CN102676539B - 桉树wpgs5或wpgs6基因及其过量表达具有调控和增加植物生长量的功能 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及两个和增加植物生物量相关的桉树基因WPGS5和WPGS6的序列与功能，属于生物技术领域。为此，提取到的桉树RNA被反转录成cDNA，再进行深度测序，得到桉树cDNA序列文库。进一步将桉树的cDNA文库中的序列与NCBIGenbank公布的拟南芥AtABAP1和AtHOG1蛋白氨基酸序列进行相似性比较，得到桉树中WPGS5和WPGS6cDNA序列，再选取它们的保守区域的正义和反义片段用以构建基因沉默重组载体，获得拟南芥由基因沉默导致的功能缺失的突变株。WPGS5和WPGS6基因沉默转基因植株显著地提高了生物量。从而证明了桉树WPGS5和WPGS6基因在双子叶植物生长中的调控功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及桉树（Eucalyptus）的两个和增加生物量相关的WPGS5和WPGS6基因。
背景技术
桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉树属（Eucalyptus）的总称，是一种集观赏、用材、纸浆原料、药用于一体的优良树种。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，常规的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求，因此人们将研究重点及成功希望寄托于基因工程技术来解决桉树常规育种难以解决的问题，加速优质、高产桉树新品种的选育进程。林木等木本植物基因资源丰富，但许多天然优良基因尚未被分离利用，大部分基因的功能仍处于未知的状态。因此，研究桉树中能增加生物量的基因可为进一步进行基因工程改造、获得高产量的优良树种奠定基础，具有重要意义。
目前对林木基因的分离及功能鉴定主要通过与模式植物拟南芥或烟草等的同源基因进行相似性比较，建立进化树，运用反向遗传学方法，通过调控基因表达如过表达或基因沉默等技术研究基因的功能。苏晓华等（2009）从美洲黑杨中分离得到MADS-box基因PdP1,并在烟草中过表达，导致其提前开花。李海霞等（2009）将毛白杨的PtDRG01基因导入烟草，转基因植株的烟草花叶病毒量显著少于对照，表明该基因具有抗病毒功能。Sonoda等将赤桉HD-Zip class Ⅱ转录因子EcHB1基因转入烟草，转基因植株纤维长度和干重增加，叶片、根和茎的生长量均高于对照。
本专利涉及的两个基因均为在拟南芥中证实有增加生物量功能的基因的桉树同源基因。ABAP1全称为犰狳BTB拟南芥蛋白1，在拟南芥叶片发育中通过和前复制复合物亚基互作参与了对有丝分裂的负反馈调控。ABAP1过表达会抑制有丝分裂中DNA的复制，从而减少细胞的扩增，相反，下调ABAP1的表达则会促进细胞分裂，从而使植物叶片增大。
HOG1，全称为同源依赖的基因沉默，拟南芥的HOG1蛋白显示出与细胞分裂素的高亲和力结合，过表达HOG1基因的拟南芥植株，生物量显著降低，但在降低HOG1表达的转基因植株中，叶产量增加。
上述基因在拟南芥和烟草等植物中已有较为透彻的功能研究，但在林木中的分离鉴定工作还有待进行。
发明内容
本发明的目的是从桉树中克隆出两个和增加植物生物量有关的WPGS5与WPGS6基因并在拟南芥中通过基因沉默方法验证了其生物功能，从而为该基因在林木基因改造和分子育种中的应用奠定了基础。
本发明又一目的是提供一种提高植物生物量的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
对桉树的RNA进行深度测序得到桉树的cDNA序列文库，然后从桉树cDNA文库中查找与NCBI Genbank中收集到的AtABAP1和AtHOG1编码蛋白的氨基酸序列进行序列相似性比对（tBLASTn），得到桉树WPGS5 和WPGS6 基因的cDNA序列（SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 4），其中WPGS5编码的蛋白和拟南芥中AtABAP1蛋白的氨基酸序列相似度为65%，而WPGS6和AtHOG1的氨基酸序列相似度为88%。
本发明所提供的提高植物生物量的方法，是将所述的桉树WPGS5或WPGS6基因转入一个双子叶植物，预期将具有90%以上同源性及编码相同蛋白的内源ABAP1基因或HOG1基因从植物个体，组织或器官中敲除，使转基因植物的生物量比野生植物在相同种植环境下得到提高。
在上述的提高植物生物量的方法中，是将桉树的WPGS5基因和WPGS6基因用已知方法进行克隆，修饰和设计所得到的。从桉树中克隆出WPGS5和WPGS6基因的保守序列反义片段（SEQ ID NO：６，８）用于基因沉默的载体构建。WPGS5基因的保守片段是从WPGS5已知序列（SEQ ID NO：2）中截取的第262个碱基到第633个碱基这一段高度保守片段，其长度为371个碱基。WPGS6的保守片段是从已知序列（SEQ ID NO：4）中截取的第297个碱基到第603个碱基这一段长度为406bp的高度保守区域。
植物基因沉默pSV载体具有一段来源于桉树基因ELF1的内含子（EU ELF1 intron），ELF1全称为 LEAFY/FLORICAULA同源基因，GenBank中的登记号位AF034806.1，其序列为序列表中的SEQ ID NO: 9。ELF1 intron也就是该基因所含有的一段内含子序列(SEQ ID NO: 10)，从873bp到967bp，其长度为94bp。本专利中，WPGS5或WPGS6的保守片段(SEQ ID NO：5, 7)的正义序列和反义序列（SEQ ID NO: 6, 8）分别成对插入ELF1的内含子的两端，形成发夹结构（如图1，图2）。然后，将该载体通过根癌农杆菌转入拟南芥中用于基因沉默，从而得到了WPGS5基因或WPGS6基因功能缺失的转基因突变株。（如图3，图4）。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一个来源于桉树的WPGS5基因及其编码蛋白。转基因实验证明，下调的WPGS5基因表达会促进细胞分裂，从而使植物叶片增大图。因此，在同样的生长环境及生长时间下，WPGS5基因的功能缺失突变株系能产生更高生物量。如图5所示，和野生型植株相比，WPGS5基因敲除突变株的叶盘直径显著增大，从而证实该基因在增加生物量方面的功能。
本发明亦提供了一个来源于桉树的WPGS6基因。它通过与植物激素细胞分裂素相互作用于调控植物的生长发育。过表达WPGS6基因的拟南芥植株，生物量显著降低，相反本发明中的实例证实WPGS6表达敲除的转基因植株叶产量增加（如图6）。
本发明提高植物生物量的方法，通过克隆和鉴定桉树中推定的，相似的ABAP1基因和HOG1基因，研究其生物学功能，然后利用生物学技术和遗传学的方法，改良植物的生物量，对培育新品种的高产量作物有着重要的理论意义及经济价值。
附图说明
图1是含有WPGS5基因发夹结构的pSV基因沉默载体说明图。其中：
WPGS5 sense 代表DNA片段序列SEQ ID NO: 5
ELF1 intron 代表DNA片段序列：SEQ ID NO: 10
WPGS5 antisense 代表DNA片段序列SEQ ID NO: ６。
图2是含有WPGS6基因发夹结构的pSV基因沉默载体说明图。其中：
WPGS6 sense 代表DNA片段序列SEQ ID NO: 7
ELF1 intron 代表DNA片段序列：SEQ ID NO: 10
WPGS6 antisense 代表DNA片段序列SEQ ID NO: 8。
图3是WPGS5基因沉默突变株基因组DNA鉴定。
图4是WPGS6基因沉默突变株基因组DNA鉴定。
图5是WPGS5基因敲除导致拟南芥叶盘增大。其中（A）为T2代突变体和野生型的的叶盘直径生长曲线。样本量>10，在差异显著性分析(T检验)中，P值均小于0.05，也就是说两者没有差异的概率小于5%，差异达到显著水平。（B）为播种后35天的植株照片。图左为野生型，右为ABAP1基因敲除突变体。
图6是WPGS6基因敲除导致拟南芥叶盘增大。其中（A）为T2代突变体和野生型的的叶盘直径生长曲线。样本量>10，在差异显著性分析(T检验)中，P值均小于0.05，也就是说两者没有差异的概率小于5%，差异达到显著水平。（B）为播种后35天的植株照片。图左为野生型，右为WPGS6基因敲除突变体。
具体实施方式
下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例一 桉树WPGS5和WPGS6基因的克隆
1. 桉树cDNA的制备
选取新鲜的桉树（Eucalyptus DH32-29）叶片，放入液氮中冰冻，然后放入-80℃冰箱中保存备用。
参考Murray 和Thompson（1980）的方法，使用十六烷基三甲基溴化胺（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB）法提取组织总RNA，具体实施：1）65℃水域中预热15 ml CTAB提取液；2）液氮中研磨2-3克桉树冷冻组织；3）转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即激烈涡旋30s，然后65℃水浴4-5分钟；4）加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋混合，10000 转/分钟常温离心15分钟；5）将上清转移至一新的离心管中，重复抽提一次；6）将上清转移至一新的离心管中，加入1/3体积的氯化锂，至终浓度为2 M，4℃沉淀过夜；7）4℃全速离心1小时，弃上清，用500 μl 70%乙醇洗沉淀，然后用500 μl 100%乙醇洗沉淀；8）用500 μl 无RNA酶的水溶解沉淀，转移至1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；9）加入2倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；10）4℃全速离心20分钟，沉淀RNA；11）先用400μl 70%乙醇洗沉淀，然后用400 μl 100%乙醇洗沉淀，吹干后用100 μl的二乙基焦碳酸酯处理的水溶解RNA；12）用DNA酶处理提取的RNA，-20℃保存备用。
将约5 μg桉树叶片组织的总RNA，采用Invitrogen公司的反转录试剂盒（Superscript III First Strand）合成cDNA。
2. 桉树WPGS5和WPGS6基因保守区序列及其反向互补序列的克隆
将桉树（品名DH32-29）cDNA送至公司（天津生物芯片技术有限公司）进行深度测序（deep sequencing）以获得cDNA全长序列。通过NCBI Genbank查找得到拟南芥ABAP1和HOG1基因编码的蛋白氨基酸序列，与桉树全长cDNA序列进行相似性比对，得到桉树中相似蛋白的cDNA序列（SEQ ID No: 2，4），命名为WPGS5和WPGS6，其中WPGS5和拟南芥中ABAP1蛋白的氨基酸序列相似度为65%，WPGS6和AtHOG1的氨基酸序列相似度为88%。
从中截取保守片段，WPGS5基因的保守片段是从WPGS5已知序列（SEQ ID NO:2）中截取的第262个碱基到第633个碱基这一段片段，其长度为371个碱基。WPGS6的保守片段是从已知序列（SEQ ID NO:4）中截取的第297个碱基到第603个碱基这一段长度为406bp的片段。
根据桉树WPGS5和WPGS6基因保守序列以及pSV双元载体上的多酶切位点设计引物（下划线处为酶切位点）：
正义序列引物：
上游: WPGS5-BamHI-F：ACGCGGATCCAACGGGACTCTCTTGTTC
下游: WPGS5- NcoI-R： CATGCCATGGGATGTCAGCCTCAGAGAC
上游: WPGS6-BamHI-F： ACGCGGATCCGTGCAAAGAGCTGCTGCTG
下游: WPGS6-NcoI-R：ACGCGGATCCGTGCAAAGAGCTGCTGCTG
反义序列引物：
上游: WPGS5- SacI-F：ACGCGAGCTCAACGGGACTCTCTTGTTC
下游: WPGS5-PvuII-R：ACGCCAGCTGGATGTCAGCCTCAGAGAC
上游 WPGS6-SacI-F：ACGCGAGCTCGTGCAAAGAGCTGCTGCTG
下游: WPGS6-PvuII-R：ACGCCAGCTGGTCGTCGGACTGAAGCATG
根据Invitrogen公司提供的Platinum? Pfx DNA Polymerase说明书，PCR扩增体系如下：10 Xpfx PCR 缓冲液5μl，硫酸镁（50 mM） 2μl，dNTPs（10 mM）1μl，5’端引物（10μM）1μl，3’端引物（10μM）1μl，桉树cDNA 2μl，pfx 高保真DNA聚合酶0.4μl（购自Invitrogen公司），水38μl，总体积50μl。PCR扩增程序为：先94 oC 预变性5分钟；然后94 oC 40 秒，53 oC 40 秒， 68 oC 40 秒，共40个循环，最后68 oC延伸 5分钟。
3. pSV基因沉默载体简介
实验所用植物基因沉默载体为pSV，长度14.3kp（见图1，2）。pSV带有花椰菜花叶病毒35S启动子，它为两个35S启动子并排重现型启动子，可在植物的各个发育阶段持续表达；具有NOS转录终止信号；具有卡纳霉素（Kanamycin，Kan）选择抗性，用于筛选大肠杆菌和农杆菌转化子；具有潮霉素选择抗性（Hygromysin, Hyg），用于筛选植物转化子。pSV载体最大特色在于其使用一段来源于桉树基因ELF1的内含子（Eucalyptus ELF1 intron），ELF1全称为 LEAFY/FLORICAULA同源基因，GenBank中的登记号位AF034806.1，其序列为序列表中的SEQ ID NO: 9。ELF1 intron也就是该基因所含有的一段内含子序列(SEQ ID NO: 10)，从该基因的873bp到967bp，其长度为94bp。将目的基因的正义保守片段和反义保守片段分别插入ELF1的内含子的两端形成基因沉默所需的发夹结构，如图1-2所示pSV载体。
4. 含有目的基因片段的pSV载体构建
先将pSV载体用限制性内切酶SacI和 PvuII-R(购自NEB生物公司)进行酶切，再和上述的含有SacI和 PvuII-R酶切位点的PCR扩增产物通过T4连接酶的作用进行连接。然后把酶连产物用BamHI-F和 NcoI-R(购自NEB生物公司)进行酶切，再用T4连接酶相对应的和上述PCR扩增产物进行酶连，从而将目的片段也就是WPGS5（SEQ ID NO: 5）或WPGS6(SEQ ID NO: 7)的保守序列以及它们的互补序列（反义序列，SEQ ID NO: 6, 8）分别地插入pSV载体（如图1，2）。酶切和酶连反应体系及条件参考NEB公司限制性内切酶使用说明书及T4连接酶使用说明书。
实施例二 HOG1和 ABAP1基因敲除拟南芥突变株的获得及其性状的观察
参考Hiei（1994）的方法，将含有目的基因保守片段构成的发夹结构的pSV表达载体利用冻融法转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101，用扩增基因的引物进行菌落PCR鉴定，图3所示为WPGS5基因沉默突变株基因组DNA鉴定，图4所示为WPGS6基因沉默突变株基因组DNA鉴定结果。对阳性克隆进行大量培养。通过蘸花浸染法（参考S J Clough等1998年发表在Plant Journal上的方法）转化拟南芥，当代收获为T0代转基因种子。将T0代转基因种子在含有50mg/L潮霉素（hygromycin）的MS培养基上进行筛选，只有载体成功转入并表达的植株才能获得潮霉素抗性从而存活，由此得到转基因阳性植株T1代。T1代植株成熟后得到T2代种子。最后将T2代种子播种在含有25mg/L潮霉素的MS培养基上进行筛选，成活的植株即为转基因阳性植株T2代，转至土壤中培养，从播种后第三周至第8周每三天对转基因植株的生长状况进行一次各项生长指标的测量（株高，叶盘直径，叶盘叶片数等），并与在相同条件下生长的野生型拟南芥的生长指标进行比较（图５，６）。如图５、６，我们统计了播种后第26天，29天，32天以及35天的转基因及野生型的拟南芥叶盘大小， 结果发现WPGS5和WPGS6基因敲除植株和野生型植株相比，叶盘直径明显增大，差异水平显著。
Claims (4)
1.来源于WPGS5基因的保守序列，其特征是该保守序列是SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列。
2.一种敲除ABAP1基因的桉树基因重组cDNA表达载体，该重组基因表达载体至少包括权利要求1所述的来源于WPGS5基因的保守序列，也包括权利要求1所述的来源于WPGS5基因的保守序列所对应的反义片段，所述反义片段是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因重组cDNA表达载体，其特征是由WPGS5基因的正义和反义片段SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6成对，夹着一个ELF1基因的内含子序列，构建一个发夹形基因沉默重组表达载体，命名为pSV；其中桉树ELF1基因的全长cDNA核苷酸序列为SEQ ID NO:9，其内含子序列为SEQ ID NO:10。
4.一种提高拟南芥叶盘直径的方法，其特征是将权利要求3所述的基因重组cDNA表达载体转入拟南芥中实现对ABAP1基因的敲除。
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