CN113025628A - 毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开了一种毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了上述毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。本发明提供的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A在植物定向育种中具有广泛的应用前景，为植物基因工程提供了新的基因资源。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A及其应用。
背景技术
毛竹(Phyllostachys edulis)的应用涉及家具、建筑和造纸等各个方面，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。植物在长期进化过程中，形成了复杂的、多层级的次生细胞壁生物合成调控网络，在次生细胞壁生物合成调控网络中涉及到多种转录因子，可以通过正反馈或负反馈进行调控。MYB转录因子是该次生细胞壁生物合成调控网络中承上启下的关键因子，不仅参与了木质素调控，又可调控次生细胞壁生物合成的结构基因和其他转录因子基因的表达。近年来的研究表明，MYB转录因子基因和NAC转录因子基因在木质素生物合成中起到重要的调控作用。MYB转录因子在毛竹中的研究较少，尤其是在次生细胞壁形成中的调控作用研究尚处空白。
植物细胞壁可以分为初生细胞壁和次生细胞壁，其中初生细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成，次生细胞壁是在初生壁和细胞质膜之间加厚的部分，木质化的次生细胞壁是植物主要的生物量来源。木质化即木质素在细胞壁中的沉积，该过程是一个从无到有、从持续增多到保持稳定的动态变化过程。木质素具有增强植物细胞壁硬度、疏水性和促进矿物质通过维管束的运输等作用，且参与到植物体抗逆的生物学过程。最重要的是，木质素参与到木材的形成与强度的提高，然而木质素的存在也对实际应用带来了诸多负面影响，例如降解木质素一直是竹浆造纸工业的难点之一。因此，寻求毛竹中参与调控纤维素、半纤维素和木质素合成的MYB转录因子基因具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种参与调控纤维素、半纤维素和木质素合成的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A及其应用。
为了达到上述目的，本发明公开了毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还公开了上述毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。
本发明还公开了包含毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的生物材料，生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。
本发明还公开了上述包含毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的生物材料在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。
本技术方案的原理和有益效果在于：
本技术方案首次发现毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A具有提高纤维素、半纤维素含量和生物量以及降低木质素的功能，可将毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A广泛地应用在表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌上，在植物定向育种中具有广泛的应用前景，为植物基因工程提供了新的基因资源。
由于目前毛竹尚未建立起稳定的遗传转化体系，无法通过转化毛竹来验证基因的功能，因此本技术方案通过模式物种拟南芥进行转基因功能验证，具体地，将毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A导入拟南芥中，得到转基因拟南芥植株的纤维素、半纤维素含量和生物量均明显提高，且木质素含量降低。
附图说明
图1为实验一中毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的CDS序列扩增琼脂糖凝胶电泳图，M：DNA分子量标记；1-3：不同退火温度(分别为61℃、65℃和70℃)条件下的扩增产物；
图2为实验二中表达载体pRI01-35S-PeMYB103A酶切图谱，其中，M1和M2：DNA分子量标记；1-3：转化pRI01-35S-PeMYB103A的单克隆菌落；
图3为实验三中表达载体pRI01-35S-PeMYB103A质粒转化农杆菌单克隆菌落PCR电泳图，其中，M：DNA分子量标记；1-3：转化pRI01-35S-PeMYB103A的单克隆菌落；4：以pRI01-35S-PeMYB103A载体质粒为阳性对照；5：以水为阴性对照；
图4为实验四中拟南芥植株中PeMYB103A的RT-PCR检测结果，其中，M：DNA分子量标记；1-2：插入位点不同的转基因拟南芥植株；3：pRI01-35S-PeMYB103A质粒；4：野生型拟南芥植株Col-0；
图5为实验五中转基因拟南芥植株生物量的实验结果图，其中A、B和C：Col-0、OE-2和OE-3的表型(标尺：10cm)，Col-0为野生型拟南芥植株，OE-2和OE-3均为转基因拟南芥植株；D：叶片数量；E：初生花茎高度；F：初生花茎直径；G：初生花茎主茎和初生花茎侧茎生物量；
图6为实验六中PeMYB103A转基因植株中木质素、纤维素和半纤维素合成基因的表达检测，其中，A：PeMYB103A表达检测(X轴：Col-0为野生型拟南芥植株，OE-2和OE-3均为转基因拟南芥植株；Y轴：PeMYB103A相对表达量)；B：纤维素和半纤维素合成相关基因表达检测(X轴：不同基因，即纤维素合成酶基因CESA7和CESA7、半纤维素合成酶基因IRX9和IRX14；Y轴：基因的相对表达量)；C：木质素合成基因表达检测(X轴：木质素合成基因PAL1、C4H、4CL、HCT、C3H、PRX72、LAC4、CAD6、COMT1、F5H1、CCR1和CCoAOMT；Y轴：基因的相对表达量)；
图7为实验六中PeMYB103A转基因植株中木质素、纤维素和半纤维素含量检测，其中Co1-0为野生型拟南芥植株，OE-2和OE-3均为转基因拟南芥植株。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
(1)本实施例公开了毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
(2)本实施例还公开了上述毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。
(3)本实施例还公开了包含上述毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的生物材料，生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。
(4)本实施例还公开了包含上述毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的生物材料在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。
实验一：获取毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的编码区序列
以毛竹(Phyllostachys edulis)笋为材料，提取RNA，并反转录成cDNA作为模板。毛竹中预测的基因PH02Gene26889设计特异性引物，PCR扩增编码区序列。引物序列如下：
上游引物：5′-ATGGGGCATCACTCTTGCTGTA-3′
下游引物：5′-TTAATCATGGTCATTTGGTCCCAT-3′
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，插入片段为969bp，如SEQ ID NO:1所示。
发明人应用Blast在线软件在毛竹中预测基因组中的几万个基因进行比对，发现SEQ ID NO:1与PH02Gene26889的序列完全一致。
进一步通过BlastP软件在线比较分析，发现该基因编码的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)与其它单子叶植物的MYB转录因子具有较高的一致性，其中与芒(Miscanthussinensis)MYB转录因子(QFI36211.1)的一致性最高为63％；蛋白结构域分析显示该蛋白具有典型的MYB DNA结构域的结构特征，包括2个典型的R结构域(R2和R3)。由此可见，克隆得到的基因编码一个MYB转录因子，将该基因命名为PeMYB103A。
实验二：构建携带毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的植物表达载体
以毛竹cDNA为模板，根据SEQ ID NO:1所示序列设计引物，PCR扩增毛竹PeMYB103A编码区的脱氧核糖核苷酸序列。在引物两端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物序列如下：
上游引物：5′-CGggattcATGGGGCATCACTC-3′(EcoRⅠ位点小写字母)；
下游引物：5′-CGgaattcTTAATCATGGTCATTT-3′(BamHⅠ位点小写字母)；
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒，单克隆测序正确后，得到含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点及编码毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的脱氧核糖核苷酸序列的质粒pT-PeMYB103A。
将质粒pT-PeMYB103A和表达载体pRI101-AN质粒在37℃条件下分别用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切6h，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，用T4 DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性(50mg·L-1)平板上长出的单克隆，提取质粒，酶切图谱鉴定(实验结果如图2所示)和测序验证。
将获得的重组表达载体命名为pRI101-35S-PeMYB103A。
实验三：含有表达载体pRI101-35S-PeMYB103A的单克隆菌落鉴定
将实验二构建的表达载体pRI101-35S-PeMYB103A通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性(50mg·L-1)平板上长出的单菌落进行PCR鉴定。以PeMYB103A基因重组表达载体转化后形成的单克隆菌落为模板，用实验二中的引物进行PCR检测，同时以重组质粒和水为对照。
如图3所示，表达载体pRI01-35S-PeMYB103A质粒转化农杆菌单克隆菌落PCR电泳图结果表明，单克隆菌落含有目的基因片段，摇菌获得农杆菌单克隆菌液，可用于侵染转化实验。
实验四：PeMYB103A转化拟南芥及RT-PCR检测
利用实验三中获得的菌液，采用蘸花法转化野生型拟南芥。通过连续抗性(卡那霉素50mg·L-1)筛选，最终获得不分离的T3代转基因拟南芥植株4个，并选取其中2个进行基因表达检测。
分别提取转基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株的RNA，并反转录成cDNA作为模板，采用RT-PCR方法，用实验二中引物进行PCR检测。如图4所示，结果表明，在转基因拟南芥植株中均检测到了目的基因表达，而在野生型拟南芥植株中未检测到表达，证明PeMYB103A在转基因拟南芥植株中得到了表达。
实验五：PeMYB103A转基因拟南芥生物量检测
如图5中的A和图5中的D(OE-2和OE-3为转基因拟南芥植株，Col-0为野生型拟南芥植株)，通过对转基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株发芽后第20天的莲座叶进行比较发现，转基因拟南芥植株的莲座叶数量和大小与野生型拟南芥植株相差无几，且抽薹前的发育状态、抽薹时间同样也几乎无差异。
如图5中的B、图5中的E和图5中的F，在发芽后第6周，转基因拟南芥株系OE-2的初生花序茎的高度无显著变化或转基因拟南芥株系OE-3显著矮于野生型拟南芥植株Col-0，而转基因拟南芥植株的初生花序茎的直径均显著粗于野生型拟南芥植株(图5中的CDE)。
如图5中的C和图5中的G，转基因拟南芥植株的初生花序主茎的生物量显著高于野生型拟南芥植株，而转基因拟南芥植株的初生花序茎侧枝生物量也高于野生型拟南芥植株，其中转基因拟南芥植株与野生型拟南芥植株差异不显著。
以上实验结果均表明过量表达PeMYB103A能够促进转基因拟南芥植株花序茎增粗，提高植株的生物量。
实验六：PeMYB103A转基因拟南芥中木质素、纤维素和半纤维素合成基因表达检测
采用qPCR方法测定PeMYB103A的表达量，由图6中的A(A：PeMYB103A的相对表达量)可知，转基因拟南芥植株中PeMYB103A的表达量显著高于野生型拟南芥植株，其中转基因拟南芥植株是野生型拟南芥植株的64倍。
进一步分析转基因拟南芥植株中内源木质素、纤维素和半纤维素生物合成通路中16个基因的表达模式。结果图6中的B和图6中的C所示(B：纤维素和半纤维素合成基因的相对表达量；C：木质素合成基因的相对表达量)，与野生型拟南芥植株相比，转基因拟南芥植株中木质素合成关键酶基因均表达下调；而与纤维素和半纤维素生物合成相关的CESA和IRX基因表达上调，尤其是在转基因拟南芥植株OE-2中，CESA和IRX基因的表达量较野生型拟南芥植株上调超过3倍。
为了验证转基因PeMYB103A对木质素生物合成的作用，通过化学分析检测转基因拟南芥木质素、纤维素和半纤维素含量的变化。化学成份分析结果如图7所示，转基因拟南芥植株木质素含量较野生型显著降低，降低了6.35％(OE-2)和18.88％(OE-3)。但与野生型拟南芥植株相比，转基因拟南芥植株的纤维素含量和半纤维素显著增加，其中转基因拟南芥株系OE-2增加了40.58％(OE-2)和45.26％(OE-2)。这些结果表明，过表达PeMYB103A对木质素的生物合成和沉积有抑制作用，但同时对纤维素和半纤维素含量的增加有促进作用。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (6)
1.毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A，其特征在于，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。
4.包含权利要求1或2所述的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的生物材料，生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。
5.根据权利要求4所述的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的生物材料在增加纤维素、半纤维素含量、生物量含量和降低木质素含量上的应用。
6.根据权利要求5所述的毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A的应用，其特征在于，将毛竹MYB转录因子基因PeMYB103A导入野生型拟南芥，获得转基因拟南芥。
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