过表达载体策略研究对于深入了解circRNA的功能十分关键。植物中迫切需要有效且准确的circRNA过表达策略。

葡萄(Vitis vinifera L.)属于葡萄科，葡萄属，是世界上最重要的经济果树之一。作为双子叶、落叶、多年生藤本植物，葡萄树具有超过7000年的栽培历史。

葡萄circRNA过表达策略，可以为加速葡萄circRNA的功能发掘工作。目前还未有相关方法的报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种植物circRNA过表达载体及其构建方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种植物circRNA过表达载体，所述过表达载体至少包括载体骨架，目的circRNA基因及辅助成环序列，所述辅助成环序列包括上游环化序列和下游环化序列，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为一对内含子反向互补序列；所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：

上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列。

本发明第二方面提供一种植物circRNA过表达载体的构建方法，所述方法至少包括如下步骤：制备上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列，将所述上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列连接到载体骨架上。

本发明第三方面提供一种工程菌，所述工程菌由前述植物circRNA过表达载体转化获得。

本发明第四方面提供前述植物circRNA过表达载体的circRNA表达效果的检测方法，为采用烟草瞬时表达法检测植物circRNA过表达载体的表达量。

如上所述，本发明的植物circRNA过表达载体及其构建方法，具有以下有益效果：本发明构建的植物circRNA过表达载体能够有效地过表达植物circRNA。操作简单，为葡萄circRNA的研究功能提供了有效的研究方法，也为其他植物物种circRNA的过表达提供参考方法。

附图说明

图1是本发明的葡萄circRNA过表达质粒结构图。

图2根据本发明的葡萄circRNA过表达载体应用的荧光定量检测结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明提供的植物circRNA过表达载体，所述过表达载体至少包括载体骨架，目的circRNA基因及辅助成环序列，所述辅助成环序列包括上游环化序列和下游环化序列，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为一对内含子反向互补序列；所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：

上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列。

进一步的，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为目的植物基因的内含子反向互补序列。

在一种实施方式中，所述目的植物基因为葡萄基因。优选的，为VIT_13s0074g00100。

在一种实施方式中，所述辅助成环序列还包括酶切位点。

在一种实施方式中，所述酶切位点包括第一酶切位点，第二酶切位点，第三酶切位点和第四酶切位点。

在一种实施方式中，所述酶切位点与所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列分别形成以下结构：1)第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点；2)第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点。

在一种实施方式中，当含有酶切位点时，所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：

第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点-目的circRNA基因-第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点。

所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点、第四酶切位点可选择常规的酶切位点，包括但不限于：HindIII、BamHI、PstI、XbaI等；一般情况下，四个酶切位点各不相同。

所述载体骨架是指能够连接酶切位点，插入外源DNA，将外源DNA导入到受体细胞并进行自我复制的DNA分子。可选的，可以为质粒或病毒载体。

在一种实施方式中，所述载体骨架选自pHB质粒。

在优选的实施方式中，在载体pHB的HindIII酶切位点和XbaI酶切位点之间插入所述上游环化驱动序列-填充序列-下游环化驱动序列。

在一种实施方式中，所述第一酶切位点选自HindIII。

在一种实施方式中，所述第二酶切位点选自BamHI。

在一种实施方式中，所述上游环化驱动序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体的：CTTGTGCTCAACTTATCACTCCAGATACCTTTTACCACCATGCCTAGATGGTTAAAATTTTGGCCTAAAAGTACTATAATGGAATCCCATATTTCTTCTTAGCCTAGTGTTGCTTTCAAAATTACCAAAACCATCTAACACTAAAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAATTGTATTCCCGGATGGAACCAAAATCTAGTTCATTATTATTCAGAACCAAACAAGTTTAATATTTAAATAATAATAATAATAATAACAACAATAATTATAATTTTTTTATGAAAAAAAAACATCTACATGTCAATAATACATAAATATATTTATATGATCATATCATTCGAAAAAAACTGAAGCAAACACCAGAATTATTATTAATTATCAATACCATCATCATCATCCTTGCTGTACA。

在一种实施方式中，所述第三酶切位点选自PstI。

在一种实施方式中，所述第四酶切位点选自XbaI。

在一种实施方式中，所述下游环化驱动序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。具体的：TGTACAGCAAGGATGATGATGATGGTATTGATAATTAATAATAATTCTGGTGTTTGCTTCAGTTTTTTTCGAATGATATGATCATATAAATATATTTATGTATTATTGACATGTAGATGTTTTTTTTTCATAAAAAAATTATAATTATTGTTGTTATTATTATTATTATTATTTAAATATTAAACTTGTTTGGTTCTGAATAATAATGAACTAGATTTTGGTTCCATCCGGGAATACAATTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTAGTGTTAGATGGTTTTGGTAATTTTGAAAGCAACACTAGGCTAAGAAGAAATATGGGATTCCATTATAGTACTTTTAGGCCAAAATTTTAACCATCTAGGCATGGTGGTAAAAGGTATCTGGAGTGATAAGTTGAGCACAAG。

在一种实施方式中，所述过表达载体还包括启动子和终止子。

在一种实施方式中，所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成的结构中，以第一酶切位点首个碱基为起点，则，第1-428bp为上游环化驱动序列，第429-856bp为下游环化驱动序列，第1-6bp为第一酶切位点，第423-428bp为第二酶切位点，第429-434bp为第三酶切位点，第851-856bp为第四酶切位点。

在一种实施方式中，所述第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点-目的circRNA基因-第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。具体的，为

AAGCTTCTTGTGCTCAACTTATCACTCCAGATACCTTTTACCACCATGCCTAGATGGTTAAAATTTTGGCCTAAAAGTACTATAATGGAATCCCATATTTCTTCTTAGCCTAGTGTTGCTTTCAAAATTACCAAAACCATCTAACACTAAAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAATTGTATTCCCGGATGGAACCAAAATCTAGTTCATTATTATTCAGAACCAAACAAGTTTAATATTTAAATAATAATAATAATAATAACAACAATAATTATAATTTTTTTATGAAAAAAAAACATCTACATGTCAATAATACATAAATATATTTATATGATCATATCATTCGAAAAAAACTGAAGCAAACACCAGAATTATTATTAATTATCAATACCATCATCATCATCCTTGCTGTACAGGATCCCTGCAGTGTACAGCAAGGATGATGATGATGGTATTGATAATTAATAATAATTCTGGTGTTTGCTTCAGTTTTTTTCGAATGATATGATCATATAAATATATTTATGTATTATTGACATGTAGATGTTTTTTTTTCATAAAAAAATTATAATTATTGTTGTTATTATTATTATTATTATTTAAATATTAAACTTGTTTGGTTCTGAATAATAATGAACTAGATTTTGGTTCCATCCGGGAATACAATTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTAGTGTTAGATGGTTTTGGTAATTTTGAAAGCAACACTAGGCTAAGAAGAAATATGGGATTCCATTATAGTACTTTTAGGCCAAAATTTTAACCATCTAGGCATGGTGGTAAAAGGTATCTGGAGTGATAAGTTGAGCACAAGTCTAGA。

优选地，所述目的circRNA基因包含自身侧翼内含子。

更优选地，所述目的circRNA基因为葡萄circRNA基因。

本发明实施例所述的植物circRNA过表达载体的构建方法，所述方法至少包括如下步骤：制备上游环化驱动序列-填充序列-下游环化驱动序列，将所述上游环化驱动序列-填充序列-下游环化驱动序列连接到载体骨架上。

进一步的，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为目的植物基因的内含子反向互补序列。

在一种实施方式中，所述目的植物基因为葡萄基因。优选的，为VIT_13s0074g00100。

在一种实施方式中，所述辅助成环序列还包括酶切位点。

在一种实施方式中，所述酶切位点包括第一酶切位点，第二酶切位点，第三酶切位点和第四酶切位点。

在一种实施方式中，所述酶切位点与所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列分别形成以下结构：1)第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点；2)第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点。

在一种实施方式中，当含有酶切位点时，所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：

第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点-目的circRNA基因-第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点。

所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点、第四酶切位点可选择常规的酶切位点，包括但不限于：HindIII、BamHI、PstI、XbaI等；一般情况下，四个酶切位点各不相同。

所述载体骨架是指能够连接酶切位点，插入外源DNA，将外源DNA导入到受体细胞并进行自我复制的DNA分子。可选的，可以为质粒或病毒载体。

在一种实施方式中，所述载体骨架选自pHB质粒。

在优选的实施方式中，在载体pHB的HindIII酶切位点和XbaI酶切位点之间插入所述上游环化驱动序列-填充序列-下游环化驱动序列。

在一种实施方式中，所述第一酶切位点选自HindIII。

在一种实施方式中，所述第二酶切位点选自BamHI。

在一种实施方式中，所述上游环化驱动序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体的；CTTGTGCTCAACTTATCACTCCAGATACCTTTTACCACCATGCCTAGATGGTTAAAATTTTGGCCTAAAAGTACTATAATGGAATCCCATATTTCTTCTTAGCCTAGTGTTGCTTTCAAAATTACCAAAACCATCTAACACTAAAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAATTGTATTCCCGGATGGAACCAAAATCTAGTTCATTATTATTCAGAACCAAACAAGTTTAATATTTAAATAATAATAATAATAATAACAACAATAATTATAATTTTTTTATGAAAAAAAAACATCTACATGTCAATAATACATAAATATATTTATATGATCATATCATTCGAAAAAAACTGAAGCAAACACCAGAATTATTATTAATTATCAATACCATCATCATCATCCTTGCTGTACA。

在一种实施方式中，所述第三酶切位点选自PstI。

在一种实施方式中，所述第四酶切位点选自XbaI。

在一种实施方式中，所述下游环化驱动序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。具体的：TGTACAGCAAGGATGATGATGATGGTATTGATAATTAATAATAATTCTGGTGTTTGCTTCAGTTTTTTTCGAATGATATGATCATATAAATATATTTATGTATTATTGACATGTAGATGTTTTTTTTTCATAAAAAAATTATAATTATTGTTGTTATTATTATTATTATTATTTAAATATTAAACTTGTTTGGTTCTGAATAATAATGAACTAGATTTTGGTTCCATCCGGGAATACAATTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTAGTGTTAGATGGTTTTGGTAATTTTGAAAGCAACACTAGGCTAAGAAGAAATATGGGATTCCATTATAGTACTTTTAGGCCAAAATTTTAACCATCTAGGCATGGTGGTAAAAGGTATCTGGAGTGATAAGTTGAGCACAAG。

在一种实施方式中，所述过表达载体还包括启动子和终止子。

在一种实施方式中，所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成的结构中，以第一酶切位点首个碱基为起点，则，第1-428bp为上游环化驱动序列，第429-856bp为下游环化驱动序列，第1-6bp为第一酶切位点，第423-428bp为第二酶切位点，第429-434bp为第三酶切位点，第851-856bp为第四酶切位点。

在一种实施方式中，所述第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点-目的circRNA基因-第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

优选地，所述目的circRNA基因包含自身侧翼内含子。

更优选地，所述目的circRNA基因为葡萄circRNA基因。

本发明的上游环化驱动序列、下游化驱动序列、和填充序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明核苷酸序列中。

在一种实施方式中，所述目的circRNA通过从目的植物的基因组序列中，利用特异性扩增引物克隆获得。所述特异性扩增引物同时可以扩增不低于100bp的目的circRNA序列上下游的侧翼内含子。

本发明提供的工程菌，由前述植物circRNA过表达载体转化获得。

进一步的，所述工程菌由前述的植物circRNA过表达载体转化农杆菌获得。

在一种实施方式中，所述农杆菌为GV3101。

本发明提供前述植物circRNA过表达载体的circRNA表达效果的检测方法，为采用烟草瞬时表达法检测植物circRNA过表达载体的表达量。

实施例一：葡萄circRNA过表达载体的构建

以植物过表达载体pHB为载体骨架，进行改造获得葡萄circRNA过表达载体。

具体实施方案如下：

1.上游环化驱动序列的克隆和连接

从葡萄基因VIT_13s0074g00100内部选取内含子片段，长度为416bp，为上游环化驱动序列。在两端分别添加BamHI、HindIII酶切位点序列，设计扩增引物：

Up-F：cggggatccTGTACAGCAAGGATGATGATG SEQ ID NO：4

Up-R：cggaagcttCTTGTGCTCAACTTATCACTCC SEQ ID NO：5

使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR反应(20ul反应体系中，10ulPrimeSTAR Master Mix，上下游引物0.3uM，模板1ul，用水补齐至20ul)，程序如下：98℃10s，55℃5s，72℃10s 34个循环；72℃延伸5mins。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131，生工生物)按照标准操作步骤进行纯化。并连接到-T1Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。分别对提取的质粒和pHB载体质粒进行酶切处理，酶切反应体系如下：

将上述反应液置于37℃保温30分钟，之后经琼脂糖凝胶电泳之后切胶回收。

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(宝日医生物技术(北京)有限公司)将目的片段与酶切后的表达载体片段连接，反应体系如下：

将上述反应液置于16℃保温30分钟。转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提，试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。

2.下游环化驱动序列的克隆和连接

下游环化驱动序列是上游环化驱动序列的反向互补序列。引物设计时在两端分别添加PstI、XbaI酶切位点序列，设计扩增引物：

Down-F：cggctgcagTGTACAGCAAGGATGATGATG SEQ ID NO：6

Down-R：cggtctagaCTTGTGCTCAACTTATCACTCC SEQ ID NO：7

同样以葡萄DNA为模板，使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR反应，之后连接克隆载体-T1Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。分别对提取的质粒和已经包含上游环化驱动序列的pHB载体质粒进行酶切处理，酶切反应体系如下：

将上述反应液置于37℃保温30分钟，之后经琼脂糖凝胶电泳之后切胶回收。

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(宝日医生物技术(北京)有限公司)将目的片段与酶切后的表达载体片段连接，反应体系如下：

将上述反应液置于16℃保温30分钟。转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽，提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。获得的载体质粒称为circRNA-OE，为葡萄circRNA过表达载体。

实施例二：插入目的基因的葡萄circRNA过表达载体的构建方法

通过实验例一，获得包含一对反向互补序列，即上、下游环化驱动序列的circRNA-OE载体质粒。可以在BamHI和PstI两个酶切位点之间加入目的成环序列。为了避免目的成环序列自身酶切位点的影响，本实施例通过同源重组的方式将目的片段插入到circRNA-OE载体的BamHI和PstI之间。试剂盒选自南京诺唯赞公司的ClonExpress II One Step CloningKit试剂盒。

为保证目的成环序列反向剪接成环的准确性，在克隆目的序列时应包含长度不低于100bp的侧翼内含子。

从DNA中克隆circRNA成环区域外加侧翼内含子(circRNA_1975；circRNA_4328；circRNA_4363；circRNA_7172)并连接到circRNA-OE载体的BamH I和Pst I之间。根据ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒要求设计引物。克隆引物如下：

使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR扩增。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化。将回收片段插入到circRNA-OE载体的BamHI和PstI之间。连接反应根据ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒标准操作步骤进行，重组后的质粒用于大肠杆菌转化。利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。即获得含有目的基因的葡萄circRNA的过表达载体质粒。

实施例三：含有目的基因的葡萄circRNA的过表达载体质粒的效果测试

借助农杆菌介导的烟草瞬时表达系统，对circRNA过表达载体方法促使circRNA反向剪接的效率和准确性进行测试。

1.农杆菌转化及阳性克隆验证

取-80℃保存的农杆菌感受态GV3101于室温融化后置于冰中。每10μl感受态细胞加入1μl阳性重组质粒，轻轻混匀，依次于冰上静置5mins、液氮5mins、37℃水浴5mins、冰浴5mins。加入800ul无抗生素的LB液体培养基，于180rpm，28℃振荡培养2～3h。6000rpm离心1min集菌，留取100ul左右上清用移液枪轻轻吹打重悬菌块，然后涂布于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的固态LB培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。挑选单菌落通过PCR进行筛选，筛选的阳性克隆可以用于后续实验。

2.烟草侵染瞬时表达方法

将含有实施例二中所述的重组质粒的根癌农杆菌菌株GV3101接种于卡那霉素和利福平的Luria-Bertani培养基中，放于28℃/200rpm摇床中培养。测定菌液的OD600值，当OD600＝1.0时，收集农杆菌并重悬于侵染缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES，100μM乙酰丁香酮，pH 5.8)，之后置于28℃下振荡4h。通过1ml注射器将菌液注射到烟草叶片。注射4天后，取样，提取RNA，设计背向引物：

利用RT-qPCR检测circRNA的表达水平。RT-qPCR根据Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(RR820L，TaKaRa Bio)试剂说明书进行，采用20ul体系(10ul SYBRPremix Ex Taq，上下游引物0.3uM，模板1ul，其余用水补齐)，程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃10s，40个循环。在RT-qPCR扩增后，检查溶解曲线和扩增曲线，以评估是否为特异性扩增。肌动蛋白(actin)作为内参，通过2-ΔΔct方法分析基因的相对表达水平(Livak KJ,Schmittgen TD:Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.Methods 2001,25(4):402-408.)。

荧光定量结果显示，转染烟草过表达载体后，目标circRNA均检测出来高表达。实验结果证明本发明构建的circRNA的过表达载体及方法可以有效过表达葡萄circRNA。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种植物circRNA过表达载体及其构建方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 416

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgtgctca acttatcact ccagatacct tttaccacca tgcctagatg gttaaaattt 60

tggcctaaaa gtactataat ggaatcccat atttcttctt agcctagtgt tgctttcaaa 120

attaccaaaa ccatctaaca ctaaaaaaac aaaaacaaaa acaaaaacaa aaacaaattg 180

tattcccgga tggaaccaaa atctagttca ttattattca gaaccaaaca agtttaatat 240

ttaaataata ataataataa taacaacaat aattataatt tttttatgaa aaaaaaacat 300

ctacatgtca ataatacata aatatattta tatgatcata tcattcgaaa aaaactgaag 360

caaacaccag aattattatt aattatcaat accatcatca tcatccttgc tgtaca 416

<210> 2

<211> 416

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtacagcaa ggatgatgat gatggtattg ataattaata ataattctgg tgtttgcttc 60

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tttaaccatc taggcatggt ggtaaaaggt atctggagtg ataagttgag cacaag 416

<210> 3

<211> 856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttcttg tgctcaactt atcactccag atacctttta ccaccatgcc tagatggtta 60

aaattttggc ctaaaagtac tataatggaa tcccatattt cttcttagcc tagtgttgct 120

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ctgaagcaaa caccagaatt attattaatt atcaatacca tcatcatcat ccttgctgta 420

caggatccct gcagtgtaca gcaaggatga tgatgatggt attgataatt aataataatt 480

ctggtgtttg cttcagtttt tttcgaatga tatgatcata taaatatatt tatgtattat 540

tgacatgtag atgttttttt ttcataaaaa aattataatt attgttgtta ttattattat 600

tattatttaa atattaaact tgtttggttc tgaataataa tgaactagat tttggttcca 660

tccgggaata caatttgttt ttgtttttgt ttttgttttt gtttttttag tgttagatgg 720

ttttggtaat tttgaaagca acactaggct aagaagaaat atgggattcc attatagtac 780

ttttaggcca aaattttaac catctaggca tggtggtaaa aggtatctgg agtgataagt 840

tgagcacaag tctaga 856

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggggatcct gtacagcaag gatgatgatg 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggaagcttc ttgtgctcaa cttatcactc c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggctgcagt gtacagcaag gatgatgatg 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggtctagac ttgtgctcaa cttatcactc c 31

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catccttgct gtacaggatc cgtaaattga tttttgtttt actggcc 47

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catccttgct gtacactgca gctagagaga gcttcgtagt gaacataaa 49

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catccttgct gtacaggatc cgtctactct ctttcttact ctctgtttat ttatg 55

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catccttgct gtacactgca gctgcacaaa taacacgaaa cagtatt 47

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catccttgct gtacaggatc cgtattatta cagctacaca ttctttttat atga 54

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catccttgct gtacactgca gctgtccaat tcacacaagt gattgt 46

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catccttgct gtacaggatc cttaaaaaaa aattgtgatt ttagatcttt g 51

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catccttgct gtacactgca gaaatgatgc cttcattgtt taaaca 46

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aacgcactgc caaaatgatc t 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagccttgat aacttcccct agaa 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctaccagcaa aatggagcta ctga 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccagtgttag caaaggcctt aag 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agagatgcag aacaacagag ttatg 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgaagttgac actgactgta attgg 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

actcggagcg caatgctttg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcaagagcc tcccggtttc 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cctgaggtcc ttttccaacc a 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggattccggc agcttccatt 20

Claims (13)

1.一种植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述过表达载体至少包括载体骨架，目的circRNA基因及辅助成环序列，所述辅助成环序列包括上游环化序列和下游环化序列，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为一对内含子反向互补序列；所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：

上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列。

2.如权利要求1所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为目的植物基因的内含子反向互补序列。

3.如权利要求2所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述目的植物基因为葡萄基因，优选的，为VIT_13s0074g00100。

4.如权利要求1所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述辅助成环序列还包括酶切位点；优选的，所述酶切位点包括第一酶切位点，第二酶切位点，第三酶切位点和第四酶切位点；更优选的，所述酶切位点与所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列分别形成以下结构：1)第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点；2)第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点；再优选的，所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构：第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点-目的circRNA基因-第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点。

5.如权利要求4所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述第一酶切位点选自HindIII；

2)所述第二酶切位点选自BamHI；

3)所述上游环化驱动序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

4)所述第三酶切位点选自PstI；

5)所述第四酶切位点选自XbaI；

6)所述下游环化驱动序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7)所述载体骨架选自pHB质粒。

6.如权利要求4所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成的结构中，以第一酶切位点首个碱基为起点，则，第1-428bp为上游环化驱动序列，第429-856bp为下游环化驱动序列，第1-6bp为第一酶切位点，第423-428bp为第二酶切位点，第429-434bp为第三酶切位点，第851-856bp为第四酶切位点。

7.如权利要求4所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述上第一酶切位点-上游环化驱动序列-第二酶切位点-目的circRNA基因-第三酶切位点-下游环化驱动序列-第四酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

8.如权利要求1所述的植物circRNA过表达载体，其特征在于，所述目的circRNA基因包含自身侧翼内含子，更优选地，所述目的circRNA基因为葡萄circRNA基因。

9.如权利要求1-8任一所述的植物circRNA过表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法至少包括如下步骤：制备上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列，将所述上游环化驱动序列-目的circRNA基因-下游环化驱动序列连接到载体骨架上。

10.一种工程菌，所述工程菌由权利要求1-8任一所述的植物circRNA过表达载体转化获得。

11.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由权利要求1-8任一所述的植物circRNA过表达载体转化农杆菌获得。

12.如权利要求11所述的工程菌，其特征在于，所述农杆菌为GV3101。

13.如权利要求1-8任一所述的植物circRNA过表达载体的circRNA表达效果的检测方法，为采用烟草瞬时表达法检测植物circRNA过表达载体的表达量。