CN114703219B

CN114703219B - 一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法

Info

Publication number: CN114703219B
Application number: CN202210077428.0A
Authority: CN
Inventors: 金松恒; 申建双; 胡玥
Original assignee: Jiyang College of Zhejiang A&F University
Current assignee: Jiyang College of Zhejiang A&F University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114703219A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法。本发明分别在RpHsfC1和RpHsfC1‑like基因的全长序列中选取一个目标片段，扩增目标基因片段与病毒载体重组，构建VIGS载体，将VIGS载体转化至杜鹃，通过荧光定量表达分析，结果发现经过VIGS沉默的目的基因的表达量受到抑制，说明成功沉默了目的基因，获得转基因植株。通过对沉默后植株进行光合荧光特征的分析，发现经过VIGS沉默掉目的基因RpHsfC‑1 like和RpHsfC‑1都对杜鹃耐热能力产生了影响。本发明通过初步鉴定基因的调控耐热能力，为杜鹃耐热性品种的培育提供了基因来源。

Description

一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法。

背景技术

杜鹃是我国的著名花卉，又作为我国的传统十大名花，杜鹃花的地理分布非常广泛，杜鹃可以在从低海拔到高海拔的不同植被地带生长，但杜鹃花主要分布在海拔1500～4000m的地区，喜冷凉的环境。目前随着全球气候变暖的加剧，高温已经成为全球性的自然灾害，涉及范围较广，然而温度是影响植物生长发育的重要因素，不适宜的生长温度极易影响植物的生长代谢。目前栽培的大多数杜鹃优良品种的耐热性较差，当温度超过35℃时，植物会进入半休眠状态，新梢和新叶的生长也会变得缓慢。目前关于高温胁迫对杜鹃的研究较多，但是大多数还局限在生理生化指标的分析，对杜鹃耐热性研究在分子生物学上的研究还较少，因此对杜鹃耐热相关基因的发掘为今后杜鹃的分子遗传育种具有重要理论和实践意义。热激转录因子(Hsfs)是调控编码热激蛋白(Hsps)的热激(HS)响应基因的核心调控因子，Hsps是一类最为重要的热胁迫蛋白，是植物细胞免受高温伤害的物质基础。目前关于耐热性与热激蛋白和热激转录因子的研究还大多集中在拟南芥、番茄、甜椒和黄瓜等植物中，在杜鹃还尚未广泛开展此类研究。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，目的是为了解决前关于高温胁迫对杜鹃的研究较多，但是大多数还局限在生理生化指标的分析，对杜鹃耐热性研究在分子生物学上的研究还较少，以及杜鹃还尚未广泛开展关于耐热性与热激蛋白和热激转录因子的研究的技术问题。

本发明提供的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，具体技术方案如下：

一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，构建含有用于沉默耐热基因特异性片段的重组病毒载体，转化到农杆菌感受态细胞制备侵染菌液，将所述侵染菌液侵染的杜鹃，对所述耐热基因的功能进行鉴定分析，所述用于沉默耐热基因特异性片段为用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段或用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段，所述用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在某些实施方式中，包括如下步骤；

S1，提取杜鹃叶片RNA，反转录获得杜鹃cDNA；

S2，利用引物1和引物2对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC-1like基因特异性片段，利用引物3和引物4对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段；

S3，将步骤S2中的用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段、用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段分别与烟草脆裂病毒pTRV2进行重组连接，获得重组载体pTRV2-HsfC-1like、pTRV2-HsfC-1；

S4，将步骤S3中重组载体pTRV2-HsfC-1 like、pTRV2-HsfC-1以及pTRV1分别转化到农杆菌GV3101 感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体pTRV2-HsfC-1 like的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1的菌液以及含pTRV1的菌液；

S5，将步骤S4的含重组载体pTRV2-HsfC-1 like的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1的菌液分别与含 pTRV1的菌液离心收集菌体，并用侵染重悬液重悬至特定OD值后分别与pTRV1的菌液以体积比1：1混匀，即为侵染夜，将所述侵染液侵染杜鹃叶片；

S6，侵染10天后，采用PCR和RT-PCR(实时荧光定量)的方法筛选侵染成功的植株，将侵染成功的杜鹃进行正常培养7天，后模拟自然高温条件进行高温胁迫处理，检测HsfC-1like、HsfC-1对在杜鹃的耐性响应中的功能，以及在杜鹃叶片光系统、光保护机制、电子传递对高温胁迫响应的作用。

在某些实施方式中，在步骤S2中，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

在某些实施方式中，在步骤S2中，所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，所述引物4的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。

在某些实施方式中，在步骤S4中，浸染方式如下：用无菌注射器在杜鹃叶片背部进行注射接种含重组载体pTRV2-HsfC-1 like的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1的菌液。

在某些实施方式中，在步骤S5中，所述高温胁迫处理的温度为40℃/32℃(昼12h/夜12h)。

在某些实施方式中，在步骤S5中，高温胁迫处理胁迫第5d后选取杜鹃新梢顶叶下的第3-4层叶片，进行功能验证。

在某些实施方式中，在步骤S5中，所述耐性响应中的功能分析包括叶绿素荧光参数、叶绿素荧光诱导曲线，所述杜鹃叶片光系统、光保护机制、电子传递对高温胁迫响应的作用包括JIP-test、延迟荧光DF、 820nm反射光谱测定。

本发明具有以下有益效果：本发明提供的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，具有时间短，速度快，高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化，利用VIGS沉默体系，进行杜鹃耐热性相关基因功能验证。通过荧光定量表达分析，结果发现经过VIGS沉默的目的基因的表达量受到抑制，说明成功沉默了目的基因HsfC-1 like和HsfC-1。通过对沉默后植株进行光合荧光特征的分析，发现经过VIGS 沉默掉目的基因HsfC-1 like和HsfC-1都对杜鹃叶片产生了影响。本发明通过初步鉴定基因的功能，为杜鹃耐热性品种的培育提供了基因来源。

附图说明

图1是本发明提供的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法流程图；

图2是本发明HsfC-1 like和HsfC-1目的片段PCR产物电泳图；

图3是本发明序列信息比对图；

图4是本发明农杆菌菌液PCR检测电泳图；

图5是本发明qRT-PCR检测HsfC-1 like基因表达量对比图；

图6是本发明RT-PCR检测HsfC-1基因表达量对比图；

图7是本发明杜鹃叶片快速荧光动力学OJIP曲线的形态变化图；

图8是本发明目的基因对杜鹃快速荧光诱导曲线L带、K带的影响图；

图9是本发明目的基因对杜鹃叶片PSⅡ以及反应中心的影响图；

图10是本发明目的基因对杜鹃叶片对光合电子传递链的影响图；

图11是本发明目的基因对杜鹃820nm反射光谱的影响图；

图12是本发明目的基因对杜鹃延迟荧光DF的影响图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1-12，对本发明进一步详细说明。

一、杜鹃总RNA提取及cDNA合成

取样生长发育良好的杜鹃叶片，取样后液氮速冻，然后从液氮转移至-80℃超低温冰箱保存以备提取杜鹃总RNA使用。

1、本试验采用RNA试剂盒提取杜鹃叶片RNA，具体操作参考天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒说明书，最终得到高浓度的RNA溶液。

2、使用天根生化科技有限公司的试剂盒合成cDNA。

将上述提取的杜鹃总RNA进行cDNA合成，具体操作如下：

(1)在1.5mL离心管中配制反应液

(2)混匀后，65℃保温5min，然后冰上迅速冷却

(3)在上述离心管中配制下列反转录反应液，总量为20μL。

(4)缓慢摇匀后，置于PCR仪按照下列条件进行反转录反应：42℃

(～50℃)30-60min，95℃，5min后，冰上冷却。

二、沉默片段HsfC-1 like、HsfC-1的扩增

根据克隆得到的杜鹃序列信息，选取保守区域以外的300bp(HsfC-1 like、HsfC-1)片段为目的片段，利用PCR Primer Stats进行引物设计，引物序列为如表1所示。按照表2配制反应体系，3000rpm，10s 离心，将反应体系放入PCR扩增仪进行体外复制(PCR反应循环如表3所示)，反应结束后用1.3％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，具体操作参照说明书(天根生化科技有限公司)。

表1沉默基因PCR所用引物

表2反应体系

注a：20μL体系可以变为50μL体系。

表3 PCR反应循环

注b：PCR扩增仪上盖温度设置为105℃。

三、重组载体的构建

1、将目的基因片段与TRV2载体进行转化

1)大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出，迅速插入冰中，5min待菌块融化，分别加入2μL 目的片段、2μL TRV2,并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用移液枪进行吸打)，冰中静置25min。

2)42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min。轻拿轻放避免出现晃动，不然可能会降低转化的效率。

3)向离心管中加入700μL的不含抗生素的无菌液体培养基，混匀之后放进摇床并设置温度37℃，转速200rpm复苏60min。

4)5000rpm离心1min倒掉废液收集菌体，留取大约100μL的上清液轻轻吹打重悬菌块然后涂布到含抗生素Kan的培养基上。

将平板倒置放于37℃的恒温培养箱过夜。

2、过夜培养好的菌斑进行菌液PCR和测序，2、过夜培养好的菌斑进行菌液PCR和测序，操作如下：

1)在无菌操作台上，在离心管中加入10μL无菌水，挑取大小中等的菌斑后在离心管中进行反复吸打，充分混合。

2)吸取2μL混合液作为PCR反应的模板，PCR反应体系如表4所示，反应条件如表5所示。

表4 PCR反应体系

表5 PCR反应条件

3)取PCR产物进行电泳鉴定，检测大肠杆菌里是否转化进TRV2质粒和目的片段。

4)确定菌液中含有目的片段后，将剩余的8μL混合液转接到含Kan的LB培养基中，过夜摇菌培养然后送至北京擎科生物公司测序。

3、进行重组载体的构建

将测序正确的菌液利用高纯度质粒小提试剂盒进行质粒提取。具体操作在说明书(天根生化科技有限公司)指导下进行，最后可以获得浓度较高的重组载体质粒。

以杜鹃的cDNA为模板，利用目的基因HsfC-1 like和HsfC-1的特异性引物进行扩增，PCR电泳结果显示(图2所示)获得的目的片段符合预期大小，经过回收以及转化大肠杆菌感受态DH5α细胞，菌液PCR。测序后，经过与原始序列信息比对结果显示，使用该引物扩增获得的片段是正确的(图3所示)。

四、重组载体转化农杆菌感受态细胞GV 3101

将测序正确的病毒重组质粒转化农杆菌感受态细胞GV 3101。具体操作步骤如下：

1)取保存在-80℃的农杆菌感受态细胞在室温放置数分钟或者将其置于手心片刻等到农杆菌感受态细胞部分融化，处于冰水混合的状态时迅速将其插入冰中。

2)每100μL的感受态细胞中加5μL的质粒DNA，用手轻轻拨打管底将感受态细胞和质粒DNA混合均匀，然后按照步骤依次首先在冰上静置5min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、最后冰浴5min。

3)在上一步完成后的离心管中加入700μL不含抗生素的液体培养基，于28℃震荡培养2-3h。

4)6000rpm离心1min收菌，将废液倒掉，同时留取上清液约100μL左右轻轻用移液枪吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素(Kan 100μg/mL、Rif 50μg/mL、Gen 100μg/mL)的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3d。

挑取单菌落于含有2mL相应抗生素(Kan 100μg/mL、Rif 50μg/mL、Gen 100μg/mL)的液体LB中， 28℃，220rpm/min摇床震荡过夜。摇好的菌液添加甘油分装并保存于-80℃备用。

双酶切验证正确的重组质粒转化农杆菌感受态细胞GV3101，获得含有重组载体的农杆菌。经过含相应抗生素的LB培养基培养，挑取单菌落进行PCR筛选，如图4所示。1-3和4-6条泳道都出现了相对应的目的条带，说明目的基因的重组质粒已经成功转入农杆菌中。

五、植株的侵染

1、侵染液的制备

1)将含有pTRV2、重组载体pTRV2-HsfC-1 like和重组载体pTRV2-HsfC-1的农杆菌菌液涂布与含相应抗生素(Kan 100μg/mL、Rif 50μg/mL、Gen 100μg/mL)的固体LB培养基中，28℃恒温培养箱培养48 h-60h，观察菌落生长情况是否良好。

2)挑取单菌落的农杆菌，接种与2mL含相应抗生素(Kan 100μg/mL、Rif 50μg/mL、Gen 100μg/mL) 的液体LB中，28℃，220r/min摇床中培养12-16h。

3)按照相应的比例(1：20)将摇好的菌液转接到诱导LB(Kan 100μg/mL、Rif 50μg/mL、Gen 100μg/mL、 AS 20μmol/L、MES 10mmol/L)中,然后设置温度28℃，220r/min在摇床中震荡培养14h左右。

4)震荡完成后，5000r/min离心10min，弃上清收集菌体。

5)配制完成的侵染液(MES 10mmol/L、AS 200μmol/L、MgCl₂ 10mmol/L)重悬菌体。取少量悬浮菌液使用微量分光光度计测量其浓度，使菌体浓度(OD₆₀₀)达到试验设计要求，获得侵染夜。然后置于室温下3-4h，将含pTRV1载体与含pTRV2、pTRV1载体与含pTRV2-HsfC-1 like、pTRV1载体与含有重组载体pTRV2-HsfC-1的侵染夜分别以体积比1：1混匀，备用。

(2)接种后检测

为了鉴定携带沉默载体的农杆菌侵染后是否成功沉默了该基因，侵染完成后，植物出现沉默表型后进行对照组、空载组和沉默组(侵染叶片上面又重新萌发出的嫩叶)取样，提取杜鹃叶片总RNA，反转录成 cDNA。

1)提取完成的杜鹃RNA进行PDS基因沉默的病毒分子检测：

以上述cDNA为模板，根据TRV2的基因序列设计引物，进行病毒分子PCR检测，PCR反应体系表6 所示，反应条件如表7所示。

表6 PCR反应体系

表7 PCR反应条件

反应结束后用1.3％琼脂凝胶电泳检测。

2)RT-PCR检测目的基因表达

以杜鹃的UBQ基因作为内参基因为对照，设计荧光定量引物检测杜鹃叶片中PDS的基因表达。

表8 qPCR检测目的基因沉默效果的引物

六、杜鹃耐热基因功能检测

侵染成功的杜鹃放于智能光照培养箱内，在25℃/17℃(昼12h、夜12h)的条件下培养7天，根据前期预实验处理，在设置胁迫温度为30℃、35℃和40℃杜鹃叶片的光合和叶绿素荧光都发生了变化，但是在高温胁迫40℃时变化明显，所以本次杜鹃耐热性基因功能验证试验所选取的高温胁迫温度为40℃。

在培养第7天开始模拟自然高温条件进行高温胁迫处理，设置胁迫温度为40℃/32℃(昼12h/夜12h)，以25℃/17℃(昼12h/夜12h)作为对照组，每组处理设置3个重复，每个重复5株。试验组除了设置温度不同外，其他条件均保持一致，光照强度为600μmolm^-2s^-1，温度设置为：22℃/18℃(昼16h/夜8h)，空气相对湿度为75％，栽培基质土壤相对含水量保持在80％。处理期间时刻关注土壤水分变化，及时浇水，防止由于缺水导致水分胁迫影响数据真实性。胁迫第5d后选取杜鹃新梢顶叶下的第3-4层叶片(非离体)，进行叶绿素荧光等指标的测定，与测量完毕后，采取部分样品置于液氮速冻后，快速放于-80℃超低温冰箱内保存，后续用于荧光定量试验的测量(高温胁迫在人工培养箱中持续不间断进行，部分杜鹃叶片在第6-7 d出现了干枯萎蔫，所以选择在进行胁迫后的第5d测定)。

七、快速荧光OJIP、JIP-test、延迟荧光DF、820nm反射光谱测定

采用多功能植物效率分析仪(M-PEA，Hansatech，Norfolk，UK)同步测定PF、DF和820nm反射。选取植株完全展开的叶片，测定前叶片暗适应20min。M-PEA光化光的波长为627±10nm，调节光的波长为820±25nm，远红光的波长为725±15nm。初始荧光F_O(t＝20μs)，此时所有反应中心(RCs)都是开放的；F_L，L相的荧光强度(t＝150μs)；F_K，K相的荧光强度(t＝300μs)；F_J，J相的荧光强度(t＝ 2ms)；F_I，I相荧光强度(t＝30ms)；F_p，最大荧光强度F_M(所有反应中心关闭)，曲线以对数时间尺度绘制以显示荧光诱导过程。

使用JIP-test分析以下荧光参数：PSII最大量子效率F_v/F_m＝(F_m-F_o)/F_m，光合性能指数 PI_ABS＝RC/ABS，PSII单位反应中心吸收的光能PSII单位反应中心捕获的能量TR₀/RC＝M₀(1/V_J)，PSII单位反应中心用于电子传递的能量ET₀/RC＝M₀(1/V_J)Ψ₀，PSII单位反应中心用于耗散的能量DI₀/RC＝(ABS/RC)/(TR₀/RC)，PSI末端受体还原的量子产额/>激子将电子从QA传递到PQ的效率/>电子传递给PSI受体侧电子受体的概率δ_Ro＝RE₀/ET₀＝(1-V_I)/(1-V_J)，电子从QA^-传递到PQ的量子产量/>PSⅡ最大光化学效率/>用于热耗散的量子比率/>对获得的OJIP曲线进行叶绿素荧光动力学参数分析，可以准确分析出在热处理胁迫下PSⅡRC_S能量捕获以及PSⅡ供体侧和受体侧电子传递的变化。

通过测量P700在875nm和830nm之间的透过率差异，即P700的氧化还原变化，可以获得延迟荧光。通过调制光照射植物叶片，300μs光照后，黑暗间隔持续100μs，3ms后，亮暗间隔持续时间变长10倍，在暗处每间隔10μs对DF进行一次测量，关灯后20μs记录第1个点。在暗处，DF信号呈指数衰减，对 20-90μs间隔记录内的信号进行积分。为了准确测定DF衰减曲线的动力学特性，将试验点拟合成指数函数。I₁点是曲线的第一个最大值，I₂点是第二个最大值，D₂是曲线的最小值。

利用820nm的调制反射信号计算MR/MR₀。第一个可信的MR测量点(MR_o)出现在0.7ms。MR/MR_o的比值反映了P700⁺与PC⁺之间的氧化还原状态。

由荧光定量结果图5-6可知，通过VIGS方法沉默了杜鹃目的基因发现，杜鹃叶片中的RpHsfC-1 like 和RpHsfC-1的表达量在经过处理后显著降低。RpHsfC-1 like基因在经过热处理之后的表达量与经过热处理的对照组相比表达量下降了31％，RpHsfC-1基因的表达量在经过热胁迫处理后与对照组相比则下降了 39％，说明经过VIGS处理RpHsfC-1 like和RpHsfC-1基因的表达受到抑制。

如图7(a)、(b)所示，杜鹃叶片的快速叶绿素荧光动力学OJIP曲线在热胁迫下从O点上升到P点的过程出现了典型的O-J-I-P多相变化，经过热胁迫处理的对照组与未处理组相比OJIP曲线出现了偏离，并且经过VIGS沉默目的基因处理的杜鹃叶片的OJIP曲线与热胁迫处理对照组相比也有偏离，而与未经过处理的对照组相比则有更大的偏离程度。为了方便比较将OJIP曲线进行标准化如图7(c)、(d)(e)、(f)，相对可变荧光(ΔV_t)能够反应PSⅡ单元复合物的变化，在热胁迫下经过VIGS沉默处理的杜鹃的J点相对可变荧光(V_J)和I点的相对可变荧光(V_I)升高。

将OJIP曲线的O到J点与O到K点进行标准化并计算差值W_OK＝(F_t-F_O)/(F_K-F_O)，ΔW_OK＝W_(treatment)-W_(control)(图8(a)、(b))、W_OJ＝(F_t-F_O)/(F_J-F_O)，ΔW_OJ＝W_(treatment)-W_(control)(图8(c)、(d))后出现了清晰的L-band与K-band，且K-band和L-band与未经过高温处理的对照组杜鹃相比有了明显的增加，并且经过VIGS沉默处理的植株比未经过沉默处理的相对增加也相较明显。

根据图9可知，经过热胁迫处理之后的杜鹃叶片的PSⅡ以及反应中心都发生了变化。高温胁迫下，对照杜鹃叶片和经过VIGS沉默的杜鹃叶片的ABS/RC、DI₀/RC、TR₀/RC在受到高温胁迫后都呈现上升的趋势，VIGS沉默处理的两种杜鹃叶片的ABS/RC分别上升了57.9％、35.9％而未经过VIGS沉默处理的对照组杜鹃叶片在受到高温胁迫后ABS/RC仅升高了15.2％；DI_O/RC分别上升了38.2％、36.8％，仅仅经过高温胁迫的对照组杜鹃上升了13.9％；TR₀/RC分别上升了21.7％、31.4％未经沉默处理的对照组杜鹃仅仅上升了5.9％。与此相反，F_v/F_m、PI_ABS和ET₀/RC都呈现下降的趋势。分别下降了12.6％和11.6％，57.2％和41.5％，11.2％和14％，而只经过高温处理的对照组分别下降了6.3％、25.6％和8.5％。

热胁迫对经过VIGS沉默之后的杜鹃叶片的光合电子传递产生了显著的影响。根据图10可知，在高温胁迫的条件下，不管是否经过了VIGS沉默处理，杜鹃叶片的PSⅡ最大光化学效率激子将电子从Q_A传递到PQ的效率/>PSⅠ末端受体还原的量子产额/>电子从Q_A ^-传递到PQ的量子产量/>以及电子传递给PSⅠ受体侧电子受体的概率(δ_Ro)都呈现了下降的趋势，值得注意的是经过VIGS侵染沉默目的基因的杜鹃叶片的下降趋势更加显著，其中热胁迫侵染沉默RpHSFC1的杜鹃植株和热胁迫沉默 RpHSFC1 like的杜鹃植株的/>分别下降了11.2％、12.7％，而没有进行侵染处理的对照植株在经过热胁迫之后/>下降了5％，/>分别下降了20.7％、16.7％，没有进行侵染处理的对照植株在经过热胁迫之后仅下降了8.1％，/>分别下降了41.5％、40.0％，同样对照植株下降了22.9％，/>两个基因沉默后的杜鹃分别下降了34.4％、21％而未经处理的对照植株仅仅下降了10.4％，δ_Ro也分别下降了28％、32.1％，没有进行处理的对照植株下降了24.4％。而杜鹃叶片的用于热耗散的量子比率/>随着温度的升高也升高，经过 VIGS沉默目的基因的杜鹃的/>分别升高了22.6％、25.9％，而未经处理的对照植株仅仅增加了8.7％。

如图11所示，经过高温处理后，与对照相比经过VIGS处理的杜鹃叶片的820nm曲线发生变化。当植物在受到高温胁迫时820nm曲线的最低点位逐渐降低，经过VIGS沉默处理的杜鹃叶片与对照相比下降的幅度较大，说明VIGS沉默后杜鹃叶片受到的胁迫程度更大。

如图12所示，高温胁迫处理后，杜鹃的DF曲线均发生明显变化，杜鹃D₀、I₁和I₂均随高温的处理而下降，其中经过VIGS沉默处理的杜鹃叶片下降明显，I₁在经过高温胁迫处理后的杜鹃叶片与对照相比下降了23.6％，而经过VIGS沉默的杜鹃叶片在高温处理后分别下降了29.1％、33.8％，I₂下降了16.8％，经过VIGS沉默目的基因的两组分别下降了26.2％、23.3％。在高温处理之后I₂/I₁的比值表现为上升的趋势， (I₁-D₂)/D₂的比值则表现为下降的趋势，并且在高温处理之后经过基因沉默处理的杜鹃叶片的变化表现更加明显。

上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江农林大学暨阳学院

<120> 一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaaggtc accaatccct acttactgcg tcacaattac gacgaggaag aagaggacga 60

caaggaaata ctaaaagaaa tagccaagct gaagcaagaa c 101

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaacaggaac gtggggggtt ttgggtgatg gagtcttgca atatagtcgc gccgttcgtg 60

atgaagacgt atcagatggt cagcgatccg tcgacggacc 100

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaggttacc gaattccagc aaggtcacca atccc 35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcggtacc ggatccagcc aagctgaagc aagaac 36

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaggttacc gaattcgaac aggaacgtgg g 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcggtacc ggatccatcc gtcgacggac c 31

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttacaggtta tttgggctag 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgggttcaa ttccttatc 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtttgaggg aaaagtagag aacgt 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaccgatca atcaagatca gtcga 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccacacaa gacacagata ct 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaaggactt tggctgacta taa 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caaggtcacc aatccctact tac 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttgcttcag cttggctatt tc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttgggtgat ggagtcttgc 20

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcgacggatc gctgacc 17

Claims

1.一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，构建含有用于沉默耐热基因特异性片段的重组病毒载体，转化到农杆菌感受态细胞制备侵染菌液，将所述侵染菌液侵染杜鹃，对所述耐热基因的功能进行鉴定分析，所述用于沉默耐热基因特异性片段为用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段或用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段，所述用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，包括如下步骤；

S1，提取杜鹃叶片RNA，反转录获得杜鹃cDNA；

S2，利用引物1和引物2对进行杜鹃cDNA片段 PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段，利用引物3和引物4对进行杜鹃cDNA片段 PCR扩增，纯化获得用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段；

S3，将步骤S2中的用于沉默RpHsfC-1 like基因特异性片段、用于沉默RpHsfC-1基因特异性片段分别与烟草脆裂病毒pTRV2进行重组连接，获得重组载体pTRV2-HsfC-1 like、pTRV2- HsfC-1；

S4，将步骤S3中重组载体pTRV2-HsfC-1 like、pTRV2- HsfC-1以及pTRV1分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体pTRV2-HsfC-1 like的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1 的菌液以及含pTRV1的菌液；

S5，将步骤S4的含重组载体pTRV2-HsfC-1 like的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1 的菌液分别与含pTRV1的菌液以体积比1：1混匀，即为侵染夜，将所述侵染液侵染杜鹃叶片；

S6，将侵染成功的杜鹃进行正常培养7天，后模拟自然高温条件进行高温胁迫处理，检测HsfC-1 like、HsfC-1对在杜鹃的耐性响应中的功能，以及在杜鹃叶片光系统、光保护机制、电子传递对高温胁迫响应的作用；

在步骤S2中，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；

在步骤S2中，所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，所述引物4的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，在步骤S5中，浸染方式如下：用无菌注射器在杜鹃叶片背部分别进行注射接种含重组载体pTRV2-HsfC-1 like和pTRV1的菌液、含重组载体pTRV2-HsfC-1和pTRV1的菌液。

4.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，在步骤S6中，所述高温胁迫处理的温度白天12h为40℃，晚上12h为32℃。

5.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，在步骤S6中，高温胁迫处理胁迫第5 d后选取杜鹃新梢顶叶下的第3-4层叶片，进行功能验证。

6.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法，其特征在于，在步骤S6中，所述耐性响应中的功能分析包括叶绿素荧光参数、叶绿素荧光诱导曲线，所述杜鹃叶片光系统、光保护机制、电子传递对高温胁迫响应的作用包括 JIP-test、延迟荧光 DF、820 nm 反射光谱测定。