CN116103316B - 一种与乌菜叶面皱泡发育相关的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种与乌菜叶面皱泡发育相关的基因及其应用，具体涉及遗传育种技术领域，所述基因被命名为BcTCP10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时本发明还通过了用于扩增所述BcTCP10基因的引物对，具体为BcTCP10‑F和BcTCP10‑R，二者的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；本发明提供的基因BcTCP10被验证其参与乌菜叶面皱泡的调控，为改良乌菜品种、提高乌菜的商品性提供了新的指导思路。
Description
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及一种与乌菜遗传育种相关的基因。
技术背景
乌菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis var.rosularis Tsen)是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种，属于不结球白菜，是中国南方重要的十字花科蔬菜作物之一。乌菜营养价值高，富含多种维生素、蛋白质、纤维、碳水化合物及矿物质等，因其味道和高营养价值而受到消费者的赞赏。叶面上有皱泡是安徽乌菜区别于其他白菜亚种作物的一个典型特征。乌菜叶面皱泡的存在，不仅增加了可食用面积，而且提高了乌菜的耐寒性和商品性。研究乌菜叶面皱泡的形成和发育是丰富植物叶片发育调控网络的重要途径与方法。
通过基因挖掘影响乌菜叶面皱泡形成及发育的关键基因，是研究乌菜叶面皱泡形成及发育的有效方法之一。对这些基因进行功能验证研究是利用这些基因研究及改变叶面形态的前提，而现有技术中对研究与乌菜叶面皱泡调控相关基因的报道较少，因此，研究发现与乌菜叶面皱泡相关的基因是急需进行的。
发明内容
本发明的目的是提供一种与乌菜叶面皱泡发育相关的基因及其应用，以改善现有技术中缺少与乌菜叶面皱泡调控相关基因的技术问题。
技术方案如下：
本发明提供了一种与乌菜叶面皱泡发育相关的基因，所述基因被命名为BcTCP10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种上述基因BcTCP10在乌菜叶面皱泡调控中的应用。
本发明还提供一种用于获得上述基因BcTCP10的方法，该方法包括：
以乌菜cDNA为模板，利用引物对BcTCP10-F和BcTCP10-R进行PCR扩增，获得所述基因BcTCP10；
其中：BcTCP10-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；
BcTCP10-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3；
PCR扩增体系为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL，ddH2O 9.5μL，cDNA1μL，BcTCP10-F和BcTCP10-R各1μL；PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，55.8℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次，72℃彻底延伸5min。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种与乌菜叶面皱泡发育相关的基因BcTCP10，该基因被验证了参与乌菜叶面皱泡调控的功能，为从基因层面改善乌菜品种、商品性等提供了一种新的指导方向。
附图说明
图1基因BcTCP10及过表达质粒电泳图；
图2野生型拟南芥与转基因植株在培养皿中的培养状态图；
图3BcTCP10在野生型拟南芥和T1代转基因拟南芥中的表达量对比图；
图4植株正常生长条件下生长三周后低温条件下生长五天后的植株生长状况图。
具体实施方式
实施例1
目的基因的获取
为了获得BcTCP10的基因序列，用olig7软件设计特异性扩增引物BcTCP10-F和BcTCP10-R，以乌菜种质WS-1的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
其中，PCR扩增体系为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL，ddH2O 9.5μL，cDNA 1μL，BcTCP10-F和BcTCP10-R各1μL。PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，55.8℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次，72℃彻底延伸5min。
对获得的PCR扩增产物进行纯化处理(购自北京全式金生物技术股份有限公司，纯化后先测序，获得乌菜BcTCP10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)后连接到19T载体中。
连接体系为：PMD 19-T Vector 1μL，solution I 5μL，胶回收产物4μL。16℃反应30min。
之后按照说明书步骤将连接BcTCP10基因的19T载体导入到DH5α大肠杆菌感受态细胞(购自唯地生物技术有限公司)中。对大肠杆菌菌液进行测序，获得与目的基因相同的序列结果。
实施例2
重组载体构建
(1)通过CE Design V1.04软件，采用单克隆片段，以BamHI和XbaI为双酶切位点，利用双酶切线性化设计重组引物BcTCP10-1305-F和BcTCP10-1305-R。以实施例1获得的大肠杆菌菌液作为模板，在重组引物BcTCP10-1305-F和BcTCP10-1305-R等作用下进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行纯化处理后采用核酸定量仪测定带有同源重组引物的乌菜BcTCP10基因片段的浓度。
PCR扩增体系为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL,ddH20 9.5μL，cDNA(实施例1中获取的大肠杆菌菌液)1μL,BcTCP10-1305-F和BcTCP10-1305-R各1μL。PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.5min，循环32次，72℃彻底延伸5min。
(2)使用提质粒试剂盒(购自北京全式金生物技术股份有限公司)按照说明书步骤提取过表达载体pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC的质粒，对提取的质粒使用Bam HI和Xba I酶进行双酶切。
双酶切体系为：10×Quiekcut Buffer 5μL，BamHI快切酶2.5μL，XbaI快切酶2.5μL，质粒15μL，ddH2O 25μL。
然后利用胶回收试剂盒进行纯化，并采用核酸定量仪测定pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC质粒的浓度。
(3)利用基因重组试剂盒(购自上海近岸科技有限公司)将步骤(2)中获得的纯化后的pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC载体质粒和步骤(1)中获得的带有同源重组引物的乌菜BcTCP10基因片段连接，构成重组载体。之后将重组载体按照说明书步骤转入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中(转入过程按DH5α大肠杆菌感受态细胞说明书进行即可)，并对大肠杆菌菌液进行测序，若测序结果与目的基因相同，则说明乌菜BcTCP10成功插入到pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC载体中。
(4)将pCambia1305-35S-BcTCP10-nFLAG-cMYC过表达载体质粒按照说明书步骤转入到GV3101农杆菌(购自唯地生物技术有限公司)中。
(5)使用BcTCP10-1305-F和BcTCP10-1305-R，BcTCP10-1305-F和1305R两对引物，以步骤(4)中获得的农杆菌菌液作为模板进行PCR验证。
PCR扩增体系分别为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL,ddH20 9.5μ L，cDNA(步骤(4)中获取的农杆菌菌液)1μL,BcTCP10-1305-F和BcTCP10-1305-R各1μL。2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL,ddH20 9.5μL，cDNA(步骤(4)中获取的农杆菌 菌液)1μL,BcTCP10-1305-F和1305R各1μL。PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.5min，循环32次，72℃彻底延伸5min。
结果发现含有载体片段扩增出来的PCR产物比BcTCP10的片段长(图1)，这说明基因BcTCP10已经成功插入到过表达载体pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC中。
实施例3
功能性验证
(1)将农杆菌菌液复苏后用缓冲液配置成OD560＝0.8-1的重悬液，利用花序侵染的方法侵染拟南芥花序，获得侵染后的T0代拟南芥种子。
缓冲液配置体系为：1/2MS 200mL，蔗糖10g，50μL Silwet-77，将PH调至5.8。
(2)将T0代拟南芥播种在含有50ug/mL潮霉素B(Invitrogen，Carlsbad，California)的1/2MS琼脂平板上筛选过表达拟南芥植株。
如图2(A为野生型拟南芥在1/2MS培养基上培养图，B为在含50μg/mL潮霉素B的1/2MS培养基上筛选得到的转基因植株)，野生型拟南芥植株可以在1/2MS培养基上正常生长，而只有被农杆菌侵染成功的植株才能在含有潮霉素B的1/2MS培养基上正常生长，获得T1代转基因植株
(3)使用特异性引物(BcTCP10-qF和BcTCP10-qR)对T1代转基因植株和野生型拟南芥进行qRT-PCR，以乌菜Actin为内参基因，计算BcTCP10基因在野生型拟南芥和T1代转基因植株中的表达水平。
qRT-PCR体系为：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 32μL,BcTCP10-qF3.2μL,BcTCP10-qR3.2μL,cDNA3.2μL,DEPC22.4μL。qRT-PCR程序为：95℃30s,95℃10s,57℃30s,图像采集，循环40次，溶解曲线57℃to 95℃5s，图像采集。
在BcTCP10基因过表达拟南芥植株中的表达水平是野生型拟南芥的124.38倍(图3)。这说明pCambia1305-35S-BcTCP10-nFLAG-cMYC已经成功导入到拟南芥基因组中并成功表达。这些结果均表明转基因拟南芥遗传转化成功，可以利用转基因株系进行后续试验。
(4)将WT和OE幼苗在24℃/18℃，16h/8h(昼、夜)，相对湿度为75％，光照强度为200mmol m-2s-1的条件下于1/2MS平板上种植，之后移栽到营养钵中培养三周。之后将植株移到16℃/10℃，其余条件一样的环境中培养五天。本试验中使用的是野生型拟南芥和T3代转基因植株，试验数据重复三次。经正常培养三周后低温培养五天后，植株的生长状况如图4所示，转基因植株的叶片出现了褶皱表型，而野生型植株叶片平展。
基于上述基因分析与基因功能验证，可得基因BcTCP10参与了乌菜叶面皱泡的调控。
BcTCP10基因克隆、载体质粒鉴定及定量表达引物
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.基因BcTCP10在乌菜叶面皱泡发育中的应用，所述基因BcTCP10的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
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2023
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