CN112430601A

CN112430601A - 一种与不结球白菜耐寒性相关的基因及其应用

Info

Publication number: CN112430601A
Application number: CN202011323337.8A
Authority: CN
Inventors: 汪承刚; 王洁; 袁凌云; 朱世东; 汪健; 侯金锋; 黄兴学; 唐小燕; 张泽根; 陈国户
Original assignee: Anhui Wanjiang Vegetable Industry Technology Research Institute Co ltd; Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Wanjiang Vegetable Industry Technology Research Institute Co ltd; Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112430601B

Abstract

本发明公开了一种与不结球白菜耐寒性相关的基因及其应用，涉及遗传育种技术领域，所述基因具体为PSBO基因，其具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；同时本发明还提供一种利用上述基因对不结球白菜耐寒性鉴定的方法，所述方法具体为将需比较的不结球白菜品种在同样的环境下分别种植，待幼苗长至5‑6片真叶时，分别取样进行权利要求1所述与不结球白菜耐寒性相关的基因的基因表达量检测；其中，表达量越高的品种其耐寒性越高；本发明能够快速鉴定不结球白菜之间的耐寒性优劣，有助于相关品种的筛选。

Description

一种与不结球白菜耐寒性相关的基因及其应用

技术领域

本发明涉及遗传育种中抗性筛选技术领域，具体为一种与不结球白菜耐寒性相关的技术。

背景技术

不结球白菜是十字花科的两年生草本植物，低温会导致不结球白菜的经济产量和品质下降，严重影响植物的生长发育。在低温(0-10℃)下，某些经济作物的产量和质量，例如蔬菜，谷物和水果，遭受严重破坏。即使在短期的低温处理中，植物也可能会重新调整其新陈代谢以提高抗逆性并避免伤害。

对不结球白菜耐寒性的鉴定可有效判定对应的耐寒性，从而便于提前针对植株进行防护处理，避免经济损失；但是传统的鉴定方法周期长，测试结果受自然环境影响大，不利于优质种质资源的筛选。

因此如何快速鉴定不结球白菜的耐寒性以便于优质种质资源的筛选，是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与不结球白菜耐寒性相关的基因，该基因表达量越高的不结球白菜的耐寒性越强。

本发明还提供与不结球白菜耐寒性相关的基因所编码的蛋白质。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种与不结球白菜耐寒性相关的基因，所示基因具体为PSBO基因，其具有如 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

进一步，本发明还提供一种利用上述基因鉴别不同不结球白菜品种间耐寒性优劣的方法，该方法包括：

将需比较的不结球白菜品种在同样的环境下分别种植，待幼苗长至5-6片真叶时，分别取样进行权利要求1所述与不结球白菜耐寒性相关的基因的基因表达量检测；其中，表达量越高的品种其耐寒性越高

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、本发明操作简单，便于实施；

2、本发明在苗期可有效的对不结球白菜各品种间的抗寒性进行鉴定，提高了鉴定效率，缩短了鉴定周期；

3、通过本发明提供的方法，能够迅速比较各品种间耐寒性的强弱，便于遗传育种的筛选。

4、本发明提供的基因可为培育耐寒的不结球白菜品种提供思路。

附图说明

图1为常温下PSBO基因表达量的检测结果示意图；

图2为实施例2中低温下PSBO基因表达量的检测结果示意图；

图3为实施例2中膜稳定指数检测结果示意图；

图4为实施例2中丙二醛含量检测结果示意图；

图5为实施例2中过氧化氢含量检测结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了验证本发明提供的鉴定方案，进行以下实施例。

实施例

本试验选取5个不结球白菜品种作为材料，5个品种分别为Ta2、WS-1，w16-13，w18，w16-12， wy16-13。于不结球白菜2-3片真叶期选取大小一致，长势一致的不结球白菜放置在白天25± 1℃，夜温20±1℃，光周期为14h/10h(光照/黑暗)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％的人工气候室内。幼苗生长至5-6片真叶时，取样进行PSBO基因表达量测定。

具体的为：

1.乌菜基因组总RNA提取及cDNA合成

参照Takara RNA提取试剂盒说明书进行基因组总RNA提取。所得RNA经定量后，按表 1体系加样合成cDNA，具体参照Takara反转录说明书进行。

表1

2.乌菜PSBO基因编码区获得及回收纯化

合成的cDNA产物用1.5％琼脂糖电泳检测，经内参检测合格后，将所得符合预期大小的片段从琼脂糖胶上切下，按照AxyPrep^TM DNA Gel Extraction Kit说明书进行DNA片段回收。

3.克隆载体构建及转化大肠杆菌

将回收目的DNA片段和pMD^TM 19-T载体按体积比1：4连接，放4℃冰箱过夜。次日取连接产物5μL，加入到50μL已解冻大肠杆菌感受态中，在冰上静置30min后40℃热激45s，再于冰上静置3min，加入1mL LB液体培养基后在震荡培养箱中37℃、220rpm 培养1h。培养结束后4000rpm、3min离心后，弃大部分上清，余下150μL用移液枪轻轻吹打，用涂布棒均匀涂布在含有100mg·L^-1Amp的LB平板上。37℃培养过夜，次日挑取 3-5个阳性菌落于不同含100mg·L^-1Amp的4mL LB中，37℃培养过夜。

4.引物设计

根据NCBI及大白菜数据库(Brassica database)上已有十字花科各物种PSBO(SEQID NO 1)基因序列，经查找比对后，取同源区，然后设计引物(F：SEQ ID NO 2；R：SEQ ID NO3)用以克隆基因，引物送生工生物公司合成。

5.测序及生物信息学分析

取上一步骤菌液，利用4获得的引物按下表中的体系扩增PSBO基因，产物经1.5％琼脂糖电泳检测合格后，取1mL菌液送上海华大公司测序，另取500μL加入500μL 40％甘油后保存于-20℃冰箱。

6.乌菜PSBO基因表达模式研究

根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，用Oligo 7.0软件设计用于检测PSBO表达的荧光引物，并以管家基因Actin为参考，引物序列送生工生物公司合成。经半定量PCR检测，引物无二聚体及非特异扩增后，设置NTC，检测操作及引物是否符合要求，二者均合格后，在冰上加样，每个样重复3次并进行三次生物学重复。将样品盖子盖好后轻微离心，在CFX 96PCR仪中检测基因表达量。

试验结果如图1所示，表明不同品种的PSBO表达量具有显著差异。

实施例2

随后在低温下进行验证。幼苗生长至5-6片真叶时，选取大小一致，长势一致的不结球白菜放置在人工气候室内。人工气候室条件为：白天7±1℃，夜晚3±1℃，光照300μmol·m^-2s^-1。该试验幼苗完全随机分配，并进行三次生物学重复。将幼苗在低温条件下处理3天后，收集每个处理组的六个植物的叶片进行混样，冷冻保存。用于后续实验。低温处理下测定了PSBO 的表达量、丙二醛含量、过氧化氢含量、膜稳定指数。图2中可以看到植株在经历低温后，PSBO 表达量也是具有显著差异的。通过图1、2、3、4、5我们可以看到PSBO表达量越高，植株的膜稳定指数越高，丙二醛和过氧化氢的含量越低，说明了PSBO表达量高的植株，在低温下能够更好的应对低温带来的伤害。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学，安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司

<120> 一种与不结球白菜耐寒性相关的基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 不结球白菜(Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atggcagcct ctctccaatc cgcctctacg ttccttcagg ccgctaaaat ctccaccgct 60

ccttcacgcg gcagtgctca cctccggtcg actcagacag tcgggaaatc tttcggacta 120

gaaacatcct ctgctcgcct cacatgttcc ttccaatctg acttcaagga cttggccggt 180

aaatgctccg acgctgtcaa aatcgctgga tccgctctcg caacctctgc tctcgtcgtc 240

tcgggagcaa gtgcagaggg agctccgaag agactgactt acgacgagat tcagagcaag 300

acttacatgg aagttaaggg aactggaacg gccaaccagt gcccaactat tgacggtggc 360

tccgagactt tctccttcaa acccggaaag tacgctggca agaagttctg cttcgagcct 420

acttccttca ccgtcaaggc tgagagtgtt agcaagaatg cgcctcctga tttccagaac 480

accaagctca tgacccgtct cacctacact cttgacgaga tcgaaggccc cttcgaggtt 540

tcttctgacg gaagcgttaa cttcaaggaa gaagacggca tcgactacgc tgctgtcact 600

gtccagcttc caggaggcga gcgtgtgcca ttcctcttca ccgtcaagca gcttgacgcc 660

tctggcaaac cagacaactt ctctggcaaa ttcttagtcc cttcataccg tggctcctcc 720

ttcttggacc ctaagggccg tggtggttcc acaggatatg acaacgccgt tgcattgcca 780

gctggaggca gaggtgacga agaggagctt tcaaaagaga acgtgaagaa cacggcagct 840

tcggtgggag agatcacttt gaaagtgacc aagagcaaac ctgagacagg agaagtgatc 900

ggagtgttcg aaagtcttca gccgtcggat actgacttgg gtgccaaggt acctaaggat 960

gtgaagatcc aaggggtgtg gtatggtcaa cttgagtga 999

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Synthetic gene)

<400> 2

atggcagcct ctctccaatc c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Synthetic gene)

<400> 3

tcactcaagt tgaccatacc a 21

Claims

1.一种与不结球白菜耐寒性相关的基因，其特征在于，所示基因具体为PSBO基因，其具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

2.一种利用权利要求1所述基因鉴别不同不结球白菜品种间耐寒性优劣的方法，其特征在于，该方法包括：

将需比较耐寒性的不结球白菜品种在同样的环境下分别种植，待幼苗长至5-6片真叶时，分别取样进行权利要求1所述与不结球白菜耐寒性相关的基因的基因表达量检测；其中，表达量越高的品种其耐寒性越高。