CN116064578A - 一种与乌菜抗逆性相关的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与乌菜抗逆性相关的基因及其应用，涉及遗传育种技术领域，其中所述逆性具体为高温、盐和干旱，所述基因具体为bHLH57基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在对相关抗逆性品种进行筛选时，只需将筛选品种种植至6片真叶时进行bHLH57基因表达量的检测，其中bHLH57基因表达量越高的品种其抗逆性越强；本发明能够为培养具有抗逆性的转基因乌菜品种提供指导方向。

Description

一种与乌菜抗逆性相关的基因及其应用

技术领域

本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及一种与乌菜抗逆性相关的技术。

背景技术

乌菜又名塌菜、塌棵菜、塌地松、黑菜等，为十字花科芸苔属芸苔种白菜亚种的一个变种，是十字花科的两年生草本植物，高温、干旱、渗透胁迫等逆境会导致乌菜的经济产量和品质下降，影响植物的生长发育。

对乌菜抗逆性的鉴定可有效判定对应的抗逆性，从而便于提前针对植株进行防护处理，避免经济损失；但是传统的鉴定方法周期长，测试结果受自然环境影响大，不利于优质种质资源的筛选。

因此如何快速鉴定乌菜的抗逆性以便于优质种质资源的筛选，是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与乌菜抗逆性相关的基因及其应用，以解决现有技术中优质种子资源筛选较慢的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种与乌菜抗逆性相关的基因，所述基因被命名为bHLH57基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述逆性具体为高温、高盐和干旱三者中的任意组合。

本发明还提供一种利用上述基因鉴定乌菜抗逆性优劣的方法，该方法包括将需要进行抗逆性比较的种质在同一条件下培养至6片真叶时，取同一位置进行bHLH57基因表达量的测定并排序，bHLH57基因表达量越高的其抗逆性越强，所述逆性具体为高温、高盐和干旱三者中的任意组合。

本发明还提供一种上述bHLH57基因在培育具有抗逆性的转基因乌菜品种中的应用，所述逆性具体为高温、高盐和干旱三者中的任意组合。

本发明相比现有技术具有以下优点：

通过对植株幼苗进行bHLH57基因表达量的测定，能够有效对多个品种的抗逆性进行优劣评判，提高了筛选速度，同时能够有效的为培育具有抗逆性的乌菜转基因品种提供指导思路。

附图说明

图1为常态下六叶期不同乌菜品种的bHLH57基因表达量对比图；

图2为不同条件下不同乌菜品种的bHLH57基因表达量对比图；

图3为不同转基因型拟南芥植株内BcbHLH57相对表达量对比图；

图4为不同胁迫下各株系的萌发情况(比例尺＝1cm)对比图；

图5为不同胁迫下各株系的萌发率对比图；

图6为高温、盐、干旱胁迫下各株系的生长情况(比例尺＝1cm)对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

乌菜bHLH57基因的获取

具体的为：

1.乌菜基因组总RNA提取及cDNA合成(本试验选取4个乌菜品种作为材料，4个品种分别为W19-6、W19-11、W20-4和W22-3)

参照Takara RNA提取试剂盒说明书进行乌菜基因组总RNA提取。所得RNA经定量后，按表1体系加样合成cDNA，具体参照Takara反转录说明书进行。

表1

2.乌菜bHLH57基因的获得及回收纯化

通过反转录乌菜的RNA得到cDNA模板，利用上游引物F：SEQ ID NO 4和下游引物R：SEQ ID NO 5克隆bHLH57基因(引物送生工生物公司合成)，按表2体系加样(每循环延伸时间为1min，退火温度为56℃，34个循环)，合成PCR产物，得到的产物用1.5％琼脂糖电泳检测，经内参检测合格后，将所得符合预期大小的片段从琼脂糖胶上切下，按照AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit说明书进行目的DNA片段得回收。

表2

3.克隆载体构建及转化大肠杆菌

将回收的目的DNA片段和pMD^TM 19-T载体按体积比1：4连接(表3)，放4℃冰箱过夜。次日取连接产物5μL，加入到50μL已解冻大肠杆菌感受态中，在冰上静置30min后40℃热激45s，再于冰上静置3min，加入1mL LB液体培养基后在震荡培养箱中37℃、220rpm培养1h。培养结束后4000rpm、3min离心后，弃大部分上清，余下150μL用移液枪轻轻吹打，用涂布棒均匀涂布在含有100mg·L^-1Amp的LB平板上。37℃培养过夜，次日挑取3-5个阳性菌落于含100mg·L^-1Amp的4mL LB离心管中分别37℃培养过夜。

表3

4.测序及生物信息学分析

取上一步骤所得菌液，利用上游引物F：SEQ ID NO 4和下游引物R：SEQ ID NO 5按表4中的体系扩增bHLH57基因(每循环延伸时间为1min，退火温度为56℃，34个循环)，产物经1.5％琼脂糖电泳检测合格后，取1mL菌液送上海华大公司测序，获得核苷酸序列为SEQID NO.1所示的bHLH57基因，另取500μL加入500μL 40％甘油后保存于-20℃冰箱。

表4

实施例2

乌菜bHLH57基因表达模式研究

1、常态下bHLH57基因表达量的测定

本试验选取4个乌菜品种作为材料，4个品种分别为W19-6、W19-11、W20-4和W22-3。将四个乌菜品种放置在白天25±1℃，夜温20±1℃，光周期为14h/10h(光照/黑暗)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％的人工气候室内。幼苗生长至6片真叶时，选取第三叶位叶片中央避开叶脉的位置进行bHLH57基因表达量测定，bHLH57基因表达量的测定具体为：

根据SEQ ID NO 1所示bHLH57基因的核苷酸序列，用Oligo 7.0软件设计用于检测bHLH57基因表达的荧光引物(F：SEQ ID NO 2；R：SEQ ID NO 3)，并以管家基因Actin为参考，引物序列送生工生物公司合成。经半定量PCR检测，引物无二聚体及非特异扩增后，设置NTC，检测操作及引物是否符合要求，二者均合格后，在冰上加样，每个样重复3次并进行三次生物学重复。将样品盖子盖好后轻微离心，在CFX 96PCR仪中检测基因表达量。

试验结果如图1所示，表明六叶期不同乌菜品种的bHLH57基因表达量具有显著差异。W19-6最低，W20-4、W19-11、W22-3中bHLH57基因表达量分别约为W19-6的2、3、4倍。

2、不同胁迫条件下乌菜bHLH57基因表达模式的分析

四个品种的幼苗生长至6片真叶时，选取大小一致，长势一致的乌菜分别进行不同胁迫处理，其中：

高温胁迫：高温人工气候室条件设置为：40±1℃/30±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照300μmol·m-2s-1，相对湿度为70％；对照人工气候室条件设置为25±1℃/20±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。

盐胁迫：人工气候室条件设置为25±1℃/20±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。盐胁迫处理组以150mM NaCl浇灌乌菜幼苗，对照组浇灌等量清水。

干旱胁迫：人工气候室条件设置为25±1℃/20±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。干旱胁迫处理组以250mmol·L-1甘露醇浇灌乌菜幼苗，对照组浇灌等量清水。

将幼苗在各自对照、高温、盐和干旱胁迫条件下处理3天后分别取样(取样部位为第三叶位叶片中央避开叶脉的位置，三次生物学重复)，冷冻保存。用于后续实验。

对所得样品分别进行bHLH57基因表达量、超氧阴离子、过氧化氢和相对电导率的测定。

测得结果如下：

不同胁迫处理对不同品种乌菜O₂ ^.-含量的影响

表5

不同胁迫处理对不同品种乌菜H2O2含量的影响

表6

不同胁迫处理对不同品种乌菜相对电导率的影响

表7

对照、高温、盐、干旱胁迫下bHLH57基因表达量的检测结果如图2所示。

由上述可得，在正常条件下，与W19-6相比，W19-11、W20-4和W22-3的O2.-含量分别下降36.64％、17.58％和42.75％；与bHLH57基因在各品种中的表达量趋势相反。高温、盐胁迫和干旱胁迫的O2.-含量比正常条件下上升48.09％、104.58％和11.45％，且各品种的O2.-含量变化趋势与正常条件下一致，均是W19-6>W20-4>W19-11>W22-3(表5)。在正常条件下，与W19-6相比，W19-11、W20-4和W22-3的H2O2含量分别下降34.94％、31.50％和43.90％；与bHLH57基因在各品种中的表达量趋势相反。高温、盐胁迫和干旱胁迫的H2O2含量比正常条件下上升713.37％、276.74％和490.70％，且各品种的H2O2含量变化趋势与正常条件下一致，均是W19-6>W20-4>W19-11>W22-3(表6)。在正常条件下，与W19-6相比，W19-11、W20-4和W22-3的相对电导率分别下降29.10％、20.68％和36.53％；与bHLH57基因在各品种中的表达量趋势相反。高温、盐胁迫和干旱胁迫的相对电导率比正常条件下上升57.27％、65.80％和29.39％，且各品种的相对电导率变化趋势与正常条件下一致，均是W19-6>W20-4>W19-11>W22-3(表7)。

图2中可以看到植株在经历胁迫后，bHLH57基因表达量也是具有显著差异的。通过图1、2、表5、6、7我们可以看到bHLH57基因表达量越高，植株的超氧阴离子、过氧化氢和相对电导率的含量越低，说明了bHLH57基因表达量高的植株能够更好的应对胁迫带来的伤害。

实施例3

实施例1中菌液PCR胶回收产物与1305载体质粒进行双酶切(表8，轻轻吸打混匀，37℃水浴热浴2h)，切胶回收后同源重组连接转化大肠杆菌(表9)。50℃反应20min后，立即将离心管置于冰上冷却2min。

表8

表9

加入4μl的反应液到感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃热激90s后快速冰浴5min，加入500μl SOC液体培养基，37℃、180rpm孵育45-60min。4000rpm离心3min后收集菌体，并将菌体均匀的涂布在含抗生素kana平板上。37℃培养箱过夜培养后挑菌、摇菌测序并-80℃保存。取5ul质粒产物加入100ul农杆菌感受态，吹打混匀混匀后，冰上静置5min，液氮速冻5min后，37℃热浴5min，在冰上静置5min。于反应液中加入1ml液体LB，28℃、220rpm孵育3h后以5000rpm在4℃下离心3min。涂布含Kan+rif平板(200ml LB+200ul Kan+400ulrif)，封口膜封口，28摄氏度倒置培养2d后挑菌、摇菌、洗菌后将菌斑用缓冲液(200ml 1/2MS+10g 5％蔗糖+50ul Silwet-77，PH＝5.8)吹打均匀，再离心，再重复加20ml(缓冲液吹打均匀，得到乳白色液体，测OD560＝0.8～1(以缓冲液校零)。

将拟南芥花序浸泡缓冲液中2min后用清水洗净，保湿避光24h后正常培养，30天时收取第一批种子,40天时收取第二批种子,晒干7～10天。将种子消毒洗净后播种于卡那霉素和利福平选择性培养基筛选进行筛选，七天后将根长较长的拟南芥幼苗移栽到营养钵中(人工气候室条件设置为25±1℃/20±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照强度300μmol·m-2·s-1，相对湿度为70％)，待植株长大后每株拟南芥单独取样并进行bHLH57荧光表达验证是否为阳性植株，收取阳性植株种子进行单株系扩繁，经过逐代筛选，最终获得3个相对表达量较高的T3代转基因株系(OE#4、OE#15和OE#23)。图3的实时定量PCR结果表明，OE#4、OE#15和OE#23相对表达水平均比野生型(WT)高。这些结果表明成功进行了转基因拟南芥的遗传转化，获得的3个转基因株系可用于后续试验。对转基因拟南芥3个T3代株系以及野生型的种子分别进行高温(40℃)、渗透(250mmol·L-1D-甘露醇)及盐(150mmol·L-1NaCl)胁迫处理，观察其萌发情况，并统计7天内的萌发率(图4,5)。高温胁迫处理和盐胁迫处理组中萌发率高低依次都为：OE#4>OE#15>OE#23>WT；而在渗透胁迫处理组，萌发率依次为：OE#4>OE#23>OE#15>WT。

将野生型拟南芥和三个过表达转基因株系幼苗在1/2MS培养基中培养5天后移栽至营养钵中，3周苗龄时对野生型以及各转基因株系植株进行高温、盐胁迫处理，此时转基因植株幼苗的存活率显著高于野生型(图6)，其中：

高温胁迫：高温人工气候室条件设置为：40±1℃/30±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照300μmol·m-2s-1，相对湿度为70％；对照人工气候室条件设置为25±1℃/20±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。

盐胁迫：人工气候室条件设置为25±1℃/20±1℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(昼/夜)，光照强度300μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。盐胁迫处理组以150mM NaCl浇灌乌菜幼苗，对照组浇灌等量清水。

将野生型拟南芥和三个过表达转基因株系幼苗在1/2MS培养基中培养5天后移栽至营养钵中，3周苗龄时对野生型以及各转基因株系植株进行14d的干旱处理(即停止浇水14d)，再复水3天，观察各株系的存活情况(图6，表10)。干旱胁迫处理7d野生型以及各转基因株系拟南芥幼苗时，发现野生型植株有较明显的叶片卷曲、植株干枯萎蔫的状况，即有较为显著的脱水现象，甚至少量植株死亡；而各转基因株系植株无明显或者有轻微的脱水现象，与对照组相似。干旱胁迫处理14d时，发现野生型植株叶片卷曲、植株干枯萎蔫的状况十分显著，大量植株死亡；而各转基因株系植株也有较为明显的脱水现象，甚至少量植株死亡，但其存活率均高于野生型。复水3天后，各转基因株系植株叶片明显返绿，存活率显著高于野生型。OE#4及OE#23转基因植株在复水3d后拥有80％以上的存活率，而野生型植株仅有10％以下的存活率，明显低于各转基因株系。

表10

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种与乌菜抗逆性相关的基因，其特征在于，所述基因被命名为bHLH57基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述逆性具体为高温、高盐和干旱三者中的任意组合。

2.一种利用权利要求1所述基因鉴定乌菜抗逆性优劣的方法，其特征在于，该方法包括将需要进行抗逆性比较的种质在同一条件下培养至6片真叶时，取同一位置进行bHLH57基因表达量的测定并排序，bHLH57基因表达量越高的其抗逆性越强，所述逆性具体为高温、高盐和干旱三者中的任意组合。

3.一种权利要求1所述bHLH57基因在培育具有抗逆性的转基因乌菜品种中的应用，所述逆性具体为高温、高盐和干旱三者中的任意组合。

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